JPH03247220A - 植物の殺虫性トキシン - Google Patents
植物の殺虫性トキシンInfo
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- JPH03247220A JPH03247220A JP2325150A JP32515090A JPH03247220A JP H03247220 A JPH03247220 A JP H03247220A JP 2325150 A JP2325150 A JP 2325150A JP 32515090 A JP32515090 A JP 32515090A JP H03247220 A JPH03247220 A JP H03247220A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（関連分野）
本発明は植物の遺伝子工学の一般的分野に関しており、
特に植物に特異的昆虫摂取者に対する毒性を付与する植
物の遺伝子工学に関する。
特に植物に特異的昆虫摂取者に対する毒性を付与する植
物の遺伝子工学に関する。
（関連技術）
現在いくつかの高等生物の遺伝子工学が可能なまでに組
換えＤＮＡ操作技術が発展してきている。
換えＤＮＡ操作技術が発展してきている。
植物技術の領域ではいくつかの商業的に重要な穀物を含
む多くの穀物植物種の遺伝子工学が可能になっている。
む多くの穀物植物種の遺伝子工学が可能になっている。
植物に外来の遺伝的特性を転移することが可能となった
現在、研究領域として植物に付与され農業的価値が増す
特性を同定することが掲げられる。植物の強さや生育に
関係する生化学的メカニズムはあまり明らかになってお
らずかつ理解されていない。また外来特性の植物への遺
伝子的転移技術では比較的少ない遺伝子しか一度に植物
に転移できないので、この分野の現状では遺伝子工学を
通してどの程度本来の植物の強さや生育力が変化するか
を検証するのは難しい。正常な農場の状態における実際
的穀物収穫はしばしば疫疫や昆虫による略奪などの植物
の略奪性因子によって左右されるのでその植物をより良
く生育させることによるのではなく、それとは別に植物
からの効果的な収穫を減少させる制限的略奪性因子の効
果を減らすことによりその農地状態において穀物植物の
実質約数！ｆｆｌを増加させることができる。
現在、研究領域として植物に付与され農業的価値が増す
特性を同定することが掲げられる。植物の強さや生育に
関係する生化学的メカニズムはあまり明らかになってお
らずかつ理解されていない。また外来特性の植物への遺
伝子的転移技術では比較的少ない遺伝子しか一度に植物
に転移できないので、この分野の現状では遺伝子工学を
通してどの程度本来の植物の強さや生育力が変化するか
を検証するのは難しい。正常な農場の状態における実際
的穀物収穫はしばしば疫疫や昆虫による略奪などの植物
の略奪性因子によって左右されるのでその植物をより良
く生育させることによるのではなく、それとは別に植物
からの効果的な収穫を減少させる制限的略奪性因子の効
果を減らすことによりその農地状態において穀物植物の
実質約数！ｆｆｌを増加させることができる。
穀物植物の昆虫の略奪を制御する本技術は少なくとも開
発地域において数十年間主要農業穀物の栽培作業−要素
であった合成化学殺虫剤の使用に基づいている。殺虫を
目的として使用される主要な農業化成品のほとんどは比
較的広い昆虫に対して毒性をもち、かつ多くのものは環
境に蓄積して悪い環境状態を生ずる。それゆえ、特定の
昆虫のみに毒性をもち、かつ環境に蓄積しない殺虫剤の
開発に多くの努力がなされてきた。
発地域において数十年間主要農業穀物の栽培作業−要素
であった合成化学殺虫剤の使用に基づいている。殺虫を
目的として使用される主要な農業化成品のほとんどは比
較的広い昆虫に対して毒性をもち、かつ多くのものは環
境に蓄積して悪い環境状態を生ずる。それゆえ、特定の
昆虫のみに毒性をもち、かつ環境に蓄積しない殺虫剤の
開発に多くの努力がなされてきた。
