JP2003533989A - ブタ生殖・呼吸症候群ウィルス（ｐｒｒｓｖ）の組換えポックスウィルスワクチン - Google Patents
ブタ生殖・呼吸症候群ウィルス（ｐｒｒｓｖ）の組換えポックスウィルスワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ブタ生殖・呼吸症候群ウィルスよる感染の治療および予防用組換えウィルス。
【解決手段】 ポックスウィルス、例えばブタ生殖・呼吸症候群ウィルスからの異種ＤＮＡを含む組換えアビポックスウィルスと、投与されたホストの動物に免疫応答を誘導する組換えアビポックスウィルスを含む免疫組成物と、本発明の免疫組成物をホストの動物に投与してブタ生殖・呼吸症候群ウィルスよる感染を治療および予防する方法。
Description
【０００１】
本発明は、組換えベクター、例えばポックスウィルスのようなウィルスと、そ
の製造方法および使用に関するものである。 本発明はさらに、ブタ生殖・呼吸症候群（Porcine Reproductive and Respira
tory Syndrome Virus（ＰＲＲＳＶ）ウィルスの遺伝子産物を発現するＡＬＶＡ
Ｃのような組換え体アビポックス（avipoxes）ウィルス、例えばＰＲＲＳＶのOR
F３と５、または５と6、または4と５、または、その組合せ、特に3、５および6
、または4、５および6の組み合わせを含み且つ発現するウィルスのような組換え
ベクター、例えばALVAC組換え体に関するものである。
の製造方法および使用に関するものである。 本発明はさらに、ブタ生殖・呼吸症候群（Porcine Reproductive and Respira
tory Syndrome Virus（ＰＲＲＳＶ）ウィルスの遺伝子産物を発現するＡＬＶＡ
Ｃのような組換え体アビポックス（avipoxes）ウィルス、例えばＰＲＲＳＶのOR
F３と５、または５と6、または4と５、または、その組合せ、特に3、５および6
、または4、５および6の組み合わせを含み且つ発現するウィルスのような組換え
ベクター、例えばALVAC組換え体に関するものである。
【０００２】
本発明はさらに、ＰＲＲＳＶ遺伝子産物に対する免疫応答を誘導する免疫学的
組成物またはワクチンに関するものである。 本発明はさらに、ＰＲＲＳＶによる感染に対する感染防御免疫を与える上記組
成物またはワクチンに関するものである。 本発明はさらに、上記の組換え体ベクターおよび組成物の製造方法と、その使
用に関するものである。
組成物またはワクチンに関するものである。 本発明はさらに、ＰＲＲＳＶによる感染に対する感染防御免疫を与える上記組
成物またはワクチンに関するものである。 本発明はさらに、上記の組換え体ベクターおよび組成物の製造方法と、その使
用に関するものである。
【０００３】
本願明細書では多くの文献を参照するが、引用した文献の詳細は特許請求の範
囲の前にまとめて記載し、および／または、最初に引用した個所に記載してある
。これらの文献の内容は本願明細書の一部を成す。また、各文献で引用し、また
、本出願で参照した各文献（以下、［引用文献］という）並びに各引用文献中で
参照された文献は本願明細書で引用したものとする。
囲の前にまとめて記載し、および／または、最初に引用した個所に記載してある
。これらの文献の内容は本願明細書の一部を成す。また、各文献で引用し、また
、本出願で参照した各文献（以下、［引用文献］という）並びに各引用文献中で
参照された文献は本願明細書で引用したものとする。
【０００４】
ブタ生殖・呼吸症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）はアルテリウイルス（artrivir
uses）と呼ばれ、エンベロープ付きポジティブストランドＲＮＡウィルスのファ
ミリーに属している。このファミリーに属する他のウィルスにはプロトタイプの
ウィルス、ウマ動脈炎ウィルス（ＥＡＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス
（ＬＤＶ）およびサル出血熱ウィルス（ＳＨＦＶ）がある(de Vries et al, 199
7 for review)。
uses）と呼ばれ、エンベロープ付きポジティブストランドＲＮＡウィルスのファ
ミリーに属している。このファミリーに属する他のウィルスにはプロトタイプの
ウィルス、ウマ動脈炎ウィルス（ＥＡＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス
（ＬＤＶ）およびサル出血熱ウィルス（ＳＨＦＶ）がある(de Vries et al, 199
7 for review)。
【０００５】
最近、コロナウイルス（coronaviridae）およびアルテリウイルス（Arterivir
idae）に共通する顕著な特徴が見付った結果、新しい目のニドウイルス（Nidovi
rales）が造られた(Pringle, 1996; Cavanagh, 1997; de Vries et al., 1997)
。アルテリウイルス群の４つの構成メンバはそのゲノム組織が類似し、そのタン
パク複製ステラテジーおよびアミノ酸配列が類似しているとともに，インビボお
よびインビトロでのマクロファージ感染に対する挙動も類似している(Conzelman
n et al., 1993; Meulenberg et al, 1993a)。
idae）に共通する顕著な特徴が見付った結果、新しい目のニドウイルス（Nidovi
rales）が造られた(Pringle, 1996; Cavanagh, 1997; de Vries et al., 1997)
。アルテリウイルス群の４つの構成メンバはそのゲノム組織が類似し、そのタン
パク複製ステラテジーおよびアミノ酸配列が類似しているとともに，インビボお
よびインビトロでのマクロファージ感染に対する挙動も類似している(Conzelman
n et al., 1993; Meulenberg et al, 1993a)。
【０００６】
ブタの新しいウィルス病は1987に北アメリカで検出され(Hill, 1990）、1990
にはヨーロッパでも検出された(Paton et al. 1991)。この疾患（ブタ生殖・呼
吸症候群（ＰＲＲＳ）、ブタ不妊症・呼吸症候群（SIRS）、ブタ流行性堕胎・呼
吸症候群（PEARS）、ブタのミステリー疾患等の種々の呼び名がある）は主とし
て生殖障害と全ての年のブタの呼吸疾患問題として特徴付けられる。その原因因
子として現在知られているＰＲＲＳウィルスはオランダでレイスタッド（Lelyst
ad）ウィルスとして最初に単離された(Wensvoort et al, 1991)。その後、Benfi
eld et al. (1992)およびCollins et al. (1992)ガ北アメリカデ関連したウィル
スを単離した(prototype strain ATCC VR2332）。ＰＲＲＳＶのヨーロッパ単離
物に対する多価抗血清特性を感染マクロファージでの免疫ペルオキシダーゼアッ
セイで北アメリカの単離物とクロス反応（cross-react）させ、また、その逆も
行われた（Wensvoort et ab、1992）が、その後の研究から、ヨーロッパと北ア
メリカの単離物は離れた大陸で独立して発展した２つの明確な遺伝子型を表すこ
とが示された(Mardassi et al., 1995:Meng et al., 1995a and b;Murtaugh et
al.,1995; Nelsen et al., 1999)。
にはヨーロッパでも検出された(Paton et al. 1991)。この疾患（ブタ生殖・呼
吸症候群（ＰＲＲＳ）、ブタ不妊症・呼吸症候群（SIRS）、ブタ流行性堕胎・呼
吸症候群（PEARS）、ブタのミステリー疾患等の種々の呼び名がある）は主とし
て生殖障害と全ての年のブタの呼吸疾患問題として特徴付けられる。その原因因
子として現在知られているＰＲＲＳウィルスはオランダでレイスタッド（Lelyst
ad）ウィルスとして最初に単離された(Wensvoort et al, 1991)。その後、Benfi
eld et al. (1992)およびCollins et al. (1992)ガ北アメリカデ関連したウィル
スを単離した(prototype strain ATCC VR2332）。ＰＲＲＳＶのヨーロッパ単離
物に対する多価抗血清特性を感染マクロファージでの免疫ペルオキシダーゼアッ
セイで北アメリカの単離物とクロス反応（cross-react）させ、また、その逆も
行われた（Wensvoort et ab、1992）が、その後の研究から、ヨーロッパと北ア
メリカの単離物は離れた大陸で独立して発展した２つの明確な遺伝子型を表すこ
とが示された(Mardassi et al., 1995:Meng et al., 1995a and b;Murtaugh et
al.,1995; Nelsen et al., 1999)。
【０００７】
こうして拡大、発展したウィルスによって起こる新しいブタの病気が世界的に
同時に発生しているということは、ブタの飼育および管理の変化がＰＲＲＳの発
展に大きく関与したということを示唆している（Nelsen et al., 1999)。 米国では現在ブタの40〜60％が感染していると見積もられ（Bautista et al.,
1993; Cho et al., 1993)、欧州でのある地域でのＰＲＲＳＶ感染は50％を超え
ると思われる(Albina, 1997)。この疾患の経済的影響は計算が難しく、各国で異
なる。米国では１年当たり、雌ブタ一頭当たり500ドルの損失になるという文献
がある（Paton、1995）。
同時に発生しているということは、ブタの飼育および管理の変化がＰＲＲＳの発
展に大きく関与したということを示唆している（Nelsen et al., 1999)。 米国では現在ブタの40〜60％が感染していると見積もられ（Bautista et al.,
1993; Cho et al., 1993)、欧州でのある地域でのＰＲＲＳＶ感染は50％を超え
ると思われる(Albina, 1997)。この疾患の経済的影響は計算が難しく、各国で異
なる。米国では１年当たり、雌ブタ一頭当たり500ドルの損失になるという文献
がある（Paton、1995）。
【０００８】
ＰＲＲＳ発生時には主として２つの臨床的徴候が見られる（なお、その臨床作
用は感染群で大きく異なり、多くの症例において感染は準臨床的なもので、許容
範囲内にある生産パラメータであると認識されている）。臨床的徴候は以下の２
つである： (1) 早産、後期堕胎、生まれた子豚が虚弱、死産およびミイラ化死産数の増加
で発現さる生殖的徴候(Done and Paton, 1995)。 (2) 呼吸器病の徴候。新生ブタでの強制呼吸、咳が最も重要な兆候。全ての年
齢で危険性があるが、症状は通常3週齢のブタで起こる。生殖障害とは対照的に
、臨床上顕著な呼吸器病は実験的に再生するのは困難である(Zirmnennann et al
. 1997)。
用は感染群で大きく異なり、多くの症例において感染は準臨床的なもので、許容
範囲内にある生産パラメータであると認識されている）。臨床的徴候は以下の２
つである： (1) 早産、後期堕胎、生まれた子豚が虚弱、死産およびミイラ化死産数の増加
で発現さる生殖的徴候(Done and Paton, 1995)。 (2) 呼吸器病の徴候。新生ブタでの強制呼吸、咳が最も重要な兆候。全ての年
齢で危険性があるが、症状は通常3週齢のブタで起こる。生殖障害とは対照的に
、臨床上顕著な呼吸器病は実験的に再生するのは困難である(Zirmnennann et al
. 1997)。
【０００９】
これらの臨床徴候には大きな違いがあり、ウィルス株毎に変化し(Halbur et a
l., 1995)、感染年齢および遺伝感受性の相違に影響され(Halbur et al., 1992
）、同時感染で変り(Galina et al., 1994）、ブタの密度、ブタの運動量、飼育
方法で変わり（Done et al, 1996）、ＰＲＲＳウィルス特異抗体の低レベルの存
在を含む免疫状態で変わる(Yoonetal., 1994）。
l., 1995)、感染年齢および遺伝感受性の相違に影響され(Halbur et al., 1992
）、同時感染で変り(Galina et al., 1994）、ブタの密度、ブタの運動量、飼育
方法で変わり（Done et al, 1996）、ＰＲＲＳウィルス特異抗体の低レベルの存
在を含む免疫状態で変わる(Yoonetal., 1994）。
【００１０】
発病学的には、ＰＲＲＳＶに起因する最も重大な変化は肺胞マクロファージの
激しい損傷であり、莫大な数が破壊される（Done and Paton, 1995; Rossow, 19
98）。肺臓およびリンパ節において多数の単核細胞のアポプトーシスが生じる原
因をＰＲＲＳＶ感染ブタ中を循環する肺胞マクロファージ数およびリンパ球およ
び単核細胞のドラマティックな減少で説明できるかもしれない (Sirinarurnitr
et al., 1998; Sur et al., 1998)。循環リンパ球の破壊および粘液線毛クリア
ランスの破壊とともに、免疫性を抑制してブタが二次感染し易くなる。ＰＲＲＳ
Ｖ感染に続く細菌性二次感染速度が速くなることは文献に記載されている（Gali
na et al., 1994; Done and Paton, 1995; Nakamine et al. 1998)。ＰＲＲＳＶ
感染は細菌性マイコプラズマ汚染によってさらに増加する(Thacker et al. 1999
)。また、その他の多くのウィルス感染がＰＲＲＳと関連することも分かってい
る(Carison, 1992; Brim et al, 1992; Halbur et al., 1993; Done et al., 19
96; Heinen et al, 1998)。
激しい損傷であり、莫大な数が破壊される（Done and Paton, 1995; Rossow, 19
98）。肺臓およびリンパ節において多数の単核細胞のアポプトーシスが生じる原
因をＰＲＲＳＶ感染ブタ中を循環する肺胞マクロファージ数およびリンパ球およ
び単核細胞のドラマティックな減少で説明できるかもしれない (Sirinarurnitr
et al., 1998; Sur et al., 1998)。循環リンパ球の破壊および粘液線毛クリア
ランスの破壊とともに、免疫性を抑制してブタが二次感染し易くなる。ＰＲＲＳ
Ｖ感染に続く細菌性二次感染速度が速くなることは文献に記載されている（Gali
na et al., 1994; Done and Paton, 1995; Nakamine et al. 1998)。ＰＲＲＳＶ
感染は細菌性マイコプラズマ汚染によってさらに増加する(Thacker et al. 1999
)。また、その他の多くのウィルス感染がＰＲＲＳと関連することも分かってい
る(Carison, 1992; Brim et al, 1992; Halbur et al., 1993; Done et al., 19
96; Heinen et al, 1998)。
【００１１】
伝染経路は３つあると思える。すなわち、(1) 鼻と鼻との接触または接近（D
one et al, 1996)、（2）エーロゾル（Le Potier al、1995）、（3）尿、糞およ
び精液による伝播。汚染精液による媒精経由の伝染は多くの文献に記載されてい
る(Yeager et al.,1993; Albina, 1997）。 アルテリウイルスのゲノム組織はde Vries et al. (1997)が記載している。こ
のゲノムのＲＮＡは単一ストランドの感染性ポリアデニル酸化され且つ5'がキャ
ップされている。ＰＲＲＳＶのゲノムは小さく、15,088塩基である。EAVおよびL
DVのゲノムは12,700塩基および14,200塩基で、それよりわずかに小さい。EAV、L
DVおよびＰＲＲＳＶのゲノムの完全な配列は入手可能である(Den Boon et al.,
1991; Godeny et al., 1993; Meulenberg et al. 1993a)。
one et al, 1996)、（2）エーロゾル（Le Potier al、1995）、（3）尿、糞およ
び精液による伝播。汚染精液による媒精経由の伝染は多くの文献に記載されてい
る(Yeager et al.,1993; Albina, 1997）。 アルテリウイルスのゲノム組織はde Vries et al. (1997)が記載している。こ
のゲノムのＲＮＡは単一ストランドの感染性ポリアデニル酸化され且つ5'がキャ
ップされている。ＰＲＲＳＶのゲノムは小さく、15,088塩基である。EAVおよびL
DVのゲノムは12,700塩基および14,200塩基で、それよりわずかに小さい。EAV、L
DVおよびＰＲＲＳＶのゲノムの完全な配列は入手可能である(Den Boon et al.,
1991; Godeny et al., 1993; Meulenberg et al. 1993a)。
【００１２】
このゲノムは８つの転写解読枠（ORF）を含み、各転写解読枠は、以下の順番
で、レプリカーゼ遺伝子（ORFIaおよびIb）、外膜タンパク（ORF2〜6）およびヌ
クレオカプシドタンパク（ORF７）をコードする(Meulenberg et al. 1993a)。OR
F２〜７は６つのサブゲノムＲＮＡから発現され、これは複製時に合成される(Me
ng et al., 1994, 1996)。これらのサブゲノムＲＮＡはネストされた3共終末セ
ットを形成し、ウィルスゲノムの5端から生じる共通リーダーを有する(Meulenbe
rg et al. 1993b)。このＲＮＡは構造的にはポリシストロン性であるが、翻訳は
上記セットの次の小さいＲＮＡには存在しない５配列に制限される。２つの大き
なオーバラップ転写解読枠（ORF）であるORFｌａおよびORF ｌbがゲノムの3分の
2以上を占める。第２のORF、ORFｌbは擬似ノョト（pseudoknot）構造を介した−
1フレームシフトを経て翻訳で読み取られた後にした発現しない（Brierley 1995
）。
で、レプリカーゼ遺伝子（ORFIaおよびIb）、外膜タンパク（ORF2〜6）およびヌ
クレオカプシドタンパク（ORF７）をコードする(Meulenberg et al. 1993a)。OR
F２〜７は６つのサブゲノムＲＮＡから発現され、これは複製時に合成される(Me
ng et al., 1994, 1996)。これらのサブゲノムＲＮＡはネストされた3共終末セ
ットを形成し、ウィルスゲノムの5端から生じる共通リーダーを有する(Meulenbe
rg et al. 1993b)。このＲＮＡは構造的にはポリシストロン性であるが、翻訳は
上記セットの次の小さいＲＮＡには存在しない５配列に制限される。２つの大き
なオーバラップ転写解読枠（ORF）であるORFｌａおよびORF ｌbがゲノムの3分の
2以上を占める。第２のORF、ORFｌbは擬似ノョト（pseudoknot）構造を介した−
1フレームシフトを経て翻訳で読み取られた後にした発現しない（Brierley 1995
）。
【００１３】
これらのORFによってコードされるポリペチドはウィルスコードプロテアーゼ
によってタンパク加水分解で切断されてＲＮＡ合成に関与するタンパクを生ずる
。 各ORFによってコードされるタンパクの特徴に関する現在の知識を下記に要約
する。Lelystadウィルス、LDVおよびEAVと比較したアメリカのＰＲＲＳＶ単離物
VR−2332のORF２〜７のアミノ酸の相同性は文献に記載されている（Murtaugh、1
995）。 ORF2はクラス１の一体膜糖タンパクの特徴を示す29〜30kDaのN-グルコシル化
された構造タンパク（GP2またはGS）をコードする(Meulenberg and Petersen-de
n Besten, 1996、LelystadウィルスのTer Huurne株を使用）。アメリカのVR−23
32単離物をLelystadウィルスと比較したときに、ORF２のタンパクは63％のアミ
ノ酸相同性を示す(Murtaugh et al., 1995)。
によってタンパク加水分解で切断されてＲＮＡ合成に関与するタンパクを生ずる
。 各ORFによってコードされるタンパクの特徴に関する現在の知識を下記に要約
する。Lelystadウィルス、LDVおよびEAVと比較したアメリカのＰＲＲＳＶ単離物
VR−2332のORF２〜７のアミノ酸の相同性は文献に記載されている（Murtaugh、1
995）。 ORF2はクラス１の一体膜糖タンパクの特徴を示す29〜30kDaのN-グルコシル化
された構造タンパク（GP2またはGS）をコードする(Meulenberg and Petersen-de
n Besten, 1996、LelystadウィルスのTer Huurne株を使用）。アメリカのVR−23
32単離物をLelystadウィルスと比較したときに、ORF２のタンパクは63％のアミ
ノ酸相同性を示す(Murtaugh et al., 1995)。
【００１４】
ORF３はGP3とよばれる45〜50kDaの小さい方のN−グルコシル化された構造タン
パクをコードする(van Nieuwstadt et al., 1996）。このVR-2332をLelystadウ
ィルスと比較すると、これは最も少なく維持されたORFで、２つのウィルス間の
アミノ酸同一性は58％だけである（Murtaugh et al. 1995)。最近のデータはGP3
は感染細胞から可溶な形で放出される非構造糖タンパクであることを示している
(Gonin et al., 1998)。 ORF4はGP4とよばれる31〜35kDAの小さい方のN−グルコシル化された膜タンパ
クをコードする(van Nieuwstadt et al., 1996)。GP4に対する単クローン抗体の
中和から少なくともタンパクの一部がウィリオン表面上にあることを示しており
、このモノクローナルは少なくとも部分的にヨーロッパの単離物とクロス反応性
がある(van Nieuwstadt et al., 1996)。VR-2332 ORF４のタンパクはLelystadウ
ィルスに比較して68％のアミノ酸同一性を示し、５つのメンブレン領域を含んで
いる(Murtaugh et 4, 1995）。
パクをコードする(van Nieuwstadt et al., 1996）。このVR-2332をLelystadウ
ィルスと比較すると、これは最も少なく維持されたORFで、２つのウィルス間の
アミノ酸同一性は58％だけである（Murtaugh et al. 1995)。最近のデータはGP3
は感染細胞から可溶な形で放出される非構造糖タンパクであることを示している
(Gonin et al., 1998)。 ORF4はGP4とよばれる31〜35kDAの小さい方のN−グルコシル化された膜タンパ
クをコードする(van Nieuwstadt et al., 1996)。GP4に対する単クローン抗体の
中和から少なくともタンパクの一部がウィリオン表面上にあることを示しており
、このモノクローナルは少なくとも部分的にヨーロッパの単離物とクロス反応性
がある(van Nieuwstadt et al., 1996)。VR-2332 ORF４のタンパクはLelystadウ
ィルスに比較して68％のアミノ酸同一性を示し、５つのメンブレン領域を含んで
いる(Murtaugh et 4, 1995）。
【００１５】
ORF５はGP5またはGLをコードする25kDAの主たるエンベロープグリコプロテイ
ンである(Meulenberg et al., 1995)。ＰＲＲＳGP5タンパクはアポプトーシスの
有効なインデューサであることが証明されているが、その機構は決定されていな
