JP2024522156A - サイトカインレベルを変化させ、受動免疫を生まれたばかりの豚に提供するためのコロナウイルススパイクタンパク質の経口投与 - Google Patents

Abstract

コロナウイルスＳタンパク質が含まれる植物および植物産生組成物が開示される。これらは、ワクチン、ブースターまたは免疫モジュレーターとして使用され得る。組成物は、炎症性サイトカイン応答を、動物に投与されたときにはサイトカインレベルを変化させることによって軽減させることが示されている。組成物は、コロナウイルス感染または他のウイルス感染にしばしば伴うサイトカインストームの軽減／改善または防止を生じさせるための免疫モジュレーターとして使用され得る。組成物はまた、ワクチン有効性を増大させるためのいずれかのワクチン組成物とともに投与されたときには相加的な保護を生じさせるために使用され得る。組成物は、ワクチンとして使用されたときには、生まれたばかりの動物を、受動免疫を介して保護することが示されている。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、米国仮出願第６３／２０２，２６４号（２０２１年６月３日出願、これは参照によってその全体が本明細書中に組み込まれる）に基づく米国特許法第１１９条の下での優先権を主張する。

配列表の組み込み
１３０，４５６バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）にて測定）であり、１１１個の生物学的配列を含み、２０２２年６月２日に作成された“ＨＯＷＡＲＤ＿Ｐ１３６２５ＵＳ０１＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”と名付けられるファイルを含有する配列表が米国特許商標庁のＰａｔｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒシステムを介して本明細書とともに電子提出され、その全体において参照によって本明細書中に組み込まれる。

背景
コロナウイルスが人間および動物の両方の福祉にとっては大きな問題となっており、近い将来における引き続く脅威である。ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）は、２８ｋｂのＰＥＤＶのゲノムを有するコロナウイルス科のプラス鎖エンベロープＲＮＡウイルスである。このウイルスは豚に感染し、その結果、産業に対する大きな損失を米国および世界中でもたらしている（Ｇｅｒｄｔｓ ａｎｄ Ｚａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋ、２０１７）。生まれたばかりの子豚は特に感染しやすく、死亡率が高い。この疾患が欧州では１９７０年代初期に、アジアでは２０１０年に、そして米国では２０１３年に初めて特定された。この疾患は養豚業界における大きな問題であり続けている。

ＰＥＤＶは子豚における重症下痢および死亡の原因である。様々なワクチンが、強固な免疫をもたらし、かつ伝染サイクルを中断させる可能性を有しており、また、有望な結果が認められている一方で、どれもがウイルスからの完全な保護をもたらしていない。スパイクタンパク質（Ｓ）が、中和抗体のためのエピトープの大多数を含有するので、コロナウイルスについてのほとんどのワクチン戦略のための標的である。ＰＥＤＶの場合、乳飲み子豚は保護を最も必要としており、しかし、自分自身の免疫応答を遅れずに開始することができず、受動免疫に頼らなければならない。

しかし、様々な供給元からの市場に基づく様々なワクチン（例えば、ＨａｒｒｉｓワクチンおよびＺｏｅｔｉｓなど）はかろうじて効果的であるにすぎず、ほとんどが古典的な株に基づいており、例えば、ＣＶ７７７（Ｇｅｒｄｔｓ ａｎｄ Ｚａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋ、２０１７）などに基づいている。低コストで、かつより効果的なＰＥＤＶ用ワクチンが明らかに求められている。

要旨
出願人らは、植物から産生されるコロナウイルススパイクタンパク質（Ｓタンパク質）を含むコロナウイルスワクチン、ブースター組成物または免疫調節組成物の利点を発見している。ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）由来の、植物によって産生された、または植物に基づいたワクチン、ブースター組成物または免疫調節が、受動免疫をワクチン接種される母親からの生まれたばかりの動物に提供すること、そしてまた、サイトカインレベルを変化させ、これによりワクチンをより効果的にすること、このことは、どのようなワクチンであれそれに変わるブースターとして使用され得ることが、本明細書中において明らかにされる。簡単に記載すると、ワクチンを製造するために、発現を植物の種子に優先的に導くプロモーター、ＰＥＤＶのスパイクポリペプチドをコードする核酸分子、および発現を小胞体に仕向ける核酸分子を含む構築物が植物に導入される。様々な実施形態により、ＣＯＥポリペプチドが含まれるＳタンパク質の配列、ＬＴＢ熱不安定ポリペプチドをコードする配列、またはそれらの組み合わせを有する構築物が提供される。植物の種子の１ｋｇあたり少なくとも１０ｍｇの発現レベルが得られる。植物または植物産物が動物に経口投与されたとき、血清抗体応答を含めて、防御応答が観察される。さらなる利点には、非特異的免疫反応および受動免疫を軽減させるための変化したサイトカインレベルが含まれる。

出願人らはＳ抗原を、後で分娩前に追加免疫される無感作の母豚および未経産豚に投与した。その後、生まれたばかりの豚をＰＥＤＶにより抗原投与し、疾患症状について評価した。経口ワクチン候補物を受けていた雌親豚からの乳飲み子豚は、対照よりも有意に高い生存率を示した。加えて、雌親豚を保護の相関物について試験した。乳汁および血清の中和抗体（ＮＡＢ）が有意な相関関係を示した。１３種の異なるサイトカインのレベルもまた雌親豚で測定され、それらのレベルはほとんどの場合において、対照の雌親豚と比較して、Ｓ抗原とともに投与されたときには低下したレベルを有することが見出された。ＩＮＦについては、サイトカインレベルが、非特異的免疫応答を低減させるためには望ましいが、増大した。このことは、コロナウイルス由来のＳ抗原が、（ＮＡＢ）を誘発させるための免疫原として作用し得るだけでなく、サイトカインレベルを低下させるための免疫モジュレーターで、ウイルス曝露前の炎症反応を軽減し、これにより疾患重症度における軽減を引き起こす免疫モジュレーターとしてもまた作用し得ることを明らかにする。したがって、Ｓタンパク質、およびそれを含有する組成物は、コロナウイルス感染または他のウイルス感染にしばしば伴うサイトカインストームの軽減／改善または防止を生じさせるための免疫モジュレーターとして使用され得る。組成物はまた、ワクチン有効性を増大させるためのいずれかのワクチン組成物とともに投与されたときには相加的な保護を生じさせるために使用され得る。その様々な効果が、経口投与または注射投与を行ったときに認められ、いくつかの実施形態においては、注射されたワクチンに対する経口付随物として、または完全経口ワクチンプロトコルにおける経口付随物として使用され得る。

さらなる実施形態において、コロナウイルスへの曝露の後で増大するサイトカインレベルが、免疫の存在を示すためのマーカーとして、またはコロナウイルスへの曝露についての診断特徴として使用され得る。

図１は、植物への導入のために作出される構築物を示すグラフィック図である。使用されるプロモーターが、ｐｒ２５、ｐｒ３９およびｐｒ４４であった。ＢＡＡＳＳはオオムギのアルファアミラーゼ配列を示す。Ｓ１は米国株のスパイクタンパク質を示し、当該タンパク質において、Ｓ１ｅｘｔ（ＵＳ）は延長配列を示し、Ｓ１（ＤＲ１３）は韓国株のスパイクタンパク質を示す。Ｖａｃは液胞標的化配列を示し、ＫＤＥＬは小胞体保持配列を示す。ＣＯＥはＣＯＥ配列を示す。ＰｉｎＩＩはＰｉｎＩＩターミネーターであり、ＬＴＢは熱不安定エンテロトキシンサブユニットを示す。これらのすべてが本明細書中においてさらに詳しく記載される。 図２は、ウイルス抗原投与後の子豚の健康状態を経時的に示すグラフである。 図３は、群あたりの子豚の平均生存率を示すグラフである。結果は、対照の死亡率が高く、一方で、経口投与されたワクチン候補物が最大の保護をもたらしたことを示す。 図４は、血清におけるＮＡＢを、注射、対照および経口送達について示すグラフである。結果が、明確な結果をもたらした最高力価で与えられ、２０の希釈度が陽性サンプルについての検出限界である。 図５は、母豚の３ｓ乳汁におけるサイトカインレベルを描写するグラフである。示される１３種の異なるサイトカインについてのレベルを求め、平均を計算し、その後、注射群および経口投与群を対照の母豚群と比較した。全体として、サイトカインレベルにおける顕著な低下が、Ｓタンパク質が経口投与または非経口投与のどちらによってでも投与されていた母豚について認められた。 図６は、母豚の血清におけるサイトカインを示すグラフである。示される１３種の異なるサイトカインについてのレベルを求め、平均を計算し、その後、経口投与群を対照の母豚群と比較した。全体として、サイトカインレベルにおける顕著な低下が、Ｓタンパク質が投与されていた母豚について認められた。 図７は、６つの異なる処置群の平均生存率を示すグラフである。 図８は、乳汁におけるサイトカインのレベルを６つすべての処置群について示すグラフである。データは、ＣＳＦ、ＩＦＮおよびＴＮＦがすべて、Ｓタンパク質組成物が経口投与されたときには、対照からの乳汁および注射投与からの乳汁において低下することを明らかにする。

説明
ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）はアルファコロナウイルス属のコロナウイルス亜科のメンバーであり（Ｂｒｉｄｇｅｎら、１９９３ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ｖｉｒｕｓ ｃｏｎｆｉｒｍｓ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２２９Ｅ ａｎｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４（Ｐｔ９）：１７９５－１８０４）、英国では１９７１年に、そしてその後、他の国々において、例えば、ベルギー、中国、ハンガリー、イタリア、日本、韓国およびタイなどで初めて特定された（Ｏｌｄｈａｍ Ｊ．１９７２ Ｌｅｔｔｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ｅｄｉｔｏｒ．Ｐｉｇ Ｆａｒｍｉｎｇ １９７２（Ｏｃｔｏｂｅｒ ｓｕｐｐｌ）：７２－７３；ＰｅｎｓａｅｒｔおよびＤｅ Ｂｏｕｃｋ Ｐ．１９７８ Ａ ｎｅｗ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ｉｎ ｓｗｉｎｅ．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．５８：２４３－２４７；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ３６：３５５－３６４；Ｎａｇｙら、１９９６．Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ，ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｃａｌｉｃｉ－ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ｉｎ Ｈｕｎｇａｒｙ．Ａｃｔａ Ｖｅｔ．Ｈｕｎｇ．４４：９－１９；Ｍａｒｔｅｌｌｉら、２００８．Ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｏｆ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｉｔａｌｙ．Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１６２：３０７－３１０；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８３．Ａｎ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｄｉａｒｒｈｅａ ｏｆ ａ ｎｅｗ－ｔｙｐｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｊａｐａｎ．日本獣医学雑誌４５：８２９－８３２；Ｃｈａｅら、２０００．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｋｏｒｅａｎ ｐｉｇｓ．Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１４７：６０６－６０８；Ｐｕｒａｎａｖｅｊａら、２００９．Ｃｈｉｎｅｓｅ－ｌｉｋｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ、Ｔｈａｉｌａｎｄ．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５：１１１２－１１１５）。この科の他のメンバーには、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎コロナウイルス（ＰＨＥ）、および伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）が含まれる。ＰＥＤＶウイルスおよびＴＧＥＶウイルスは近縁であり、臨床徴候が非常に類似しているにもかかわらず、免疫交差防御が全くない。

ＰＥＤＶは、５’端のキャップおよび３’端のポリアデニル化尾部を有する、およそ２８ｋｂの一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。（ＰｅｎｓａｅｒｔおよびＤｅ Ｂｏｕｃｋ Ｐ．１９７８）。ゲノムは、５’端側の非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’端側のＵＴＲ、ならびに４つの構造タンパク質（スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）およびヌクレオカプシド（Ｎ））と、３つの非構造タンパク質（レプリカーゼ１ａおよびレプリカーゼ１ｂならびにＯＲＦ３）とをコードする少なくとも７つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、これらは５’－レプリカーゼ（１ａ／１ｂ）－Ｓ－ＯＲＦ３－Ｅ－Ｍ－Ｎ－３’の順でゲノムに配列される（Ｏｌｄｈａｍ Ｊ．１９７２；およびＢｒｉｄｇｅｎら、１９９３）。特徴づけられる最初の３つの出現した北米ＰＥＤＶゲノム配列、すなわち、ミネソタＭＮ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ４６８７５２．１）、アイオワＩＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ４６８７５３．１）およびアイオワＩＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ４６８７５４．１）は、ポリアデノシン尾部を除いて、２８，０３８ヌクレオチド（ｎｔ）の同じサイズを有しており、プロトタイプＰＥＤＶのＣＶ７７７株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３５３５１１．１）とゲノム構成を共有する。これらの３つの北米ＰＥＤＶ配列は９９．８％～９９．９％のヌクレオチド同一性を共有した。特に、ＭＮ株およびＩＡ２株はゲノム全体にわたってほんの１１個にすぎないヌクレオチド相違を有した。