生物学的殺虫剤はこれらの基準のいくつかを満足し得る
。たとえば土壌微生物バチルススリンジエンシス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂ、
ｔ、）により産生されるデルタ内毒素を殺虫剤として
使用することに基づくいくつかの産物がある。このポリ
ペプチドトキシンはレピドプテラン昆虫類に特異的に毒
性があることが分り、また集用殺虫剤として商業的に永
年使用されてきた。また最近種々の型のＢ、ｔ、 ト
キシンは昆虫が摂取する植物組織内で発現するとき昆虫
に毒性を示し得ることが分った。このことは最初で、か
つこれまで唯一のトランスジェニック植物細胞中で発現
する天然の生物学的殺虫剤の例である。
。たとえば土壌微生物バチルススリンジエンシス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂ、
ｔ、）により産生されるデルタ内毒素を殺虫剤として
使用することに基づくいくつかの産物がある。このポリ
ペプチドトキシンはレピドプテラン昆虫類に特異的に毒
性があることが分り、また集用殺虫剤として商業的に永
年使用されてきた。また最近種々の型のＢ、ｔ、 ト
キシンは昆虫が摂取する植物組織内で発現するとき昆虫
に毒性を示し得ることが分った。このことは最初で、か
つこれまで唯一のトランスジェニック植物細胞中で発現
する天然の生物学的殺虫剤の例である。
またしばしば昆虫は通用する殺虫剤に対し耐性となるこ
とは農業への殺虫剤の使用の歴史のコードなっている。
とは農業への殺虫剤の使用の歴史のコードなっている。
この現象は昆虫群の殺虫剤耐性による自然淘汰と毎年の
単一殺虫剤の継続的適用を通して起こる。Ｂ、ｔ、デル
タ−内毒素などの生物学的トキシンに対しては昆虫の巾
広い耐性の発達が未だ示されていないが、そのような耐
性群の発達の可能性は昆虫耐性植物の開発の長期的計画
において考えなくてはならない。そのような殺虫剤耐性
群の発達の可能性を最小にする１つの方法は各々その活
性様式の異なる少なくとも２つのトキシンにその昆虫略
奪者を露すことである。標的昆虫群に同時にもしくは連
続して２つの試剤を使用すると耐性昆虫群の発達し得る
統計的可能性が劇的に減少する。植物中で発現する生物
学的試剤として有効なようにこれらのトキシンは単一の
遺伝子特性を通して植物細胞に導入し得るポリペプチド
であることが好ましい。このようなトキシンの起源を探
索する１つの場所は昆虫捕食動物がある。
単一殺虫剤の継続的適用を通して起こる。Ｂ、ｔ、デル
タ−内毒素などの生物学的トキシンに対しては昆虫の巾
広い耐性の発達が未だ示されていないが、そのような耐
性群の発達の可能性は昆虫耐性植物の開発の長期的計画
において考えなくてはならない。そのような殺虫剤耐性
群の発達の可能性を最小にする１つの方法は各々その活
性様式の異なる少なくとも２つのトキシンにその昆虫略
奪者を露すことである。標的昆虫群に同時にもしくは連
続して２つの試剤を使用すると耐性昆虫群の発達し得る
統計的可能性が劇的に減少する。植物中で発現する生物
学的試剤として有効なようにこれらのトキシンは単一の
遺伝子特性を通して植物細胞に導入し得るポリペプチド
であることが好ましい。このようなトキシンの起源を探
索する１つの場所は昆虫捕食動物がある。
昆虫を捕食し得る生物の１つにサソリがある。
サソリは比較的感覚の発達は乏しいがサソリよりも動き
の多い昆虫の細物を素速く固定する毒を生成する能力を
発達した節足動物捕食者である。サソリの毒はサソリ補
食者に対する防御および自分自身の餌食の入手という２
つの機能を果している。
の多い昆虫の細物を素速く固定する毒を生成する能力を
発達した節足動物捕食者である。サソリの毒はサソリ補
食者に対する防御および自分自身の餌食の入手という２
つの機能を果している。
それゆえこの毒は種々のトキシン混合物からなり、その
多くは医薬的に活性のあるたんばく質である。
多くは医薬的に活性のあるたんばく質である。
サソリトキシン由来の各たんばく質の活性は哺乳類、昆
虫、または甲殻類など特定の生物に対し比較的選択的で