い (Suarez et al 1996)。LelystadウィルスのORF５のタンパクとアメリカのVR-
2332分離物ＰＲＲＳとを比較すると、59％のアミノ酸相同性がある(Murtaugh et
al. 1995)。26と39との間の一つの領域が0〜3の潜在的なN−グリコシル化部位
を含む高度変異部に対応することが分かっている（Pirzadeh et al., 1998b)。
標準的な手段ではそれに対する単クローン抗体を作ることは難しので、このタン
パクは免疫原性が悪いと思える（Pirzadeh and Dea, 1997; Drew et al., 1995)
。しかし、このタンパクは保護期の大部分のブタ血清中に認められる(Nelson et
al, 1993; Meulenberg et al., 1995）。ＰＲＲＳＶの血清中和はGP5の主エン
ベロープグリコプロテインに応答する抗体に関係する(Gonin et al., 1999）。G
P5に対するのモノクローナル抗体は通常は親ウィルスに対してだけ特異的である
中和活性を有している（Pirzadeh. and Dea, 1997; Weiland et at., 1999)。
ンである(Meulenberg et al., 1995)。ＰＲＲＳGP5タンパクはアポプトーシスの
有効なインデューサであることが証明されているが、その機構は決定されていな
い (Suarez et al 1996)。LelystadウィルスのORF５のタンパクとアメリカのVR-
2332分離物ＰＲＲＳとを比較すると、59％のアミノ酸相同性がある(Murtaugh et
al. 1995)。26と39との間の一つの領域が0〜3の潜在的なN−グリコシル化部位
を含む高度変異部に対応することが分かっている（Pirzadeh et al., 1998b)。
標準的な手段ではそれに対する単クローン抗体を作ることは難しので、このタン
パクは免疫原性が悪いと思える（Pirzadeh and Dea, 1997; Drew et al., 1995)
。しかし、このタンパクは保護期の大部分のブタ血清中に認められる(Nelson et
al, 1993; Meulenberg et al., 1995）。ＰＲＲＳＶの血清中和はGP5の主エン
ベロープグリコプロテインに応答する抗体に関係する(Gonin et al., 1999）。G
P5に対するのモノクローナル抗体は通常は親ウィルスに対してだけ特異的である
中和活性を有している（Pirzadeh. and Dea, 1997; Weiland et at., 1999)。
【００１６】
ORF6は18kDAのクラスIIIの非グルコシル化された一体メンブレン（M）タンパ
クをコードする(Meulenberg et at., 1995)。ＰＲＲＳＶ、LDVおよびEAVに関す
る局所的な研究から、ORF５（GL）タンパクおよびORF６のＭタンパクはウィリオ
ン中にジスルフィド結合によって共有結合したヘテロダイマーとして存在するこ
とが示された(Mardassi et at. 1996; de Vries et al., 1995b; Faaberg et al
., 1995)。この結合はおそらくＰＲＲＳＶおよびEAVの等価タンパクに強く保持
された２つのタンパクの外側領域のステイン残基の間に存在するであろう(Plage
mann, 1996, Meulenberg et al., 1993a)。LDVではビリオンのジスルフィド結合
の開裂で感染性が無くなるということは証明されて折、これは、これらの２つの
タンパクのリンケージが宿主細胞受容器との相互作用のためのウィルス付着サイ
トを安定させることを示していると考えられる（Faaberg and Plagemann, 1995)
。Lelystadウィルスと単離物VR-2332とを比較すると、両者のアミノ酸の相同性
は78％で、ORF ６タンパクは最も保持されたタンパクである(Murtaugh et at.,
1995)。最近のデータは、ORF6の産物は主たる役目は細胞免疫にあるということ
を示唆している(Bautista et al, 1999)。
クをコードする(Meulenberg et at., 1995)。ＰＲＲＳＶ、LDVおよびEAVに関す
る局所的な研究から、ORF５（GL）タンパクおよびORF６のＭタンパクはウィリオ
ン中にジスルフィド結合によって共有結合したヘテロダイマーとして存在するこ
とが示された(Mardassi et at. 1996; de Vries et al., 1995b; Faaberg et al
., 1995)。この結合はおそらくＰＲＲＳＶおよびEAVの等価タンパクに強く保持
された２つのタンパクの外側領域のステイン残基の間に存在するであろう(Plage
mann, 1996, Meulenberg et al., 1993a)。LDVではビリオンのジスルフィド結合
の開裂で感染性が無くなるということは証明されて折、これは、これらの２つの
タンパクのリンケージが宿主細胞受容器との相互作用のためのウィルス付着サイ
トを安定させることを示していると考えられる（Faaberg and Plagemann, 1995)
。Lelystadウィルスと単離物VR-2332とを比較すると、両者のアミノ酸の相同性
は78％で、ORF ６タンパクは最も保持されたタンパクである(Murtaugh et at.,
1995)。最近のデータは、ORF6の産物は主たる役目は細胞免疫にあるということ
を示唆している(Bautista et al, 1999)。
【００１７】
ORF７は非グルコシル化された15kDa塩基のタンパクであり、他のヌクレオカプ
シドタンパクの配列との類似性から、ヌクレオカプシドタンパク（N）である考
えらる。LelystadウィルスのORF７タンパクはLelystadウィルスおよびアメリカ
単離物VR-2332との間で65％のアミノ酸同一性を有する(Murtaugh et al., 1995)
。ウエスタンブロットの検出で最初に現れるのはNに対する抗体であるので、最
も免疫原のＰＲＲＳＶタンパクであるのはＮタンパクであるように見える (Nels
on et al, 1994, Yoon et al., 1995)。 ウマ動脈炎ウィルス（EAV）ゲノムで、アルテリウイルスに保持された新しい
転写解読枠が最近同定された(Snijder et al., 1999)。このEAV ORFは2aと名付
けられ、“E”とよばれる８kDaの基本的構造タンパクをコードする。ＰＲＲＳＶ
ではその相同ORFは2bと名付けられ、GP2をコードするORF２（上記参照）は改め
てORF2aと名付けられた (Snijder et at., 1999)。
シドタンパクの配列との類似性から、ヌクレオカプシドタンパク（N）である考
えらる。LelystadウィルスのORF７タンパクはLelystadウィルスおよびアメリカ
単離物VR-2332との間で65％のアミノ酸同一性を有する(Murtaugh et al., 1995)
。ウエスタンブロットの検出で最初に現れるのはNに対する抗体であるので、最
も免疫原のＰＲＲＳＶタンパクであるのはＮタンパクであるように見える (Nels
on et al, 1994, Yoon et al., 1995)。 ウマ動脈炎ウィルス（EAV）ゲノムで、アルテリウイルスに保持された新しい
転写解読枠が最近同定された(Snijder et al., 1999)。このEAV ORFは2aと名付
けられ、“E”とよばれる８kDaの基本的構造タンパクをコードする。ＰＲＲＳＶ
ではその相同ORFは2bと名付けられ、GP2をコードするORF２（上記参照）は改め
てORF2aと名付けられた (Snijder et at., 1999)。
【００１８】
ＰＲＲＳＶに対する防御免疫応答を何が構成しているかはいまだに不明である
。感染したブタで、ウィルス血症は循環抗体の表面上に何週間も存在することが
でき、免疫を発現する機構についてはほとんど分かっていない。しかし、ＰＲＲ
ＳＶが持続する群では雌ブタが生殖ロスを繰り返すことはない。このことはある
種の感染防御免疫が現れたことを示している(Done et al., 1996; Rossow et at
., 1998)。中和抗体は初期感染後6ヵ月で迅速に無くなることは、活動免疫の持
続期間が短いことを示している (Ohlinger et at. 1992)。中和抗体でＰＲＲＳ
Ｖがブタで複製し、拡散することから、免疫応答の基本部分は血清−中和抗体で
は必ずしもないということを示している(Oblinger 1995)。ブタを動物地方病Ｐ
ＲＲＳＶへ曝すと、相同なＰＲＲＳＶ−起因性生殖ロスに対する保護が得られる
が、異なるＰＲＲＳＶに対する保護の程度および期間は使用植菌および抗原投与
で使用したウィルス株の抗原性の相関性に依存して変わる。(Lager et at., 199
9)。抗ＰＲＲＳＶ細胞免疫は感染ブタで検出されている(Rossow. 1998）。ＰＲ
ＲＳＶの構造ポリペチドに応答する培養Ｔ細胞は構造ポリペチドを発現するワク
シニアウィルス組換え体を用いて最近分析された（ORFs 2〜7、下記参照）。大
きな反応がORF６の製品で観測された(Bautista et al., 1999)。
。感染したブタで、ウィルス血症は循環抗体の表面上に何週間も存在することが
でき、免疫を発現する機構についてはほとんど分かっていない。しかし、ＰＲＲ
ＳＶが持続する群では雌ブタが生殖ロスを繰り返すことはない。このことはある
種の感染防御免疫が現れたことを示している(Done et al., 1996; Rossow et at
., 1998)。中和抗体は初期感染後6ヵ月で迅速に無くなることは、活動免疫の持
続期間が短いことを示している (Ohlinger et at. 1992)。中和抗体でＰＲＲＳ
Ｖがブタで複製し、拡散することから、免疫応答の基本部分は血清−中和抗体で
は必ずしもないということを示している(Oblinger 1995)。ブタを動物地方病Ｐ
ＲＲＳＶへ曝すと、相同なＰＲＲＳＶ−起因性生殖ロスに対する保護が得られる
が、異なるＰＲＲＳＶに対する保護の程度および期間は使用植菌および抗原投与
で使用したウィルス株の抗原性の相関性に依存して変わる。(Lager et at., 199
9)。抗ＰＲＲＳＶ細胞免疫は感染ブタで検出されている(Rossow. 1998）。ＰＲ
ＲＳＶの構造ポリペチドに応答する培養Ｔ細胞は構造ポリペチドを発現するワク
シニアウィルス組換え体を用いて最近分析された（ORFs 2〜7、下記参照）。大
きな反応がORF６の製品で観測された(Bautista et al., 1999)。
【００１９】
不活化または弱毒ウィルスワクチンは入手可能である。Plana Duran(1997）は
70％の保護を誘導する油−アジュバンド型ワクチンを記載している。米国ではGo
rcyca et at (1995）が一回の筋肉内投与される弱毒生ワクチンを記載している
。ウィルス血症は検出されるが、妊娠後期の雌ブタでは安全で、接触ブタには伝
えられないということは分かっている。実地試験の結果、ＰＲＲＳＶ感染地域の
育児中のブタにワクチンを使用することが利点であることを示した(Done et at.
, 1996)。しかし、他の研究では、妊娠中に投与した場合には安全性が不足する
か、弱毒生ワクチンが有効手あることを示している(Dewey et al., 1999; Menge
ling et al., 1999b)。さらに、いくつのブタ群では、ワクチン株は持続し、弱
毒程度の低いものに変化している(Mengeling et a!., 1 999a)。最近の研究では
、米国のブタ群で現在流行しているＰＲＲＳＶ株が従来公知のものよりビルレン
トであることを示している。ＰＲＲＳ予防注射した群の臨床結果は、新世代のワ
クチンのに必要性を示唆している (Mengenling et at., 1998)。他の最近の研究
からは、欧州のセロタイプの抗原投与に対して欧州のセロタイプＰＲＲＳＶワク
チンは保護を示すが、米国のセロタイプワクチンはそうしないということを示し
ている (van Woensel et at. 1998a and b)。要するに、安全で有効な新しい改
良型のワクチンに対するニーズがある。
70％の保護を誘導する油−アジュバンド型ワクチンを記載している。米国ではGo
rcyca et at (1995）が一回の筋肉内投与される弱毒生ワクチンを記載している
。ウィルス血症は検出されるが、妊娠後期の雌ブタでは安全で、接触ブタには伝
えられないということは分かっている。実地試験の結果、ＰＲＲＳＶ感染地域の
育児中のブタにワクチンを使用することが利点であることを示した(Done et at.
, 1996)。しかし、他の研究では、妊娠中に投与した場合には安全性が不足する
か、弱毒生ワクチンが有効手あることを示している(Dewey et al., 1999; Menge
ling et al., 1999b)。さらに、いくつのブタ群では、ワクチン株は持続し、弱
毒程度の低いものに変化している(Mengeling et a!., 1 999a)。最近の研究では
、米国のブタ群で現在流行しているＰＲＲＳＶ株が従来公知のものよりビルレン
トであることを示している。ＰＲＲＳ予防注射した群の臨床結果は、新世代のワ
クチンのに必要性を示唆している (Mengenling et at., 1998)。他の最近の研究
からは、欧州のセロタイプの抗原投与に対して欧州のセロタイプＰＲＲＳＶワク
チンは保護を示すが、米国のセロタイプワクチンはそうしないということを示し
ている (van Woensel et at. 1998a and b)。要するに、安全で有効な新しい改
良型のワクチンに対するニーズがある。
【００２０】
Wensvoortの米国特許第5,620,691号または国際特許第WO 92/21375は「ミステ
リーなブタの病気」の「原因因子」としての「Leylstad因子」に関するものであ
り、この因子とその一定の転写解読枠は1991年6月5日にパスツール研究所（パリ
、フランス）に1-1102として寄託されている。Wensvoortは上記因子またはその
一部がベクター、例えばワクシニアウィルス、ヘルペスウィルス、仮性狂犬病ウ
イルス、アデノウィルスに取り入れられることを指摘しているが、本発明で示す
ようなＰＲＲＳＶ免疫源またはそのエピトープを含み、発現する組換え体ベクタ
ーをいかにして作るかはWerisvoortは教示も示唆もしてない。特に、ORFの特定
の組合せおよび／または本発明の組換え体ＰＲＲＳＶORFを含み、発現するアビ
ポックスウィルス組換え体に関しては教示も示唆もない。
リーなブタの病気」の「原因因子」としての「Leylstad因子」に関するものであ
り、この因子とその一定の転写解読枠は1991年6月5日にパスツール研究所（パリ
、フランス）に1-1102として寄託されている。Wensvoortは上記因子またはその
一部がベクター、例えばワクシニアウィルス、ヘルペスウィルス、仮性狂犬病ウ
イルス、アデノウィルスに取り入れられることを指摘しているが、本発明で示す
ようなＰＲＲＳＶ免疫源またはそのエピトープを含み、発現する組換え体ベクタ
ーをいかにして作るかはWerisvoortは教示も示唆もしてない。特に、ORFの特定
の組合せおよび／または本発明の組換え体ＰＲＲＳＶORFを含み、発現するアビ
ポックスウィルス組換え体に関しては教示も示唆もない。
【００２１】
Plana Duran et at. (1997）はバキュロウイルス発現系のＰＲＲＳＶスペイン
単離物のORF２〜７の発現に関するものである。ORF3〜７を妊娠した雌ブタの免
疫原性を見つけるため検査している。Ｎタンパクを発現するORF7をワクチン接種
しただけで有意な抗体反応を与えている（免疫ペルオキシダーゼ単層アッセイ）
。しかしORF7は抗原投与に対して保護を与えず、ORF3および5単独または組合せ
で生殖ロスに対して50〜70％の保護を与えている(Plana Duran et at. 1997)。
また、ORF3および5を受けた母ブタからの子豚も離乳後に抗原投与に対して抗Ｐ
ＲＲＳＶ抗体を示さず、ウイルス複製がないことを示している。 Pirzadeb and Dea (1998）はORF５を発現するプラスミドＤＮＡをブタに予防
注射している。中和抗体、リンパ球培養およびＰＲＲＳＶ抗原投与に対する保護
の誘起が観測されている。Similarly, Kwang et at. (1999)はブタにORF4〜7を
コードするプラスミドＤＮＡの免疫性を評価している。ＰＲＲＳウィルスに対す
るＤＮＡ免疫化で、免疫したブタでそれぞれ71％および86％の液性および細胞免
疫応答が生じた。この結果はORF4およびORF５によってコードされるウイルスの
エンベロープグリコプロテインにＰＲＲＳウィルスに対する中和エピトープが存
在することを示している。
単離物のORF２〜７の発現に関するものである。ORF3〜７を妊娠した雌ブタの免
疫原性を見つけるため検査している。Ｎタンパクを発現するORF7をワクチン接種
しただけで有意な抗体反応を与えている（免疫ペルオキシダーゼ単層アッセイ）
。しかしORF7は抗原投与に対して保護を与えず、ORF3および5単独または組合せ
で生殖ロスに対して50〜70％の保護を与えている(Plana Duran et at. 1997)。
また、ORF3および5を受けた母ブタからの子豚も離乳後に抗原投与に対して抗Ｐ
ＲＲＳＶ抗体を示さず、ウイルス複製がないことを示している。 Pirzadeb and Dea (1998）はORF５を発現するプラスミドＤＮＡをブタに予防
注射している。中和抗体、リンパ球培養およびＰＲＲＳＶ抗原投与に対する保護
の誘起が観測されている。Similarly, Kwang et at. (1999)はブタにORF4〜7を
コードするプラスミドＤＮＡの免疫性を評価している。ＰＲＲＳウィルスに対す
るＤＮＡ免疫化で、免疫したブタでそれぞれ71％および86％の液性および細胞免
疫応答が生じた。この結果はORF4およびORF５によってコードされるウイルスの
エンベロープグリコプロテインにＰＲＲＳウィルスに対する中和エピトープが存
在することを示している。
【００２２】
Cochranの米国特許第6,033,904号または国際特許第WO 96/22363号は組換え体
豚痘ウイルスおよびＰＲＲＳＶORF7に関するものであるが、Cohcranは本発明の
ＰＲＲＳＶ免疫原を含み、発現する組換え体ベクターまたはそのエピトープを記
載しておらず、本発明のORFおよび／または組換え体ＰＲＲＳＶORFを含み、発現
する組換え体アビポックスウィルスまたはその特定な組合せを教示も、示唆もし
ていない。 Cochranの国際特許第WO 03／00 030は組換え体ラココン（raccoonpox）ウィル
スに関するもので、ＰＲＲＳＶについても言及しているが、Cohcranは本発明の
ＰＲＲＳＶ免疫原を含み、発現する組換え体ベクターまたはそのエピトープを記
載しておらず、本発明のORFおよび／または組換え体ＰＲＲＳＶORFを含み、発現
する組換え体アビポックスウィルスまたはその特定な組合せを教示も、示唆もし
ていない。
豚痘ウイルスおよびＰＲＲＳＶORF7に関するものであるが、Cohcranは本発明の
ＰＲＲＳＶ免疫原を含み、発現する組換え体ベクターまたはそのエピトープを記
載しておらず、本発明のORFおよび／または組換え体ＰＲＲＳＶORFを含み、発現
する組換え体アビポックスウィルスまたはその特定な組合せを教示も、示唆もし
ていない。 Cochranの国際特許第WO 03／00 030は組換え体ラココン（raccoonpox）ウィル
スに関するもので、ＰＲＲＳＶについても言及しているが、Cohcranは本発明の
ＰＲＲＳＶ免疫原を含み、発現する組換え体ベクターまたはそのエピトープを記
載しておらず、本発明のORFおよび／または組換え体ＰＲＲＳＶORFを含み、発現
する組換え体アビポックスウィルスまたはその特定な組合せを教示も、示唆もし
ていない。
【００２３】
ワクシニアウィルスは痘瘡に対する免疫として成功裏に用いられてきて、1980
年には痘瘡は世界から根絶された。痘瘡の根絶によって、ポックスウィルスの新
しい役割、すなわち、異種遺伝子の形質発現のための遺伝子設計されたベクター
としての役割が重要になった(Panicali and Paoletti, 1982; Paoletti et at.,
1984)。異種免疫原をコードする遺伝子はワクシニアで発現されてきており、対
応する病原の抗原投与に対して感染防御免疫を示すことがあった(Tartaglia et
at., 1990中にレビューがある)。MVAとよばれる高度に弱毒されたワクチン株も
ポックスウィルスをベースにしたワクチンのためのベクターとして使われている
。このMVAの使用は米国特許第5,185,146号に記載されている。
年には痘瘡は世界から根絶された。痘瘡の根絶によって、ポックスウィルスの新
しい役割、すなわち、異種遺伝子の形質発現のための遺伝子設計されたベクター
としての役割が重要になった(Panicali and Paoletti, 1982; Paoletti et at.,
1984)。異種免疫原をコードする遺伝子はワクシニアで発現されてきており、対
応する病原の抗原投与に対して感染防御免疫を示すことがあった(Tartaglia et
at., 1990中にレビューがある)。MVAとよばれる高度に弱毒されたワクチン株も
ポックスウィルスをベースにしたワクチンのためのベクターとして使われている
。このMVAの使用は米国特許第5,185,146号に記載されている。
【００２４】
他の２つのワクチンベクターには自然ではホスト制限されるポックスウィルス
、アビポックスウィルスがある。鶏痘ウイルス（fowlpoxvirus、FPV; Taylor et
a!. 1988a, b）およびカナリアポックスウイルス（canarypoxvirus、CPV; Tayl
or et at., 1991 & 1992)の２つは異種遺伝子産物を発現する遺伝子工学で用い
られてきた。鶏痘ウィルス（FPV）はポックスウイルス科のアビポックスウィル
ス属の原始型のウィルスである。このウィルスは家禽に経済的に重要な損失を与
えるウイルスで、1920年代から弱毒生ワクチンの使用によって急速になくなった
。アビポックスウィルスの複製は鳥類に限定され（Matthews,1982）、ヒトを含
む鳥類以外の生物種の培養性感染にアビポックスウィルスを使用したという文献
はない。この寄主制限が他の生物種へのウィルスの伝染を防ぐバリアとなり、ま
た、獣医学およびヒトでのアビポックスウィルスベースのワクチンの使用を可能
にした。
、アビポックスウィルスがある。鶏痘ウイルス（fowlpoxvirus、FPV; Taylor et
a!. 1988a, b）およびカナリアポックスウイルス（canarypoxvirus、CPV; Tayl
or et at., 1991 & 1992)の２つは異種遺伝子産物を発現する遺伝子工学で用い
られてきた。鶏痘ウィルス（FPV）はポックスウイルス科のアビポックスウィル
ス属の原始型のウィルスである。このウィルスは家禽に経済的に重要な損失を与
えるウイルスで、1920年代から弱毒生ワクチンの使用によって急速になくなった
。アビポックスウィルスの複製は鳥類に限定され（Matthews,1982）、ヒトを含
む鳥類以外の生物種の培養性感染にアビポックスウィルスを使用したという文献
はない。この寄主制限が他の生物種へのウィルスの伝染を防ぐバリアとなり、ま
た、獣医学およびヒトでのアビポックスウィルスベースのワクチンの使用を可能
にした。
【００２５】
FPVは家禽病原からの免疫原を発現するベクターとして使うのが好ましい。ビ
ルレントな鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパクがFPV組換え体