ＰＥＤＶのスパイク（Ｓ）タンパク質は、約１，３８３個のアミノ酸（ａａ）から構成されるＩ型糖タンパク質である（韓国株に関しては１３８６個、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＡＭ１９７１６．１（配列番号２２）を参照のこと、Ｓ１領域が残基２３４～７３６として特定される；中国株では１３８２個のアミノ酸、Ｓ１が２３０～７３２として特定され、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＦＬ０２６２７．１（配列番号２３）を参照のこと）。このタンパク質は推定上のシグナルペプチド（残基１～２４）を含有する。Ｓタンパク質は２つの領域に分割することができる。一方が、Ｓ１のＮ端側領域（１～７３３または７３５ａａ）である。下記の実施例で使用されるスパイクタンパク質を参照すると、この領域はＡＡＭ１９７１６．１の韓国株例に対する９４％の同一性を有し、ＡＦＬ０２６２７．１の中国株例との９３％の同一性を有する。もう一方の領域が、他のコロナウイルスのＳタンパク質とのその相同性に基づいて、スパイクタンパク質の残基７３６～７４１から末端までが含まれるとして特定されるＣ端側領域Ｓ２である（Ｃｈａｎｇら、２００２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｇｉｏｎ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ、１４，２９５－２９９）。スパイクタンパク質のＳ１およびＳ２への切断がトリプシンの存在下で生じ得る。（例えば、Ｗｉｃｈｔら（２０１４）Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８：２９５２－７９６１を参照のこと）。スパイクタンパク質のカルボキシ末端に位置するＧＰＲＬＱＰＹモチーフにより、ブタ流行性下痢ウイルスを中和する抗体が誘導される。Ｇｏｄｅｔら、１９９４Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．１３２、１９２－１９６．Ｍａｊｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ａｒｅ ｌｏｃａｔｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，８００８－８０１６；Ｊａｃｋｗｏｏｄら、２００１．Ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ．Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．４５，３６６－３７２；Ｓｔｕｒｍａｎら、１９８４ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｅｐｌｏｍｅｒｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ２ ｏｆ ＭＨＶ ｙｉｅｌｄｓ ｔｗｏ ９０Ｋ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１７３，２５－３５．３３；Ｓｕｎら、２００８．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３１，７３－８１．３４）。コロナウイルスにおけるＳタンパク質は表面抗原であり、この場合、Ｓタンパク質は、ウイルス進入を媒介するように宿主細胞受容体糖タンパク質との相互作用を調節すること、および天然宿主における中和抗体の誘導を刺激することにおいて役割を果たしている。Ｓ遺伝子およびその領域の系統発生学的および遺伝学的な比較分析では、米国株、中国株、韓国株を含めて様々な株の間におけるわずかな変動が示され、８９．４％の同一性から１００％の同一性にまで及ぶパーセント同一性が示された。これには、ＤＲ１３、ＢＭ１、Ｊ３１４２、ＢＭ３、ＣＶ７７７、ＡＨ２０１２、ＢＪ－２０１２－２、コロラド３０、インジアナ３４およびテキサス３１の株が比較されたときのパーセント同一性が含まれた。Ｃｈｕｎｇら（２０１７）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ１ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ Ｋｏｒｅａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｏｒｄ．Ｖｏｌ．１ Ｎｏ．１を参照のこと。Ｓタンパク質のポリペプチドの配列比較では、様々な韓国単離物が相互との９３．６％～９９．６％の同一性を有し、他の株との９２．２％～９３．７％の同一性を有したことが示された。Ｌｅｅら（２０１０）Ｈｅｔｅｒｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｓｏｌａｔｅ ｄｉｎ Ｋｏｒｅ、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．１４９（２）：１７５－８２。したがって、Ｓ糖タンパク質が、ＰＥＤＶに対する効果的なワクチンを開発するための第一の標的である。

ＰＥＤＶのＭタンパク質は、重要な役割をウイルス組立てプロセスにおいて果たす最も多量に存在するエンベロープ構成成分であり、ウイルスを中和する抗体もまた誘導する。同様に、ヌクレオカプシドのための構造的基礎を提供するビリオンＲＮＡに結合するＰＥＤＶのＮタンパク質もまた、細胞媒介免疫を誘導するために重要であり得る（Ｓａｉｆ，Ｌ．１９９３ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８５－２９７）。

ＰＥＤＶにおける唯一のアクセサリー遺伝子がＯＲＦ３である。様々なアクセサリー遺伝子が一般に野外株では維持されるが、ＯＲＦ３の変化はビルレンスに影響を与えると考えられており、そのため、細胞培養適応がこれまで、ビルレンスを低減させるためにＯＲＦ３遺伝子を変化させるように使用されている（Ｓｏｎｇら、２００３ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ ａｄａｐｔｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ Ｋｏｒｅａｎ ｆｉｅｌｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＯＲＦ３．Ｖａｃｃｉｎｅ２１，１８３３－１８４２）。実際、ＯＲＦ３遺伝子の調査を通じて、研究者らは２００６年以来、中国での免疫化された豚群におけるＰＥＤＶの新しい遺伝子型群の出現を図表にしている。これらの株の系統学的研究、および中国でのＰＥＤＶの地理学的再出現は、壊滅的な腸疾患を引き起こすそれらの野外株が欧州株およびワクチン株とＯＲＦ３において遺伝子的に異なることを明らかにしている（Ｐａｒｋら、２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ（ＰＥＤＶ）ｆｉｅｌｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ Ｋｏｒｅａ．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１５６，５７７－５８５。

変化する様々なレベルのビルレンスを有するＰＥＤＶの種々の株が存在する。ＰＥＤＶ感染の臨床徴候は伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）感染に類似している（Ｐｉｊｐｅｒｓら、１９９３）。３週齢およびより若齢のブタにおいては、１００％の死亡率に至る様々な臨床兆候（急性水様性下痢、嘔吐および脱水が含まれる）が、ＰＥＤＶ感染後２４時間もの早期に認められ得る。ＰＥＤＶ感染した肥育豚および育成豚、同様にまた、母豚および未去勢雄豚は、下痢および嘔吐を発症し得る。これらの動物は食欲不振の徴候もまた示し得るし、不活発であり得る。より高齢の豚は、低下した飼料効率、すなわち、市場に出すまでの追加の日数を示し、感染動物の二次感染に対する感受性が高そうである。母豚については、低下した身体状態が生殖能力に悪影響を与える場合がある。

ＰＥＤＶに感染した動物の腸における肉眼的および組織学的な変化は、米国では、中国で認められる変化と類似している；本質的には、ウイルスは、栄養分の吸収不良が生じるように豚の腸の絨毛を破壊する。ミネソタ州およびアイオワ州での大流行において病死する動物は、小腸に限定される肉眼的な病理学的病変を有し、しかも、小腸は、黄色い液体により膨張した薄い半透明な壁によって特徴づけられた。組織学的評価により、絨毛の平坦化および融合、ならびに粘膜固有層（ｌａｍｉａ ｐｒｏｐｒｉａ）の絨毛の極めて少ないリンパ芽球浸潤を有する小腸の領域が明らかにされた。

Ｈｕａｎｇら、２０１３は、米国における去りゆく大流行からのＰＥＤＶの３つの異なる株を特徴づけた：１つがミネソタ州由来であり、２つがアイオワ州由来であり、これらは、ＭＮ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＫＦ４６８７５２）、ならびにＩＡ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＫＦ４６８７５３）およびＩＡ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＫＦ４８７５４）とそれぞれ称される。（Ｈｕａｎｇら、２０１３ Ｏｒｉｇｉｎ，ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｅｍｅｒｇｅｎｔ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．ｍＢｉｏ ４（５）：ｅ００７３７－１３。）Ｈｕａｎｇの系統学的調査では、ＰＥＤＶ株が、遺伝子型群１（Ｇ１）および遺伝子型群２（Ｇ２）と称される２つの異なった遺伝子型群に分かれるとしてグループ分けされた。遺伝子型群１には、１ａ、１ｂ、およびＲの少なくとも３つのクラスターが含まれる。サブグループ１ａには、初期の欧州単離物、中国単離物および韓国単離物、例えば、プロトタイプＣＶ７７７株（ベルギー、１９７８年、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３５３５１１．１）、ならびにＬＺＣ株（甘粛省、中国、２００６年；ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ１８５９９２）およびＳＭ９８株（韓国、１９９８年；ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＵ９３７７９７．１）が含まれる。サブグループ１ｂは５つの株を含有し、１つが韓国由来であり（ＤＲ１３弱毒化ワクチン株、ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ０２３１６２．１）、それ以外が中国由来であり、ｎｓｐ３における共通した「遺伝的シグナチャー」の８－ａａ欠失と、Ｃ末端における大きなＯＲＦ３欠失とによって関連づけられる。グループ「Ｒ」は、それ以外の遺伝子型群の組換え体に関連する。ある特定の株が遺伝子型群Ｇ２ａに属する。中国株ＡＨ２０１２（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＫＣ２１０１４５）および北米株はいくつかの特異なヌクレオチド変化を共有しており、遺伝子型群２ａにおいて一緒になってクラスターを形成する。ＭＮ株およびＩＡ２株についてのＡＨ２０１２に対するヌクレオチド同一性が９９．６％であり、ＩＡ１株については９９．５％であった。非常に近い北米分離物ＵＳ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／２０１３（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＫＦ２７２９２０．１）もまた、Ｍａｒｔｈａｌｅｒら、２０１３ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＵＳＡ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／２０１３ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｕｎｃ．１（４）：ｅ００５５５－１３．１０．１１２８／ｇｅｎｏｍｅＡ．００５５５－１３によって報告されている。上記の北米分離物のように、ＣＯ／１３の完全なＰＥＤＶゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋにおいて入手可能な他の完全なＰＥＤＶゲノムとの９６．５～９９．５％のヌクレオチド同一性を有しており、中国株ＡＨ２０１２（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＫＣ２１０１４５）との最も高いヌクレオチド同一性（９９．５％）を有する。この株は２ａ遺伝子型群のメンバーである。

ＰＥＤＶワクチンを作出するための試みには、弱毒化ウイルスワクチンの製造が含まれる：例えば、米国特許第９，９５０，０６１号（これはその全体が参照によって組み込まれる）で記載される弱毒化ウイルスワクチンなど。この弱毒化ワクチンには、スパイク抗原（その改変されたスパイクタンパク質が配列識別子９として示され、示される保護のために効果的な変動を伴って配列識別子８の核酸によってコードされ、少なくとも８０％の相同性を有する）が含まれ、かつ、配列識別子３、配列識別子７、配列識別子９および配列識別子１４が含まれた（これらのすべてがそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。

本書では、植物産生スパイク（Ｓ）ポリペプチド、ならびに当該ポリペプチドを含む免疫モジュレーターおよび組成物としてのその使用が提供される。１つの実施形態において、Ｓポリペプチドが、発現を種子の胚にさらに優先させ得る種子優先プロモーターを、Ｓポリペプチドをコードする核酸分子に動作可能に連結されて含む構築物において植物に導入される。さらなる実施形態において、構築物は、Ｓポリペプチドの発現を植物の細胞の小胞体において保持する核酸分子を含む。さらにさらなる実施形態では、胚優先プロモーターと、発現を小胞体において保持する核酸分子とをそれぞれが含む２つの植物転写ユニット（ＰＴＵ）が規定される。追加の実施形態により、これらのＰＴＵが、同じ種子優先プロモーターと、発現を小胞体において保持する核酸分子とを含むことが提供される。

コロナウイルスのウイルスゲノムはキャップ化され、ポリアデニル化され、ヌクレオカプシドタンパク質により覆われる。コロナウイルスビリオンには、スパイク（Ｓ）タンパク質として示されるＩ型融合糖タンパク質を含有するウイルスエンベロープが含まれる。ほとんどのコロナウイルスが、共通したゲノム構成を有しており、レプリカーゼ遺伝子がゲノムの５’端側部分に含まれ、構造遺伝子がゲノムの３’端側部分に含まれる。コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質は、前駆体タンパク質として最初に合成されるクラスＩ融合糖タンパク質である。個々の前駆体Ｓポリペプチドがホモ三量体を形成し、シグナルペプチドを除くためのプロセシングと同様にグリコシル化をゴルジ装置内で受け、別々のＳ１ポリペプチド鎖およびＳ２ポリペプチド鎖を生じさせるように細胞プロテアーゼによって切断され、しかし、これらのポリペプチド鎖はホモ三量体内ではＳ１／Ｓ２プロトマーとして会合したままであり、そのため、ヘテロ二量体の三量体である。Ｓ１サブユニットはウイルス膜の遠位にあり、ウイルスの宿主受容体に対するウイルス付着を媒介する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有する。Ｓ２サブユニットは、融合タンパク質機構、例えば、融合ペプチド、２つのヘプタッド反復配列（ＨＲ１およびＨＲ２）、および融合糖タンパク質に典型的な中心ヘリックス、膜貫通ドメイン、ならびに細胞質ゾル尾部ドメインなどを含有する。いくつかの実施形態において、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）－コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、ＳＡＲＳ－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＳＡＲＳ様コロナウイルス、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）－コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＭＥＲＳ様コロナウイルス、ＮＬ６３－ＣｏＶ、２２９Ｅ－ＣｏＶ、ＯＣ４３－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＷＩＶ１－ＣｏＶ、ＭＨＶ、ＨＫＵ９－ＣｏＶ、ＰＥＤＶ－ＣｏＶ、またはＳＤＣＶである。前述の実施形態のいずれにおいても、Ｓタンパク質はコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質あるいはそのフラグメントまたはエピトープを含むことができ、ただし、エピトープは必要に応じて線状エピトープまたは立体配座エピトープであり、タンパク質は３つの組換えポリペプチドを含む。前述の実施形態のいずれにおいても、表面抗原は、シグナルペプチド、Ｓ１サブユニットペプチド、Ｓ２サブユニットペプチド、またはどのような組み合わせであれそれらの組み合わせを含むことができる。

Ｓタンパク質は発現が組換え系では不良であり、そのため、商用サブユニットワクチンを開発することが困難である。本書では、１つの実施形態において、トウモロコシ穀粒が、サブユニットワクチンの製造のための基礎として使用される。種子全体の１ｋｇあたり少なくとも１０ｍｇの高い発現レベルが得られる。１つの実施形態では、約１０～１００ｍｇ／ｋｇの範囲が規定される。さらなる実施形態では、種子全体の１ｋｇあたり１１ｍｇ、１ｋｇあたり１２ｍｇ、１ｋｇあたり１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇでの発現、またはそれを超える発現、またはその間の量での発現が規定される。米国特許出願公開番号２０２０－００８０１０１Ａ（２０２０年３月１２日発行、発明の名称：ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＰＥＤＶ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＩＮ ＰＬＡＮＴＳ ＡＮＤ ＰＬＡＮＴ ＰＲＯＤＵＣＥＤ ＶＡＣＣＩＮＥ ＦＯＲ ＳＡＭＥ）を参照のこと：その開示はここに参照によって組み込まれる。

さらに、植物、植物部分、または当該植物部分から製造される製造物、例えば、種子、穀粒、穀粉、またはスパイクタンパク質を含む当該植物、植物部分、もしくはそれらから製造される製造物を含む他の食用組成物などの経口投与は、動物からの驚くべき血清応答をもたらし、また、それらの経口投与はまた、粘膜応答を同様に生じさせることができる。１つの実施形態における血清応答が対照の２倍超～１００倍超の範囲にある。別の実施形態において、応答は、ワクチン接種を受けない対照動物の５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、またはそれを超えること、あるいはその間での量であることが可能である。