あることが分った。
虫、または甲殻類など特定の生物に対し比較的選択的で
あることが分った。
いくつかの昆虫選択的神経毒がサソリから単離され、特
性が明らかにされ、かつ配列決定された。
性が明らかにされ、かつ配列決定された。
北アフリカサソリアンドロクトナスオーストラリス （
八ｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ） ヘク
ターからｊｌ！された１つの神経毒、ペプチドＡａ Ｉ
Ｔは７０個のアミノ酸からなる高荷電ポリペプチドであ
る。インビトロの研究に基づき、昆虫のシナプトソーム
膜ベシクルに対するＡａ ＩＴペプチドの特異性および
該たんばく質が他の昆虫組織または哺乳類、クモ類また
は甲殻類！ＩＪ１織に対してアフィニティーを示さない
ことが報告された。Ａａ ＩＴポリペプチドは昆虫の神
経膜の非相互作用性結合部位の１つに４ｆ＝ｉ的に、可
逆的にかつ高いアフィニティーで結合する。
八ｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ） ヘク
ターからｊｌ！された１つの神経毒、ペプチドＡａ Ｉ
Ｔは７０個のアミノ酸からなる高荷電ポリペプチドであ
る。インビトロの研究に基づき、昆虫のシナプトソーム
膜ベシクルに対するＡａ ＩＴペプチドの特異性および
該たんばく質が他の昆虫組織または哺乳類、クモ類また
は甲殻類！ＩＪ１織に対してアフィニティーを示さない
ことが報告された。Ａａ ＩＴポリペプチドは昆虫の神
経膜の非相互作用性結合部位の１つに４ｆ＝ｉ的に、可
逆的にかつ高いアフィニティーで結合する。
毒性化合物を発現するための植物の遺伝子工学における
１つの困難な点は植物細胞に対するこれらの化合物の毒
性はトランスホームした植物の回収能に悪い影響を与え
うろことである。たとえばＢ、ｔ、デルタ内毒素の全ア
ミノ酸配列を生成する特性を持たせた植物細胞は、おそ
らくその植物細胞自身に関する全長のトキシンの毒性の
ため現在のトランスホーメーション技術でネガティブに
選択されるようである。それゆえ少なくとも現在では昆
虫に対して毒性のあるペプチドの植物細胞へのインビボ
における毒性は予測できない。またこのようなトキシン
が食物摂取により昆虫に投与されたとき通常その昆虫に
導入された昆虫トキシンの毒性を予測することも不可能
である。
１つの困難な点は植物細胞に対するこれらの化合物の毒
性はトランスホームした植物の回収能に悪い影響を与え
うろことである。たとえばＢ、ｔ、デルタ内毒素の全ア
ミノ酸配列を生成する特性を持たせた植物細胞は、おそ
らくその植物細胞自身に関する全長のトキシンの毒性の
ため現在のトランスホーメーション技術でネガティブに
選択されるようである。それゆえ少なくとも現在では昆
虫に対して毒性のあるペプチドの植物細胞へのインビボ
における毒性は予測できない。またこのようなトキシン
が食物摂取により昆虫に投与されたとき通常その昆虫に
導入された昆虫トキシンの毒性を予測することも不可能
である。
（本発明の概要）
本発明は植物組織を摂取した選択的昆虫に対し毒性を引
き起こすのに十分な量の昆虫捕食者の昆虫特異的トキシ
ンを細胞中で効果的に発現するトランスジェニック植物
の作成というようにまとめられる。
き起こすのに十分な量の昆虫捕食者の昆虫特異的トキシ
ンを細胞中で効果的に発現するトランスジェニック植物
の作成というようにまとめられる。
本発明の別の目的は昆虫耐性を植物に付与する新しい戟
術を見つける方法で昆虫耐性を植物に付与する上で有効
で植物細胞に挿入された昆虫捕食者により産生されるポ
リペプチドをスクリーニングすることを含む方法を提供
することである。
術を見つける方法で昆虫耐性を植物に付与する上で有効
で植物細胞に挿入された昆虫捕食者により産生されるポ
リペプチドをスクリーニングすることを含む方法を提供
することである。
したがって本発明のもう１つの目的は昆虫略奪者に毒性
を示し、それにより畑殻物を保護するための人工農業化
学剤の必要性を滅じた遺伝子工学的植物の提供にある。