で発現さている(Taylor et at., 1988c)。この組換え体をニワトリおよびシチメ
ンチョウに接種すると、同一または異種のビルレントな風邪ウイルスの抗原投与
に対して保護する免疫応答が生じる(Taylor et at., 198 Sc)。ニューカッスル
病ウイルス（Newcastle Disease Virus）の表面グリコプロテインを発現するFPV
組換え体も開発されている (Taylor et at., 1990; Edbauer et at., 1990)。 野生のウィルス株の遺伝子操作によって他の弱毒ポックスウィルスベクターも
調製されている。NYVACベクターは、ワクシニアのコペンハーゲン株に由来する
特定のビルレンスおよび宿主の遺伝子の欠失によって得られたもので(Tartaglia
et al., 1992)、異種免疫原に対する防御免疫応答を生じる組換え体ベクターと
して有効であることがに証明されている。 その他の設計されたポックスウィルスベクターはカナリア痘ウイルスに由来す
るALVACである。このALVACは非鳥ホストでは生産的に複製せず、その特徴は安全
性プロフィールを改良すると考えられている (Taylor et at., 1991 & 1992)。A
LVACおよびNYVACはともにBSL−lベクターである。
ルレントな鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパクがFPV組換え体
で発現さている(Taylor et at., 1988c)。この組換え体をニワトリおよびシチメ
ンチョウに接種すると、同一または異種のビルレントな風邪ウイルスの抗原投与
に対して保護する免疫応答が生じる(Taylor et at., 198 Sc)。ニューカッスル
病ウイルス（Newcastle Disease Virus）の表面グリコプロテインを発現するFPV
組換え体も開発されている (Taylor et at., 1990; Edbauer et at., 1990)。 野生のウィルス株の遺伝子操作によって他の弱毒ポックスウィルスベクターも
調製されている。NYVACベクターは、ワクシニアのコペンハーゲン株に由来する
特定のビルレンスおよび宿主の遺伝子の欠失によって得られたもので(Tartaglia
et al., 1992)、異種免疫原に対する防御免疫応答を生じる組換え体ベクターと
して有効であることがに証明されている。 その他の設計されたポックスウィルスベクターはカナリア痘ウイルスに由来す
るALVACである。このALVACは非鳥ホストでは生産的に複製せず、その特徴は安全
性プロフィールを改良すると考えられている (Taylor et at., 1991 & 1992)。A
LVACおよびNYVACはともにBSL−lベクターである。
【００２６】
サブユニットＰＲＲＳＶワクチン開発の一つのアプローチは関連するＰＲＲＳ
ＶORFを発現する生きたウイルスのベクターを使用することである。組換え体ポ
ックスウィルスは２段階で構築されるということは知られており、米国特許第4,
769,330号、第4,722,848号;第4,603,112号;第5,110,587号;第5,174,993号;第5,4
94,807号;第5,942,235号、第5,505,941号に記載のワクシニアウィルス、アビポ
ックスウィルスようなポックスウィルスの合成組換え体アビポックスウィルスの
製造方法で作ることができる。これらの特許に記載の内容は本願明細書の一部を
成す。従って、ＰＲＲＳＶ組換え体ポックスウィルスと、その組成物および製品
、特にALVACをベースにしたＰＲＲＳＶ組換え体および組成物と、それらか得ら
れる製品、特にORF 2、3、4、5、6または7を発現する組換え体およびこれらとＰ
ＲＲＳＶ組換え体との組合せ、およびそれから得られる製品が強く望まれており
、現在の技術を大きく前進させるものである。
ＶORFを発現する生きたウイルスのベクターを使用することである。組換え体ポ
ックスウィルスは２段階で構築されるということは知られており、米国特許第4,
769,330号、第4,722,848号;第4,603,112号;第5,110,587号;第5,174,993号;第5,4
94,807号;第5,942,235号、第5,505,941号に記載のワクシニアウィルス、アビポ
ックスウィルスようなポックスウィルスの合成組換え体アビポックスウィルスの
製造方法で作ることができる。これらの特許に記載の内容は本願明細書の一部を
成す。従って、ＰＲＲＳＶ組換え体ポックスウィルスと、その組成物および製品
、特にALVACをベースにしたＰＲＲＳＶ組換え体および組成物と、それらか得ら
れる製品、特にORF 2、3、4、5、6または7を発現する組換え体およびこれらとＰ
ＲＲＳＶ組換え体との組合せ、およびそれから得られる製品が強く望まれており
、現在の技術を大きく前進させるものである。
【００２７】
本発明の対象は、組換え体ウィルスと、その組成物と、ＰＲＲＳＶによる感染
の治療および予防方法と、この種のウィルスの製造方法とを提供することにある
。 本発明は、組換え体ポックスウィルスのような少なくとも一種の外来の核酸分
子を含み且つ発現する組換え体ウィルス、上記の外来の核酸分子がＰＲＲＳＶか
らの免疫原またはエピトープをコードする核酸分子であるか、ORFまたはそのＰ
ＲＲＳＶの一部である組換え体ベクターを提供する。 本発明はさらに、上記ウィルスまたはその発現産物から成る免疫学的（または
免疫原性）ワクチン組成を提供する。
の治療および予防方法と、この種のウィルスの製造方法とを提供することにある
。 本発明は、組換え体ポックスウィルスのような少なくとも一種の外来の核酸分
子を含み且つ発現する組換え体ウィルス、上記の外来の核酸分子がＰＲＲＳＶか
らの免疫原またはエピトープをコードする核酸分子であるか、ORFまたはそのＰ
ＲＲＳＶの一部である組換え体ベクターを提供する。 本発明はさらに、上記ウィルスまたはその発現産物から成る免疫学的（または
免疫原性）ワクチン組成を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、ＰＲＲＳＶに対する疫学的（または免疫原性）または保護的
な反応を誘導する方法、並びに、上記ウィルスまたはこのウィルス発現産物から
成る組成物を投与することから成る、ＰＲＲＳＶまたはＰＲＲＳＶによって生じ
る疾病を予防または治療するための方法を提供する。 本発明はさらに、上記ウィルスの発現産物と、発現産物から作られる抗体また
はそれから生体内で作られる抗体と、これらの物質、抗体の使用、例えば診断で
の利用にあるということは理解できよう。 「〜から成る」という表現は「〜を含む」という意味であり、米国特許法で認
められている「comprising」という意味である。 以下、本発明の具体例を示す。本発明は以下の詳細な説明からより明確になる
であろう。
な反応を誘導する方法、並びに、上記ウィルスまたはこのウィルス発現産物から
成る組成物を投与することから成る、ＰＲＲＳＶまたはＰＲＲＳＶによって生じ
る疾病を予防または治療するための方法を提供する。 本発明はさらに、上記ウィルスの発現産物と、発現産物から作られる抗体また
はそれから生体内で作られる抗体と、これらの物質、抗体の使用、例えば診断で
の利用にあるということは理解できよう。 「〜から成る」という表現は「〜を含む」という意味であり、米国特許法で認
められている「comprising」という意味である。 以下、本発明の具体例を示す。本発明は以下の詳細な説明からより明確になる
であろう。
【００２９】
本発明の一つの観点から、本発明は接種された宿主動物に免疫的または保護的
な反応を誘導する免疫学的組成物またはワクチンまたは治療組成物を提供する。
この組成物は、キャリアまたは希釈液または賦形剤および／またはアジュバント
と、組換え体ベクター、例えば組換え体ウィルスとを含む。この組換え体ウィル
スは改質した組換え体ウィルス、例えば不活化（例えば分裂または欠失されるこ
と）したウィルスコード遺伝機能を有するウィルスの組換え体でもよい。この改
質した組換え体ウィルスはウィルスがコードする本質的でない遺伝的機能を不活
化した部分を有することができ、例えば、ビルレンスを弱くして安全性を高めた
組換え体ウィルスにすることができる。
な反応を誘導する免疫学的組成物またはワクチンまたは治療組成物を提供する。
この組成物は、キャリアまたは希釈液または賦形剤および／またはアジュバント
と、組換え体ベクター、例えば組換え体ウィルスとを含む。この組換え体ウィル
スは改質した組換え体ウィルス、例えば不活化（例えば分裂または欠失されるこ
と）したウィルスコード遺伝機能を有するウィルスの組換え体でもよい。この改
質した組換え体ウィルスはウィルスがコードする本質的でない遺伝的機能を不活
化した部分を有することができ、例えば、ビルレンスを弱くして安全性を高めた
組換え体ウィルスにすることができる。
【００３０】
本発明組成で使用されるウィルスはポックスウィルス、例えばワクシニアウィ
ルス、好ましくはアビポックスウィルス、例えば鶏痘ウィルスまたはカナリア痘
ウイルス、さらに好ましくはALVACウィルスである。組換え体ベクターまたは組
換え体ウィルスは哺乳動物生物種での複製がない発現をするものが有利である。
組換えベクターまたは改質した組換え体ウィルスはそのウイルスゲノム内、例え
ばウイルスゲノムの本質的でない領域内に、免疫原のタンパクをコードする異種
DNAの塩基配列、例えばＰＲＲＳＶ ORFからの塩基配列、例えばＰＲＲＳＶ ORF
2、3、4、5、6または7またはこれらの任意の組合せ、好ましくはＰＲＲＳＶORF
3と5、または5と6、または、4と5、またはこれらの組合せ、特に3と5と6または4
と5と6を含むことができる（免疫原タンパクは上記のエピトープ、例えばＰＲＲ
ＳＶ ORF 2、3、4、5、6または7のいずれかつが発現するタンパクからのエピト
ープ、例えばＰＲＲＳＶORF 3と5からのエピトープまたは5と6または4と5または
これらの組合せ、特に3と5と6または4と5と6からのエピトープにすることができ
る）。
ルス、好ましくはアビポックスウィルス、例えば鶏痘ウィルスまたはカナリア痘
ウイルス、さらに好ましくはALVACウィルスである。組換え体ベクターまたは組
換え体ウィルスは哺乳動物生物種での複製がない発現をするものが有利である。
組換えベクターまたは改質した組換え体ウィルスはそのウイルスゲノム内、例え
ばウイルスゲノムの本質的でない領域内に、免疫原のタンパクをコードする異種
DNAの塩基配列、例えばＰＲＲＳＶ ORFからの塩基配列、例えばＰＲＲＳＶ ORF
2、3、4、5、6または7またはこれらの任意の組合せ、好ましくはＰＲＲＳＶORF
3と5、または5と6、または、4と5、またはこれらの組合せ、特に3と5と6または4
と5と6を含むことができる（免疫原タンパクは上記のエピトープ、例えばＰＲＲ
ＳＶ ORF 2、3、4、5、6または7のいずれかつが発現するタンパクからのエピト
ープ、例えばＰＲＲＳＶORF 3と5からのエピトープまたは5と6または4と5または
これらの組合せ、特に3と5と6または4と5と6からのエピトープにすることができ
る）。
【００３１】
組換え体ベクターまたは組換え体ウィルスはＰＲＲＳＶORF3と5、5と6または4
と5、または、3、5および6または4、5および6の組合せを含み且つ発現するのが
有利である。 本発明の別の態様から、本発明は組換え体ベクターまたは組換え体ウィルスに
よるこれらORFのインビトロ発現物を提供する。本発明の発現産物は単離でき、
免疫学的組成物または免疫ワクチン組成として適切なキャリア、賦形剤、希釈液
および／またはアジュバントと混合して病気の治療または予防に使用できる。 本発明の別の態様から、本発明は、これらORFインビボ発現物およびこれらORF
を含み且つ発現する組換え体ベクターまたは組換え体ウィルスから成るの組成物
を提供する。この組成物は組換え体ベクターまたは組換え体ウィルスと、適切な
キャリア、賦形剤、希釈液および／またはアジュバントを含むことができる。 発明はさらに、上記ORFおよび／またはこれらORFの組成物および／またはこれ
らの発現産物から成る組成を含み且つ発現する組換え体ベクターまたは組換え体
ウィルスおよび／または上記組換え体ベクターまたは組換え体ウィルスのインビ
トロ発現産物を投与することから成る免疫原応答、免疫学的応答および／または
保護反応を得るための治療方法を提供する。
と5、または、3、5および6または4、5および6の組合せを含み且つ発現するのが
有利である。 本発明の別の態様から、本発明は組換え体ベクターまたは組換え体ウィルスに
よるこれらORFのインビトロ発現物を提供する。本発明の発現産物は単離でき、
免疫学的組成物または免疫ワクチン組成として適切なキャリア、賦形剤、希釈液
および／またはアジュバントと混合して病気の治療または予防に使用できる。 本発明の別の態様から、本発明は、これらORFインビボ発現物およびこれらORF
を含み且つ発現する組換え体ベクターまたは組換え体ウィルスから成るの組成物
を提供する。この組成物は組換え体ベクターまたは組換え体ウィルスと、適切な
キャリア、賦形剤、希釈液および／またはアジュバントを含むことができる。 発明はさらに、上記ORFおよび／またはこれらORFの組成物および／またはこれ
らの発現産物から成る組成を含み且つ発現する組換え体ベクターまたは組換え体
ウィルスおよび／または上記組換え体ベクターまたは組換え体ウィルスのインビ
トロ発現産物を投与することから成る免疫原応答、免疫学的応答および／または
保護反応を得るための治療方法を提供する。
【００３２】
本発明の別の態様から、本発明は組換え体ウィルス、例えば不活化（例えば、
欠失または分裂させた）ウィルスコード遺伝機能を有する組換え体ウィルス、例
えばビルレンスを減らし、安全性を高めた本質的でないウィルスコード遺伝機能
を改質した組換え体ウィルスような組換え体ベクターを含む免疫原組成物を提供
する。改質した組換え体は例えばウイルスゲノムの本質的でない領域に免疫原の
タンパクをコードする異種DNAの塩基配列ウイルスゲノム（例えばＰＲＲＳＶORF
、例えばＰＲＲＳＶORF２、３、４、５、６または７、好ましくはＰＲＲＳＶORF
3と5または5と6または4と5またはその組合せ、特に3と5と6または4と5と6の組
み合せ）を含む。本発明組成物はホストに投与れた時に免疫原タンパクに免疫応
答する（この免疫原のタンパクは例えばＰＲＲＳＶORF2、3、4、5、6または7の
エピトープ、好ましくはＰＲＲＳＶORF 3と5または5と6または4と5またはこれら
の組合せ3と5と6または4と5と6によっても発現されるタンパクからのエピトープ
でもよい）。
欠失または分裂させた）ウィルスコード遺伝機能を有する組換え体ウィルス、例
えばビルレンスを減らし、安全性を高めた本質的でないウィルスコード遺伝機能
を改質した組換え体ウィルスような組換え体ベクターを含む免疫原組成物を提供
する。改質した組換え体は例えばウイルスゲノムの本質的でない領域に免疫原の
タンパクをコードする異種DNAの塩基配列ウイルスゲノム（例えばＰＲＲＳＶORF
、例えばＰＲＲＳＶORF２、３、４、５、６または７、好ましくはＰＲＲＳＶORF
3と5または5と6または4と5またはその組合せ、特に3と5と6または4と5と6の組
み合せ）を含む。本発明組成物はホストに投与れた時に免疫原タンパクに免疫応
答する（この免疫原のタンパクは例えばＰＲＲＳＶORF2、3、4、5、6または7の
エピトープ、好ましくはＰＲＲＳＶORF 3と5または5と6または4と5またはこれら
の組合せ3と5と6または4と5と6によっても発現されるタンパクからのエピトープ
でもよい）。
【００３３】
本発明のさらに他の観点から、本発明は組換え体ウィルスのような組換え体ベ
クターを提供する。本発明は例えば不活化されたウィルスコードされる遺伝機能
を有することによって改質（例えば欠失、分裂）されてウィルスがビルレンスを
低下し、さらに、ウイルスゲノムの本質的でないウィルスコード遺伝機能を有す
ることによって改質され且つ異種の供給源から供給されたＤＮＡを含んだ改質さ
れた組換え体ウィルスを提供する。上記のＤＮＡはＰＲＲＳＶをコードするエピ
トープまたはＰＲＲＳＶ遺伝子またはまたはその部分、例えばＰＲＲＳＶORF2、
ORF３、ORF4、ORF５、ORF6、ORF7の一部または全てまたはこれらOREの組合せ、
例えばＰＲＲＳＶORF 2と3または3と4または3と5または3と5と6または4と5と6ま
たは3と4と5と６および／またはこれらORFのいずれか一つを発現するエピトープ
にすることができる。特に、遺伝機能はビルレンス因子をコードする転写解読枠
を欠失させるか、自然のホスト制限されたウィルスを利用するか、不活化されお
よび／または自然にホスト制限されたウィルスを用いることによって弱毒化する
ことがでる。本発明で使われるウィルスはワクシニアウィルス、好ましくはアビ
ポックスウィルスのようなポックスウィルス、例えば鶏痘ウィルス、好ましくは
カナリア痘ウィルスである。ワクシニアに対する転写解読枠は、J2R、B13R＋B14
R、A26L、A56R、C7L−KlLおよび14L（Goebel et al., 1990に記載の用語）、こ
れの組合せ、好ましくはJ2R、B13R＋B14R、A26L、A56R、C7L−K1LおよびI4Lから
成る群の中から選択するのが好ましい。
クターを提供する。本発明は例えば不活化されたウィルスコードされる遺伝機能
を有することによって改質（例えば欠失、分裂）されてウィルスがビルレンスを
低下し、さらに、ウイルスゲノムの本質的でないウィルスコード遺伝機能を有す
ることによって改質され且つ異種の供給源から供給されたＤＮＡを含んだ改質さ
れた組換え体ウィルスを提供する。上記のＤＮＡはＰＲＲＳＶをコードするエピ
トープまたはＰＲＲＳＶ遺伝子またはまたはその部分、例えばＰＲＲＳＶORF2、
ORF３、ORF4、ORF５、ORF6、ORF7の一部または全てまたはこれらOREの組合せ、
例えばＰＲＲＳＶORF 2と3または3と4または3と5または3と5と6または4と5と6ま
たは3と4と5と６および／またはこれらORFのいずれか一つを発現するエピトープ
にすることができる。特に、遺伝機能はビルレンス因子をコードする転写解読枠
を欠失させるか、自然のホスト制限されたウィルスを利用するか、不活化されお
よび／または自然にホスト制限されたウィルスを用いることによって弱毒化する
ことがでる。本発明で使われるウィルスはワクシニアウィルス、好ましくはアビ
ポックスウィルスのようなポックスウィルス、例えば鶏痘ウィルス、好ましくは
カナリア痘ウィルスである。ワクシニアに対する転写解読枠は、J2R、B13R＋B14
R、A26L、A56R、C7L−KlLおよび14L（Goebel et al., 1990に記載の用語）、こ
れの組合せ、好ましくはJ2R、B13R＋B14R、A26L、A56R、C7L−K1LおよびI4Lから
成る群の中から選択するのが好ましい。
【００３４】
この点で、転写解読枠はチミジンキナーゼ遺伝子、出血領域、A型封入領域、
ヘマグルチニン遺伝子、寄生範囲遺伝領域または大サブユニット、リボヌクレオ
チドレダクターゼまたはこれらの組合せから成る。ワクシニアウィルスの適切な
改質コペンハーゲン株はNYVAC (Tartaglia et al., 1992)、または、J2R、B13R+
B14R、A26L、A56R、C7L-Kl Iおよび14Lを欠失したワクシニアウィルス、または
、チミジンキナーゼ遺伝子、出血領域、A型封入領域、ヘマグルチニン遺伝子、
寄生範囲領域、大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼにすることがで
きる（本発明を実施する上で有用なNYVACおよびその一部の欠失したまたはNYVAC
より弱毒化したベクターに関しては米国特許第5,364,773号、第5,494,807号およ
び第5,762,938号を参照）。
ヘマグルチニン遺伝子、寄生範囲遺伝領域または大サブユニット、リボヌクレオ
チドレダクターゼまたはこれらの組合せから成る。ワクシニアウィルスの適切な
改質コペンハーゲン株はNYVAC (Tartaglia et al., 1992)、または、J2R、B13R+
B14R、A26L、A56R、C7L-Kl Iおよび14Lを欠失したワクシニアウィルス、または
、チミジンキナーゼ遺伝子、出血領域、A型封入領域、ヘマグルチニン遺伝子、
寄生範囲領域、大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼにすることがで
きる（本発明を実施する上で有用なNYVACおよびその一部の欠失したまたはNYVAC
より弱毒化したベクターに関しては米国特許第5,364,773号、第5,494,807号およ
び第5,762,938号を参照）。
【００３５】
ポックスウィルスベクターはALVACであるか、弱毒化されたカナリア痘ウイル
ス、例えばニワトリ胚繊維芽細胞の連続200継代物（Rentschlerワクチン株）に
するのが好ましい。マスター種を寒天で５回継代プラーク精製し、プラーククロ
ーンをさらに４回継代培養する（ALVACおよびTROVAC（本発明を実施する上で有
効な鶏痘ウィルス）に関して米国特許第5,756,103号および第5,766,599号も参照
）、さらに、米国特許第6,004,777号および第5,990,091号および1999年8月31日
そ、6月10日および6月10日にそれぞれ出願した米国特許出願第60/15 1,564号、
第60/138,352号および第60/138,478号（これらのコピーを添付）。ベクター、例
えばブタに対して発現および／または有効なベクター（例えばブタ宿主に有効な
ベクターは仮性狂犬病ウイルス、ブタアデノウィルスを含むアデノウィルス、ブ
タヘルペスウィルスを含むワクシニアウィルス、アビポックスウィルス、カナリ
ア痘ウイルス、ラココンポックス（raccoonpox）ウィルスおよび豚痘ウイルスを
含むポックスウィルスのようなベクターに関しては例えば米国特許第6,033,904
号、第5,869,312号および第5,382,425号を参照）、これらは本発明の実施で利用
でき、また、本願明細書で用いる用語、例えば「免疫原組成物」、「免疫学的組
成物」、「ワクチン」および「エピトープ」の理解と、供与量、投与経路、調合
法、アジュバントおよび組換え体ウィルスおよび発現産物の使用法の理解にも利
用できる。上記組換え体ベクターまたは組換え体ウィルスはホスト内で生産的な
複製形質発現をしないのが望ましい。
ス、例えばニワトリ胚繊維芽細胞の連続200継代物（Rentschlerワクチン株）に
するのが好ましい。マスター種を寒天で５回継代プラーク精製し、プラーククロ
ーンをさらに４回継代培養する（ALVACおよびTROVAC（本発明を実施する上で有
効な鶏痘ウィルス）に関して米国特許第5,756,103号および第5,766,599号も参照
）、さらに、米国特許第6,004,777号および第5,990,091号および1999年8月31日
そ、6月10日および6月10日にそれぞれ出願した米国特許出願第60/15 1,564号、
第60/138,352号および第60/138,478号（これらのコピーを添付）。ベクター、例
えばブタに対して発現および／または有効なベクター（例えばブタ宿主に有効な
ベクターは仮性狂犬病ウイルス、ブタアデノウィルスを含むアデノウィルス、ブ
タヘルペスウィルスを含むワクシニアウィルス、アビポックスウィルス、カナリ
ア痘ウイルス、ラココンポックス（raccoonpox）ウィルスおよび豚痘ウイルスを
含むポックスウィルスのようなベクターに関しては例えば米国特許第6,033,904
号、第5,869,312号および第5,382,425号を参照）、これらは本発明の実施で利用