本明細書中で使用される場合、核酸またはポリヌクレオチドの用語は、一本鎖形態または二本鎖形態でのどちらでもデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを示す。ワクチンを作製するために使用される配列は、どのような供給源からであっても、例えば、生物学的サンプルから単離する際の生物学的供給源などから得られる場合があり、または前記サンプルから得られる配列に基づいて合成的に製造される配列を示すことができる。そのようなものとして、これらの用語には、ＲＮＡおよびＤＮＡが含まれ、これらは、遺伝子またはその一部分、ｃＤＮＡ、合成ポリデオキシリボ核酸配列、あるいは同様なものであることが可能であり、また、一本鎖状または二本鎖状、同様にまた、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドであることが可能である。さらには、これらの用語は、細胞から単離することができる天然に存在する核酸分子、同様にまた、例えば、化学合成の方法によって、または酵素的方法によって、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによって調製することができる合成分子が含まれるように本明細書中では使用される。具体的に限定される場合を除き、これらの用語は、参照核酸と類似した結合特性を有し、かつ、天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で代謝される、天然ヌクレオチドの知られている類似体を含有する核酸を包含する。別途示される場合を除き、特定の核酸配列がまた、明示的に示される配列と同様に、当該核酸配列の保存的改変バリアント（例えば、縮重コドン置換体）、および相補的配列を暗黙的に包含する。具体的には、様々な縮重コドン置換が、１またはそれを超える選択された（あるいはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基残基および／またはデオキシイノシン残基により置換される配列を生じさせることによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら、（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８；Ｃａｓｓｏｌら、（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、８：９１－９８）。核酸の用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。

本書で用いられる核酸には、ポリペプチド全体をコードする核酸、同様にまた、当該ポリペプチドの部分配列をコードする核酸、または防御応答をもたらすフラグメントを生じさせる核酸が含まれる。例えば、全長ではなく、それにもかかわらず、ＰＥＤＶに対する保護活性を有するポリペプチドをコードする核酸。本発明には、本明細書中に示されるようなヌクレオチド配列が含まれる核酸だけでなく、例示された実施形態と実質的に同一である、または例示された実施形態に対応する、または例示された実施形態に対して実質的に相補的である核酸もまた含まれる。例えば、本発明には、少なくとも約７０％の同一性を本明細書中に示されるヌクレオチド配列に対して有するヌクレオチド配列、より好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、８５．５％、８６％、８６．５％、８７％、８７．５％、８８％、８８．５％、８９％、８９．５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９０．５％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９４．５％、９４％、９４．５％、いっそうより好ましくは少なくとも約９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９５．５％、１００％の同一性（またはどのような百分率であれその間の百分率）を例示されたヌクレオチド配列に対して有するヌクレオチド配列が含まれる核酸が含まれる。ヌクレオチド配列は、産生されるコードされたポリペプチドがどれも、防御応答の生成を誘導することが可能である限り、前述のように改変され得る。

核酸は、当業者に知られている様々な方法を使用して得ることができる。好適な核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムまたは部分配列）をクローニングすることができ、またはインビトロ方法によって、例えば、好適なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）、または自己持続配列複製システム（ＳＳＲ）などによって増幅することができる。多種多様なクローニング方法論およびインビトロ増幅方法論が当業者には広く知られている。多くのクローニング訓練を通じて当業者を導くために十分であるこれらの技術および説明書の様々な例が、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｖｏｌ．１－３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．と、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間での共同事業体、（１９９４年増補）（Ａｕｓｕｂｅｌ）；Ｃａｓｈｉｏｎら、米国特許第５，０１７，４７８号；およびＣａｒｒ、欧州特許第０，２４６，８６４号において見出される。インビトロ増幅方法を介して当業者を導くために十分である技術の様々な例が、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、同様にまた、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）、米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ他編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｍｈｅｉｍ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）、Ｃ＆ＥＮ、３６－４７；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１－９４；Ｋｗｏｈら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら、（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１０７７－１０８０；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：２９１－２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ、４：５６０；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら、（１９９０）Ｇｅｎｅ、８９：１１７において見出される。インビトロ増幅核酸をクローニングする改善された様々な方法が、Ｗａｌｌａｃｅらの米国特許第５，４２６，０３９号に記載される。様々な核酸、またはこれらの核酸の部分配列を、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限を含めて、どのような方法であれ上記で記載されるような好適な方法によって調製することができる。

「コドン最適化」を、配列を動物における発現のために最適化するために使用することができ、「コドン最適化」は、生来的配列の少なくとも１つのコドン、２つ以上のコドン、またはかなりの数のコドンを、その動物の遺伝子においてより頻繁に、または最も頻繁に使用されるコドンにより置き換えることによって、核酸配列を目的とする動物（例えば、豚）の細胞における増強された発現のために改変することとして定義される。様々な生物種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンについては特定の偏りを示す。

本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」は一般には、ペプチドおよびタンパク質を示す。ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個またはそれを超えるアミノ酸である、あるいはそれを超える、あるいはどのような量であれその間の量であり得る。ペプチドは一般には、５０個を超えるアミノ酸であると見なされる。用語「フラグメント」、用語「誘導体」および用語「ホモログ」は、本発明によるポリペプチドに言及するときには、前記ポリペプチドと本質的に同じ生物学的な機能または活性を保持するポリペプチド、すなわち、抗原として作用する、かつ／あるいは疾患のための処置および／または疾患からの保護をもたらすポリペプチドを意味する。そのようなフラグメント、誘導体およびホモログを、ポリペプチドの生物学的活性の１つまたはそれを超えるものを保持する能力、すなわち、抗原として作用する、かつ／あるいは病原体のための処置および／または病原体からの保護をもたらす能力に基づいて選定することができる。本発明のポリペプチドワクチンは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドである場合があり、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。当業者は、防御ポリペプチドが、宿主細胞、および動物に投与される植物組成物における遺伝子によって発現させられ、投与前に植物から抽出され得ることが可能であることを認識する。

「保存的改変バリアント」はアミノ酸配列および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的改変バリアントは、同一のアミノ酸配列もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそのような核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を示す。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同一の核酸により、どのようなポリペプチドであれ所与のポリペプチドがコードされる。例えば、ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧの各コドンがすべて、アミノ酸のアルギニンをコードする。したがって、アルギニンが、あるコドンによって指定されるどの位置においても、このコドンは、コードされたポリペプチドを変化させることなく、記載される対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸変動は、「保存的改変変動」の１つの種である「サイレント置換」または「サイレント変動」である。ポリペプチドをコードする本明細書中に記載されるどのポリヌクレオチド配列もまた、別途記される場合を除いて、ありとあらゆるサイレント変動を表す。したがって、サイレント置換は、アミノ酸をコードするあらゆる核酸配列の言外の特徴である。当業者は、核酸におけるそれぞれのコドン（通常はメチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧを除く）が、標準的な技術によって、機能的に同一の分子を得るために改変され得ることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、防御ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は好ましくは、ポリペプチドまたはＲＮＡを産生させるために使用される特定の宿主細胞（例えば、酵母、哺乳動物、植物、真菌、および同様なもの）における発現のために最適化される。

アミノ酸配列については、当業者は、コードされた配列におけるただ１つのアミノ酸または小さい割合のアミノ酸を変更する、または付加する、または欠失する、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換が当該変更によってもたらされる「バリアント」として本明細書中では示される「保存的改変バリアント」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する様々な保存的置換表がこの技術分野では広く知られている。例えば、Ｄａｖｉｓら、“Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．（１９９４）を参照のこと。そのような保存的改変バリアントは、本発明の多型バリアント、種間ホモログおよび対立遺伝子に加えてのものであり、それらを除外しない。

下記の８つの群がそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。

単離されたバリアントタンパク質は、それを生来的に発現する細胞から精製することができ、またはそれを発現するように変更されている細胞から精製することができ（組換え）、または知られているタンパク質合成方法を使用して合成することができる。例えば、バリアントポリペプチドをコードする核酸分子が発現ベクターにクローニングされ、発現ベクターが宿主細胞に導入され、バリアントタンパク質が宿主細胞において発現させられる。その後、バリアントタンパク質を、標準的なタンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームによって細胞から単離することができる。これらの技術の多くが下記において詳しく記載される。

方法には、少なくとも約７０％の同一性を本明細書中に示されるアミノ酸配列に対して有するアミノ酸配列、より好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、８５．５％、８６％、８６．５％、８７％、８７．５％、８８％、８８．５％、８９％、８９．５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９０．５％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９４．５％、９４％、９４．５％、いっそうより好ましくは少なくとも約９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９５．５％、１００％の同一性（またはどのような割合であれその間の割合）を例示されたヌクレオチド配列に対して有するアミノ酸配列が含まれるアミノ酸が含まれる。配列は、ポリペプチドが、防御応答の生成を誘導することが可能である限り、前述のように改変され得る。

本方法において使用されるバリアントタンパク質は、キメラタンパク質または融合タンパク質を形成するために異種配列に取り付けることができる。そのようなキメラタンパク質および融合タンパク質は、バリアンタンパク質とは実質的に相同的ではないアミノ酸配列を有する異種タンパク質に読み枠を合わせて融合されるバリアントタンパク質を含む。異種タンパク質はバリアントタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合することができる。

キメラタンパク質または融合タンパク質を標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生させることができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードするＤＮＡフラグメントが、従来の技術に従って読み枠を合わせて一緒に連結される。別の実施形態において、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機が含まれる従来の技術によって合成することができる。代替において、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、後でアニーリングされ、キメラ遺伝子配列が生じるように再増幅されることが可能である２つの連続する遺伝子フラグメントの間での相補的な突出部を生じさせるアンカープライマーを使用して行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９２を参照のこと）。そのうえ、融合成分（例えば、ＧＳＴタンパク質）を既にコードする多くの発現ベクターが市販されている。バリアントタンパク質をコードする核酸を、融合成分がバリアントタンパク質に読み枠を合わせて連結されるようにそのような発現ベクターにクローニングすることができる。

ポリペプチドはときには、２０個の天然の存在するアミノ酸として一般には示される２０個のアミノ酸とは別のアミノ酸を含有する。さらに、末端アミノ酸を含めて多くのアミノ酸が、天然のプロセス、例えば、プロセシングおよび他の翻訳後修飾などによって、またはこの技術分野では広く知られている化学的修飾技術によって改変され得る。ポリペプチドにおいて天然に生じる一般的な修飾が、基礎的なテキスト、詳細なモノグラフ、および研究文献に記載されており、それらは当業者には広く知られている。したがって、本発明のバリアントペプチドはまた、置換されたアミノ酸残基が、遺伝暗号によってコードされるものではない誘導体または類似体、置換基が含まれる誘導体または類似体、成熟ポリペプチドが別の化合物と、例えば、ポリペプチドの半減期を増大させるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などと融合される誘導体または類似体、あるいは追加のアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合される、例えば、リーダー配列もしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列を精製するための配列などが融合される誘導体または類似体を包含する。

知られている修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付着、ヘム成分の共有結合付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付着、脂質または脂質誘導体の共有結合付着、ホスホチジルイノシトールの共有結合付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加（例えば、アルギニル化など）、およびユビキチン化が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の方法はさらに、核酸分子およびポリペプチド（ポリペプチドのバリアントタンパク質を含む）の機能的フラグメントを、そのようなフラグメントが抗原として作用し、かつ／あるいはＰＥＤＶのための処置および／またはＰＥＤＶからの保護をもたらすことを条件として、そのようなフラグメントを含むタンパク質およびペプチド、ならびにそのようなフラグメントからなるタンパク質およびペプチドに加えて、提供する。

本明細書中で使用される場合、用語「サブユニット」は、保護をもたらし、自身が抗原性であるかもしれない、すなわち、免疫応答を動物において誘導することが可能であるかもしれない微生物の一部分を示す。この用語は、組換え方法および生化学的方法の両方によって得られるサブユニットが含まれるように解釈されなければならない。

「構築物」は、様々な技術を介して細胞のゲノムに挿入される遺伝物質のパッケージである。「ベクター」は、どのような手段であれ核酸の宿主細胞への移入のための手段である。ベクターは、別のＤＮＡセグメントが、取り付けられたセグメントの複製をもたらすように取り付けられ得るレプリコンであり得る。「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製またはＲＮＡ複製の自律的ユニットとして機能する、すなわち、それ自身の制御のもとでの複製が可能であるいずれかの遺伝要素（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。用語「ベクター」には、核酸をインビトロで、エクスビボで、またはインビボで細胞に導入するためのウイルス手段および非ウイルス手段の両方が含まれる。ウイルスベクターには、アルファウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ポックスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアベクター、単純ヘルペスベクター、エプスタイン・バーベクター、狂犬病ウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターが含まれる。非ウイルスベクターには、プラスミド、リポソーム、電荷を帯びた脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡタンパク質複合体またはＲＮＡタンパク質複合体、およびバイオポリマーが含まれるが、これらに限定されない。核酸に加えて、ベクターはまた、１またはそれを超える調節領域、ならびに／あるいは核酸移入結果（どの組織への移入か、発現継続期間など）を選択すること、測定すること、およびモニタリングすることにおいて有用である選択マーカーを含有し得る。

「カセット」は、特定の制限部位においてベクターに挿入することができるＤＮＡのセグメントを示す。ＤＮＡのセグメントは目的のポリペプチドをコードし、またはＲＮＡを産生させ、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のための適正な読み枠での当該カセットの挿入を保証するように設計される。

核酸分子が、細胞に挿入されるときには当該細胞に導入される。細胞は、外因性または異種のＤＮＡまたはＲＮＡが細胞の内部に導入されているときにはそのようなＤＮＡまたはＲＮＡによって「トランスフェクション」されている。

細胞は、トランスフェクションされたＤＮＡまたはＲＮＡが表現型変化をもたらすときには外因性または異種のＤＮＡまたはＲＮＡによって「形質転換」されている。形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに一体化され得る（共有結合により連結され得る）。