を示し、それにより畑殻物を保護するための人工農業化
学剤の必要性を滅じた遺伝子工学的植物の提供にある。
また本発明のもう１つの目的はトキシン耐性昆虫群の発
達を最小限にとどめるようＢ、ｔ、トキシン類と合せて
、植物中に導入し得る別の昆虫選択的ペプチドトキシン
を提供することである。
達を最小限にとどめるようＢ、ｔ、トキシン類と合せて
、植物中に導入し得る別の昆虫選択的ペプチドトキシン
を提供することである。
本発明のその他の目的、利点および特徴は、添付した図
とともに以下の詳細な説明から明らかであろう。
とともに以下の詳細な説明から明らかであろう。
（発明の説明）
本発明に従がい節足性昆虫捕食者の術中の構成物の１つ
の遺伝子を合成し得、その後植物の遺伝子操作により特
定の昆虫により摂取されたとき特異的な毒性を示す植物
を作成できることが明らかになった。サソリやクモなど
昆虫捕食動物により天然に産生されるたんぱく質トキシ
ンが特定の昆虫に摂取されたときその植物に毒性を付与
する場合でさえその植物細胞中でうまく発現し得ること
が見い出された。これらの知見に基づき、昆虫による摂
取に対する植物の耐性を増加するだめの種々の植物への
導入に用いられる特定の遺伝子が公開されるばかりでな
く、一般に昆虫の摂取への耐性を増加させるために遺伝
子工学的に作り得る新しい殺虫剤が公開されている。
の遺伝子を合成し得、その後植物の遺伝子操作により特
定の昆虫により摂取されたとき特異的な毒性を示す植物
を作成できることが明らかになった。サソリやクモなど
昆虫捕食動物により天然に産生されるたんぱく質トキシ
ンが特定の昆虫に摂取されたときその植物に毒性を付与
する場合でさえその植物細胞中でうまく発現し得ること
が見い出された。これらの知見に基づき、昆虫による摂
取に対する植物の耐性を増加するだめの種々の植物への
導入に用いられる特定の遺伝子が公開されるばかりでな
く、一般に昆虫の摂取への耐性を増加させるために遺伝
子工学的に作り得る新しい殺虫剤が公開されている。
ここで公開され、かつ以下に詳しく説明されている１つ
のトキシンは北アフリカサソリアンドロクｌ−ナスオー
ストラリス（八ｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ａｕｓｔｒａｌ
ｉｓ）により産生される毒の構成物として発見されたペ
プチドトキシンである。このトキシンはインビトロおよ
びインビボの両方のテストで昆虫に毒性を示すことが分
ったものである。ここで示されている他のトキシンは中
央アジアサソリブサスエペウス（Ｂｕｔｈｕｓ ｅｐｅ
ｕｓ）から単離された２つのトキシンおよび２種のクモ
から単離された２つのトキシンである。それゆえこれら
のトキシン類からの選択およびテストの方法論から、お
よびこれらのトキシン類が単離されかつテストされる論
理により他の同様のトキシンも同しスクリーニングおよ
びテストにより見つけられ得ることは明白である。
のトキシンは北アフリカサソリアンドロクｌ−ナスオー
ストラリス（八ｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ａｕｓｔｒａｌ
ｉｓ）により産生される毒の構成物として発見されたペ
プチドトキシンである。このトキシンはインビトロおよ
びインビボの両方のテストで昆虫に毒性を示すことが分
ったものである。ここで示されている他のトキシンは中
央アジアサソリブサスエペウス（Ｂｕｔｈｕｓ ｅｐｅ
ｕｓ）から単離された２つのトキシンおよび２種のクモ
から単離された２つのトキシンである。それゆえこれら
のトキシン類からの選択およびテストの方法論から、お
よびこれらのトキシン類が単離されかつテストされる論
理により他の同様のトキシンも同しスクリーニングおよ
びテストにより見つけられ得ることは明白である。
特に本明細書に公開されているトキシンが有効であるこ
とが分った昆虫毒性の現象は合理的な計画により発展さ
れ昆虫摂取に対する防御を提供するようトランスジェニ
ック植物に導入し得るその他の特性を見い出す必要性に