でき、また、本願明細書で用いる用語、例えば「免疫原組成物」、「免疫学的組
成物」、「ワクチン」および「エピトープ」の理解と、供与量、投与経路、調合
法、アジュバントおよび組換え体ウィルスおよび発現産物の使用法の理解にも利
用できる。上記組換え体ベクターまたは組換え体ウィルスはホスト内で生産的な
複製形質発現をしないのが望ましい。
【００３６】
エピトープに関してはKendrew（THE ENCYCLOPEDIA OF MOLECULAR BIOLOGY (Bl
ackwell Science Ltd., 1995)およびSambrook, Fritsch and Maniatis, Molecul
ar Cidning, ALaboratory Manual, 2nd Ed．, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1982）が参考できる。エピトープは、獣医またはヒトの病原またはトキ
シン、例えばＰＲＲＳＶからの免疫原または免疫活性断片の免疫的に有効な領域
である。当業者はペプチドまたはポリペチドのアミノ酸および対応DNAの塩基配
列、特定のアミノ酸の種類（例えば寸法、電荷等）の通常の知識およびコードン
辞書から過度の実験なしで、ペプチドまたはポリペチドのエピトープまたは免疫
主体領域およびコード化ＤＮＡを決定することができる。
ackwell Science Ltd., 1995)およびSambrook, Fritsch and Maniatis, Molecul
ar Cidning, ALaboratory Manual, 2nd Ed．, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1982）が参考できる。エピトープは、獣医またはヒトの病原またはトキ
シン、例えばＰＲＲＳＶからの免疫原または免疫活性断片の免疫的に有効な領域
である。当業者はペプチドまたはポリペチドのアミノ酸および対応DNAの塩基配
列、特定のアミノ酸の種類（例えば寸法、電荷等）の通常の知識およびコードン
辞書から過度の実験なしで、ペプチドまたはポリペチドのエピトープまたは免疫
主体領域およびコード化ＤＮＡを決定することができる。
【００３７】
DNAの塩基配列は少なくとも抗体反応またはＴ細胞応答を生じるペプチド領域
をコードするのが好ましい。ＴおよびＢ細胞エピトープを決定する一つの方法は
エピトープのマッピングである。必要なタンパクの短い重なり合うペプチド（PE
PSCAN）を合成し、個々のペプチドの天然タンパクによって引き出された抗体と
の結合能力と、Ｔ細胞またはＢ細胞の活性化を誘導する能力をテストする（Jani
s Kuby, Immunology, (1992) pp.79-80）。 必要なエピトープを決定するための他の方法は親水性のタンパク領域を選択す
ることである。一般に親水性残基はタンパクの表面上の抗体に接近可能なタンパ
クの領域にある（Janis Kuby, Immunology, (1992) p. 81）。
をコードするのが好ましい。ＴおよびＢ細胞エピトープを決定する一つの方法は
エピトープのマッピングである。必要なタンパクの短い重なり合うペプチド（PE
PSCAN）を合成し、個々のペプチドの天然タンパクによって引き出された抗体と
の結合能力と、Ｔ細胞またはＢ細胞の活性化を誘導する能力をテストする（Jani
s Kuby, Immunology, (1992) pp.79-80）。 必要なエピトープを決定するための他の方法は親水性のタンパク領域を選択す
ることである。一般に親水性残基はタンパクの表面上の抗体に接近可能なタンパ
クの領域にある（Janis Kuby, Immunology, (1992) p. 81）。
【００３８】
Ｔ細胞応答を生じせることができる所望エピトープを選択するさらに別の方法
は、MHC分子に結合されているであろうことが知られているペプチド配列である
ＨＬＡアンカー結合部をタンパク配列から同定する方法である。Ｔ細胞応答を発
生させる所望エピトープであると考えられるペプチドはMHC複合体内に存在しな
ければならない。このペプチドはMHC分子に結合する適当なアンカー部を含む必
要があり、免疫応答を発生させるための高い十分な親和性で結合しなければなら
ない。 タンパクがＴ細胞応答を刺激する所望エピトープであるか否かを決める際の一
つのガイドラインはペプチド長さで、ペプチドはクラスIのMHC複合体に合った少
なくとも８〜９つのアミノ酸長とクラスII のMHC複合体に合った少なくとも13-2
5アミノ酸長であければならない。この長さはMHC複合体に結合するペプチドの最
小長さである。細胞は発現したペプチドを切断するので、ペプチドはこれらの長
さより長いいのが好しい。このペプチドは免疫応答を生じさせるのに十分に高い
特異性でクラスI分子またはクラスII分子に結合できるようにする適当なアンカ
ー部を含まなければならない（Bocehia, M. et at, Specific Binding of Leuke
mia Oncogene Fusion Protein Peptides to HLA Class I Molecules, Blood 85:
2680-2684、Englehard、VH, Structure of peptides associated with class I
and class II MHC molecules Ann. Rev. Immunol. 12: 181 (1994）参照)。こ
れはMHC分子に関連したペプチドの公知構造と所望タンパクの配列とを比較する
ことによって実験なしで行うことができる。
は、MHC分子に結合されているであろうことが知られているペプチド配列である
ＨＬＡアンカー結合部をタンパク配列から同定する方法である。Ｔ細胞応答を発
生させる所望エピトープであると考えられるペプチドはMHC複合体内に存在しな
ければならない。このペプチドはMHC分子に結合する適当なアンカー部を含む必
要があり、免疫応答を発生させるための高い十分な親和性で結合しなければなら
ない。 タンパクがＴ細胞応答を刺激する所望エピトープであるか否かを決める際の一
つのガイドラインはペプチド長さで、ペプチドはクラスIのMHC複合体に合った少
なくとも８〜９つのアミノ酸長とクラスII のMHC複合体に合った少なくとも13-2
5アミノ酸長であければならない。この長さはMHC複合体に結合するペプチドの最
小長さである。細胞は発現したペプチドを切断するので、ペプチドはこれらの長
さより長いいのが好しい。このペプチドは免疫応答を生じさせるのに十分に高い
特異性でクラスI分子またはクラスII分子に結合できるようにする適当なアンカ
ー部を含まなければならない（Bocehia, M. et at, Specific Binding of Leuke
mia Oncogene Fusion Protein Peptides to HLA Class I Molecules, Blood 85:
2680-2684、Englehard、VH, Structure of peptides associated with class I
and class II MHC molecules Ann. Rev. Immunol. 12: 181 (1994）参照)。こ
れはMHC分子に関連したペプチドの公知構造と所望タンパクの配列とを比較する
ことによって実験なしで行うことができる。
【００３９】
さらに、当業者はタンパク配列をタンパクのデータベースに記載の配列と比較
することによって所望エピトープを確かめることができる。 さらに他の方法は単に所望タンパクの一部を作るか発現させ、所望タンパクの
上記一部にに対して単クローン抗体を作り、そのタンパクが誘導された病原がイ
ンビトロで成長を抑制するか否かを確かめるだげでよい。当業者は本願明細書に
開示の他のガイドラインおよび所望タンパクの一部を作り、発現させ、抗体がイ
ンビトロで成長を抑制するか否かを分析する公知技術を用いることができる。
することによって所望エピトープを確かめることができる。 さらに他の方法は単に所望タンパクの一部を作るか発現させ、所望タンパクの
上記一部にに対して単クローン抗体を作り、そのタンパクが誘導された病原がイ
ンビトロで成長を抑制するか否かを確かめるだげでよい。当業者は本願明細書に
開示の他のガイドラインおよび所望タンパクの一部を作り、発現させ、抗体がイ
ンビトロで成長を抑制するか否かを分析する公知技術を用いることができる。
【００４０】
「免疫原組成物」、「免疫学的組成物」および「ワクチン」とはベクター（ま
たはその発現産物）を含む免疫学的組成物が免疫応答を局所的または全身に誘導
するものをいう。その応答は保護応答でなくてもよい。本発明組換え体またはベ
クター（またはその発現産物）を含む免疫原組成物も同様に局所的または全身に
免疫応答を誘導する引き出す。その応答は保護応答でなくてもよい。ワクチン組
成は局所的または全身に保護応答を誘導する。従って、「免疫学的組成物」およ
び「免疫原組成物」という用語には「ワクチン組成物」を含む（前者の２つは保
護組成物である）。本発明は免疫学的組成物、免疫原組成物またはワクチン組成
物であるということは理解できよう。
たはその発現産物）を含む免疫学的組成物が免疫応答を局所的または全身に誘導
するものをいう。その応答は保護応答でなくてもよい。本発明組換え体またはベ
クター（またはその発現産物）を含む免疫原組成物も同様に局所的または全身に
免疫応答を誘導する引き出す。その応答は保護応答でなくてもよい。ワクチン組
成は局所的または全身に保護応答を誘導する。従って、「免疫学的組成物」およ
び「免疫原組成物」という用語には「ワクチン組成物」を含む（前者の２つは保
護組成物である）。本発明は免疫学的組成物、免疫原組成物またはワクチン組成
物であるということは理解できよう。
【００４１】
供与量、投与経路、調合法、アジュバントおよび組換え体ウィルスおよびその
発現産物の使用方法に関しては、本発明組成物を腸管外または粘膜経由、好まし
くは皮内または皮下または筋肉経路で投与で使用できる。粘膜投与を使う場合、
経口、経眼または経鼻経路を使用することができる。本発明のさらに他の観点か
ら、本発明は本発明の組換え体またはベクターの発現産物、例えば治療、予防、
診断または試験のための免疫学的組成物またはワクチン組成物の形を産物または
ウィルス、例えば組換え体ポックスウィルスと、この組換え体または本発明ウィ
ルスからのＤＮＡ、例えばＤＮＡプローブおよびPCRプライマを作るのに有効で
あるポックスウィルスとその使用に関するものである。 一つの観点から、本発明は組換え体ベクター、例えばウィルス、例えばＰＲＲ
ＳＶからのDNAの塩基配列を含む組換え体ポックスウィルスのようなウィルス、
例えばポックスウィルスゲノム、好ましくはそのウィルスの本質的でない領域、
ポックスウィルスゲノムを提供する。ポックスウィルスはワクシニアウィルス、
例えばNYVACまたはNYVAC-ベースのウィルスにすることができ、ポックスウィル
スは鶏痘ウィルス、特に弱毒化された鶏痘ウィルスTROVACのようなアビポックス
ウィルス、カナリア痘ウイルス、特にALVACのような弱毒化されたカナリア痘ウ
イルスであるのが好ましい。
発現産物の使用方法に関しては、本発明組成物を腸管外または粘膜経由、好まし
くは皮内または皮下または筋肉経路で投与で使用できる。粘膜投与を使う場合、
経口、経眼または経鼻経路を使用することができる。本発明のさらに他の観点か
ら、本発明は本発明の組換え体またはベクターの発現産物、例えば治療、予防、
診断または試験のための免疫学的組成物またはワクチン組成物の形を産物または
ウィルス、例えば組換え体ポックスウィルスと、この組換え体または本発明ウィ
ルスからのＤＮＡ、例えばＤＮＡプローブおよびPCRプライマを作るのに有効で
あるポックスウィルスとその使用に関するものである。 一つの観点から、本発明は組換え体ベクター、例えばウィルス、例えばＰＲＲ
ＳＶからのDNAの塩基配列を含む組換え体ポックスウィルスのようなウィルス、
例えばポックスウィルスゲノム、好ましくはそのウィルスの本質的でない領域、
ポックスウィルスゲノムを提供する。ポックスウィルスはワクシニアウィルス、
例えばNYVACまたはNYVAC-ベースのウィルスにすることができ、ポックスウィル
スは鶏痘ウィルス、特に弱毒化された鶏痘ウィルスTROVACのようなアビポックス
ウィルス、カナリア痘ウイルス、特にALVACのような弱毒化されたカナリア痘ウ
イルスであるのが好ましい。
【００４２】
本発明では組換え体ベクター、例えばポックスウィルスのようなウィルスは外
来のＰＲＲＳＶ遺伝子または核酸分子を発現する。特定のＰＲＲＳＶ ORFからの
エピトープをコードする特定のＰＲＲＳＶのORFまたは核酸分子が組換え体ベク
ター、例えばポックスウィルスベクターのようなウィルスに挿入され、得られた
ベクター、例えばポックスウィルスのような組換え体ウィルスはそれを投与した
動物に感染させるかその動物でインビトロで発現させるために用いる。ＰＲＲＳ
Ｖ遺伝産物の動物での発現でＰＲＲＳＶに対する動物の免疫応答を導くことがで
きる。従って、本発明の組換え体ベクター、例えばポックスウィルスを免疫学的
組成物またはワクチンで用いて免疫応答を誘導する手段として用いることができ
る。
来のＰＲＲＳＶ遺伝子または核酸分子を発現する。特定のＰＲＲＳＶ ORFからの
エピトープをコードする特定のＰＲＲＳＶのORFまたは核酸分子が組換え体ベク
ター、例えばポックスウィルスベクターのようなウィルスに挿入され、得られた
ベクター、例えばポックスウィルスのような組換え体ウィルスはそれを投与した
動物に感染させるかその動物でインビトロで発現させるために用いる。ＰＲＲＳ
Ｖ遺伝産物の動物での発現でＰＲＲＳＶに対する動物の免疫応答を導くことがで
きる。従って、本発明の組換え体ベクター、例えばポックスウィルスを免疫学的
組成物またはワクチンで用いて免疫応答を誘導する手段として用いることができ
る。
【００４３】
組換え体ベクター、例えば組換え体ポックスウィルス−ＰＲＲＳＶのような組
換え体ウィルスまたはその発現産物と、本発明組成物、例えば免疫学的組成物ま
たはワクチン組成物または治療組成物（例えばポックスウィルスまたはその発現
産物のような組換え体ベクターを含む組成物または組換え体ウィルス）の投与経
路は経腸管外、皮内、筋肉内または皮下にすることができる。この投与によって
全身での免疫応答または液性または細胞性応答をえることができる。 ベクターまたは組換え体ウィルス−ＰＲＲＳＶ、例えばポックスウィルス−Ｐ
ＲＲＳＶまたはその発現産物またはこれらの発現産物および／またはベクターを
含む組成物またはウィルスは任意の年齢または性のブタにも与えて、ＰＲＲＳＶ
に対する免疫応答を引き出し、例えばＰＲＲＳＶおよび／またはＰＲＲＳＶに関
連した他の疾患症を予防することができる。上記ベクターまたは組換え体ウィル
ス−ＰＲＲＳＶ、例えばポックスウィルス−ＰＲＲＳＶまたはその発現産物また
はこの発現産物および／またはベクターを含む組成物またはウィルスは、子豚お
よび／または妊娠した雌ブタを含む新生児または非常に若いブタへ投与されて妊
娠期間中に活性免疫を授け、および／または、母性の抗体を介して新産児にパッ
シブ免疫を与える。
換え体ウィルスまたはその発現産物と、本発明組成物、例えば免疫学的組成物ま
たはワクチン組成物または治療組成物（例えばポックスウィルスまたはその発現
産物のような組換え体ベクターを含む組成物または組換え体ウィルス）の投与経
路は経腸管外、皮内、筋肉内または皮下にすることができる。この投与によって
全身での免疫応答または液性または細胞性応答をえることができる。 ベクターまたは組換え体ウィルス−ＰＲＲＳＶ、例えばポックスウィルス−Ｐ
ＲＲＳＶまたはその発現産物またはこれらの発現産物および／またはベクターを
含む組成物またはウィルスは任意の年齢または性のブタにも与えて、ＰＲＲＳＶ
に対する免疫応答を引き出し、例えばＰＲＲＳＶおよび／またはＰＲＲＳＶに関
連した他の疾患症を予防することができる。上記ベクターまたは組換え体ウィル
ス−ＰＲＲＳＶ、例えばポックスウィルス−ＰＲＲＳＶまたはその発現産物また
はこの発現産物および／またはベクターを含む組成物またはウィルスは、子豚お
よび／または妊娠した雌ブタを含む新生児または非常に若いブタへ投与されて妊
娠期間中に活性免疫を授け、および／または、母性の抗体を介して新産児にパッ
シブ免疫を与える。
【００４４】
本発明の好ましい実施例では、雌ブタ（例えば経産雌ブタ、未経産雌ブタ）に
ＰＲＲＳＶからの免疫原またはこの免疫原からの所望エピトープから成る組成物
を投与する。この組成物は例えばＰＲＲＳＶORE2、ORF３、ORF 4、ORF５,ORF 6
および／またはORF 7からの免疫原、例えばＰＲＲＳＶORF 3と5、または5と6ま
たは4と5、並びに、これらの組合せ3と5と6または4と5と6および／またはこれら
ORFのいずれかつを発現するエピトープまたはORFの組合せおよび／または上記免
疫原または所望エピトープを発現するベクターを含む。投与は繁殖前および／ま
たは種付け前および／または妊娠中（または妊娠時）および／または周産期また
は分娩前に行うことができ、その一一生の間に繰り返して投与でき、好ましくは
種付け前に少なくとも一回投与する。好ましくは妊娠中、例えば妊娠中期（妊娠
の約6−8週目）および／または妊娠終期（妊娠の約11−13週目）に投与する。す
なわち、好ましくは種付け前に投与し、妊娠中にブースター投与する。その後は
、種付け前および／または妊娠中、妊娠中期（妊娠の約6−8週目）および／また
は妊娠終期（妊娠の約11−13週目）に再接種できる。好ましくは、再接種は妊娠
中にのみ行う。他の好ましい実施例では、予防注射をされた雌からの子豚（例え
ば本発明で接種された親からの子豚）は生後の第１週目以内に予防接種され、例
えば生後1および／または2および／または3および／または4および／または5週
目に投与される。好ましくは、新生子豚は生後１週間内または第3週目（例えば
、離乳時）に投与される。これらの子豚には２週目から4週目（最初の接種後）
にブースター投与するのが好ましい。従って、雌ブタ（経産雌ブタ、未経産雌ブ
タ）および新生子豚の両方を本発明組成物および／または本発明方法で管理でき
る。投与法および投与量は上記のものにすることができる。ポックスウィルスま
たはウィルス組成物の投与法および母仔免疫に関しては米国特許第5,338,683号
を参考されたい。
ＰＲＲＳＶからの免疫原またはこの免疫原からの所望エピトープから成る組成物
を投与する。この組成物は例えばＰＲＲＳＶORE2、ORF３、ORF 4、ORF５,ORF 6
および／またはORF 7からの免疫原、例えばＰＲＲＳＶORF 3と5、または5と6ま
たは4と5、並びに、これらの組合せ3と5と6または4と5と6および／またはこれら
ORFのいずれかつを発現するエピトープまたはORFの組合せおよび／または上記免
疫原または所望エピトープを発現するベクターを含む。投与は繁殖前および／ま
たは種付け前および／または妊娠中（または妊娠時）および／または周産期また
は分娩前に行うことができ、その一一生の間に繰り返して投与でき、好ましくは
種付け前に少なくとも一回投与する。好ましくは妊娠中、例えば妊娠中期（妊娠
の約6−8週目）および／または妊娠終期（妊娠の約11−13週目）に投与する。す
なわち、好ましくは種付け前に投与し、妊娠中にブースター投与する。その後は
、種付け前および／または妊娠中、妊娠中期（妊娠の約6−8週目）および／また
は妊娠終期（妊娠の約11−13週目）に再接種できる。好ましくは、再接種は妊娠
中にのみ行う。他の好ましい実施例では、予防注射をされた雌からの子豚（例え
ば本発明で接種された親からの子豚）は生後の第１週目以内に予防接種され、例
えば生後1および／または2および／または3および／または4および／または5週
目に投与される。好ましくは、新生子豚は生後１週間内または第3週目（例えば
、離乳時）に投与される。これらの子豚には２週目から4週目（最初の接種後）
にブースター投与するのが好ましい。従って、雌ブタ（経産雌ブタ、未経産雌ブ
タ）および新生子豚の両方を本発明組成物および／または本発明方法で管理でき
る。投与法および投与量は上記のものにすることができる。ポックスウィルスま
たはウィルス組成物の投与法および母仔免疫に関しては米国特許第5,338,683号
を参考されたい。
【００４５】
本発明組の換え体ベクターまたはウィルス−ＰＲＲＳＶ（例えばポックスウィ
ルス−ＰＲＲＳＶ組換え体）免疫学的組成物またはワクチン組成物または治療組
成物は製薬または獣医学の技術の当業者に周知の標準技術で調製できる。獣医学
の技術の当業者は周知の技術、年齢、性、投与経路等の因子を考慮して供与量を
管理することができる。本発明組成物はそれ単独で管理でき、または「他の」免
疫学的組成物と同時または順番に投与することができる。「他の」免疫学的組成
物としては例えば不活化、弱毒組換え体ワクチン、多価ワクチン、カクテル、本
発明組成物と他の組成物との組合せ等の治療組成物が挙げられる。その組成物は
ＰＲＲＳＶ成分（例えばプラスミドまたはウィルスのような組換え体ベクターま
たはＰＲＲＳＶ抗原またはエピトープを発現するポックスウィルスおよび／また
は所望ＰＲＲＳＶ抗原またはエピトープ）と、一種以上のブタの他の病原ワクチ
ン（例えばエピトープ、抗原および／または組換え体ウィルスのような組換え体
ベクターまたはウィルス、例えば上記エピトープを発現する組換え体ポックスウ
ィルスまたは免疫原）とを含む。ブタの他の病原は例えば一種以上のブタの細菌
性および／またはウイルス病（例えばエピトープまたは一種以上の免疫原からの
一種以上の免疫原またはエピトープ：ブタシルコウイルス（circovirus）、ブタ
パルボウィルス、ブタインフルエンザウィルス、仮性狂犬病ウイルス、大腸菌、
Erysipelothrix rhusiopathiae、マイコプラズマ、hyopneumoniae、Pasteurella
multocida、Bord.etella bronchiseptica、Actinobacillus pneumoniae、豚コ
レラウィルス等にすることができる。この場合にも、成分比、投与方法（同時投
与か順次投与か）、供与量は加齢、性、投与経路のような因子を考慮して調整で
きる。この点に関しては狂犬病組成物および組合せ組成物に関する米国特許第5,
843,456号を参考されたい。この特許の内容は本願明細書の一部を成す。また、
ここで引用した他の文献および狂犬病組成物および組合せ組成物に関する米国特
許出願第60／l5l,564号および米国特許第6217883号も参照。
ルス−ＰＲＲＳＶ組換え体）免疫学的組成物またはワクチン組成物または治療組
成物は製薬または獣医学の技術の当業者に周知の標準技術で調製できる。獣医学
の技術の当業者は周知の技術、年齢、性、投与経路等の因子を考慮して供与量を
管理することができる。本発明組成物はそれ単独で管理でき、または「他の」免
疫学的組成物と同時または順番に投与することができる。「他の」免疫学的組成
物としては例えば不活化、弱毒組換え体ワクチン、多価ワクチン、カクテル、本
発明組成物と他の組成物との組合せ等の治療組成物が挙げられる。その組成物は
ＰＲＲＳＶ成分（例えばプラスミドまたはウィルスのような組換え体ベクターま
たはＰＲＲＳＶ抗原またはエピトープを発現するポックスウィルスおよび／また
は所望ＰＲＲＳＶ抗原またはエピトープ）と、一種以上のブタの他の病原ワクチ
ン（例えばエピトープ、抗原および／または組換え体ウィルスのような組換え体
ベクターまたはウィルス、例えば上記エピトープを発現する組換え体ポックスウ
ィルスまたは免疫原）とを含む。ブタの他の病原は例えば一種以上のブタの細菌