遺伝子が、所望の特徴（例えば、所望の細胞内局在化配列）を含有するように操作されると、遺伝子はその後、標準的な方法によって発現ベクター内に設置され得る。適切な発現ベクターの選択は、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法に依存するであろう。典型的な発現ベクターは、細菌の複製起点についてコードする原核生物ＤＮＡエレメント、ならびに細菌宿主における成長および発現ベクターの選択に備えるための抗生物質耐性遺伝子；外因性ＤＮＡ配列の挿入のためのクローニング部位；外因性遺伝子の転写の開始を制御する真核生物ＤＮＡエレメント；および転写物のプロセシングを制御するＤＮＡエレメント、例えば、転写終結／ポリアデニル化配列などを含有する。発現ベクターはまた、ベクターの宿主染色体内への最終的な一体化のために必要とされるような配列を含有すことができる。

「プロモーター」によって、それに連結される配列の転写を調節することが可能であるＤＮＡの調節領域が意味される。この調節領域は通常、ＲＮＡ合成を特定のコード配列のための適切な転写開始部位で開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを導くことが可能であるＴＡＴＡボックスを含む。プロモーターは、転写を所望の様式で導くために十分である最小配列である。用語「調節領域」はまた、転写を所望の様式で開始させることが可能である配列を示すために使用される。

核酸分子は、それ自身のプロモーターまたは別のプロモーターと併せて使用され得る。１つの実施形態において、選択マーカー、目的とする核酸分子を、同じプロモーターに機能的に連結することができる。別の実施形態において、それらは、異なるプロモーターに機能的に連結することができる。さらに第３および第４の実施形態において、発現ベクターは、同じプロモーターまたは異なるプロモーターに連結されることが可能である目的とする２またはそれを超える遺伝子を含有することができる。例えば、１つのプロモーターを、目的とする核酸分子と、選択マーカーとを駆動させるために使用することができ、あるいは、異なるプロモーターを１つまたはそれぞれのために使用することができる。これらの他のプロモーターエレメントは、プロモーター依存的遺伝子発現を、細胞タイプ特異的、組織特異的または時間特異的もしくは発達段階特異的であるとして、あるいは外部のシグナルまたは作用因によって誘導可能であるとして制御可能にするために構成的または十分であるものが可能である。そのようなエレメントは遺伝子の５’側領域または３’側領域に位置し得る。追加のプロモーターが、目的とする構造遺伝子の内因性プロモーターであり得るにもかかわらず、プロモーターはまた、外来の調節配列であることが可能である。産物タンパク質および選択遺伝子の発現を制御するために用いられるプロモーターエレメントは、宿主適合性プロモーターがどのようなものであれ可能である。これらは、植物遺伝子プロモーターであることが可能であり、例えば、ユビキチンプロモーター（欧州特許出願第０３４２９２６号）；リブロース－１，５－ビス－ホスファートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）のためのプロモーター（Ｃｏｒｕｚｚｉら、１９８４；Ｂｒｏｇｌｉｅら、１９８４）；あるいはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の腫瘍誘導プラスミドからのプロモーター、例えば、植物活性を有するノパリンシンターゼプロモーター、オクトピンシンターゼプロモーターおよびマンノピンシンターゼプロモーターなど（ＶｅｌｔｅｎおよびＳｃｈｅｌｌ、１９８５）；あるいはウイルスプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の１９Ｓプロモーターおよび３５Ｓプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙら、１９８２；Ｏｄｅｌｌら、１９８５）、ゴマノハグサモザイクウイルスＦＬｔプロモーター（Ｍａｉｔｉら、１９９７）、またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Ｇｒｄｚｅｌｉｓｈｖｉｌｉら、２０００）などであることが可能である。代替において、植物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター（例えば、ダイズｈｓｐ１７．５－Ｅ（Ｇｕｒｌｅｙら、１９８６））など、またはエタノール誘導性プロモーター（Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９８）が使用され得る。好適に用いられる例示的な植物プロモーターの総説については、国際特許出願公開番号ＷＯ９１／１９８０６を参照のこと。

プロモーターは加えて、転写開始速度に影響を与える、ＴＡＴＡボックスの一般には上流側に、すなわち、５’端側に配置される他の認識配列（これは上流側プロモーターエレメントとして示される）を含むことができる。プロモーター領域のためのヌクレオチド配列が特定されているので、本明細書中に特定される特定のプロモーター領域の上流側にある５’領域におけるさらなる調節エレメントを単離し、特定することは、最先端技術の範囲内であることが認識される。したがって、プロモーター領域は一般には、上流側の調節エレメント、例えば、コード配列、エンハンサーおよび同様なものの組織発現および時間的発現を担う調節エレメントなどを含むことによってさらに定義される。

組織優先プロモーターを、特定の組織の内部における増強された転写および／または発現を目標とするために利用することができる。優先的発現に言及するとき、意味するものは、特定の組織における、他の組織におけるよりも高いレベルでの発現である。これらのタイプのプロモーターの例には、種子優先発現、例えば、ファセオリンプロモーターによってもたらされる発現（Ｂｕｓｔｏｓら（１９８９）、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．１、８３９－８５３）などが含まれる。双子葉植物については、種子優先プロモーターには、マメβ－ファセオリン、ナピン、β－コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリン、および同様なものが含まれるが、これらに限定されない。単子葉植物については、種子優先プロモーターには、トウモロコシの１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、γ－ゼイン、ｗａｘｙ、ｓｈｒｕｎｋｅｎ１、ｓｈｒｕｎｋｅｎ２の各遺伝子、Ｌｔｐ１遺伝子（例えば、米国特許第７，５５０，５７９号を参照のこと）、Ｌｔｐ２遺伝子（Ｏｐｓａｈｌ－Ｓｏｒｔｅｂｅｒｇ，Ｈ－Ｇ．ら（２００４）、Ｇｅｎｅ、３４１：４９－５８、および米国特許第５，５２５，７１６号）、およびオレオシン遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。ｅｎｄ１遺伝子およびｅｎｄ２遺伝子からの種子優先プロモーターが開示される国際公開ＷＯ００／１２７３３もまた参照のこと。種子優先プロモーターにはまた、遺伝子発現を主に種子内の特定の組織に導くプロモーター、例えば、γ－ゼインの胚乳優先プロモーター、タバコ由来の潜在性プロモーター（Ｆｏｂｅｒｔら、（１９９４）“Ｔ－ＤＮＡ ｔａｇｇｉｎｇ ｏｆ ａ ｓｅｅｄ ｃｏａｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ”Ｐｌａｎｔ Ｊ．４：５６７－５７７）、トウモロコシ由来のＰ遺伝子プロモーター（Ｃｈｏｐｒａら、（１９９６）“Ａｌｌｅｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ Ｐ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｅｎｃｏｄｅ Ｍｙｂ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ”Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：１１４９－１１５８、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１９９７、１：１０９の訂正）、トウモロコシ由来のグロブリン－１プロモーター（ＢｅｌａｎｇｅｒおよびＫｒｉｚ（１９９１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ａｌｌｅｌｉｃ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ－１ ｇｅｎｅ”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２９：８６３－９７２、およびＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｌ２２３４４）、発現をトウモロコシ穀粒の種皮または種子外皮に導くプロモーター、例えば、果皮特異的グルタミンシンテターゼプロモーター（Ｍｕｈｉｔｃｈら、（２００２）“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ_１－２ Ｇｅｎｅ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍａｉｚｅ”Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６３：８６５－８７２、およびＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ３５９５１１）、および発現を胚（胚芽）に導くプロモーター、例えば、米国特許第７，１６９，９６７号で開示されるプロモーターなどが含まれる。種子優先プロモーターまたは胚優先プロモーターに言及するときには、当該プロモーターが、動作可能に連結された配列を種子または胚組織において、他の植物組織におけるよりも高い程度に発現させることが意味される。種子優先プロモーターまたは胚優先プロモーターは、種子または胚の発達期間中に、他の段階での発現と一緒に発現させる場合があり、また、種子または胚の発達期間中に強く、そして他の時点でははるかにより少ない程度に発現させ得る。

利用可能なプロモーターの範囲には、誘導性プロモーターが含まれる。誘導性の調節エレメントは、１またはそれを超えるＤＮＡ配列または遺伝子の転写を誘導因子に応答して直接的または間接的に活性化することが可能である調節エレメントである。誘導因子の非存在下では、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されないであろう。典型的には、誘導性調節エレメントに特異的に結合して転写を活性化するタンパク質因子は、後において誘導因子によって活性な形態に直接的または間接的に変換される不活性な形態で存在している。誘導因子は、化学的作用因、例えば、タンパク質、代謝産物、成長調節剤、除草剤またはフェノール系化合物など、あるいは生理学的ストレスで、熱、寒冷、塩もしくは毒性元素によって直接的に強いられる、または病原体もしくは疾患媒介者（例えば、ウイルスなど）の作用（ａｃｔｉｏｎ）を介して間接的に強いられる生理学的ストレスであり得る。典型的には、誘導性調節エレメントに特異的に結合して転写を活性化するタンパク質因子は、後において誘導因子によって活性な形態に直接的または間接的に変換される不活性な形態で存在している。誘導因子は、化学的作用因、例えば、タンパク質、代謝産物、成長調節剤、除草剤またはフェノール系化合物など、あるいは生理学的ストレスで、熱、寒冷、塩もしくは毒性元素によって直接的に強いられる、または病原体もしくは疾患媒介者（例えば、ウイルスなど）のアクチン（ａｃｔｉｎ）を介して間接的に強いられる生理学的ストレスであり得る。誘導性調節エレメントを含有する細胞が、噴霧、水やり、加熱または同様の方法によるなどして誘導因子を細胞または植物に外部から適用することによって、誘導因子に曝され得る。

どのような誘導性プロモーターも使用することができる。Ｗａｒｄら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：３６１－３６６（１９９３）を参照のこと。例示的な誘導性プロモーターには、エクジソン受容体プロモーター、米国特許第６，５０４，０８２号；銅に応答するＡＣＥ１系に由来するプロモーター（Ｍｅｔｔら、ＰＮＡＳ９０：４５６７－４５７１（１９９３））；ベンゼンスルホンアミド系除草剤の毒性緩和剤に応答するトウモロコシ由来のＩｎ２－１遺伝子およびＩｎ２－２遺伝子（米国特許第５，３６４，７８０号；Ｈｅｒｓｈｅｙら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２２７：２２９－２３７（１９９１）、およびＧａｔｚら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２４３：３２－３８（１９９４））、Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサー（Ｇａｔｚら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９－２３７（１９９１）、またはステロイドホルモン遺伝子由来のＴｅｔリプレッサーであって、その転写活性がグルココルチコステロイドホルモンによって誘導される、Ｔｅｔリプレッサーが含まれる。Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１０４２１（１９９１）；トウモロコシＧＳＴプロモーター（これは、出芽前除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化される）；およびタバコＰＲ－１ａプロモーター（これはサリチル酸によって活性化される）。目的とする他の化学調節型プロモーターには、ステロイド応答性プロモーター（例えば、Ｓｃｈｅｎａら（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０４２１－１０４２５、およびＭｃＮｅｌｌｉｓら、（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１４（２）：２４７－２５７）におけるグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照のこと）、ならびにテトラサイクリン誘導性プロモーターおよびテトラサイクリン抑制性プロモーター（例えば、Ｇａｔｚら、（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９－２３７、ならびに米国特許第５，８１４，６１８号および同第５，７８９，１５６号を参照のこと）が含まれる。

ベクターの他の構成成分が、遺伝子の意図された使用にこれらもまた依存して、含まれ得る。例には、選択マーカー、標的化配列または調節配列、安定化配列またはリーダー配列、イントロンなどが含まれる。植物発現ベクターおよびレポーター遺伝子の様々な一般的記載および例を、Ｇｒｕｂｅｒら、“Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｌｉｃｋ他編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ．８９－１１９（１９９３））において見出すことができる。適切な発現ベクターの選択は、宿主、および発現ベクターを宿主に導入する方法に依存するであろう。発現カセットはまた、目的とする異種ヌクレオチド配列の３’末端に、植物において機能的である転写終結領域および翻訳終結領域を含むであろう。

発現ベクターは必要に応じてまた、プロモーターと、目的とする遺伝子との間に、および／または目的とする遺伝子の後に位置するシグナル配列を含有することができる。シグナル配列は、真核生物細胞内または真核生物細胞外の特定の場所に配置されるように目的とするタンパク質またはポリペプチドを導くために細胞によって使用されるアミノ酸配列を与えるように翻訳されるヌクレオチド配列である。多くのシグナル配列がこの技術分野では知られている。例えば、Ｂｅｃｋｅｒら、（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：４９、Ｋｎｏｘ，Ｃ．ら、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｗｏ Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ａｌｐｈａ－Ａｍｙｌａｓｅ Ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｂａｒｌｅｙ”Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：３－１７（１９８７）、Ｌｅｒｎｅｒら、（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：１２４－１２９、Ｆｏｎｔｅｓら、（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：４８３－４９６、Ｍａｔｓｕｏｋａら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：８３４；Ｇｏｕｌｄら、（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：１６５７；Ｃｒｅｉｓｓｅｎら、（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：１２９；Ｋａｌｄｅｒｏｎら、（１９８４）“Ａ ｓｈｏｒｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｂｌｅ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ”、Ｃｅｌｌ ３９：４９９－５０９；Ｓｔｅｉｆｅｌら、（１９９０）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｉｚｅ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｌｅａｆ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：７８５－７９３を参照のこと。タンパク質を細胞壁に仕向けるときには、シグナル配列の使用が必要である。一例がオオムギのアルファ－アミラーゼシグナル配列である。Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．（１９８５）“Ｔｗｏ ｂａｒｌｅｙ ａｌｐｈａ－ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｉｅｓ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ ｉｎ ａｌｅｕｒｏｎｅ ｃｅｌｌｓ”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７３１－３７３８。