答えた。以前に主に土（ｆｆ ｍ 生物ハチルスサリン
ジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
ｉｓ）により産生されるトキシンを用い殺虫性トキシン
が植物を摂取した昆虫に対する毒性を該植物に与えるよ
う植物細胞中でうまく作ることができることが示された
。他の適当な殺虫性トキシンを見つけるために昆虫に対
し独特な毒性を持つような殺虫性化学物質を用いる捕食
者を調査した。多くの捕食者はクモ、サソリ、ムカデお
よびすずめばちなど肉食性昆虫など最も顕著な節足動物
などが昆虫を摂取するのにトキシンを利用している。特
にサソリは好ましい候補であり、これから殺虫成分が取
り出された。自然界でサソリは比較的視覚嗅覚が弱く比
較的鏡型な動物である。
とが分った昆虫毒性の現象は合理的な計画により発展さ
れ昆虫摂取に対する防御を提供するようトランスジェニ
ック植物に導入し得るその他の特性を見い出す必要性に
答えた。以前に主に土（ｆｆ ｍ 生物ハチルスサリン
ジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
ｉｓ）により産生されるトキシンを用い殺虫性トキシン
が植物を摂取した昆虫に対する毒性を該植物に与えるよ
う植物細胞中でうまく作ることができることが示された
。他の適当な殺虫性トキシンを見つけるために昆虫に対
し独特な毒性を持つような殺虫性化学物質を用いる捕食
者を調査した。多くの捕食者はクモ、サソリ、ムカデお
よびすずめばちなど肉食性昆虫など最も顕著な節足動物
などが昆虫を摂取するのにトキシンを利用している。特
にサソリは好ましい候補であり、これから殺虫成分が取
り出された。自然界でサソリは比較的視覚嗅覚が弱く比
較的鏡型な動物である。
それゆえサソリは素速い動きとそのサソリの餌食を速や
かに固定比する働きのある強力な毒を必要とする。さら
にサソリのトキシンの単離、特性化および配列決定に多
くの努力が払われてきており、このことはその毒性をス
クリーニングし得る特定のたんぱく質の選択に役立った
。したがってサソリのトキシンは殺虫性トキシン活性を
研究し得る一群の試剤を提供した。他の昆虫捕食者には
それらの昆虫餌食を無力化または殺生するのにペプチド
トキシンを使用する動物が含まれる。
かに固定比する働きのある強力な毒を必要とする。さら
にサソリのトキシンの単離、特性化および配列決定に多
くの努力が払われてきており、このことはその毒性をス
クリーニングし得る特定のたんぱく質の選択に役立った
。したがってサソリのトキシンは殺虫性トキシン活性を
研究し得る一群の試剤を提供した。他の昆虫捕食者には
それらの昆虫餌食を無力化または殺生するのにペプチド
トキシンを使用する動物が含まれる。
植物への遺伝子挿入用の候補者となるためトキシンはい
くつかの制約を満足しなければならないことを忘れては
ならない。少なくとも現在の遺伝子工学的植物に関する
技術における１つの制約はトキシンが植物細胞中に挿入
し得る単一の遺伝子により合成され得るペプチドである
ことが好ましいことである。植物の遺伝子工学技術が発
展し、かつより多くの遺伝子を挿入し得る技術が開発さ
れてきたので非ペプチド性トキシンの合成を触媒する酵
素をコードする遺伝子も挿入し得る。別の制約はトキシ
ンがその活性に特異性を持つように選択すべきであるこ
とである。多（のトキシンはほとんどの動物に対し広い
活性を示す。このようなトキシンはヒトまたは動物の食
物に使用する植物中に遺伝子工学的に挿入するには好ま
しい候補とはなり得ない。しかし、組織特異的様式で植
物においてペプチドを発現するキメラ遺伝子を構築する
技術の開発により動物またはヒトの食物として使用しな
い植物組織でのみトキシンを産生じ得る植物を作成する
ことが可能になったことから広い範囲のトキシンを使用
できる可能性がでてきた。
くつかの制約を満足しなければならないことを忘れては
ならない。少なくとも現在の遺伝子工学的植物に関する
技術における１つの制約はトキシンが植物細胞中に挿入
し得る単一の遺伝子により合成され得るペプチドである