性および／またはウイルス病（例えばエピトープまたは一種以上の免疫原からの
一種以上の免疫原またはエピトープ：ブタシルコウイルス（circovirus）、ブタ
パルボウィルス、ブタインフルエンザウィルス、仮性狂犬病ウイルス、大腸菌、
Erysipelothrix rhusiopathiae、マイコプラズマ、hyopneumoniae、Pasteurella
multocida、Bord.etella bronchiseptica、Actinobacillus pneumoniae、豚コ
レラウィルス等にすることができる。この場合にも、成分比、投与方法（同時投
与か順次投与か）、供与量は加齢、性、投与経路のような因子を考慮して調整で
きる。この点に関しては狂犬病組成物および組合せ組成物に関する米国特許第5,
843,456号を参考されたい。この特許の内容は本願明細書の一部を成す。また、
ここで引用した他の文献および狂犬病組成物および組合せ組成物に関する米国特
許出願第60／l5l,564号および米国特許第6217883号も参照。
【００４６】
本発明組成物の具体例は粘膜投与、例えば経口、経鼻、経眼投与等のための液
体製剤を含む懸濁液、非経口投与薬（皮下、皮内、筋肉）のための例えば滅菌懸
濁液またはエマルション状態の製剤（例えば注射投与約）である。これらの組成
物では組換え体ポックスウィルスまたは免疫原を適切なキャリア、希釈液または
無菌水、生理食塩液または賦形剤と混合した製剤にすることができる。また、本
発明組成物は凍結乾燥することができる。本発明組成物はさらに補助物質、加湿
剤、乳化剤、pH緩衝剤、アジュバント、防腐剤等を投与経路および製法に応じて
加えることができる。
体製剤を含む懸濁液、非経口投与薬（皮下、皮内、筋肉）のための例えば滅菌懸
濁液またはエマルション状態の製剤（例えば注射投与約）である。これらの組成
物では組換え体ポックスウィルスまたは免疫原を適切なキャリア、希釈液または
無菌水、生理食塩液または賦形剤と混合した製剤にすることができる。また、本
発明組成物は凍結乾燥することができる。本発明組成物はさらに補助物質、加湿
剤、乳化剤、pH緩衝剤、アジュバント、防腐剤等を投与経路および製法に応じて
加えることができる。
【００４７】
本発明組成物は、アクリル酸またはメタアクリル酸のポリマーおよび無水マレ
イン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中から選択される少なくとも一種の
アジュバント化合物を含むことができる。好ましいアジュバント化合物はアクリ
ル酸またはメタアクリル酸のポリマー、特にポリアルケニルエーテルまたは糖ま
たは多価アルコールで架橋されたポリマーである。これらの化合物はカルボマー
（carbomer）（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996)の名称で公知である。当
業者は米国特許第2,909,462号（この内容は本願明細書の一部を成す）を参照で
きる。この特許にはポリヒドロキシル化物で架橋されたアクリル重合体が記載さ
れている。このポリヒドロキシル化物は少なくとも３つ、好ましくは8つ以下の
水酸基を有し、少なくとも３つのヒドロキシルの水素原子は少なくとも２つの炭
素原子を有する不飽和脂肪基で置換されている。好ましい基は2〜４の炭素原子
を有する基、例えばビニル、アリールおよび他のエチレン性不飽和基である。こ
の不飽和基自体が他の置換基、例えばメチルを含むことができる。特に好ましい
製品はカルボポル（Carbopol、登録商標) (BF Goodrich, Ohio, USA)の名称で市
販の化合物である。この化合物はアリール糖またはアリールペンタエリスリトー
ルで架橋されている。特に好ましいものはカルボポルCarbopol 974P, 934Pおよ
び971Pである。
イン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中から選択される少なくとも一種の
アジュバント化合物を含むことができる。好ましいアジュバント化合物はアクリ
ル酸またはメタアクリル酸のポリマー、特にポリアルケニルエーテルまたは糖ま
たは多価アルコールで架橋されたポリマーである。これらの化合物はカルボマー
（carbomer）（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996)の名称で公知である。当
業者は米国特許第2,909,462号（この内容は本願明細書の一部を成す）を参照で
きる。この特許にはポリヒドロキシル化物で架橋されたアクリル重合体が記載さ
れている。このポリヒドロキシル化物は少なくとも３つ、好ましくは8つ以下の
水酸基を有し、少なくとも３つのヒドロキシルの水素原子は少なくとも２つの炭
素原子を有する不飽和脂肪基で置換されている。好ましい基は2〜４の炭素原子
を有する基、例えばビニル、アリールおよび他のエチレン性不飽和基である。こ
の不飽和基自体が他の置換基、例えばメチルを含むことができる。特に好ましい
製品はカルボポル（Carbopol、登録商標) (BF Goodrich, Ohio, USA)の名称で市
販の化合物である。この化合物はアリール糖またはアリールペンタエリスリトー
ルで架橋されている。特に好ましいものはカルボポルCarbopol 974P, 934Pおよ
び971Pである。
【００４８】
無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中では無水マレイン酸と
エチレンとの線状または例えばジビニルエーテルで架橋された架橋コポリマーで
あるコポリマーEMA(登録商標) (Monsanto)が好ましい。I. Fields et al, Natur
e, 186: 778-780,4 June 1960を参考。この文献の内容は本願明細書の一部を成
す。 構造的見解から見ると、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよびコポ
リマーEMA(登録商標)は下記式の基本単位からなる：
エチレンとの線状または例えばジビニルエーテルで架橋された架橋コポリマーで
あるコポリマーEMA(登録商標) (Monsanto)が好ましい。I. Fields et al, Natur
e, 186: 778-780,4 June 1960を参考。この文献の内容は本願明細書の一部を成
す。 構造的見解から見ると、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよびコポ
リマーEMA(登録商標)は下記式の基本単位からなる：
【００４９】
【化１】
【００５０】
（ここで、
R1およびR2はHまたはCH3を表し、互いに同一でも異なっていてもよく、
x＝0またはl、好ましくはx＝lで、
y ＝lまたは２で、x＋y＝2である）
コポリマーEMA(登録商標)ではx＝0かつy＝2であり、カルボマーではx＝y＝1で
ある。
ある。
【００５１】
これらのポリマーを水に溶か酸性溶液になり、それを中和、好ましく生理的ｐ
Ｈに中和するとアジュバント溶液になり、その中にワクチンを加えることができ
る。このポリマーのカルボキシル基の一部をCOO-の形にする。 本発明のアジュバント、特にカルボマーの溶液は蒸留水、好ましくは塩化ナト
リウムの存在下に、調製するのが好ましい。得られた溶液は酸性pHである。この
原液をNaC1を加えた水、好ましくは生理食塩液（NaCｌ 9グラム/リットル）で希
釈して所望量（所望の最終濃度を得るための量）にし、次に、好ましくはNaOHで
中和（pH 7.3〜7.4）する。この生理学的pHの溶液をワクチン混合のためにその
ままに使うことができ、得られたワクチンは凍結乾燥でき、また、液状または凍
った形態で保存することができる。
Ｈに中和するとアジュバント溶液になり、その中にワクチンを加えることができ
る。このポリマーのカルボキシル基の一部をCOO-の形にする。 本発明のアジュバント、特にカルボマーの溶液は蒸留水、好ましくは塩化ナト
リウムの存在下に、調製するのが好ましい。得られた溶液は酸性pHである。この
原液をNaC1を加えた水、好ましくは生理食塩液（NaCｌ 9グラム/リットル）で希
釈して所望量（所望の最終濃度を得るための量）にし、次に、好ましくはNaOHで
中和（pH 7.3〜7.4）する。この生理学的pHの溶液をワクチン混合のためにその
ままに使うことができ、得られたワクチンは凍結乾燥でき、また、液状または凍
った形態で保存することができる。
【００５２】
最終ワクチン組成でのポリマー濃度は0.０1〜2％、特に0.06〜1％、好ましく
は0.1〜0.６％である。 本発明組成物は、水中油または油中水の形のエマルジョンにすることもできる
（例えばV. Ganne et al. Vaccine 1994, 12, 1190-1196参照）。 本願に適した調剤法は標準的なテキスト（例えば"REMINGTON'S PHARMACEUTICA
L SCIENCE", 17th edition, 1985）で過度の実験なしに実施できる。この文献の
内容は本願明細書の一部を成す。 本発明組成物は多様な投与経路で投与できる。有効投与量および投与経路は公
知の因子、例えば加齢、性、体重に基づいて過度の実験なしに決定できる。各活
性剤の投与量は引用した文献（または参照またはここで引用された文献で引用さ
れこ文献）に記載されており、および／または、サブユニット免疫原組成物、免
疫学的組成物またはワクチン組成物の場合、１〜数百マイクログラム、例えば1
μ g〜1mgで変えることができる。
は0.1〜0.６％である。 本発明組成物は、水中油または油中水の形のエマルジョンにすることもできる
（例えばV. Ganne et al. Vaccine 1994, 12, 1190-1196参照）。 本願に適した調剤法は標準的なテキスト（例えば"REMINGTON'S PHARMACEUTICA
L SCIENCE", 17th edition, 1985）で過度の実験なしに実施できる。この文献の
内容は本願明細書の一部を成す。 本発明組成物は多様な投与経路で投与できる。有効投与量および投与経路は公
知の因子、例えば加齢、性、体重に基づいて過度の実験なしに決定できる。各活
性剤の投与量は引用した文献（または参照またはここで引用された文献で引用さ
れこ文献）に記載されており、および／または、サブユニット免疫原組成物、免
疫学的組成物またはワクチン組成物の場合、１〜数百マイクログラム、例えば1
μ g〜1mgで変えることができる。
【００５３】
組換え体ベクターは、本願および／または引用した文献に記載の投与量に対応
するインビボ形質発現を得る適切な量を投与できる。例えば、ウイルス懸濁液の
適切な範囲は経験的に決定できる。本発明のウイルスベクターまたは組換え体は
一匹のブタ当たり少なくとも103pfuの量、特に104〜1010pfu、好ましくは105〜1
09pfu、例えば2mlの投与量につき106〜108pfuを投与、感染、トランスフェクト
することができる。複数の遺伝子製品が複数の組換え体によって発現さる場合に
は、各組換え体を上記の量で投与できる。すなわち、組合せの場合には上記の量
を組換え体の合計の量にして投与できる。本発明で使用する組換え体ベクター組
成物の場合の投与量は上記または引用した文献または文献に記載の参照または引
用された文献に記載の量にすることができる。例えば、組換え体ベクター組成物
の各ＤＮＡの適切な量は１μg〜２mg、好ましくは50μg〜1mgである。ＤＮＡベ
クターに関して引用した文献（または引用された文献で参照された文献）を参考
に当業者は本発明の組換えＤＮＡベクター組成物の他の適切な供与量を過度の実
験なしに決めることができる。
するインビボ形質発現を得る適切な量を投与できる。例えば、ウイルス懸濁液の
適切な範囲は経験的に決定できる。本発明のウイルスベクターまたは組換え体は
一匹のブタ当たり少なくとも103pfuの量、特に104〜1010pfu、好ましくは105〜1
09pfu、例えば2mlの投与量につき106〜108pfuを投与、感染、トランスフェクト
することができる。複数の遺伝子製品が複数の組換え体によって発現さる場合に
は、各組換え体を上記の量で投与できる。すなわち、組合せの場合には上記の量
を組換え体の合計の量にして投与できる。本発明で使用する組換え体ベクター組
成物の場合の投与量は上記または引用した文献または文献に記載の参照または引
用された文献に記載の量にすることができる。例えば、組換え体ベクター組成物
の各ＤＮＡの適切な量は１μg〜２mg、好ましくは50μg〜1mgである。ＤＮＡベ
クターに関して引用した文献（または引用された文献で参照された文献）を参考
に当業者は本発明の組換えＤＮＡベクター組成物の他の適切な供与量を過度の実
験なしに決めることができる。
【００５４】
しかし、適切な免疫応答を誘導する本発明組成物の投与量、成分濃度および投
与のタイミングは血清の抗体タイター、例えばELISAおよび／または血清中和ア
ッセイ分析および／またはブタでのワクチン抗原投与接種評価にによって決定で
きる。この決定は当業者の知識と引用した文献から過度の実験なしに決定できる
。継続投与の時間も当業者の知識と引用した文献から過度の実験なしに決定でき
る。 ＰＲＲＳＶ抗原または所望エピトープはＰＲＲＳＶから得るか、ＰＲＲＳＶ遺
伝子のインビボ発現組換え体またはその部分から得ることができる。発現のため
のベクター（または組換え体）の作成方法および／または使用方法と発現産物お
よびその産物（例えば抗体）の使用は上記で引用した文献および引用文献で参照
した文献と類似の方法と同じである。 適切な供与量を実施例に基づいて決めることもできる。
与のタイミングは血清の抗体タイター、例えばELISAおよび／または血清中和ア
ッセイ分析および／またはブタでのワクチン抗原投与接種評価にによって決定で
きる。この決定は当業者の知識と引用した文献から過度の実験なしに決定できる
。継続投与の時間も当業者の知識と引用した文献から過度の実験なしに決定でき
る。 ＰＲＲＳＶ抗原または所望エピトープはＰＲＲＳＶから得るか、ＰＲＲＳＶ遺
伝子のインビボ発現組換え体またはその部分から得ることができる。発現のため
のベクター（または組換え体）の作成方法および／または使用方法と発現産物お
よびその産物（例えば抗体）の使用は上記で引用した文献および引用文献で参照
した文献と類似の方法と同じである。 適切な供与量を実施例に基づいて決めることもできる。
【００５５】
本発明の一つの観点は好ましくはポックスウィルスゲノムの本質的でない領域
のＰＲＲＳＶからのDNAの塩基配列を含む組換え体ポックスウィルスにある。こ
の組換え体ポックスウィルスは異種ＰＲＲＳＶ遺伝子産物を発現する。特に、Ｐ
ＲＲＳＶタンパクをコードするORF2、ORF３、ORF4、ORF５、ORF 6およびORF７の
遺伝子を単離し、特徴付け、ALVAC（カナリア痘ベクター）組換え体に挿入する
。このALVACカナリア痘ベクターはＰＲＲＳＶORF 3と5または5と6または4と5ま
たはこれらの組合せ3と5と6または4と5と6を含むのが好ましい。使用する分子生
物学的技術はSainbrook et al. (1989)に記載されている。 以下、例示として本発明の実施例を記載するが、本発明が下記の記載に限定さ
れるものではない。
のＰＲＲＳＶからのDNAの塩基配列を含む組換え体ポックスウィルスにある。こ
の組換え体ポックスウィルスは異種ＰＲＲＳＶ遺伝子産物を発現する。特に、Ｐ
ＲＲＳＶタンパクをコードするORF2、ORF３、ORF4、ORF５、ORF 6およびORF７の
遺伝子を単離し、特徴付け、ALVAC（カナリア痘ベクター）組換え体に挿入する
。このALVACカナリア痘ベクターはＰＲＲＳＶORF 3と5または5と6または4と5ま
たはこれらの組合せ3と5と6または4と5と6を含むのが好ましい。使用する分子生
物学的技術はSainbrook et al. (1989)に記載されている。 以下、例示として本発明の実施例を記載するが、本発明が下記の記載に限定さ
れるものではない。
【００５６】
【実施例】細胞系およびウィルス株
ＰＲＲＳＶの株は1991年にドイツで感染子豚の異なる器官から単離されたΜＬ
20−117B／13／Macro／1／27−01−93である。ATCC VR−2332、米国特許第5,47
6,778号、米国特許第5,620,691号、国際特許第WO92/21375号、1991年6月5日にパ
スツール研究所（パリ、フランス）に寄託した1−1102、Meulenberg J. et al.,
Virology, 192:62-72 (1993)、Mardassi H. et al., Arch. Virol., 140:1405-
1418 (1995)、Den Boon et al., 1991; Godeny et al., 1993、Meulenberg et a
l. 1993a、国際特許第WO 98/03658号、国際特許第PCT/FR97/01313号、フランス
特許出願第96／09338、米国特許出願第09/232468号、Murtaugh, 1995および本明
細書で引用した他の文献も参照。
20−117B／13／Macro／1／27−01−93である。ATCC VR−2332、米国特許第5,47
6,778号、米国特許第5,620,691号、国際特許第WO92/21375号、1991年6月5日にパ
スツール研究所（パリ、フランス）に寄託した1−1102、Meulenberg J. et al.,
Virology, 192:62-72 (1993)、Mardassi H. et al., Arch. Virol., 140:1405-
1418 (1995)、Den Boon et al., 1991; Godeny et al., 1993、Meulenberg et a
l. 1993a、国際特許第WO 98/03658号、国際特許第PCT/FR97/01313号、フランス
特許出願第96／09338、米国特許出願第09/232468号、Murtaugh, 1995および本明
細書で引用した他の文献も参照。
【００５７】
親のカナリア痘ウイルス（Rentschler株）はカナリアに対するワクチン株であ
る。このワクチン株は野生からの単離物から得たものをニワトリ胚繊維芽細胞上
で200世代以上連続継代して弱毒化したものである。マスターウイルス種に４回
の連続した寒天プラーク精製を行い、一つのプラーククローンを5回の追加の継
代で培養した後、得られたストックウィルスをインビトロ組換えテストののその
親ウィルスとして用いた。プラーク精製したカナリア痘ウイルス単離物はALVAC
とよばれる。このALVACは1996年11月14日にブダペスト条約に基づき米国のType
Culture CollectionにATCC受入れ番号VR-2547で寄託されている。他の引用文献
も参照のこと。
る。このワクチン株は野生からの単離物から得たものをニワトリ胚繊維芽細胞上
で200世代以上連続継代して弱毒化したものである。マスターウイルス種に４回
の連続した寒天プラーク精製を行い、一つのプラーククローンを5回の追加の継
代で培養した後、得られたストックウィルスをインビトロ組換えテストののその
親ウィルスとして用いた。プラーク精製したカナリア痘ウイルス単離物はALVAC
とよばれる。このALVACは1996年11月14日にブダペスト条約に基づき米国のType
Culture CollectionにATCC受入れ番号VR-2547で寄託されている。他の引用文献
も参照のこと。
【００５８】
ポックスウィルス組換え体の生成には以下の複数の異なる段階が含まれる。す
なわち、(1)ポックスウィルスゲノム内で挿入部位をフランキングする配列（"ア
ーム"）と２つのフランキングアームの間に位置した多重クローニングサイト（M
CS）を含むプラスミドを挿入する構築段階（実施例1を参照）、(2)異質遺伝子形
質発現カセットを組成物挿入した上記MCSに挿入プラスミドから成るドナープラ
スミドを構築する段階（実施例2および3を参照）、（3）ドナープラスミドのア
ームと親のポックスウィルスのゲノムとの間で細胞培養インビトロ組換えを行っ
てポックスウィルスゲノムの適当な遺伝子部位に異種遺伝子形質発現カセットを
のその挿入し、組換え体ウィルスをプラーク精製する（実施例10を参照）。
なわち、(1)ポックスウィルスゲノム内で挿入部位をフランキングする配列（"ア
ーム"）と２つのフランキングアームの間に位置した多重クローニングサイト（M
CS）を含むプラスミドを挿入する構築段階（実施例1を参照）、(2)異質遺伝子形
質発現カセットを組成物挿入した上記MCSに挿入プラスミドから成るドナープラ
スミドを構築する段階（実施例2および3を参照）、（3）ドナープラスミドのア
ームと親のポックスウィルスのゲノムとの間で細胞培養インビトロ組換えを行っ
てポックスウィルスゲノムの適当な遺伝子部位に異種遺伝子形質発現カセットを
のその挿入し、組換え体ウィルスをプラーク精製する（実施例10を参照）。
【００５９】実施例1 C6部位挿入のカナリア痘プラスミドの構築
図1（配列番号：1）はカナリア痘ＤＮＡの3.7kb断片の配列である。この配列
の分析から、位置377から始まり、位置2254で終るC6LとよばれるORFが分かって
いる。以下、C6ORFを除去し、それを転写、翻訳終了信号によってフランキング
された多クローニングサイト（MCS）で置換することによって構築したC6挿入プ
ラスミドについて説明する。380bp PCR断片をオリゴヌクレオチドプライマーC6A
1（配列番号：2）およびC6BI（配列番号：3）を用いて遺伝子操作したカナリア
痘ＤＮＡから培養する。1155bp PCR断片はオリゴヌクレオチドプライマーC6C1（
配列番号：4）およびC6D1（配列番号：5）を用いて遺伝子操作したカナリア痘Ｄ
ＮＡから培養する。380bpおよび1155bpの断片を加えて鋳型として一緒にして融
合し、1613bp PCR断片をオリゴヌクレオチドプライマC6A1（配列番号：2）およ
びC6D1（配列番号：5）を用いて培養する。この断片をSadおよびKpnIで消化し、
SacIIKpnIで消化したpBluescript SK+にリゲートした。得られたプラスミドpC6L
はDNAの塩基配列分析で確認した。これはC6（「C6左アーム」）のカナリア痘Ｄ
ＮＡ上流側370bp、ワクシニア早期終結信号、６つの解読枠の翻訳ストップコー
ドン、SmaI、PstI、XhoIおよびEcoRl部位を含むMCS、ワクシニア早期終結信号、
６つの解読枠の翻訳停止コードンおよびカナリア痘配列（「C6右アーム」）の下
流1156bpからなる。
の分析から、位置377から始まり、位置2254で終るC6LとよばれるORFが分かって
いる。以下、C6ORFを除去し、それを転写、翻訳終了信号によってフランキング
された多クローニングサイト（MCS）で置換することによって構築したC6挿入プ
ラスミドについて説明する。380bp PCR断片をオリゴヌクレオチドプライマーC6A
1（配列番号：2）およびC6BI（配列番号：3）を用いて遺伝子操作したカナリア
痘ＤＮＡから培養する。1155bp PCR断片はオリゴヌクレオチドプライマーC6C1（
配列番号：4）およびC6D1（配列番号：5）を用いて遺伝子操作したカナリア痘Ｄ
ＮＡから培養する。380bpおよび1155bpの断片を加えて鋳型として一緒にして融
合し、1613bp PCR断片をオリゴヌクレオチドプライマC6A1（配列番号：2）およ
びC6D1（配列番号：5）を用いて培養する。この断片をSadおよびKpnIで消化し、
SacIIKpnIで消化したpBluescript SK+にリゲートした。得られたプラスミドpC6L
はDNAの塩基配列分析で確認した。これはC6（「C6左アーム」）のカナリア痘Ｄ