異種ヌクレオチド配列の発現産物を特定のオルガネラに、特に色素体、アミロプラストに、または小胞体に向かわせること、あるいは細胞の表面に、または細胞外に分泌させることが望ましいそのような場合において、発現カセットはさらに、輸送ペプチドのためのコード配列を含むことができる。様々なそのような輸送ペプチドがこの技術分野では広く知られており、それらには、アシルキャリアタンパク質のための輸送ペプチド、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット、植物ＥＰＳＰシンターゼ、トウモロコシのＢｒｉｔｔｌｅ－１葉緑体輸送ペプチド（Ｎｅｌｓｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１７（４）：１２３５－１２５２（１９９８）；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３（１２）：１３３７－４８；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｐｌａｎｔａ（１９９５）、１９６（３）：４７７－８４；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７（２６）：１８９９９－９００４）、および同様なものが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、特定のオルガネラに至るように生成物を発現させることにおいて利用可能である多くの選択肢を容易に理解するであろう。輸送ペプチドの使用が広く知られている（例えば、米国特許第５，７１７，０８４号、同第５，７２８，９２５号を参照のこと）。タンパク質が植物細胞の小胞体に仕向けられ得る。これが局在化配列の使用によって、例えば、ＫＤＥＬなどの使用によって達成され得る。この配列（Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）は小胞体における受容体のための結合部位を含有する。（Ｍｕｎｒｏら、（１９８７）“Ａ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｉｇｎａｌ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｌｕｍｉｎａｌ ＥＲ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｃｅｌｌ．４８：８９９－９０７．多種多様な小胞体保持シグナル配列が当業者に利用可能であり、ＫＤＥＬ配列が一例である。別の一例がＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ（配列番号２４））である。例えば、様々な小胞体タンパク質を産生させる方法を議論するＫｕｍａｒらを参照のこと。Ｋｕｍａｒら、（２０１７）“ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅ”Ｐｅｅｒ Ｊ．ｄｏｉ：１０．７７１７／ｐｅｅｒｊ．３５６１。

タンパク質を液胞に保持することが、別の一例である。これを達成するための様々なシグナル配列が広く知られている。例えば、Ｒａｉｋｈｅｌの米国特許第５，３６０，７２６号には、Ｗａｒｒｅｎらの米国特許第５，８８９，１７４号が示すような液胞シグナル配列が示される。液胞標的化シグナルがアミノ末端部分に存在する場合があり（Ｈｏｌｗｅｒｄａら、（１９９２）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、４：３０７－３１８、Ｎａｋａｍｕｒａら、（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０１：１－５）、またはカルボキシ末端部分に存在する場合があり、または標的化タンパク質の内部配列に存在し得る。（Ｔａｇｕｅら、（１９９２）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、４：３０７－３１８、Ｓａａｌｂａｃｈら、（１９９１）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、３：６９５－７０８）。加えて、アミノ末端配列がカルボキシ末端配列と連携して、遺伝子産物の液胞標的化を担う（Ｓｈｉｎｓｈｉら、（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１４：３５７－３６８）。

終結領域はプロモーターヌクレオチド配列とともに生来的であり得るし、または目的とするＤＮＡ配列とともに生来的であり得るし、または別の供給源に由来し得る。使いやすい様々な終結領域が、Ａ，ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドから利用可能であり、例えば、オクトピンシンターゼの終結領域（ＭａｃＤｏｎａｌｄら、（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９（２０）５５７５－５５８１）およびノパリンシンターゼの終結領域（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、（１９８２）Ｍｏｌ．ａｎｄ Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１－５７３；およびＳｈａｗら、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．１２、Ｎｏ．２０ ｐｐ７８３１－７８４６（ｎｏｓ））などが利用可能である。様々な他のターミネーターの例には、ジャガイモ由来のプロテアーゼ阻害剤ＩＩ遺伝子からのｐｉｎＩＩターミネーター（Ａｎら、（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １、１１５－１２２）が含まれる。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら、（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１－１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１－６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎら、（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１－１４９；Ｍｏｇｅｎら、（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１－１２７２；Ｍｕｎｒｏｅら、（１９９０）Ｇｅｎｅ、９１：１５１－１５８；Ｂａｌｌａｓら、（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１－７９０３；およびＪｏｓｈｉら、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：９６２７－９６３９もまた参照のこと。

プロモーター、選択マーカー、シグナル配列、リーダー配列、終結配列、イントロン、エンハンサー、およびベクターの他の構成成分に対する多くの変化体が当業者に利用可能である。

植物の用語は、植物全体、または植物材料、または植物部分、または植物組織、または植物細胞の集合体を含めた植物細胞を示す。この用語は、植物切断物、植物細胞培養物、植物器官、植物種子および小植物を含めて、発達のいずれかの段階にあるどのような植物も含まれるように本明細書中では広く使用される。例えば、植物種子の様々な部分には、果皮または仁（ｋｅｒｎｅｌ）、胚または胚芽、および内質が含まれる。植物細胞は、プロトプラストおよび細胞壁を含む、植物の構造的および生理学的な単位物である。植物細胞は、単離された単一細胞もしくは細胞凝集塊（例えば、脆弱なカルスなど）、または培養細胞の形態であることが可能であり、あるいはより高度に組織化された単位物（例えば、植物組織、植物器官または植物）の一部分であり得る。したがって、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、あるいは完全な植物に再生することができる細胞または細胞の集合体であり得る。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、あるいは植物細胞のどのような一群であれ構造的単位物または機能的単位物に組織化される他の植物細胞群であり得る。植物の特に有用な部分には、収穫可能な部分、および子孫植物の繁殖のために有用な部分が含まれる。植物の収穫可能な部分は、植物のいずれかの有用な部分、例えば、花、花粉、実生、塊茎、葉、茎、果実、種子、根、および同様なものであり得る。繁殖のために有用な植物の部位には、例えば、種子、果実、切断物、実生、塊茎、根茎、および同様なものが含まれる。１つの実施形態において、組織培養は好ましくは、植物を再生させることが可能であろう。好ましくは、そのような組織培養物における再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、毛（ｓｉｌｋ）、花、仁、穂（ｅａｒ）、穂軸（ｃｏｂ）、穀皮（ｈｕｓｋ）または茎であろう。なおさらに、植物が組織培養物から再生され得る。

どのような植物種も、単子葉類であろうと、または双子葉類であろうと、使用される場合があり、これらには、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、カノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｓｐ．）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ ｓｐｐ．）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類樹（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、オートムギ（Ａｖｅｎａ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、野菜類、観賞植物および針葉樹が含まれるが、これらに限定されない。野菜類には、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えば、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｓｐｐ．）、ならびにキュウリ属のメンバー、例えば、キュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタループ（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）およびマスクメロン（Ｃ．ｍｅｌｏ）などが含まれる。観賞植物には、アザレア（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ ｓｐｐ．）、スイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｓｐｐ．）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポアンセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、およびキクが含まれる。本発明を実施する際に用いられることがある針葉樹には、例えば、藻類またはウキクサ亜科（Ｌｅｍｎｏｉｄｅａｅ）（別名、アオウキクサ）、マツ類、例えば、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、スラッシュマツ（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ロッジポールマツ（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｔｔａ）およびモンテレーマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）など；ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）；アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；ベイトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）；セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）；モミ類、例えば、モミ（Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌｉｓ）およびバルサムモミ（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ）など；シーダー類、例えば、ベイスギ（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）およびベイヒバ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）などが含まれる。１つの実施形態により、植物がトウモロコシであることが提供される。

形質転換／トランスフェクションの方法は重要ではなく、形質転換またはトランスフェクションの様々な方法が現在のところ利用可能である。より新しい方法が、作物または他の宿主細胞を形質転換するために利用可能であるので、直接に適用され得る。それゆえ、多種多様な方法が、ＤＮＡ配列を宿主細胞のゲノムに挿入して、当該配列の転写または転写物および翻訳を得て、表現型変化を生物において生じさせるために開発されている。したがって、効率的な形質転換／トランスフェクションを規定するどのような方法も用いられ得る。

発現ベクターを当業者に利用可能な植物組織に導入するための方法が様々であり、これらの方法は、選択される植物に依存するであろう。多種多様な植物種を形質転換するための様々な手順が広く知られており、文献の至るところに記載される。（例えば、ＭｉｋｉおよびＭｃＨｕｇｈ（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０７、１９３－２３２；Ｋｌｅｉｎら、（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１０、２８６－２９１；およびＷｅｉｓｉｎｇら、（１９８８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２、４２１－４７７を参照のこと）。例えば、ＤＮＡ構築物が、微小弾丸媒介送達（Ｋｌｅｉｎら、１９９２、前掲）、エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍら、１９８５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、５８２４－５８２８）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿（ＭａｔｈｕｒおよびＫｏｎｃｚ、１９９８ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８２、２６７－２７６）、遺伝子の直接移入（国際公開ＷＯ８５／０１８５６および欧州特許出願公開第２７５０６９号）、インビトロでのプロトプラスト形質転換（米国特許第４，６８４，６１１号）、および植物細胞プロトプラストまたは胚形成性カルスの微量注入（Ｃｒｏｓｓｗａｙ，Ａ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２、１７９－１８５）などの技術を使用して植物細胞のゲノムＤＮＡに導入され得る。Ｉｓｈｉｄａら（１９９６）のアグロバクテリウム形質転換方法、同様に、米国特許第５，５９１，６１６号に記載されるアグロバクテリウム形質転換方法が、さらに別の選択肢である。植物組織をアグロバクテリウム・ツメファシエンスと共培養することが、ＤＮＡ構築物がバイナリーベクターシステムの中に置かれる一変形である（Ｉｓｈｉｄａら、１９９６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４、７４５－７５０）。アグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主のビルレンス機能は、細胞が細菌によって感染したとき、構築物の植物細胞ＤＮＡへの挿入を導くであろう。例えば、Ｆｒａｌｅｙら（１９８３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０、４８０３－４８０７を参照のこと。アグロバクテリウムは主に双子葉植物において使用され、しかし、トウモロコシを含めた単子葉植物がアグロバクテリウムによって形質転換され得る。例えば、米国特許第５，５５０，３１８号を参照のこと。この方法に対する多くの変形の１つにおいて、トウモロコシへのアグロバクテリウム感染を、未成熟胚の熱ショック処理（Ｗｉｌｓｏｎら、米国特許第６，４２０，６３０号）とともに、またはＩＩ型カルスの抗生物質選抜（Ｗｉｌｓｏｎら、米国特許第６，９１９，４９４号）とともに使用することができる。

イネの形質転換が、Ｈｉｅｉら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊ．６、２７１－２８２、およびＬｅｅら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８、６３８９－６３９３によって記載される。カノーラを形質転換するための標準的な方法が、Ｍｏｌｏｎｅｙら、（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、８、２３８－２４２によって記載される。トウモロコシの形質転換が、Ｆｒｏｍｍら、（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）８、８３３－８３９、およびＧｏｒｄｏｎ－Ｋａｍｍら、（１９９０）上掲によって記載される。コムギを、トウモロコシまたはイネを形質転換するために使用される技術と類似する技術によって形質転換することができる。モロコシの形質転換がＣａｓａｓらによって記載される（Ｃａｓａｓら、（１９９３）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｏｒｇｈｕｍ ｐｌａｎｔｓ ｖｉａ ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、１１２１２－１１２１６）。オオムギの形質転換がＷａｎおよびＬｅｍａｕｘによって記載される（ＷａｎおよびＬｅｍａｕｘ（１９９４）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｆｅｒｔｉｌｅ ｂａｒｌｅｙ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４、３７－４８）。ダイズの形質転換が、米国特許第５，０１５，５８０号を含めて多数の刊行物に記載される。

１つの方法において、Ｉｓｈｉｄａら（１９９６）のアグロバクテリウム形質転換方法、同様に、米国特許第５，５９１，６１６号に記載されるアグロバクテリウム形質転換方法が、本発明者らが見出している、得られる形質転換体の数を改善する改変とともに、大体においてまねられる。Ｉｓｈｉｄａの方法では、Ｉ型カルスを培養において産生するＡ１８８品種のトウモロコシが使用される。１つの実施形態において、Ｈｉ ＩＩトウモロコシ系統が使用され、これはＩＩ型胚形成性カルスを培養で生じさせる（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９１）。

Ｉｓｈｉｄａは、ｂａｒ遺伝子またはｐａｔ遺伝子を選抜のために使用するときにはホスフィノトリシンでの選抜を推奨するが、別の好ましい実施形態により、ビアラホスの使用が代わりに提供される。一般には、第５，５９１，６１６号特許に記載されるように、また下記においてより詳しく概説されるように、脱分化が、植物の外植片を脱分化誘導培地で７日以上にわたって培養することによって得られ、脱分化中または脱分化後の組織が、目的とする遺伝子を有するアグロバクテリウムと接触させられる。培養組織は、例えば、カルス、不定胚様組織、または浮遊細胞であり得る。この好ましい実施形態において、アグロバクテリウムの懸濁物は１０^６～１０^１１細胞／ｍｌの細胞集団を有しており、組織と３～１０分間にわたって接触させられ、またはアグロバクテリウムと７日以上にわたって連続培養される。アグロバクテリウムは、目的とする遺伝子がプラスミドのＴ領域の境界配列の間に存在するプラスミドｐＴＯＫ１６２を含有することができ、または目的とする遺伝子が別のプラスミド含有アグロバクテリウムに存在し得る。ビルレンス領域は起源がＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドのビルレンス領域であり得る。Ｉｓｈｉｄａプロトコルで使用される細菌株は、超病原性Ａ２８１株からの３つのｖｉｒ遺伝子座を含有する４０ｋｂのスーパーバイナリープラスミドを有するＬＢＡ４４０４である。このプラスミドはテトラサイクリンに対する耐性を有する。クローニングベクターがスーパーバイナリープラスミドとコインテグレートする。クローニングベクターは、アグロバクテリウムの複製起点ではなく、大腸菌特異的な複製起点を有しているため、スーパーバイナリープラスミドとコインテグレートすることなしにアグロバクテリウムにおいて生き残ることができない。ＬＢＡ４４０４株は高病原性でなく、スーパーバイナリープラスミドなしには適用が限られるため、本発明者らは、ＥＨＡ１０１株が好ましいことをさらに別の実施形態において見出している。この株は、超病原性Ａ２８１株に由来する武装解除されたヘルパー株である。ＬＢＡ４４０４親由来のコインテグレートしたスーパーバイナリー／クローニングベクターが単離され、ＥＨＡ１０１にエレクトロポレーションされ、スペクチノマイシン耐性について選択する。プラスミドが、ＥＨＡ１０１が当該プラスミドを含有することを確かなものにするために単離される。ＥＨＡ１０１は、カナマイシンに対する耐性を伝える武装解除されたｐＴｉを含有する。Ｈｏｏｄら（１９８６）を参照のこと。