ＮＡ上流側370bp、ワクシニア早期終結信号、６つの解読枠の翻訳ストップコー
ドン、SmaI、PstI、XhoIおよびEcoRl部位を含むMCS、ワクシニア早期終結信号、
６つの解読枠の翻訳停止コードンおよびカナリア痘配列（「C6右アーム」）の下
流1156bpからなる。
【００６０】
異種遺伝子に連結したワクシニアH6プロモータ因子を含むカセットをpC6LのSm
aJJEcoRI部位にリゲートして（Taylor et al. (1988c), Guo et a!. (1989), an
d Perkus et al. (1989)に記載）、pC6LからプラスミドpJP099を作る。このプラ
スミドpJP099はH6プロモータの3.に位置する独特なEcoRV部位と独特なNruI部位
とを含み、異種遺伝子の停止PコードンとC6左アームとの間に独特なSailとPspAI
部位を有する。従って、このpJP099からの4.5kbのEcoRV/SallまたはEcoRVIPspAI
断片は上記プラスミド配列（pBluescript SK+、Stratagene, La Jolla, CA, USA
）、２つのC6アーム、EcoRVまでのH6プロモータの5端を含む。プラスミドpJΜＬ
05はpC6Lに挿入した異種遺伝子を含むpJP099の誘導体である。pJΜＬ05からの〜
4.5kbのEcoRV/SalI断片は上記pJP099のそれと同じである。
aJJEcoRI部位にリゲートして（Taylor et al. (1988c), Guo et a!. (1989), an
d Perkus et al. (1989)に記載）、pC6LからプラスミドpJP099を作る。このプラ
スミドpJP099はH6プロモータの3.に位置する独特なEcoRV部位と独特なNruI部位
とを含み、異種遺伝子の停止PコードンとC6左アームとの間に独特なSailとPspAI
部位を有する。従って、このpJP099からの4.5kbのEcoRV/SallまたはEcoRVIPspAI
断片は上記プラスミド配列（pBluescript SK+、Stratagene, La Jolla, CA, USA
）、２つのC6アーム、EcoRVまでのH6プロモータの5端を含む。プラスミドpJΜＬ
05はpC6Lに挿入した異種遺伝子を含むpJP099の誘導体である。pJΜＬ05からの〜
4.5kbのEcoRV/SalI断片は上記pJP099のそれと同じである。
【００６１】そのプライマの配列
：
プライマC6A1（配列番号：2）
【００６２】実施例2 ＰＲＲＳＶの作成とウィルスＲＮＡの抽出
ＰＲＲＳＶ株ΜＬ20−117B/13/Macro/1/27-01-93を、5％ウシ胎仔血清を補給
したDMEM培地のMA1O4細胞で培養した。4日間インキュベーションした後、感染細
胞を37℃で回収した。細胞残存物を３回の凍結融解サイクル後に遠心分離して除
去した。 ウイルスの懸濁からMicro-Scale全ＲＮＡ分離器キット(Clontech Laboratorie
s, Inc., Palo Alto, CA, U.S.A、Cat#K1044-1、ORF4〜7の場合）または高純度
ＲＮＡ単離キット(Boehringer Mannheirn Gmbh, Roche Molecular Biochemicals
, Mannheim, .Germany、ref 1828665、ORF 2および3の場合)の指示に従って全Ｒ
ＮＡを抽出した。ＲＮＡペレットは20μ1のDEPC処理水中にケン濁させた。
したDMEM培地のMA1O4細胞で培養した。4日間インキュベーションした後、感染細
胞を37℃で回収した。細胞残存物を３回の凍結融解サイクル後に遠心分離して除
去した。 ウイルスの懸濁からMicro-Scale全ＲＮＡ分離器キット(Clontech Laboratorie
s, Inc., Palo Alto, CA, U.S.A、Cat#K1044-1、ORF4〜7の場合）または高純度
ＲＮＡ単離キット(Boehringer Mannheirn Gmbh, Roche Molecular Biochemicals
, Mannheim, .Germany、ref 1828665、ORF 2および3の場合)の指示に従って全Ｒ
ＮＡを抽出した。ＲＮＡペレットは20μ1のDEPC処理水中にケン濁させた。
【００６３】実施例3 ＰＲＲＳＶORF2に対するALVACドナープラスミドの構築
最初のストランドｃDNA合成は、1ｓｔストランド相補ＤＮＡ合成キット（Perk
in Elmer、Roche Molecular Systems Inc., Branchburg, NJ, U.S.A.; Cat #N8
08-0017)に従って、１μｌのＲＮＡ（実施例2を参照）と、19μｌのＲＴ−PCR M
aster Mixとから最終容積を20μｌにして実行した。上記のMaster MixhはMgC12
（5mM）、PCR 緩衝液ll（lx）、dNTPs（1mM）、Ｒnaseインヒビター（IU）、Mur
in.e Leukemia Virus Reverse Transcriptase（2.5U）およびプライマ（配列番
号：6）として 用いるオリゴヌクレオチドPB613（0.75μM）を含む。反応混合物
を42℃で15分、99℃で5分、４℃で５分連続して培養した。その後、一本鎖相補
ＤＮＡをPCR−増殖し、オリゴヌクレオチドプライマPB612（配列番号：7）およ
びPB613（配列番号：6）を含む最終容積100μｌを得た。この最終容積は20μｌ
のRT−PCR反応物と、80μｌのPCR混合物（10μｌの１０Ｘ緩衝液、25mMのdNTP、
2.5Ｕのクローン化されたPfuＤＮＡポリメラーゼ(ref ＃600154; Stratagene, L
a Jolla, California, USA)から成る。培養は35サイクル実行した（95℃で45秒
間、56℃で45秒間および72℃で１分間）。ＰＲＲＳＶORF 2およびORF３コード配
列を含む1534bpのPCR断片をGeneclean（GENECLEANキット、BIO101、Vista、CA、
米国）で精製し、pCRIIプラスミド(Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.)へクロ
ーニングした。得られたプラスミドをpPB356とよぶ。
in Elmer、Roche Molecular Systems Inc., Branchburg, NJ, U.S.A.; Cat #N8
08-0017)に従って、１μｌのＲＮＡ（実施例2を参照）と、19μｌのＲＴ−PCR M
aster Mixとから最終容積を20μｌにして実行した。上記のMaster MixhはMgC12
（5mM）、PCR 緩衝液ll（lx）、dNTPs（1mM）、Ｒnaseインヒビター（IU）、Mur
in.e Leukemia Virus Reverse Transcriptase（2.5U）およびプライマ（配列番
号：6）として 用いるオリゴヌクレオチドPB613（0.75μM）を含む。反応混合物
を42℃で15分、99℃で5分、４℃で５分連続して培養した。その後、一本鎖相補
ＤＮＡをPCR−増殖し、オリゴヌクレオチドプライマPB612（配列番号：7）およ
びPB613（配列番号：6）を含む最終容積100μｌを得た。この最終容積は20μｌ
のRT−PCR反応物と、80μｌのPCR混合物（10μｌの１０Ｘ緩衝液、25mMのdNTP、
2.5Ｕのクローン化されたPfuＤＮＡポリメラーゼ(ref ＃600154; Stratagene, L
a Jolla, California, USA)から成る。培養は35サイクル実行した（95℃で45秒
間、56℃で45秒間および72℃で１分間）。ＰＲＲＳＶORF 2およびORF３コード配
列を含む1534bpのPCR断片をGeneclean（GENECLEANキット、BIO101、Vista、CA、
米国）で精製し、pCRIIプラスミド(Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.)へクロ
ーニングした。得られたプラスミドをpPB356とよぶ。
【００６４】
このpPB356の３つのクローンの挿入配列からORF2および3のためのコンセンサ
ス配列を作る。ORF2のコンセンサスヌクレオチド配列は５の位置で参考配列（Ｐ
ＲＲＳＶ Lelystad株、Genebank受入れ番号M96262）と異なり（750bp中99％の相
同）、その2つはアミノ酸配列に変っている（アミノ酸29：pPB356ではSer、Lely
stadではPro、アミノ酸122: pPB356ではVal、LelystadではAla）。ORP3のコンセ
ンサスヌクレオチド配列は６つの位置で参考配列 (ＰＲＲＳＶ Lelystad strain
, Genebank受入れ番号M96262）と異なる（798bp中99％の相同性）。その4つがア
ミノ酸配列を変えている（アミノ酸15：pPB356ではVA、Lelystad ではPhe、アミ
ノ酸93：pPB356ではPro、LelystadではSer、アミノ酸102：pPB356ではArg、Lely
stadではLys、アミノ酸150：pPB356ではGln、Le1ystadではHis）。クローンpPB3
56.6AはORF2およびORF３のためのコンセンサスアミノ酸配列を含んでいる。
ス配列を作る。ORF2のコンセンサスヌクレオチド配列は５の位置で参考配列（Ｐ
ＲＲＳＶ Lelystad株、Genebank受入れ番号M96262）と異なり（750bp中99％の相
同）、その2つはアミノ酸配列に変っている（アミノ酸29：pPB356ではSer、Lely
stadではPro、アミノ酸122: pPB356ではVal、LelystadではAla）。ORP3のコンセ
ンサスヌクレオチド配列は６つの位置で参考配列 (ＰＲＲＳＶ Lelystad strain
, Genebank受入れ番号M96262）と異なる（798bp中99％の相同性）。その4つがア
ミノ酸配列を変えている（アミノ酸15：pPB356ではVA、Lelystad ではPhe、アミ
ノ酸93：pPB356ではPro、LelystadではSer、アミノ酸102：pPB356ではArg、Lely
stadではLys、アミノ酸150：pPB356ではGln、Le1ystadではHis）。クローンpPB3
56.6AはORF2およびORF３のためのコンセンサスアミノ酸配列を含んでいる。
【００６５】
ＰＲＲＳＶORF2はプライマJP800（配列番号：８、H6プロモータの3（EcoRVか
ら）とＰＲＲＳORF2の5端とを含む）とJP801（配列番号：9、ＰＲＲＳORF2の3と
SalIクローニング端とを含む）とを用いてプラスミドpPB356.6AでのPCRで得られ
、PCR JI315とよばれる〜770 bp断片ができる。このPCR J13 l5をEcoRV/SalIで
消化してpJP105から〜4.5kbのEcoRV/SalI断片にクローニングした（実施例1参照
）。 得られたプラスミドを配列分析で確認し、pJP115と名付けた（図2の地図と、
図3の配列（配列番号：10）を参照）。このドナープラスミドpJPll5（NotIで線
形化）をインビボ組換え（IVR）アッセイで用いてALVAC組換え体vCP1642（実施
例10の参照）をつくる。
ら）とＰＲＲＳORF2の5端とを含む）とJP801（配列番号：9、ＰＲＲＳORF2の3と
SalIクローニング端とを含む）とを用いてプラスミドpPB356.6AでのPCRで得られ
、PCR JI315とよばれる〜770 bp断片ができる。このPCR J13 l5をEcoRV/SalIで
消化してpJP105から〜4.5kbのEcoRV/SalI断片にクローニングした（実施例1参照
）。 得られたプラスミドを配列分析で確認し、pJP115と名付けた（図2の地図と、
図3の配列（配列番号：10）を参照）。このドナープラスミドpJPll5（NotIで線
形化）をインビボ組換え（IVR）アッセイで用いてALVAC組換え体vCP1642（実施
例10の参照）をつくる。
【００６６】プライマの配列
【００６７】実施例4 ＰＲＲＳＶORF3のためのALVACドナープラスミドの構築
そのクローンpPB356.6A（実施例3参照）からのＰＲＲＳＶORF３の配列はポッ
クスウィルスの早期転写終結信号であることが知られている334−340位置にT5NT
を含み、従って、自然に突然変異させる必要がある。ORF３はプライマJP804（配
列番号：11、H6プロモータ（EcoRV部位から）の3端と、ＰＲＲＳORF３の5端とを
含む）と、JP805（配列番号：12、ＰＲＲＳORF３の3端と、SalIクローニングサ
イトとを含む）を用いたプラスミドpPB356.6AでのPCRでの培養によって〜820bp
断片（PCR J1317Aとよばれる）を作る。このPCR J1317AをEcoRV/SalIで消化し、
pJP105から〜4.5kbのEcoRV/SalI断片ののクローニングした（実施例1参照）。8S
20および8S19と名付けた得られたプラスミドの２つのクローンのORF３配列を決
定した。ORF３の正しい配列がクローン8S19および8S20のそれぞれでT5NT信号の
前（5）および後（3）に見られた。
クスウィルスの早期転写終結信号であることが知られている334−340位置にT5NT
を含み、従って、自然に突然変異させる必要がある。ORF３はプライマJP804（配
列番号：11、H6プロモータ（EcoRV部位から）の3端と、ＰＲＲＳORF３の5端とを
含む）と、JP805（配列番号：12、ＰＲＲＳORF３の3端と、SalIクローニングサ
イトとを含む）を用いたプラスミドpPB356.6AでのPCRでの培養によって〜820bp
断片（PCR J1317Aとよばれる）を作る。このPCR J1317AをEcoRV/SalIで消化し、
pJP105から〜4.5kbのEcoRV/SalI断片ののクローニングした（実施例1参照）。8S
20および8S19と名付けた得られたプラスミドの２つのクローンのORF３配列を決
定した。ORF３の正しい配列がクローン8S19および8S20のそれぞれでT5NT信号の
前（5）および後（3）に見られた。
【００６８】
T5NTを突然変異させるために、プライマJPSO4（配列番号：ll）およびJP821（
配列番号：13、BspEI部位の下流から開始し、T5NT変異を含む配列を含む）とを
用いてプラスミド8S19でPCRJ1319を作った。このPCR J1319をEcorV/BspEIで消化
し、8S20とよばれるEcoRVIBspEIでリゲートする。得られたpJP119と名付けられ
たプラスミドは配列分析で確認した（図4の地図と図5の配列（配列番号：14）参
照）。このドナープラスミドpJP119（NotIで線形化）を用いてインビトロ組換え
（IVR）アッセイでALVAC組換え体vCP1643を作った（実施例10参照）。
配列番号：13、BspEI部位の下流から開始し、T5NT変異を含む配列を含む）とを
用いてプラスミド8S19でPCRJ1319を作った。このPCR J1319をEcorV/BspEIで消化
し、8S20とよばれるEcoRVIBspEIでリゲートする。得られたpJP119と名付けられ
たプラスミドは配列分析で確認した（図4の地図と図5の配列（配列番号：14）参
照）。このドナープラスミドpJP119（NotIで線形化）を用いてインビトロ組換え
（IVR）アッセイでALVAC組換え体vCP1643を作った（実施例10参照）。
【００６９】プライマの配列
【００７０】実施例5 ＰＲＲＳＶORF4のためのALVACドナープラスミドの構築
最初のストランドｃDNA合成は、１μｌのウィルスＲＮＡ（実施例2参照）と1s t
-ストランド相補ＤＮＡ合成キット (Perkin Elmer（Roche Molecular Systems
Inc., Branchburg, NJ, U.S.A. Cat#N808-0017) に従った19μｌのＲＴ−PCR Ma
ster Mixとから成る20μｌの最終容積で実行した。上記Master MixhはMgC12（5m
M）、PCR 緩衝液ll（lx）、dNTPs（1mM）、Ｒnaseインヒビター（IU）、Murine
Leukemia Virus Reverse Transcriptase（2.5U）およびプライマ（配列番号：15
）として用いるオリゴヌクレオチドPB472（0.75μM）を含む。反応混合物を42℃
で15分、99℃で5分、４℃で５分連続して培養した。その後、一本鎖相補ＤＮＡ
をオリゴヌクレオチドプライマPB471（配列番号：16）およびPB472（配列番号：
15）を含むPCR Master Mix（MgC12（2mM）、PCR 緩衝液ll（lx）、Ampli Taq (
登録商標) ＤＮＡ ポリメラーゼ（2.5Ｕ）からなる最終容積100μｌ中で増殖す
る。第１回目の培養を95℃で２分間行った後、培養（56℃で45秒間および72℃で
１分間）を35サイクル実行した。ＰＲＲＳＶORF４コード配列を含むPCR断片をGe
neclean（GENECLEANキット、BIO101、Vista、CA、米国）で精製した後、SalIお
よびBamHIで消化して595bpのSalI−BamHI断片を作った。この断片をSalIおよびB
amHIで消化ベクターpVR10l2 (VICAL Inc., San Diego, CA, U.S.A.)にクローニ
ングしてプラスミドpPB272を作った。３つの独立したクローン中に存在するORF
4の全ての配列を決定し、コンセンサス配列を確定し、基準のＰＲＲＳＶ Lelyst
ad株（Genebank受入れ番号M96262）の配列と比較した。４塩基対が突然変異した
ことが分かる（ORF4の552bp配列中、99％の相同）。が、アミノ酸の変化は一つ
のみである（アミノ酸８： LelystadおよびpPB272でそれぞれPheとLeu）。
Inc., Branchburg, NJ, U.S.A. Cat#N808-0017) に従った19μｌのＲＴ−PCR Ma
ster Mixとから成る20μｌの最終容積で実行した。上記Master MixhはMgC12（5m
M）、PCR 緩衝液ll（lx）、dNTPs（1mM）、Ｒnaseインヒビター（IU）、Murine
Leukemia Virus Reverse Transcriptase（2.5U）およびプライマ（配列番号：15
）として用いるオリゴヌクレオチドPB472（0.75μM）を含む。反応混合物を42℃
で15分、99℃で5分、４℃で５分連続して培養した。その後、一本鎖相補ＤＮＡ
をオリゴヌクレオチドプライマPB471（配列番号：16）およびPB472（配列番号：
15）を含むPCR Master Mix（MgC12（2mM）、PCR 緩衝液ll（lx）、Ampli Taq (
登録商標) ＤＮＡ ポリメラーゼ（2.5Ｕ）からなる最終容積100μｌ中で増殖す
る。第１回目の培養を95℃で２分間行った後、培養（56℃で45秒間および72℃で
１分間）を35サイクル実行した。ＰＲＲＳＶORF４コード配列を含むPCR断片をGe
neclean（GENECLEANキット、BIO101、Vista、CA、米国）で精製した後、SalIお
よびBamHIで消化して595bpのSalI−BamHI断片を作った。この断片をSalIおよびB
amHIで消化ベクターpVR10l2 (VICAL Inc., San Diego, CA, U.S.A.)にクローニ
ングしてプラスミドpPB272を作った。３つの独立したクローン中に存在するORF
4の全ての配列を決定し、コンセンサス配列を確定し、基準のＰＲＲＳＶ Lelyst
ad株（Genebank受入れ番号M96262）の配列と比較した。４塩基対が突然変異した
ことが分かる（ORF4の552bp配列中、99％の相同）。が、アミノ酸の変化は一つ
のみである（アミノ酸８： LelystadおよびpPB272でそれぞれPheとLeu）。
【００７１】
ALVACC6挿入プラスミドpJP099（実施例1参照）中へＰＲＲＳＶORF 4を挿入す
るために、PCRJ1306をプライマJP762（配列番号：17、H6プロモータ（EcoRV部位
から）の3端と、ＰＲＲＳORF4の5端とを含む）と、JP763（配列番号：18、ＰＲ
ＲＳORF4の3端と、SalIクローン化端とを含む）とを用いてプラスミドpPB272で
作った。このPCR J1306をEcoRV/ SalIで消化し、得られた〜570bp断片を〜4.5 k
b EcoRV/SalIバンドにpJP099からクローニングした。得られたプラスミド（pJP1
03と名付けた）は配列分析の結果、pPB272（図6の地図および図7の配列（配列番
号：19）を参照）と同じORF4のアミノ酸配列を含むことが確認された。このドナ
ープラスミドpJP103（NotIで線形化）を用いてインビトロ組換え（IVR）アッセ
イでALVAC組換え体vCPＬ6I8を作った（実施例10参照）。
るために、PCRJ1306をプライマJP762（配列番号：17、H6プロモータ（EcoRV部位
から）の3端と、ＰＲＲＳORF4の5端とを含む）と、JP763（配列番号：18、ＰＲ
ＲＳORF4の3端と、SalIクローン化端とを含む）とを用いてプラスミドpPB272で
作った。このPCR J1306をEcoRV/ SalIで消化し、得られた〜570bp断片を〜4.5 k
b EcoRV/SalIバンドにpJP099からクローニングした。得られたプラスミド（pJP1
03と名付けた）は配列分析の結果、pPB272（図6の地図および図7の配列（配列番
号：19）を参照）と同じORF4のアミノ酸配列を含むことが確認された。このドナ
ープラスミドpJP103（NotIで線形化）を用いてインビトロ組換え（IVR）アッセ
イでALVAC組換え体vCPＬ6I8を作った（実施例10参照）。
【００７２】プライマ配列
【００７３】実施例6 ＰＲＲＳＶORF５のためのALVACドナープラスミドの構築
最初のストランドｃDNA合成は、１μｌのウィルスＲＮＡ（実施例2参照）と1s t
-ストランド相補ＤＮＡ合成キット (Perkin Elmer（Roche Molecular Systems
Inc., Branchburg, NJ, U.S.A. Cat#N808-0017) に従った19μｌのＲＴ−PCR Ma
ster Mixとから成る20μｌの最終容積で実行した。上記Master MixhはMgC12（5m
M）、PCR 緩衝液ll（lx）、dNTPs（1mM）、Ｒnaseインヒビター（IU）、Murine
Leukemia Virus Reverse Transcriptase（2.5U）およびプライマ（配列番号：20
）として用いるオリゴヌクレオチドPB43（0.75μM）を含む。反応混合物を42℃
で15分、99℃で5分、４℃で５分連続して培養した。その後、一本鎖ｃＤＮＡを2
0μｌのRT−PCR反応物と、オリゴヌクレオチドプライマ462（配列番号：21）お
よびPB43（配列番号：20）を含むPCR Master Mix（MgC12（2mM）、PCR 緩衝液ll
（lx）、Ampli Taq (登録商標) ＤＮＡ ポリメラーゼ（2.5Ｕ）からなる最終容
積100μｌ中で増殖する。 第１回目の培養を95℃で２分間行った後、培養（96℃で45秒間、52℃で45秒間お
よび72℃で１分間）を35サイクル実行した。ＰＲＲＳＶORF５コード配列を含むP
CR断片をGeneclean（GENECLEANキット、BIO101、Vista、CA、米国）で精製した
後、SalIおよびBamHIで消化して642bpのSalI−BamHI断片を作った。この断片をS
alIおよびBamHIで消化したベクターpVR10l2 (VICAL Inc., San Diego, CA, U.S.