さらに、記載されるようなＩｓｈｉｄａプロトコルは、アグロバクテリウムの新鮮な培養物をプレートで成長させ、細菌をプレートから掻き取り、トウモロコシ胚とのインキュベーションのために第５，５９１，６１６号特許で述べられるような共培養培地に再懸濁することを規定する。この培地には、１リットルあたり４．３ｇのＭＳ塩、０．５ｍｇのニコチン酸、０．５ｍｇのピリドキシン塩酸塩、１．０ｍｌのチアミン塩酸塩、カザミノ酸、１．５ｍｇの２，４－Ｄ、６８．５ｇのスクロースおよび３６ｇのグルコースが、すべてが５．８のｐＨにおいて含まれる。さらに好ましい方法において、細菌が１ｍｌの培養物で一晩成長させられ、その後、新鮮な１０ｍｌの培養物が、形質転換が行われることになる翌日に再接種される。細菌は成長して対数期に入り、ＯＤ_６００＝０．５を決して超えない密度で、好ましくは０．２～０．５の間の密度で集められる。細菌はその後、培地を除くために遠心分離され、共培養培地に再懸濁される。Ｈｉ ＩＩが使用されるため、Ｈｉ ＩＩのために好まれる培地が使用される。この培地が、ＡｒｍｓｔｒｏｎｇおよびＧｒｅｅｎ（１９８５）によってかなり詳しく記載される。再懸濁培地は、上記で記載される培地と同じである。すべてのさらなるＨｉ ＩＩ培地が、ＡｒｍｓｔｒｏｎｇおよびＧｒｅｅｎ（１９８５）に記載される通りである。結果が植物細胞の再分化および植物への再生である。再分化はときには脱分化として示され、しかし、前者の用語はより正確には、細胞が形態および同一性を伴って始まり、細胞がその同一性を失い、新しい同一性を有するように「再プログラム」される培地に置かれるプロセスを表す。したがって、胚盤細胞が胚形成カルスになる。

ポリペプチドをコードする導入核酸分子を含有する遺伝子組換え植物が作製され得る。

植物へのヌクレオチド配列の導入に言及するとき、細胞への形質転換、同様にまた、従来の植物育種技術における場合のように、当該配列を有する植物を別の植物と交雑し、その結果、第２の植物が異種配列を含有するようにすることが含まれることが意味される。そのような育種技術は当業者には広く知られている。これは、どのような手段であれ植物を育種するためにこの技術分野で知られている手段によって、例えば、上記で記載される遺伝子組換え植物の他の植物との他家受粉、およびアミノ酸配列を発現する後世代からの植物についての選択などによって達成することができる。本明細書中で使用される植物育種方法は当業者には広く知られている。植物育種技術の議論については、Ｐｏｅｈｌｍａｎ（１９９５）Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ（ＡＶＩ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏ．、Ｗｅｓｔｐｏｒｔ Ｃｏｎｎ、第４版）を参照のこと。この方法において有用な多くの作物植物が、植物の受粉方法の利点を利用する技術を介して育種される。１つの花からの花粉が同じ植物の同じ花または別の花に移されるならば、植物は自家受粉性である。花粉が、異なる植物にある花に由来するならば、植物は他家受粉性である。例えば、アブラナ属においては、植物は通常、自家不稔性であり、変異体の発見を介して、または遺伝学的介入を介して自家和合性が得られる場合を除いて、他家受粉のみが可能である。自家受粉種、例えば、イネ、オートムギ、コムギ、オオムギ、エンドウ、マメ、ダイズ、タバコおよびワタなどにおいて、雄性植物および雌性植物は解剖学的には並置される。自然受粉の期間中に、所与の花の雄性生殖器官が、同じ花の雌性生殖器官に授粉する。トウモロコシ植物（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）は自家受粉技術および他家受粉技術の両方によって育種することができる。トウモロコシは、雄穂に位置する雄花と、穂に位置する雌花とを、同じ植物に有する。トウモロコシは自家受粉または他家受粉することができる。

受粉は、手、風または昆虫を介した受粉、あるいは雄性稔性植物および雄性不稔植物との間での機械的接触（これらに限定されない）を含めて、どのような手段によってであっても可能である。ハイブリッド種子をほとんどの植物種において商業的規模で生産するためには、風による受粉、または昆虫による受粉が好ましい。受粉プロセスのより厳密な制御を、一方の植物プールを雄性不稔性にし、かつ他方を雄性稔性花粉ドナーにするための様々な方法を使用することによって達成することができる。これを、手による雄穂除去、細胞質雄性不稔、または熟練の育種者には広く知られている様々な方法を介する雄性不稔の制御によって達成することができる。より洗練された雄性不稔系の例には、Ｂｒａｒら、米国特許第４，６５４，４６５号および同第４，７２７，２１９号、ならびにＡｌｂｅｒｔｓｅｎら、米国特許第５，８５９，３４１号および同第６，０１３，８５９号によって記載される系が含まれる。

戻し交配方法が、遺伝子を植物に導入するために使用され得る。この技術は、様々な形質を植物に導入するために何十年にわたって使用されている。広く知られているこの植物育種方法論および他の植物育種方法論の説明の一例を参考文献において、例えば、Ｎｅａｌ（１９８８）などにおいて見出すことができる。典型的な戻し交配プロトコルにおいて、目的とする元の品種（反復親）が、移入されることになる目的とするただ１つのだけの遺伝子を運ぶ第２の品種（非反復親）に対して交雑させられる。この交雑からの得られた子孫がその後、再び反復親に対して交雑させられる：このプロセスが、反復親の所望の形態学的特徴および生理学的特徴の本質的にすべてが、非反復親からのただ１つだけの移入遺伝子に加えて転換植物において取り戻される植物が得られるまで繰り返される。

上記で記載される選抜技術および繁殖技術は、従来の様式で収穫される複数の遺伝子組換え植物をもたらすことができる。組換えポリペプチドを発現する植物、またはどのような部分であれ、組換えポリペプチドを発現する部分は商業的プロセスにおいて使用することができ、あるいはポリペプチドを抽出することができる。植物または部分そのものを使用するときには、植物または部分は、例えば、粉にされ、その後、商業的プロセスにおいて適用されることが可能である。バイオマスからのポリペプチド抽出を、知られている方法によって達成することができる。どのような製造システムであれ製造システムのための下流側の加工は、製造物合成、この場合においては遺伝子組換え種子でのタンパク質産生（Ｋｕｓｎａｄｉ，Ａ．Ｒ．、Ｎｉｋｏｌｏｖ，Ｚ．Ｌ．、Ｈｏｗａｒｄ，Ｊ．Ａ．、１９９７．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．５６：４７３－４８４）の後におけるすべての単位操作を示す。例えば、種子を、種子全体が粉に粉砕され得るように、または分画化されて、胚芽が外皮および胚乳から分離され得るようにどちらであっても加工することができる。胚芽が使用されるならば、胚芽は通常の場合、抽出プロセスを使用して脱脂され、残った破砕胚芽が粉砕されて粗びき粉またはふるい分け粉にされる。いくつかの場合において、胚芽が直接にプロセスにおいて使用され、またはタンパク質を抽出することができる（例えば、国際公開ＷＯ９８／３９４６１を参照のこと）。抽出は一般には、組換えタンパク質の抽出を増強し、かつ生来的な種子タンパク質の抽出を最小限にするために、特定のｐＨで水性緩衝液の中に行われる。続くタンパク質の濃縮または精製を次に続けることができる。

本発明の治療剤は、動物におけるインビボ使用に先立って、所望の治療活性または予防活性についてインビトロで試験することができる。例えば、特定の治療剤の投与が指示されるかどうかを判定するために使用することができるインビトロアッセイには、細胞株からの適切な細胞、または特定の疾患もしくは障害を有する対象から培養される細胞が治療剤に曝される、あるいはそうでない場合にはそのような細胞に治療剤が投与され、細胞に対する治療剤の効果が観察されるインビトロ細胞培養アッセイが含まれる。

代替において、治療剤は、治療剤を、感染性疾患媒介者による感染に対して感受性があり、しかし感染性疾患媒介者には感染していない細胞（対象から培養される細胞、または培養細胞株から培養される細胞のどちらか）に接触させ、当該細胞を感染性疾患媒介者に曝し、その後、治療剤と接触させられる細胞の感染率が、治療剤と接触していない細胞の感染率よりも低かったかどうかを判定することによってアッセイされ得る。感染性疾患媒介者による細胞の感染が、どのような方法であれこの技術分野で知られている方法によってアッセイされ得る。

加えて、治療剤は、抗体が向けられる分子のレベルを動物モデルまたはヒト対象において、治療前、治療期間中または治療後に好適な時間間隔で測定することによって評価され得る。どのような変化であれ当該分子の量における変化、または当該分子の量における変化の非存在を特定し、対象に対する処置の効果と相関させることができる。当該分子のレベルは、どのような方法であれこの技術分野で知られている方法によって求めることができる。

下記は、本発明の範囲を限定することを意図する範囲内で例示として提供される。本明細書中で引用されるすべての参考文献が参照によって本明細書中に組み込まれる。

本発明の様々な実施形態には下記が含まれる：
１．コロナウイルス導入の影響からの受動免疫防御を動物に提供する方法であって、
分娩前の前記動物に、コロナウイルスのスパイク（Ｓ１）タンパク質を含む植物または植物産物の組成物を投与すること
を含む方法。
２．前記コロナウイルス導入が経口投与を介してである、請求項１に記載の方法。
３．前記コロナウイルスがＰＥＤＶである、請求項１に記載の方法。
４．前記Ｓタンパク質が別のタンパク質に融合される、請求項１に記載の方法。
５．前記コロナウイルスＰＥＤＶタンパク質が、前記植物の種子において少なくとも１０ｍｇ／ｋｇのレベルで発現される、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号２１もしくは配列番号２２、または配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号２１もしくは配列番号２２に対する少なくとも９０％の同一性を有する配列、または前記Ｓ１タンパク質の機能的フラグメントを含み；その結果、炎症性サイトカインレベルが、感染前において炎症を軽減させるように変化する、請求項３に記載の方法。
６．前記動物が雌親豚である、請求項１に記載の方法。
７．前記投与には、分娩前のブースターが含まれる、請求項１に記載の方法。
８．前記雌親豚がその子豚に保護を伝える、請求項６に記載の方法。
９．前記投与が３用量である、請求項１に記載の方法。
１０．前記植物または植物産物が、前記Ｓタンパク質を発現する種子である、請求項１に記載の方法。
１１．前記種子が動物飼料とともに投与される、請求項８に記載の方法。
１２．前記組成物が、サイトカインレベルを前記動物において変化させることによってサイトカイン炎症応答を低下させる、請求項１に記載の方法。
１３．変化させられる前記サイトカインレベルには、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮガンマ、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ１８またはＴＮＦアルファのうちの１つまたはそれを超えるものが含まれる、請求項１に記載の方法。
１４．前記サイトカインレベルが、ＧＮ－ＣＳＦ、ＩＦＮガンマおよび／またはＴＮＦアルファのうちの１つまたはそれを超えるものである、請求項１３に記載の方法。
１５．炎症性サイトカイン応答の低減を、それを必要とする動物においてもたらす方法であって、
前記動物に、コロナウイルススパイクタンパク質が含まれる植物または植物産物の免疫調節量を投与すること
を含む方法。
１６．前記Ｓタンパク質が別のタンパク質に融合される、請求項１５に記載の方法。
１７．前記植物または植物生産物が、ワクチンとの組み合わせでの免疫学的な調節用ブースター組成物として投与される、請求項１５に記載の方法。
１８．前記スパイクタンパク質が植物によって産生される、または植物の一部として投与される、請求項１５に記載の方法。
１９．前記ブースター組成物が経口投与される、請求項１５に記載の方法。
２０．前記スパイクタンパク質ブースター組成物が、抗体保護を誘導しないであろうレベルで投与される、請求項１５に記載の方法。
２１．前記スパイクタンパク質ブースター組成物が、前記サイトカイン炎症応答を、サイトカインレベルを変化させることによって前記動物において軽減させる、請求項１７に記載の方法。
２２．前記サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮガンマ、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ１８またはＴＮＦアルファのうちの１つまたはそれを超えるものであり、前記Ｓタンパク質の投与の後で変化する、請求項１５に記載の方法。
２３．前記サイトカインレベルが、ＧＮ－ＣＳＦ、ＩＦＮガンマおよび／またはＴＮＦアルファのうちの１つまたはそれを超えるものである、請求項２２に記載の方法。
２４．炎症性サイトカイン応答を低下させる免疫調節組成物であって、
コロナウイルスＳタンパク質を発現するように改変されている植物産生あるいは植物または植物産物
を含む免疫調節組成物。
２５．前記Ｓタンパク質が植物材料の一部分において産生され、および／または植物材料の一部分として存在する、請求項２４に記載の組成物。
２６．前記Ｓタンパク質がＰＥＤＶ由来である、請求項２４に記載の組成物。
２７．前記Ｓタンパク質が別のタンパク質に融合される、請求項２４に記載の組成物。
２８．前記コロナウイルスＰＥＤＶタンパク質が、前記植物の種子において少なくとも１０ｍｇ／ｋｇのレベルで発現される、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号２１もしくは配列番号２２、または配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号２１もしくは配列番号２２に対する少なくとも９０％の同一性を有する配列、または前記Ｓ１タンパク質の機能的フラグメントを含み、その結果、前記炎症性サイトカイン応答が感染前において軽減される、請求項２６に記載の組成物。
２９．乳飲み中の生まれたばかりの動物を免疫学的に保護する方法であって、
コロナウイルスＳタンパク質を含む植物または植物産物を、受動免疫が母親の乳汁から前記生まれたばかりの動物に移行されるように母親に投与すること
を含む方法。
３０．前記動物が母豚／未経産豚である、請求項２９に記載の方法。
３１．前記コロナウイルス導入が経口投与によってである、請求項２９に記載の方法。
３２．前記コロナウイルスがＰＥＤＶである、請求項２９に記載の方法。
３３．前記Ｓタンパク質が別のタンパク質に融合される、請求項２９に記載の方法。
３４．前記コロナウイルスＰＥＤＶタンパク質が、前記植物の種子において少なくとも１０ｍｇ／ｋｇのレベルで発現される、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号２１もしくは配列番号２２、または配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号２１もしくは配列番号２２に対する少なくとも９０％の同一性を有する配列、または前記Ｓ１タンパク質の機能的フラグメントを含み；その結果、炎症性サイトカインレベルが感染前において低減される、請求項３２に記載の方法。
３５．サイトカイン誘導炎症性応答を乳飲み動物において低減させる方法であって、
コロナウイルスＳタンパク質を含む植物または植物産物を、受動免疫が母親の乳汁から前記生まれたばかりの動物に移行されるように母親に投与すること
を含む方法。
３６．前記動物が母豚／未経産豚である、請求項３５に記載の方法。
３７．前記動物が母豚／未経産豚である、請求項３５に記載の方法。
３８．前記コロナウイルス導入が経口投与によってである、請求項３５に記載の方法。
３９．前記コロナウイルスがＰＥＤＶである、請求項３５に記載の方法。
４０．前記Ｓタンパク質が別のタンパク質に融合される、請求項３５に記載の方法。
４１．前記コロナウイルスＰＥＤＶタンパク質が、前記植物の種子において少なくとも１０ｍｇ／ｋｇのレベルで発現される、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号２１もしくは配列番号２２、または配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号２１もしくは配列番号２２に対する少なくとも９０％の同一性を有する配列、または前記Ｓ１タンパク質の機能的フラグメントを含み；その結果、炎症性サイトカインレベルが感染前において低減される、請求項３９に記載の方法。

実施例１
スパイクタンパク質は、その多くの中和エピトープ、および可能性のあるワクチン候補物のために主要な免疫原である。スパイクタンパク質の異なる部分に基づく数多くのプロトタイプ候補物が、有望な免疫応答を動物研究において示している（Ｏｈら、２０１４；Ｍａｋａｄｉｙａら、２０１６）。これらには、Ｓ１成分に基づく免疫原（Ｏｈら、２０１４）（Ｍａｋａｄｉｙａら、２０１６）、Ｓ２成分に基づく免疫原（Ｏｋｄａら、２０１７）、および中和エピトープを含有するとして特定されているコア中和エピトープまたはＣＯＥとして知られているより小さい一部（アミノ酸４９９～６３８）に基づく免疫原（Ｃｈａｎｇ他、２００２）が含まれる。しかしながら、プロトタイプワクチンは、いくつかの組換え系（Ｍａｋａｄｉｙａら、２０１６；Ｐｉａｏ他、２０１６）では高レベルで産生させることがこれまで困難であったＳタンパク質の精製を必要とする（Ｖａｎ ＮｏｉおよびＣｈｕｎｇ、２０１７）。加えて、非経口送達ワクチンは商用操作については労働集約的であり、また、粘膜を越える伝播に対するより良好な保護のために要求されると考えられる強い粘膜応答をもたらしそうにない。

経口投与ならば、注射の必要性がなくなるであろうし、また、ＰＥＤＶに対する広範囲にわたるワクチン接種が非常に促進されるであろう。ＰＥＤＶのための経口免疫化についての前例には、ＰＥＤＶのＳタンパク質またはＮタンパク質をプロバイオティクス（例えば、ラクトバチルス属など）において発現させる多数の研究が含まれる。これらの産物の経口送達により、免疫応答および保護が抗原投与時に誘発される（Ｄｉ－ｑｉｕら、２０１２；Ｈｏｕら、２０１８）。ＰＥＤＶのためのＳタンパク質がこれまでに、タバコ、イネおよび他の植物において産生されており、このタンパク質により、免疫応答が、ウイルスに対する中和活性（Ｋａｎｇら、２００５）とともに誘発される（Ｂａｅら、２００３；Ｈｕｙら、２０１２；ＨｕｙおよびＫｉｍ、２０１９）。理想的には、この保護は、抗原が、産生時、貯蔵時および輸送時に安定であり、抗原を他の毒性化合物から精製することを必要としない系で達成され得るであろう。

トウモロコシ穀粒が、組換えタンパク質の高レベルの蓄積、および消化管での分解からタンパク質を保護するためのタンパク質のバイオカプセル化をもたらすので、経口ワクチンのための好ましい選択肢として出現している。トウモロコシ系はまた、家畜のための実用的な低コスト経口ワクチンを作出することを容易にする多くの固有の特性を有する：例えば、活性を穀粒において何年間にわたって保持し、これにより、長期間の貯蔵、周囲温度での輸送を可能にする組換えタンパク質の安定性、毎回大量の加工を収穫時に直ちに行うことが要求されるよりはむしろ、穀粒が思いのままに加工されること、および穀粒は飼料の主たる構成成分であるので、穀粒により、送達のための安全かつ非希釈のマトリックスが提供されることなど。

別のコロナウイルスからのスパイクタンパク質、すなわち、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）由来のスパイクタンパク質を用いた初期の研究では、経口送達された、トウモロコシに基づく候補ワクチンが、豚における抗原投与のときに免疫応答を誘発し、保護をもたらしたことが明らかにされた。トウモロコシに基づく他のワクチンもまた、動物治験における有効性（Ｈａｙｄｅｎら、２０１５）、およびヒト臨床治験における安全性を示している。同様に、免疫応答をマウスにおいて誘発した、トウモロコシにおけるＰＥＤＶスパイクタンパク質ＣＯＥの発現が１つ報告されている（Ｍａｎら、２０１４）。本発明者らの以前の研究は、抗原の熱安定的な低コスト製造供給について可能にするであろうトウモロコシにおけるＳ抗原の高発現を明らかにした。加えて、豚にトウモロコシ産生Ｓタンパク質が経口投与されたとき、高レベルの血清中和抗体がウイルスによる抗原投与の後で認められた。しかしながら、疾患症状は乳飲み豚においてのみ急性であるため、ウイルスからの保護を判定することができなかった。本報告において、本発明者らは、ワクチン候補物を無感作の母豚／未経産豚に投与し、分娩後、それらの生まれたばかりの豚を、雌親豚が受動免疫化を生まれたばかりの豚に与えることができるであろうかを判定するためにウイルスにより抗原投与した。

材料および方法
トウモロコシ産生Ｓ抗原の産生。実施例１
スパイク（Ｓ１）ヌクレオチド配列を、下記および図１において概説されるような構築物に導入した。Ｓ１は、図１に示される２１５４ｂｐのヌクレオチド配列を示す。Ｓ１（ｅｘｔ）は２３０７ｂｐの配列（配列番号１）を示す。これらの配列によってコードされるタンパク質が配列番号２である。ＢＡＡＳＳはオオムギのアルファアミラーゼシグナル配列（配列番号３、コードされるポリペプチドが配列番号４である）を示し、ＰｉｎＩＩはジャガイモのプロテイナーゼ阻害剤のポリアデニル化配列を示し、ＭはＰＥＤＶのマトリックスタンパク質コードヌクレオチド配列（配列番号７、コードされるポリペプチドが配列番号８である）を示し、ＮはＰＥＤＶのＮタンパク質（配列番号１０、コードされるポリペプチドが配列番号１１である）を示し、ＤＲ１３はウイルスの韓国株を示し（配列番号２５はヌクレオチドであり、コードされたポリペプチドが配列番号９である）、ＣＯＥは、免疫応答に関与するＳ１タンパク質の小さい一部を示し、配列が下記に示される（配列番号１２）。ＤＣｐｅｐは樹状突起結合ペプチドを示す。１つの実施形態により、スパイクポリペプチドが樹状細胞標的化配列（ＤＣ３）（配列番号１３）および／または熱不安定エンテロトキシンＢサブユニット（ＬｔＢ）ペプチド（配列番号１４、コードされるポリペプチドが配列番号１５である）に融合されることが提供される。樹状細胞は、Ｔ細胞の活性化に関与する抗原提示細胞である。様々なポリペプチドが樹状細胞に仕向けられ得る。Ｍｏｈａｍａｄｚａｄｅｈら（２００９）、“Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｌｅｔｈａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６、４３３１－４３３６を参照のこと。

プロモーターｐｒ２５に対する言及はトウモロコシのグロブリン－１遺伝子（配列番号１６）を示し、ｐｒ３９はトウモロコシの２７ｋＤガンマ－ゼイン遺伝子プロモーター（配列番号１７）を示し、ｐｒ４４は、プロモーターの一部の２コピーが追加されるｐｒ２５グロブリン－１プロモーター（配列番号１８）を示す。

すべてのフラグメントがトウモロコシのコドン使用頻度のために最適化され、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔによって合成された。全長コード配列のフラグメントを、ＢＡＡＳＳシグナル配列を有する米国株またはＤＲ１３株との構築物のために、同様にまたＣＯＥ－ＤＣペプチド構築物のために合成した。液胞シグナル配列またはＫＤＥＬシグナル配列（配列番号１９）を有する構築物を、部分フラグメントの合成、ならびにＢＡＡＳＳ全長Ｓ１の合成フラグメントと交換するためにＮｃｏＩ、ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を使用する全コード領域の再構築によって調製した。部分フラグメントを、Ｓ１ Ｅｘｔのためにもまた注文し、全コード領域をＨｉｎｄＩＩＩ＋ＰａｃＩによる制限消化によって再構築するために使用した。ｐＳＢ１１ベクターへのクローニングがＮｃｏＩおよびＰａｃＩの制限部位によってであった。完全なプロモーター＋コード領域転写ユニットを二重に有する構築物を、ＡｓｃＩおよびＭｌｕＩによる消化、ならびにこの転写ユニットの第２のコピー体の連結によって調製した。

ＰＥＤＶ配列全体が配列番号２１であり、コードされるスパイクタンパク質が配列番号２２である。
Ｓタンパク質は、他の宿主において発現させることが極めて困難であり、そのため、本発明者らは、トウモロコシ穀粒において何が予想されるかは分からなかった。アポプラスト標的化配列を有する構築物ＰＤＡにより、タンパク質の不良な発現レベルがもたらされ、一方で、ＥＲ標的化配列を有するＰＤＣ構築物により、良好な発現レベルが明らかにされたことは、驚くべきことであった。以前に記載されるようなＳタンパク質（ＰＤＣ）を含有する遺伝子組換えトウモロコシを、研究のために使用された穀粒を得るために成長させた。穀粒は、本発明者らのカスタマイズされた胚芽分画装置を使用して胚芽について富化され、加工された穀粒を１２％未満の水分含有量にまで乾燥させ、その後、Ｇｌｅｎ－Ｍｉｌｌ粉砕機に通して、それによって、材料の８０％超が２０メッシュのふるいを通過することができるように粗い（ｃｏｕｒｓｅ）トウモロコシ粉を得た。

ウエスタンブロット分析。穀粒のサンプルを抜き取り、ウエスタンゲルを、Ｓタンパク質のレベルを求めるために実施した。タンパク質を、１×ＰＢＳ＋１％ＳＤＳを用いて粉砕種子から抽出し、４－１２％ビス－トリスゲル（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）に負荷し、ｉＢｌｏｔによってＰＤＶＦメンブランに転写した。ブロットを、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙの特注のウサギ抗ＰＥＤＶ Ｓ１において１：２０００の希釈度で一晩インキュベーションし、１：２０００の希釈度での抗ウサギ－アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１１１－０５５－００３）およびＢＣＩＰ－ＮＢＴ液体基質（Ｓｉｇｍａ ＃Ｂ１９１１）により発色させた。Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔによって合成された１０ｎｇのＣＯＥ標準物を陽性対照として負荷し、Ｓ１の濃度（ｃｏｎｃｅｒｔａｔｉｏｎ）を、この標準物を使用して目視により推定した。

動物治験のための材料の調製。動物に１日で与えられるトウモロコシ粉を個別袋に入れた（１ｋｇ）。非遺伝子組換え商品トウモロコシを対照のために使用し、また、所定の用量を与えるために必要とされるときにはブレンドするために使用した。用量を、ＣＯＥペプチドを標準物として使用して１０ｍｇのＳ抗原を含有するように計算した。袋を文字および色のコードにより標識し、それぞれの処置が何からなるかに関しての手がかりを知らない動物治験の管理者に与えた。

動物。ＰＩＣ１０５０雌親豚をＰＩＣ３３７未去勢雄豚由来の精液で妊娠させた（両方が白色交雑種である）。ＰＩＣ１０５０は大型の白色／ヨークシャー市販交配種であり、ＰＩＣ３３７は市販ヨークシャー交配種未去勢雄豚／精液である。この試験で使用されるすべての母豚／未経産豚が、ＰＥＤＶを有していないと判定された。試験施設への送達に先立って、すべての豚が、所与用量のＰＣＶ２ワクチン（Ｃｉｒｃｏｆｌｅｘ（登録商標））、抗生物質（０．３ｍＬのＥｘｃｅｄｅ（登録商標））、および所与用量のビタミンＥ（Ｖｉｔａｌ Ｅ（登録商標））を受けた。すべての豚が、ＢＬ－２条件下で実施されるヘパフィルターろ過の隔離室に収容された。それぞれの動物に、当該動物を一義的に特定するための２つの耳タグを与えた。動物を体重測定し、動物に、（Ｅｘｃｅｌ乱数発生ジェネレーターによる）乱数を割り当て、その後、動物を推定分娩日によって並び替えた。その後、雌親豚に、特定の群を昇順によって割り当て、雌親豚を分娩ブロックにおける処置群に割り当てた。おりが、プラスチック製のスラット付き床材を備える一段高くなったプラスチックチューブ（４フィート×５フィート）であった。

動物治験
１つのおりあたり４匹の豚（合計で５つのおり）を使用した。飼料は、豚の年齢／サイズについて適切である市販タイプであった（Ｐｕｒｉｎａ（登録商標）銘柄）。飼料を、６穴のプラスチック製育成フィーダーを介して自由に取れるように与えた。水を、乳首が１つの給水器を介して自由に取れるように与えた。水を現場の農業井戸から調達した。光周期をタイマーによって制御し、１５時間の明期および９時間の暗期を与えた。室温を高／低温度計（６８°Ｆ～８３°Ｆの範囲）により毎日モニターした。それぞれの処置群が４匹の動物からなった。動物を処置群によって分けた（４匹の動物／処置群）。処置群が、表１に示される下記からなった。