A.)にクローニングしてプラスミドpPB273を作った。このPCR断片をベクターpCRl
l（Invitrogen, Carlsbad: CA, U.S.A.)にクローニングしてプラスミドpPB267を
作った。プラスミドpPB273はSalIおよびClalで消化して487bpのSalI −Clal断片
（断片A）にした。プラスミド267はClaIおよびBamHIで消化してl6lbpのClaI−Ba
mHI断片（断片B）にした。これらの断片AおよびBをSalIおよびBamHIで消化した
ベクターpVR1O12(VICAL Inc., San Diego, CA, U.S.A.)にリゲートしてＰＲＲＳ
ＶORF５を含むプラスミドpPB 270を作った。３つの独立したクローン中に存在す
るORF５の全ての配列を決定し、コンセンサス配列を確定し、基準（ＰＲＲＳＶ
Lelystad株、Genebank受入れ番号M96262）の配列と比較して100％の相同がある
ことを確認した。
Inc., Branchburg, NJ, U.S.A. Cat#N808-0017) に従った19μｌのＲＴ−PCR Ma
ster Mixとから成る20μｌの最終容積で実行した。上記Master MixhはMgC12（5m
M）、PCR 緩衝液ll（lx）、dNTPs（1mM）、Ｒnaseインヒビター（IU）、Murine
Leukemia Virus Reverse Transcriptase（2.5U）およびプライマ（配列番号：20
）として用いるオリゴヌクレオチドPB43（0.75μM）を含む。反応混合物を42℃
で15分、99℃で5分、４℃で５分連続して培養した。その後、一本鎖ｃＤＮＡを2
0μｌのRT−PCR反応物と、オリゴヌクレオチドプライマ462（配列番号：21）お
よびPB43（配列番号：20）を含むPCR Master Mix（MgC12（2mM）、PCR 緩衝液ll
（lx）、Ampli Taq (登録商標) ＤＮＡ ポリメラーゼ（2.5Ｕ）からなる最終容
積100μｌ中で増殖する。 第１回目の培養を95℃で２分間行った後、培養（96℃で45秒間、52℃で45秒間お
よび72℃で１分間）を35サイクル実行した。ＰＲＲＳＶORF５コード配列を含むP
CR断片をGeneclean（GENECLEANキット、BIO101、Vista、CA、米国）で精製した
後、SalIおよびBamHIで消化して642bpのSalI−BamHI断片を作った。この断片をS
alIおよびBamHIで消化したベクターpVR10l2 (VICAL Inc., San Diego, CA, U.S.
A.)にクローニングしてプラスミドpPB273を作った。このPCR断片をベクターpCRl
l（Invitrogen, Carlsbad: CA, U.S.A.)にクローニングしてプラスミドpPB267を
作った。プラスミドpPB273はSalIおよびClalで消化して487bpのSalI −Clal断片
（断片A）にした。プラスミド267はClaIおよびBamHIで消化してl6lbpのClaI−Ba
mHI断片（断片B）にした。これらの断片AおよびBをSalIおよびBamHIで消化した
ベクターpVR1O12(VICAL Inc., San Diego, CA, U.S.A.)にリゲートしてＰＲＲＳ
ＶORF５を含むプラスミドpPB 270を作った。３つの独立したクローン中に存在す
るORF５の全ての配列を決定し、コンセンサス配列を確定し、基準（ＰＲＲＳＶ
Lelystad株、Genebank受入れ番号M96262）の配列と比較して100％の相同がある
ことを確認した。
【００７４】
ＰＲＲＳORF５の配列分析から、59−65位置および264−270位置にポックスウ
ィルスの早期転写終結信号であることが知られている２つのT5NTが存在すること
が示された。 ORF５内のコードされる２つのT5NTを自然に突然変異させるために以下の戦略
を用いた。すなわち、T5NT（位置59−65）を突然変異させるために、プライマJP
764（配列番号：22、このプライマ764はH6プロモータの3端と、所望のT5NT変異
を含むＰＲＲＳORF５の5端の最初の71塩基をを含む）と、JP776（配列番号：23
、このプライマJP776はＰＲＲＳORF５の3端と、PspAIクローン化端とを含む）と
プラスミドpPB270でを用いて、〜627bpのPCRJ1307を作り、これをpCR2.1プラス
ミド（Invitrogen、Carlsbad、CA）にクローニングした。得られたプラスミドを
pJP106と名付ける。このプラスミドpJP106からＰＲＲＳORF５を含む〜627 bp Ec
oRVIPspAI断片を単離し、pJP099（実施例１参照）から〜4.5KbのEcoRV／PspAJ断
片にクローニングしてpJP 108とよばれる新しいプラスミドを作る。T5NT（位置2
64−270）を突然変異させるために、PCR31314とよばれる〜345bp断片をプライマ
JP766（配列番号：25、このプライマJP766はH6プロモータの20塩基を含む）と、
JP767（配列番号：24、このプライマJP767は所望のT5NT変異を含むＰＲＲＳORF
５配列を含む）とを用いてプラスミドpJP108で作る。このPCR11314をEcoRV/SnaB
Iで消化してpJP108から〜4.9KbのEcoRV/SnaBI断片にクローニングする。得られ
たドナープラスミド（pJP110と名付ける）は配列分析によって所望のT5NT突然変
異を有するＰＲＲＳORF５を含むことが確認され（ORFの位置63および267でＴか
らCへ変異）、これは遺伝子のアミノ酸配列に影響しない（図８の地図と図9の配
列（配列番号：26）を参照）。このドナープラスミドpJP110（NotIで線形化）を
インビトロ組換え（IVR）アッセイで用いてALVAC組換え体vCPＬ619を作る（実施
例10参照）。
ィルスの早期転写終結信号であることが知られている２つのT5NTが存在すること
が示された。 ORF５内のコードされる２つのT5NTを自然に突然変異させるために以下の戦略
を用いた。すなわち、T5NT（位置59−65）を突然変異させるために、プライマJP
764（配列番号：22、このプライマ764はH6プロモータの3端と、所望のT5NT変異
を含むＰＲＲＳORF５の5端の最初の71塩基をを含む）と、JP776（配列番号：23
、このプライマJP776はＰＲＲＳORF５の3端と、PspAIクローン化端とを含む）と
プラスミドpPB270でを用いて、〜627bpのPCRJ1307を作り、これをpCR2.1プラス
ミド（Invitrogen、Carlsbad、CA）にクローニングした。得られたプラスミドを
pJP106と名付ける。このプラスミドpJP106からＰＲＲＳORF５を含む〜627 bp Ec
oRVIPspAI断片を単離し、pJP099（実施例１参照）から〜4.5KbのEcoRV／PspAJ断
片にクローニングしてpJP 108とよばれる新しいプラスミドを作る。T5NT（位置2
64−270）を突然変異させるために、PCR31314とよばれる〜345bp断片をプライマ
JP766（配列番号：25、このプライマJP766はH6プロモータの20塩基を含む）と、
JP767（配列番号：24、このプライマJP767は所望のT5NT変異を含むＰＲＲＳORF
５配列を含む）とを用いてプラスミドpJP108で作る。このPCR11314をEcoRV/SnaB
Iで消化してpJP108から〜4.9KbのEcoRV/SnaBI断片にクローニングする。得られ
たドナープラスミド（pJP110と名付ける）は配列分析によって所望のT5NT突然変
異を有するＰＲＲＳORF５を含むことが確認され（ORFの位置63および267でＴか
らCへ変異）、これは遺伝子のアミノ酸配列に影響しない（図８の地図と図9の配
列（配列番号：26）を参照）。このドナープラスミドpJP110（NotIで線形化）を
インビトロ組換え（IVR）アッセイで用いてALVAC組換え体vCPＬ619を作る（実施
例10参照）。
【００７５】プライマの配列
【００７６】実施例7 ＰＲＲＳＶORF6のためのALVACドナープラスミドの構築
最初のストランドｃDNA合成は、１μｌのウィルスＲＮＡ（実施例2参照）と1s t
-ストランド相補ＤＮＡ合成キット (Perkin Elmer（Roche Molecular Systems
Inc., Branchburg, NJ, U.S.A. Cat#N808-0017) に従った19μｌのＲＴ−PCR Ma
ster Mixとから成る20μｌの最終容積で実行した。上記Master MixhはMgC12（5m
M）、PCR 緩衝液ll（lx）、dNTPs（1mM）、Ｒnaseインヒビター（IU）、Murine
Leukemia Virus Reverse Transcriptase（2.5U）およびプライマ（配列番号：27
）として用いるオリゴヌクレオチドPB465（0.75μM）を含む。反応混合物を42℃
で15分、99℃で5分、４℃で５分連続して培養した。その後、一本鎖ｃＤＮＡを2
0μｌのRT−PCR反応物と、オリゴヌクレオチドプライマ464（配列番号：28）お
よびPB465（配列番号：27）を含むPCR Master Mix（MgC12（2mM）、PCR 緩衝液l
l（lx）、Ampli Taq (登録商標) ＤＮＡ ポリメラーゼ（2.5Ｕ）からなる最終容
積100μｌ中で増殖する。 第１回目の培養を95℃で２分間行った後、培養（96℃で45秒間、52℃で45秒間お
よび72℃で１分間）を35サイクル実行した。ＰＲＲＳＶORF６コード配列を含むP
CR断片をGeneclean（GENECLEANキット、BIO101、Vista、CA、米国）で精製した
後、SalIおよびBamHIで消化して572bpのSalI−BamHI断片を作った。この断片をS
alIおよびBamHIで消化したベクターpVR10l2 (VICAL Inc., San Diego, CA, U.S.
A.)にクローニングしてプラスミドpPB268を作った。１つのクローン中に存在す
るORF６の配列は基準（ＰＲＲＳＶ Lelystad株、Genebank受入れ番号M96262）の
配列と100％の相同があることを確認した。
Inc., Branchburg, NJ, U.S.A. Cat#N808-0017) に従った19μｌのＲＴ−PCR Ma
ster Mixとから成る20μｌの最終容積で実行した。上記Master MixhはMgC12（5m
M）、PCR 緩衝液ll（lx）、dNTPs（1mM）、Ｒnaseインヒビター（IU）、Murine
Leukemia Virus Reverse Transcriptase（2.5U）およびプライマ（配列番号：27
）として用いるオリゴヌクレオチドPB465（0.75μM）を含む。反応混合物を42℃
で15分、99℃で5分、４℃で５分連続して培養した。その後、一本鎖ｃＤＮＡを2
0μｌのRT−PCR反応物と、オリゴヌクレオチドプライマ464（配列番号：28）お
よびPB465（配列番号：27）を含むPCR Master Mix（MgC12（2mM）、PCR 緩衝液l
l（lx）、Ampli Taq (登録商標) ＤＮＡ ポリメラーゼ（2.5Ｕ）からなる最終容
積100μｌ中で増殖する。 第１回目の培養を95℃で２分間行った後、培養（96℃で45秒間、52℃で45秒間お
よび72℃で１分間）を35サイクル実行した。ＰＲＲＳＶORF６コード配列を含むP
CR断片をGeneclean（GENECLEANキット、BIO101、Vista、CA、米国）で精製した
後、SalIおよびBamHIで消化して572bpのSalI−BamHI断片を作った。この断片をS
alIおよびBamHIで消化したベクターpVR10l2 (VICAL Inc., San Diego, CA, U.S.
A.)にクローニングしてプラスミドpPB268を作った。１つのクローン中に存在す
るORF６の配列は基準（ＰＲＲＳＶ Lelystad株、Genebank受入れ番号M96262）の
配列と100％の相同があることを確認した。
【００７７】
ALVACC6挿入プラスミドpJP099（実施例1参照）中へＰＲＲＳＶORF６を挿入す
るために、PCRJ1302をプライマJP768（配列番号：29、H6プロモータ（EcoRV部位
から）の3端と、ＰＲＲＳORF６の5端とを含む）と、JP769（配列番号：30、ＰＲ
ＲＳORF６の3端と、SalIクローン化端とを含む）とを用いてプラスミドpPB278で
作った。このPCR J1302をEcoRV/ SalIで消化し、得られた〜550bp断片を〜4.5 k
b EcoRV/SalIバンドにpJP099からクローニングした。得られたプラスミド（pJP1
00と名付けた）を配列分析した。その結果、pPB268から１つの塩基が変化してい
ることが確認された（51の位置でＣからＴへ）が、アミノ酸には変化はない（図
10のpJP100の地図および図11の配列（配列番号：31）を参照）。このドナープラ
スミドpJP100（NotIで線形化）を用いて実施例10に記載の方法でインビトロ組換
え（IVR）アッセイでALVAC組換え体vCPＬ6I8を作った。
るために、PCRJ1302をプライマJP768（配列番号：29、H6プロモータ（EcoRV部位
から）の3端と、ＰＲＲＳORF６の5端とを含む）と、JP769（配列番号：30、ＰＲ
ＲＳORF６の3端と、SalIクローン化端とを含む）とを用いてプラスミドpPB278で
作った。このPCR J1302をEcoRV/ SalIで消化し、得られた〜550bp断片を〜4.5 k
b EcoRV/SalIバンドにpJP099からクローニングした。得られたプラスミド（pJP1
00と名付けた）を配列分析した。その結果、pPB268から１つの塩基が変化してい
ることが確認された（51の位置でＣからＴへ）が、アミノ酸には変化はない（図
10のpJP100の地図および図11の配列（配列番号：31）を参照）。このドナープラ
スミドpJP100（NotIで線形化）を用いて実施例10に記載の方法でインビトロ組換
え（IVR）アッセイでALVAC組換え体vCPＬ6I8を作った。
【００７８】プライマの配列
【００７９】実施例8 ＰＲＲＳＶORF5およびORF6のためのALVACダブルドナープラスミドの構築
頭−頭の向き（２つのプロモータの5端を接続し、連結されているそのおよび
中にあるその２つのORFは逆向き、図12参照）でORF６ドナープラスミドへORF５
を挿入するためにpJP110（実施例6参照）からの〜742bpのSmaI/DpnI断片をSmaI
消化したがpJP100（実施例7参照）にクローニングした。得られたプラスミドを
制限解析でＰＲＲＳORF５および６のカセットが所望の向きで含まれることを確
認した。これをpJP 113（図12の地図と図13の配列（配列番号：32）を参照）と
名付けた。このドナープラスミドpJP113（NotIで線形化）をインビトロ組換え（
IVR）アッセイで用いてALVAC組換え体vCPＬ626を作った（実施例10参照）。
中にあるその２つのORFは逆向き、図12参照）でORF６ドナープラスミドへORF５
を挿入するためにpJP110（実施例6参照）からの〜742bpのSmaI/DpnI断片をSmaI
消化したがpJP100（実施例7参照）にクローニングした。得られたプラスミドを
制限解析でＰＲＲＳORF５および６のカセットが所望の向きで含まれることを確
認した。これをpJP 113（図12の地図と図13の配列（配列番号：32）を参照）と
名付けた。このドナープラスミドpJP113（NotIで線形化）をインビトロ組換え（
IVR）アッセイで用いてALVAC組換え体vCPＬ626を作った（実施例10参照）。
【００８０】実施例9 ＰＲＲＳＶORF7のためのALVACドナープラスミドの構築
最初のストランドｃDNA合成は、１μｌのウィルスＲＮＡ（実施例2参照）と1s t
-ストランド相補ＤＮＡ合成キット (Perkin Elmer（Roche Molecular Systems
Inc., Branchburg, NJ, U.S.A. Cat#N808-0017) に従った19μｌのＲＴ−PCR Ma
ster Mixとから成る20μｌの最終容積で実行した。上記Master MixhはMgC12（5m
M）、PCR 緩衝液ll（lx）、dNTPs（1mM）、Ｒnaseインヒビター（IU）、Murine
Leukemia Virus Reverse Transcriptase（2.5U）およびプライマ（配列番号：33
）として用いるオリゴヌクレオチドPB461（0.75μM）を含む。反応混合物を42℃
で15分、99℃で5分、４℃で５分連続して培養した。その後、一本鎖ｃＤＮＡを2
0μｌのRT−PCR反応物と、オリゴヌクレオチドプライマ460（配列番号：34）お
よびPB461（配列番号：33）を含むPCR Master Mix（MgC12（2mM）、PCR 緩衝液l
l（lx）、Ampli Taq (登録商標) ＤＮＡ ポリメラーゼ（2.5Ｕ）からなる最終容
積100μｌ中で増殖する。 第１回目の培養を95℃で２分間行った後、培養（96℃で45秒間、52℃で45秒間お
よび72℃で１分間）を35サイクル実行した。ＰＲＲＳＶORF７コード配列を含むP
CR断片をGeneclean（GENECLEANキット、BIO101、Vista、CA、米国）で精製した
後、SalIおよびBamHIで消化して411bpのSalI−BamHI断片を作った。この断片をS
alIおよびBamHIで消化したベクターpVR10l2 (VICAL Inc., San Diego, CA, U.S.
A.)にクローニングしてプラスミドpPB269を作った。このpPB269の１つのクロー
ン中に存在するORF６の配列は基準（ＰＲＲＳＶ Lelystad株、Genebank受入れ番
号M96262）の配列と100％の相同があることを確認した。
Inc., Branchburg, NJ, U.S.A. Cat#N808-0017) に従った19μｌのＲＴ−PCR Ma
ster Mixとから成る20μｌの最終容積で実行した。上記Master MixhはMgC12（5m
M）、PCR 緩衝液ll（lx）、dNTPs（1mM）、Ｒnaseインヒビター（IU）、Murine
Leukemia Virus Reverse Transcriptase（2.5U）およびプライマ（配列番号：33
）として用いるオリゴヌクレオチドPB461（0.75μM）を含む。反応混合物を42℃
で15分、99℃で5分、４℃で５分連続して培養した。その後、一本鎖ｃＤＮＡを2
0μｌのRT−PCR反応物と、オリゴヌクレオチドプライマ460（配列番号：34）お
よびPB461（配列番号：33）を含むPCR Master Mix（MgC12（2mM）、PCR 緩衝液l
l（lx）、Ampli Taq (登録商標) ＤＮＡ ポリメラーゼ（2.5Ｕ）からなる最終容
積100μｌ中で増殖する。 第１回目の培養を95℃で２分間行った後、培養（96℃で45秒間、52℃で45秒間お
よび72℃で１分間）を35サイクル実行した。ＰＲＲＳＶORF７コード配列を含むP
CR断片をGeneclean（GENECLEANキット、BIO101、Vista、CA、米国）で精製した
後、SalIおよびBamHIで消化して411bpのSalI−BamHI断片を作った。この断片をS
alIおよびBamHIで消化したベクターpVR10l2 (VICAL Inc., San Diego, CA, U.S.