すべての豚を全身健康状態について毎日観察した。糞便、血液および乳汁のサンプルを採取し、分析が実施されるまで凍結した。

処置
１つの処置が、市販の死滅ウイルスワクチン（Ｚｏｅｔｉｓ）が筋肉内投与される豚からなった。第２の処置が、上記で記載されるような材料（１ｋｇのトウモロコシ粉）をそれぞれの投与について３日間連続して経口投与することからなった。３用量の投与を、馴化後６日、初回投与後１ヶ月、および分娩前１０日で行った。第３の群には、非形質転換の粉砕トウモロコシ胚芽を同じスケジュールに従って投与した。動物を４時間絶食させ、その後、トウモロコシ材料が与えられ、その通常食に投与後１時間で戻された。それぞれの動物が手による給餌を受け、与えられたトウモロコシ材料の全量を食べ尽くした。

分娩時に、それぞれの母豚をその子豚とともに別のおりに入れ、それぞれの処置群を別部屋に収容した。すべての動物を全身健康状態における変化について毎日観察した。便、血清および乳汁のサンプルを、表２に示される日に採取し、凍結保存した。候補物の投与およびサンプル収集が同日であるときには、すべてのサンプルを注射材料または経口材料の投与に先立って採取した。血液を集め、凝固させ、血清を遠心分離し、バイアルに入れた。

抗原投与
分娩したとき、それぞれの母豚を、研究の残りのためにその生まれたばかりのブタとともに別々に飼育した。下痢症状および体重に特に留意する日ごとの観察を２日～３日ごとに行った。すべての子豚を、分娩日（ＤＯＦ）、ならびに抗原投与後３日目、６日目、９日目および１１日目（ＤＰＣ）に体重測定した。高い同腹子数の母豚を選別して、どの母豚も、研究の残りのためには１４匹を超える子豚を有しないようにした。抗原投与のためのウイルスを、アイオワ州立大学のＪｉａｎｑｉａｎｇ Ｚｈａｎｇ博士から得た（ＩＳＵバッチ番号ＰＥＤＶ ＵＳＡ／ＮＣ／４９４６９／２０１３、１０^∧３ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で）。ウイルス（１０ｍｌ）を、子豚が全量を受け取ることを確実にするために、ＩＧによってそれぞれの子豚に分娩後３日～５日で与えた。

診断学
ウイルス力価が、実験開始前の母豚に関してウイルスを検出して、母豚がウイルスを有していないことを確認するために、ＰＣＲ（ＰＥＤＶ／ＰＤＣｏＶ／ＴＧＥＣ多重アッセイおよびＮＡＢアッセイ（ＰＥＤＶ ＨＴＮＴアッセイ））を使用して、ＩＳＵ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで評価された。血清サンプルを投与日およびその２週間後に集めた。乳汁サンプルを分娩日に、同様にまた、その後のいくつかの時点で集めた。血清および乳汁サンプルについての中和アッセイが、サウスダコタ州立大学のＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって実施された。

統計学
分散の混合効果分析（ｍｉｘｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）を使用して、データを、目的の応答変数としての最終力価ならびに因子としての処置群および体重群を用いて分析した。体重群を、動物体重に起因する力価におけるどのような変動も説明するためにランダム効果として分析に含めた。処置群における差を、５％の有意水準を用いたテューキーのＨＳＤ手順を使用して比較した。データを、２を底とする対数スケールで分析した。力価を対数スケールで比較することにより、処置群間の有意差が検出される（ｐ値＝０．０５）。群間の差を、テューキーＨＳＤ法を使用して判定した。

結果
乳飲み子豚に対するウイルス抗原投与。
抗原投与日（ＤＯＣ）における処置群あたりの子豚の平均体重が表１に示される。処置１における子豚のわずかにより大きい体重は、それ以外の群と比較して同腹子における数がより少ないためである可能性が最も高い（約９対約１２）。

抗原投与日（ＤＯＣ）から開始して、それぞれのブタを、脱水、下痢および全身健康状態について毎日観察した。観察結果を、表３における手引きを使用して記録した。その後、これらの判定基準を使用して、スコアおよび図２に示される結果を加えることによって全身健康状態指数を計算した。

死亡率が、全体的には対照母豚で育つ子豚については高く、この結果、子豚生存率が、図３に示されるような最も意味のある測定値であることがもたらされた。結果は、選択されるウイルスレベルが、ワクチン接種されていない雌親豚で育った子豚の９０％超が抗原投与後に死亡したという点で非常に効果的であったことを示す。対照的に、子豚の５３％が、経口ワクチン候補物が投与される雌親豚で育ったときには抗原投与を生き延びた。非経口市販ワクチンは中間的レベルの保護（３７％の生存）をもたらした。

データを、応答としての生存／死亡、予測因子としての処置および抗原投与重量、ならびにランダム効果としての母豚を用いるロジスティック混合モデル分析を使用して統計学的に分析した。分析を、主にはＲバージョン４．０．４におけるｌｍｅ４パッケージのｇｌｍｅｒコマンドを使用して行った。他のパッケージ、例えば、ｍｕｌｔｃｏｍｐおよびｅｍｍｅａｎｓなどを、モデル推定値をさらに分析するために使用した。９０％の全体的信頼度でのテューキーのＨＳＤ手順を、処置を区別するために使用した。

体重は、腸疾患の重症度に影響を与えることが知られており、そのため、体重が考慮に入れられた。特に、処置１の子豚における豚は平均よりも有意に重く、モデルは、生存の非常に有意な予測因子であった０日目の体重について調整される。モデルでは、それぞれの処置の生存率が、あたかも処置がすべて、同じ平均体重を有したかのように調整される。その結果、処置１についてのより高い生存率の一部が現時点では、（適切には）処置効果よりもむしろ体重効果に起因している。体重効果が説明されると、処置１の効果はより低いものになる。このことが、０日目の体重を含まないモデルを実行することによって確認された。表４の結果における値を、３つの異なるコンピュータプログラム（Ｒ、ＳＡＳ、およびＳＰＳＳ）を使用して、分析のために最初に使用されるＲパッケージには誤りがなかったことを確認するために検証した。値がすべて、プログラムによって使用される異なる推定アルゴリズムに起因するほんのごく小さい違いを伴って一致する。異なる文字は処置間の有意差を示している。

要約すると、０日目における子豚の体重、および処置群は、実験終了までの生存の有意な予測因子である（ｐ＜０．０００１およびｐ＝０．００３６）。経口処置群は、９０％の全体的信頼度を伴って対照よりも有意に高い生存率を有した唯一の群であった。

保護の相関物
特定のバイオマーカーを病原体に対する保護と相関させることが可能であることが、作用機構を理解することを助けるための有用なアプローチであると判明した。したがって、本発明者らは、母豚からの血清サンプル、初乳サンプルおよび乳汁サンプルを調べることによってこのことを調査し、このことを保護と相関させることを試みた。

図４には、異なる群の乳汁ＮＡＢおよび血清ＮＡＢについての平均値が例示される。図は、注射ワクチンを受けた母豚が血清ＮＡＢについて最高力価を有したことを示す。より低いレベルのＮＡＢが経口投与群の血清において検出された。注射群および経口群の両方が、より低いレベルのＮＡＢを乳汁において有し、一方で、対照群は血清および乳汁の両方について陰性であった。

ＮＡＢに加えて、サイトカインレベルを様々な処置において分析した。サンプルが、１３種の異なるサイトカインについてｐｇ／ｍｌ単位でのサイトカインの値を報告するＥｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって分析され、平均値を計算した。その後、平均値を使用して、結果を対照に対して正規化した。示される対照のパーセントが下記において、乳汁については図４に示され、血清については図５に示される。

考察
生まれたばかりの子豚はＰＥＤＶに最も感染しやすく、本研究では、ウイルス抗原投与後、死亡率が対照群では９０％であったことが明らかにされた。経口送達処置はウイルスからの保護をもたらし、このことから、これが、有効なワクチンを豚に送達するための効果的な様式であり得ることが明らかにされた。ＮＡＢを、保護をもたらすことを部分的に担うかもしれない母豚の血清および乳汁の両方で検出することができた。しかしながら、予想外であったが、Ｓタンパク質を非経口的に、または経口的にどちらにせよ受けた母豚は、ほとんどのサイトカインの低下したレベルを有した。サイトカインのこの低下したレベルが、乳汁を介して、乳飲み子豚に伝わる。コロナウイルスは、高レベルのサイトカインが、死に至る最も重症の症状に関連すると考えられる「サイトカインストーム」を引き起こすことが知られているので。ほとんどのサイトカインのこの低下したレベルが、著しい役割を保護において果たしているかもしれない（この傾向と一致して、ＩＮＦレベルが増大したが、このことは、軽減された非特異的反応のためには望ましい）。この現象が、他のコロナウイルスからの他のＳタンパク質についても同様に起こりそうである。さらには、サイトカインレベルにおける低下は、サイトカインレベルが著しい役割を果たす他の疾患から動物を保護することを助けるかもしれない。

実施例２
試験された６つの群。図７は、異なる群の平均生存率を示す。略号一覧が右側に示される。ブースター投与は、初回投与が商用ワクチンであり、追加免疫が本発明者らの経口候補物であったＣである。Ｂ群は、追加免疫が初回投与後になかったときである。結果は、経口追加免疫することが、注射によって追加免疫するのと同じくらいに効果的であったことを示唆する。

Ｆ群（ＨＯ）は、高い経口用量（５倍の低用量）を示す。この場合、生存率が対照レベルである。

図８は、乳汁におけるサイトカインのレベルを６つすべての処置群について示す。Ｆ群は、より高いレベルのＴＮＦを示すので、特に興味深く、また、Ｄ群におけるレベルと比較して、本発明らの低い経口用量の経口処置である。

実施例３
異なる研究において、それぞれが５匹の母豚の３つの群に、対照、高用量ＰＥＤＶワクチンまたは低用量ＰＥＤＶワクチンのいずれかを投与した。３用量の投与が、分娩の９週間前、５週間前および２週間前であった。３つのサイトカイン（ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦα）を、分娩日、抗原投与日（抗原投与後Ｄ０）、および抗原投与後３日目（抗原投与後Ｄ３）に測定した。

下記の表は、異なるサイトカインについて得られたデータを示す。

Claims (28)

1. コロナウイルス導入の影響からの受動免疫防御を動物に提供する方法であって、
   分娩前の前記動物に、コロナウイルスのスパイク（Ｓ１）タンパク質を含む植物または植物産物の組成物を投与すること
   を含む方法。
2. 前記コロナウイルス導入が経口投与を介してである、請求項１に記載の方法。
3. 前記コロナウイルスがＰＥＤＶである、請求項１に記載の方法。
4. 前記Ｓタンパク質が別のタンパク質に融合される、請求項１に記載の方法。
5. 前記コロナウイルスＰＥＤＶタンパク質が、前記植物の種子において少なくとも１０ｍｇ／ｋｇのレベルで発現される、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号２１もしくは配列番号２２、または配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号２１もしくは配列番号２２に対する少なくとも９０％の同一性を有する配列、または前記Ｓ１タンパク質の機能的フラグメントを含み；その結果、炎症性サイトカインレベルが、感染前において炎症を軽減させるように変化する、請求項３に記載の方法。
6. 前記動物が雌親豚である、請求項１に記載の方法。
7. 前記投与には、分娩前のブースターが含まれる、請求項１に記載の方法。
8. 前記雌親豚がその子豚に保護を伝える、請求項６に記載の方法。
9. 前記投与が３用量である、請求項１に記載の方法。
10. 前記植物または植物産物が、前記Ｓタンパク質を発現する種子である、請求項１に記載の方法。
11. 前記種子が動物飼料とともに投与される、請求項８に記載の方法。
12. 前記組成物が、サイトカインレベルを前記動物において変化させることによってサイトカイン炎症応答を低下させる、請求項１に記載の方法。
13. 変化させられる前記サイトカインレベルには、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮガンマ、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ１８またはＴＮＦアルファのうちの１つまたはそれを超えるものが含まれる、請求項１に記載の方法。
14. 前記サイトカインレベルが、ＧＮ－ＣＳＦ、ＩＦＮガンマおよび／またはＴＮＦアルファのうちの１つまたはそれを超えるものである、請求項１３に記載の方法。
15. 炎症性サイトカイン応答の低減を、それを必要とする動物においてもたらす方法であって、
    前記動物に、コロナウイルススパイクタンパク質が含まれる植物または植物産物の免疫調節量を投与すること
    を含む方法。
16. 前記Ｓタンパク質が別のタンパク質に融合される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記植物または植物生産物が、ワクチンとの組み合わせでの免疫学的な調節用ブースター組成物として投与される、請求項１５に記載の方法。
18. 前記スパイクタンパク質が植物によって産生される、または植物の一部として投与される、請求項１５に記載の方法。
19. 前記ブースター組成物が経口投与される、請求項１５に記載の方法。
20. 前記スパイクタンパク質ブースター組成物が、抗体保護を誘導しないであろうレベルで投与される、請求項１５に記載の方法。
21. 前記スパイクタンパク質ブースター組成物が、前記サイトカイン炎症応答を、サイトカインレベルを変化させることによって前記動物において軽減させる、請求項１７に記載の方法。
22. 前記サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮガンマ、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ１８またはＴＮＦアルファのうちの１つまたはそれを超えるものであり、前記Ｓタンパク質の投与の後で変化する、請求項１５に記載の方法。
23. 前記サイトカインレベルが、ＧＮ－ＣＳＦ、ＩＦＮガンマおよび／またはＴＮＦアルファのうちの１つまたはそれを超えるものである、請求項２２に記載の方法。
24. 炎症性サイトカイン応答を低下させる免疫調節組成物であって、
    コロナウイルスＳタンパク質を発現するように改変されている植物産生あるいは植物または植物産物
    を含む免疫調節組成物。
25. 前記Ｓタンパク質が植物材料の一部分において産生され、および／または植物材料の一部分として存在する、請求項２４に記載の組成物。
26. 前記Ｓタンパク質がＰＥＤＶ由来である、請求項２４に記載の組成物。
27. 前記Ｓタンパク質が別のタンパク質に融合される、請求項２４に記載の組成物。
28. 前記コロナウイルスＰＥＤＶタンパク質が、前記植物の種子において少なくとも１０ｍｇ／ｋｇのレベルで発現される、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号２１もしくは配列番号２２、または配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号２１もしくは配列番号２２に対する少なくとも９０％の同一性を有する配列、または前記Ｓ１タンパク質の機能的フラグメントを含み、その結果、前記炎症性サイトカイン応答が感染前において軽減される、請求項２６に記載の組成物。

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