A.)にクローニングしてプラスミドpPB269を作った。このpPB269の１つのクロー
ン中に存在するORF６の配列は基準（ＰＲＲＳＶ Lelystad株、Genebank受入れ番
号M96262）の配列と100％の相同があることを確認した。
【００８１】
ALVACC6挿入プラスミドpJP099（実施例1参照）中へＰＲＲＳＶORF７を挿入す
るために、PCRJ1303をプライマJP770（配列番号：35、H6プロモータ（EcoRV部位
から）の3端と、ＰＲＲＳORF７の5端とを含む）と、JP771（配列番号：36、ＰＲ
ＲＳORF７の3端と、SalIクローン化端とを含む）とを用いてプラスミドpPB269で
作った。このPCR J1303をEcoRV/ SalIで消化し、得られた〜415bp断片を〜4.5 k
b EcoRV/SalIバンドにpJP099からクローニングした。得られたプラスミド（pJP1
01と名付けた）を配列分析した（図14の地図および図15の配列（配列番号：37）
を参照）。このドナープラスミドpJP101（NotIで線形化）を用いて実施例10に記
載の方法でインビトロ組換え（IVR）アッセイでALVAC組換え体を作った。
るために、PCRJ1303をプライマJP770（配列番号：35、H6プロモータ（EcoRV部位
から）の3端と、ＰＲＲＳORF７の5端とを含む）と、JP771（配列番号：36、ＰＲ
ＲＳORF７の3端と、SalIクローン化端とを含む）とを用いてプラスミドpPB269で
作った。このPCR J1303をEcoRV/ SalIで消化し、得られた〜415bp断片を〜4.5 k
b EcoRV/SalIバンドにpJP099からクローニングした。得られたプラスミド（pJP1
01と名付けた）を配列分析した（図14の地図および図15の配列（配列番号：37）
を参照）。このドナープラスミドpJP101（NotIで線形化）を用いて実施例10に記
載の方法でインビトロ組換え（IVR）アッセイでALVAC組換え体を作った。
【００８２】プライマの配列
【００８３】実施例10
ALVAC−ＰＲＲＳＶ 組換え体の作成
プラスミドpJP115（ORF 2、実施例3参照）、pJP119（ORF３、実施例4参照）、
pJP 103（ORF 4、実施例5参照）、pJP110（ORF５、実施例6参照）およびpJP 113
（ORF５およびORF 6、実施例8参照）をNotIで線形にし、上記のリン酸カルシウ
ム沈殿法(Panicali and Paoletti, 1982; Piccini et al., 1987)を用いてALVAC
感染一次CEF細胞にトランスフェクションした。特異的ＰＲＲＳＶ放射化プロー
ブへのハイブリダイゼーションをベースにしてポジなプラークを選択し、プラー
ク精製を4回行って純粋な個体群を得た。各IVRからの一つの代表プラークを培養
し、得られたALVAC組換え体をvCP1642（ORF2）、vCP1643）（ORF３）、vCP1618
（ORF4）、vCP1619（ORF５）およびvCP1626（ORF５およびORF 6）と名付けた。
［表1］にはドナープラスミド、ALVAC組換え体および発現さたＰＲＲＳORFの名
称を示してある。これらの全ての組換え体はALVACベクターとドナープラスミド
との間の組換えの結果であり、ALVAC C6遺伝子位置に挿入されたＰＲＲＳＶORF
を含んでいる。全ての組換え体の遺伝子構造は制限解析と、各種プローブを用い
たサザンブロッティングで決定した。
pJP 103（ORF 4、実施例5参照）、pJP110（ORF５、実施例6参照）およびpJP 113
（ORF５およびORF 6、実施例8参照）をNotIで線形にし、上記のリン酸カルシウ
ム沈殿法(Panicali and Paoletti, 1982; Piccini et al., 1987)を用いてALVAC
感染一次CEF細胞にトランスフェクションした。特異的ＰＲＲＳＶ放射化プロー
ブへのハイブリダイゼーションをベースにしてポジなプラークを選択し、プラー
ク精製を4回行って純粋な個体群を得た。各IVRからの一つの代表プラークを培養
し、得られたALVAC組換え体をvCP1642（ORF2）、vCP1643）（ORF３）、vCP1618
（ORF4）、vCP1619（ORF５）およびvCP1626（ORF５およびORF 6）と名付けた。
［表1］にはドナープラスミド、ALVAC組換え体および発現さたＰＲＲＳORFの名
称を示してある。これらの全ての組換え体はALVACベクターとドナープラスミド
との間の組換えの結果であり、ALVAC C6遺伝子位置に挿入されたＰＲＲＳＶORF
を含んでいる。全ての組換え体の遺伝子構造は制限解析と、各種プローブを用い
たサザンブロッティングで決定した。
【００８４】
【表1】
【００８５】
同様な方法で、ＰＲＲＳＶORF6およびＰＲＲＳＶORF7のみを発現する組換え体
ALVACは実施例7および9にそれぞれ記載のドナープラスミドpJP100およびpJP 101
を用いて作ることができる。
ALVACは実施例7および9にそれぞれ記載のドナープラスミドpJP100およびpJP 101
を用いて作ることができる。
【００８６】実施例11 組換え体カナリア痘ウイルスとカルボポル（CARBOPOL、登録商標）974Pとの組合 せ
ワクチン製法のために、組換え体カナリア痘ウイルス（実施例10）をはカルボ
マー（carbomer）の溶液と混合わせる。本発明のブタワクチン用に使うカルボマ
ー成分はBFグッドリッチ社製造のカルボポル（CARBOPOL、登録商標）9741 P（分
子量3,000,000）である。先ず、塩化ナトリウム（lg./l）を含む蒸留水でカルボ
ポル9741 Pの1.5％原液を調製する。この原液を用いて生理水中にカルボポル974
1 Pの 4mg/m1溶液を作る。原液を一段または何回かに分けて生理水に混合して所
望容積とし、１N（またはそれ以上）の水酸化ナトリウム溶液で各段でpH値を最
終pH値7.3〜7.4へ調整する。この最後のカルボポル9741 P溶液は、凍結乾燥した
組換え体ウィルスの再構成で直ちに使用可能な溶液であるか、濃縮組換え体ウィ
ルス株の希釈に利用できる。例えば2mlの供与量につきl0e8 pfuを含む最終ウイ
ルス懸濁液を得る場合には、10e9pfu/mlのウイルス原液溶液を上記の直ちに使用
可能なカルボポル9741 Pの 4mg/m1溶液1.9mlに希釈する。組換え体ウィルス混合
液の場合にも必要とする最終pfu/ml量を考慮して同様な計算法を適用できる。直
ちに使用可能なカルボポル9741 Pの 2mg/m1溶液も作れる。
マー（carbomer）の溶液と混合わせる。本発明のブタワクチン用に使うカルボマ
ー成分はBFグッドリッチ社製造のカルボポル（CARBOPOL、登録商標）9741 P（分
子量3,000,000）である。先ず、塩化ナトリウム（lg./l）を含む蒸留水でカルボ
ポル9741 Pの1.5％原液を調製する。この原液を用いて生理水中にカルボポル974
1 Pの 4mg/m1溶液を作る。原液を一段または何回かに分けて生理水に混合して所
望容積とし、１N（またはそれ以上）の水酸化ナトリウム溶液で各段でpH値を最
終pH値7.3〜7.4へ調整する。この最後のカルボポル9741 P溶液は、凍結乾燥した
組換え体ウィルスの再構成で直ちに使用可能な溶液であるか、濃縮組換え体ウィ
ルス株の希釈に利用できる。例えば2mlの供与量につきl0e8 pfuを含む最終ウイ
ルス懸濁液を得る場合には、10e9pfu/mlのウイルス原液溶液を上記の直ちに使用
可能なカルボポル9741 Pの 4mg/m1溶液1.9mlに希釈する。組換え体ウィルス混合
液の場合にも必要とする最終pfu/ml量を考慮して同様な計算法を適用できる。直
ちに使用可能なカルボポル9741 Pの 2mg/m1溶液も作れる。
【００８７】実施例12 妊娠した雌ブタモデルでのワクチン接種と抗原投与
8ヵ月齢の未経産雌ブタに個別のALVAC/ＰＲＲＳＶ組換え体またはALVAC/ＰＲ
ＲＳＶ組換え体混合液を予防注射した。ワクチンウイルス懸濁液は組換え体ウィ
ルス株原液を滅菌生理水（NaC1 0.9％）中に希釈して作った。ウイルス懸濁に適
した範囲は約l0e６、l0e７、l0e8 pfu ／単位投与量である。実施例11で説明し
たように、カルボポル9741Pの溶液を組換え体ウィルス懸濁液と混合してワクチ
ン溶液を調製することもできる。 個々の組換え体ウィルスまたは組換え体ウィルス混合液をワクチンに組み入れ
ることができる。例えば、ワクチンを生理水に希釈したvCPl642、vCP1643、vCPl
618、vCP1619、vCP1626で構成するか、生理水に希釈したvCPl643+vCP1619、vCP1
643+vCP1626、vCP1618+vCP1626、vCP1619+vCP1618の混合液にすることができる
。既に述べたように（実施例11）、個々の組換え体ウィルスまたは組換え体ウィ
ルス混合液をカルボポル9741Pの溶液と混合することもできる。
ＲＳＶ組換え体混合液を予防注射した。ワクチンウイルス懸濁液は組換え体ウィ
ルス株原液を滅菌生理水（NaC1 0.9％）中に希釈して作った。ウイルス懸濁に適
した範囲は約l0e６、l0e７、l0e8 pfu ／単位投与量である。実施例11で説明し
たように、カルボポル9741Pの溶液を組換え体ウィルス懸濁液と混合してワクチ
ン溶液を調製することもできる。 個々の組換え体ウィルスまたは組換え体ウィルス混合液をワクチンに組み入れ
ることができる。例えば、ワクチンを生理水に希釈したvCPl642、vCP1643、vCPl
618、vCP1619、vCP1626で構成するか、生理水に希釈したvCPl643+vCP1619、vCP1
643+vCP1626、vCP1618+vCP1626、vCP1619+vCP1618の混合液にすることができる
。既に述べたように（実施例11）、個々の組換え体ウィルスまたは組換え体ウィ
ルス混合液をカルボポル9741Pの溶液と混合することもできる。
【００８８】
全てのワクチンは皮下注射で2mlの容積を投与する。最初のワクチン接種は0日
目に与え、最初の注射後、約21日後にブースターを投与する。対照雌ブタのグル
ープには予防注射をしない（予防注射なし、抗原投与あり）。 未経産験ブタに標準ワクチンを予防注射し、適当なホルモン管理で処理し、発
情の徴候を観測し、ＰＲＲＳＶに感染していない牡のブタから得られた精液を37
日目に種付けした。妊娠した雌ブタ（超音波で確認）をワラを敷いた大きな畜舎
無いで放し飼いした。標準的な給餌をし、水は自由に摂取できるようにした。 127日目（約妊娠90日目）に全てのグループの雌ブタの鼻腔内に1mlのＰＲＲＳ
ＶＰ120 117B抗原投与株の懸濁液を投与して抗原投与した（懸濁のウイルスタ
イター＝約10e7.5 CCID50）。抗原投与ウィルスは注射器を使用して各鼻孔内に
噴霧投与した。
目に与え、最初の注射後、約21日後にブースターを投与する。対照雌ブタのグル
ープには予防注射をしない（予防注射なし、抗原投与あり）。 未経産験ブタに標準ワクチンを予防注射し、適当なホルモン管理で処理し、発
情の徴候を観測し、ＰＲＲＳＶに感染していない牡のブタから得られた精液を37
日目に種付けした。妊娠した雌ブタ（超音波で確認）をワラを敷いた大きな畜舎
無いで放し飼いした。標準的な給餌をし、水は自由に摂取できるようにした。 127日目（約妊娠90日目）に全てのグループの雌ブタの鼻腔内に1mlのＰＲＲＳ
ＶＰ120 117B抗原投与株の懸濁液を投与して抗原投与した（懸濁のウイルスタ
イター＝約10e7.5 CCID50）。抗原投与ウィルスは注射器を使用して各鼻孔内に
噴霧投与した。
【００８９】
抗原投与後、全ての動物で以下の基準点をモニターした：
１） 抗原投与前後の直腸温度
２） 出生約7、14および21日の子豚の重量
３） 異常な挙動
ウイルス単離および抗体滴定するために実験中に雌ブタから血液サンプルを採
取した。また、初乳（分娩時）および乳汁サンプルも回収した。 ウイルス単離および抗体滴定するために実験中に子豚からも血液サンプルを採
取した。 死亡または安楽死させた各動物を死亡後検査した。 本発明の組換え体は免疫応答を誘導した。
取した。また、初乳（分娩時）および乳汁サンプルも回収した。 ウイルス単離および抗体滴定するために実験中に子豚からも血液サンプルを採
取した。 死亡または安楽死させた各動物を死亡後検査した。 本発明の組換え体は免疫応答を誘導した。
【００９０】実施例13 子豚モデルでのワクチン接種／抗原投与
ＰＲＲＳＶに感染していない繁殖農場から得られた8−10週齢の平均体重が25-
27kgの通常の子豚をランダムに寄せ集めた。予防注射したグループは6匹の子豚
より構成され、対照グループ（予防注射なし）は9匹の子豚で構成した。予防注
射は個別のALVAC／ＰＲＲＳＶ組換え体またはALVAC／ＰＲＲＳＶ組換え体混合液
で行った。ワクチンのウイルス懸濁液は組換え体ウィルス株を滅菌した生理な水
（NaC1 0.9％）に希釈して調製した。ウイルス懸濁液の範囲は約10e6、10 e７、
l0 e8 pfu／投与量である。また、実施例11で説明したように組換え体ウィルス
懸濁液と、カルボポル9741 P溶液とを混合してワクチン溶液 調製することもできる。
27kgの通常の子豚をランダムに寄せ集めた。予防注射したグループは6匹の子豚
より構成され、対照グループ（予防注射なし）は9匹の子豚で構成した。予防注
射は個別のALVAC／ＰＲＲＳＶ組換え体またはALVAC／ＰＲＲＳＶ組換え体混合液
で行った。ワクチンのウイルス懸濁液は組換え体ウィルス株を滅菌した生理な水
（NaC1 0.9％）に希釈して調製した。ウイルス懸濁液の範囲は約10e6、10 e７、
l0 e8 pfu／投与量である。また、実施例11で説明したように組換え体ウィルス
懸濁液と、カルボポル9741 P溶液とを混合してワクチン溶液 調製することもできる。
【００９１】
個々の組換え体ウィルスまたは組換え体ウィルス混合液をワクチンに組み込む
ことができる。例えば、ワクチンは生理学水に希釈したvCPl642、vCP643、vCPl6
l8、vCP1619、vCPＬ626に構成するか、生理学水に希釈したvCP1643+vCP1619、vC
P1643+vCP1626、vCP1618+vCP1626、vCP1619+vCP1618混合液で構成することがで
きる。既に述べたように（実施例11）、同じ個々の組換え体ウィルスまたは組換
え体ウィルス混合液をカルボポル9741 P溶液と混合することもできる。 子豚には2mlのワクチンを0日に経筋肉で一回予防注射した。ブースターは最初
の注射後約21日目に同じワクチンの2mlを経筋肉で一回投与した。
ことができる。例えば、ワクチンは生理学水に希釈したvCPl642、vCP643、vCPl6
l8、vCP1619、vCPＬ626に構成するか、生理学水に希釈したvCP1643+vCP1619、vC
P1643+vCP1626、vCP1618+vCP1626、vCP1619+vCP1618混合液で構成することがで
きる。既に述べたように（実施例11）、同じ個々の組換え体ウィルスまたは組換
え体ウィルス混合液をカルボポル9741 P溶液と混合することもできる。 子豚には2mlのワクチンを0日に経筋肉で一回予防注射した。ブースターは最初
の注射後約21日目に同じワクチンの2mlを経筋肉で一回投与した。
【００９２】
全てのグループ（予防注射なしのグールプを含む）の子豚に約35日目に約10e6
.5 CCID50／mlのタイターで1.5 mlのＰＲＲＳＶ抗原投与株（Ｐ120 117B株）懸
濁液を鼻腔内投与して抗原投与した。この抗原投与は注射器を使用して各鼻孔に
噴霧して行った。 抗原投与後、全ての子豚の臨床的徴候（下痢、食欲低下、デプレッション／衰
弱、吐物、咳／くさめ、結膜炎）、直腸温および体重をモニターした。 全ての子豚の体重を21日、35日（抗原投与日）および56日（実験終了日、子豚
の安楽死日）に計測した。 ウイルス単離および抗体滴定のために血液サンプルを採取した。 安楽死後、全ての子豚を検死し、肺臓のサンプルを採ってウイルスを単離した
。 本発明の組換え体は免疫応答を誘導した。 以上、本発明の好ましい実施例を詳細に記載したが、特許請求の範囲に定義さ
れる本発明は上記の特定な詳細に限定されるものではなく、本発明の範囲を逸脱
せずに多く変更が可能であるということは理解できよう。
.5 CCID50／mlのタイターで1.5 mlのＰＲＲＳＶ抗原投与株（Ｐ120 117B株）懸
濁液を鼻腔内投与して抗原投与した。この抗原投与は注射器を使用して各鼻孔に
噴霧して行った。 抗原投与後、全ての子豚の臨床的徴候（下痢、食欲低下、デプレッション／衰
弱、吐物、咳／くさめ、結膜炎）、直腸温および体重をモニターした。 全ての子豚の体重を21日、35日（抗原投与日）および56日（実験終了日、子豚
の安楽死日）に計測した。 ウイルス単離および抗体滴定のために血液サンプルを採取した。 安楽死後、全ての子豚を検死し、肺臓のサンプルを採ってウイルスを単離した
。 本発明の組換え体は免疫応答を誘導した。 以上、本発明の好ましい実施例を詳細に記載したが、特許請求の範囲に定義さ
れる本発明は上記の特定な詳細に限定されるものではなく、本発明の範囲を逸脱
せずに多く変更が可能であるということは理解できよう。
【００９３】
（参照文献）
【表２】
【００９４】
【表３】
【００９５】
【表４】
【００９６】
【表５】
【００９７】
【表６】
【００９８】
【表７】
【００９９】
【表８】
【０１００】
【表９】
【０１０１】
【表１０】
【０１０２】
【表１１】
【図１】（配列番号：1） C6転写解読枠を含むALVAC ＤＮＡの3.7キロ塩基
対の断片断片のヌクレオチド配列を示す図。
対の断片断片のヌクレオチド配列を示す図。
【図２】 pJPl 15のドナープラスミドを示す地図を示す図。
【図３】（配列番号：l0） pJΜＬ15ドナープラスミドからのKpnI（653位置
）からSac（3214位置）制限サイトまでの2.6キロ塩基対の断片のヌクレオチド配
列を示す図。
）からSac（3214位置）制限サイトまでの2.6キロ塩基対の断片のヌクレオチド配
列を示す図。
【図４】 pJΜＬ19のドナープラスミドの地図を示す図。
【図５】（配列番号：14） pJΜＬ19のドナープラスミドからのKpnI（653位
置）からSad（3262位置）制限サイトまでの2.6キロ塩基対の断片のヌクレオチド
配列を示す図。
置）からSad（3262位置）制限サイトまでの2.6キロ塩基対の断片のヌクレオチド
配列を示す図。
【図６】 pJPlO3ドナープラスミドの地図を示す図。
【図７】（配列番号：19）はpJΜＬ０３ドナープラスミドからのKpnI（653位
置）からSad（3016位置）制限サイトまでの2.4キロ塩基対断片のヌクレオチド配
列を示す図。
置）からSad（3016位置）制限サイトまでの2.4キロ塩基対断片のヌクレオチド配
列を示す図。
【図８】 pJΜＬ10のプラスミドの地図を示す図。
【図９】（配列番号：26）はpJΜＬ10のドナープラスミドからのKpnI（653位
置）からSad（3064位置）制限サイトまでの2.4キロ塩基対断片のヌクレオチド配
列を示す図。
置）からSad（3064位置）制限サイトまでの2.4キロ塩基対断片のヌクレオチド配
列を示す図。
【図１０】 pJΜＬ00ドナープラスミドの地図を示す図。
【図１１】（配列番号：31） pJΜＬ00ドナープラスミドからのKpnI（653位
置）からSad（2986位置）制限サイトまでの2.3キロ塩基対の断片のヌクレオチド
配列を示す図。
置）からSad（2986位置）制限サイトまでの2.3キロ塩基対の断片のヌクレオチド
配列を示す図。
【図１２】 pJPl13ドナープラスミドの地図を示す図。
【図１３】（配列番号：32） pJΜＬ１３ドナープラスミドからのKpnI（653
位置）からSad（3732位置）制限サイトまでの3.1キロ塩基対断片のヌクレオチド
配列を示す図。
位置）からSad（3732位置）制限サイトまでの3.1キロ塩基対断片のヌクレオチド
配列を示す図。
【図１４】 pJP l０lドナープラスミドの地図を示す図。
【図１５】（配列番号：37） pJP l０lドナープラスミドからのKpnI（653位
置）からSad（2851位置）制限サイトまでの2.2キロ塩基対断片のヌクレオチド配
列を示す図。
置）からSad（2851位置）制限サイトまでの2.2キロ塩基対断片のヌクレオチド配
列を示す図。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
// Ａ６１Ｋ 39/12 Ｃ１２Ｒ 1:93
(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｒ 1:93）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ
，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，
ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ
Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ
，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，
ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ
Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ
，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，
ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ペレ，ジェニファー，マリア
アメリカ合衆国 01605 マサチューセッ
ツ ウォーセスター ロング メドウ ア
ヴェニュー 135
(72)発明者 ボデュ，フィリップ，ギ，ニコラ
フランス国 69290 クラポンヌ アヴニ
ュ エドゥワール ミロ 58
Ｆターム(参考） 4B024 AA10 BA32 CA04 CA11 EA02
FA02 HA12
4B065 AA95X AA95Y AB01 BA02
CA45
4C076 CC35 EE03N EE11N EE15N
FF34
4C084 AA13 NA10 ZA592 ZA812
4C085 AA03 BA51 BB11 CC08 EE06
FF11 FF12 FF17 GG03 GG04
GG05 GG08
Claims (18)
- 【請求項１】 ブタ生殖・呼吸症候群ウィルス（Porcine Reproductive and R
espiratory Syndrome Virus、ＰＲＲＳＶ）からの遺伝子ＲＮＡに相補なＤＮＡ
を含む組換えアビポックスウィルス。 - 【請求項２】 鶏痘（fowlpox）ウィルスである請求項1に記載の組換えアビポ
ックスウィルス。 - 【請求項３】 カナリア痘（canarypox）ウイルスである請求項１に記載の組
換えアビポックスウィルス。 - 【請求項４】 ALVACである請求項1に記載の請求項１に記載の組換えアビポッ
クスウィルス。 - 【請求項５】 ブタ生殖・呼吸症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）からの遺伝子Ｒ
ＮＡに相補なＤＮＡが、ＰＲＲＳＶグリコプロテイン、メンブレンまたはカプシ
ドタンパクをコードし且つ発現する請求項1〜4のいずれか一項に記載の組換えア
ビポックスウィルス。 - 【請求項６】 転写解読枠５（ORF５）に対応するブタ生殖・呼吸症候群ウィ
ルス（ＰＲＲＳＶ）からの遺伝子ＲＮＡに相補なＤＮＡからなる請求項5に記載
の組換えアビポックスウィルス。 - 【請求項７】 転写解読枠５（0RF５）および３(ORF３)に対応するブタ生殖・
呼吸症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）からの遺伝子ＲＮＡに相補なＤＮＡからなる
請求項５に記載の組換えアビポックスウィルス。 - 【請求項８】 転写解読枠S（ORF５）および６(ORF６)に対応するブタ生殖・
呼吸症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）からの遺伝子ＲＮＡに相補なＤＮＡからなる
請求項５に記載の組換えアビポックスウィルス。 - 【請求項９】 転写解読枠５（ORF５）、3(ORF３)および6（ORF６）に対応す
るブタ生殖・呼吸症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）からの遺伝子ＲＮＡに相補なＤ
ＮＡからなる請求項5に記載の組換えアビポックスウィルス。 - 【請求項１０】 ORF５、ORF6またはORF３が頭−頭の向きになっている請求項
7または8に記載の組換えアビポックスウィルス。 - 【請求項１１】 vCP1618、vCP1619、vCP1626またはvCP1643である請求項4に
記載の組換えアビポックスウィルス。 - 【請求項１２】 キャリアと、請求項１〜11のいずれか一項に記載の少なくと
も一種の組換え体ウィルスとを含む、投与したホストに免疫応答を誘導するため
の免疫組成物。 - 【請求項１３】 キャリアと、請求項１〜11のいずれか一項に記載の少なくと
も一種の組換え体ウィルスとを含む、ＰＲＲＳに対するワクチン。 - 【請求項１４】 アジュバントをさらに含む請求項13に記載のワクチン。
- 【請求項１５】 アジュバントがアクリル酸またはメタアクリル酸のポリマー
、または、無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーである請求項14に
記載のワクチン。 - 【請求項１６】 アジュバントがカルボマー（carbomer）、好ましくはカルポ
ボル（Carpobol、登録商標）である請求項15に記載のワクチン。 - 【請求項１７】 アジュバントがEMA(登録商標)である請求項15に記載のワク
チン。 - 【請求項１８】 請求項13〜17のいずれか一項に記載の少なくとも一種のワク
チンと、ブタの他の病原に対する少なくとも一種の他のワクチンとからなるブタ
ワクチン組成物。
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