ことが好ましいことである。植物の遺伝子工学技術が発
展し、かつより多くの遺伝子を挿入し得る技術が開発さ
れてきたので非ペプチド性トキシンの合成を触媒する酵
素をコードする遺伝子も挿入し得る。別の制約はトキシ
ンがその活性に特異性を持つように選択すべきであるこ
とである。多（のトキシンはほとんどの動物に対し広い
活性を示す。このようなトキシンはヒトまたは動物の食
物に使用する植物中に遺伝子工学的に挿入するには好ま
しい候補とはなり得ない。しかし、組織特異的様式で植
物においてペプチドを発現するキメラ遺伝子を構築する
技術の開発により動物またはヒトの食物として使用しな
い植物組織でのみトキシンを産生じ得る植物を作成する
ことが可能になったことから広い範囲のトキシンを使用
できる可能性がでてきた。
それにもかかわらず至適トキシン候補は昆虫に対して特
異的に毒性をもつがその植物を摂取する他の種類の動物
についてはほとんど、もしくは全く毒性を示さないトキ
シンであろう。特に呻乳類には毒性がなく、その結果植
物細胞へのトキシンの挿入後もヒトまたは家畜動物に対
して変らぬ栄養価を有する植物のままであることが望ま
しい。
異的に毒性をもつがその植物を摂取する他の種類の動物
についてはほとんど、もしくは全く毒性を示さないトキ
シンであろう。特に呻乳類には毒性がなく、その結果植
物細胞へのトキシンの挿入後もヒトまたは家畜動物に対
して変らぬ栄養価を有する植物のままであることが望ま
しい。
適当なトキシンはトキシンの効果およびそのトキシンの
効果の選択性の両方を決定するインビトロおよびインビ
ボでの活性でスクリーニングし得る。このようなインビ
トロにおけるスクリーニングは問題となっている動物か
ら精製したトキシンまたは有意な量のトキシンを産生ず
るのに原核生物で用いられている遺伝子発現システムを
用いて、または標的昆虫の摂取に使用し得る植物細胞へ
のトランスジェニック的導入により合成されるトキシン
を使用することにより行い得る。
効果の選択性の両方を決定するインビトロおよびインビ
ボでの活性でスクリーニングし得る。このようなインビ
トロにおけるスクリーニングは問題となっている動物か
ら精製したトキシンまたは有意な量のトキシンを産生ず
るのに原核生物で用いられている遺伝子発現システムを
用いて、または標的昆虫の摂取に使用し得る植物細胞へ
のトランスジェニック的導入により合成されるトキシン
を使用することにより行い得る。
北アフリカサソリアンドロクトナスオーストラリス（Ａ
ｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ） ヘクタ
ーから単離した適当なトキシンをＡａ ＩＴと命名した
。昆虫選択的神経毒Ａａ ＩＴは７０個のアミノ酸から
なるペプチドである。以前にＡａＩＴ中の８個のシステ
ィン残基はを椎動物に活性のある他のサソリトキシンと
比べ昆虫に対するトキシンの選択性に寄与している独特
の二次構造をそのたんぱく質に付与するために結合して
いる成熟ＡａＩＴたんばく質の４個のジスルフィド結合
に寄与していることが示された。ダーボン（Ｄａｒｂｏ
ｎ）等、Ｉｎｔｅｒｎ。
ｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ） ヘクタ
ーから単離した適当なトキシンをＡａ ＩＴと命名した
。昆虫選択的神経毒Ａａ ＩＴは７０個のアミノ酸から
なるペプチドである。以前にＡａＩＴ中の８個のシステ
ィン残基はを椎動物に活性のある他のサソリトキシンと
比べ昆虫に対するトキシンの選択性に寄与している独特
の二次構造をそのたんぱく質に付与するために結合して
いる成熟ＡａＩＴたんばく質の４個のジスルフィド結合
に寄与していることが示された。ダーボン（Ｄａｒｂｏ
ｎ）等、Ｉｎｔｅｒｎ。
Ｊ、 Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ、
２０ ｐ、 ３２０（１９８２）。別の人の以前の仕
事はＡａ ＩＴペプチドが昆虫のンナブトソーム膜ベシ
クルに対する特異的アフィニティーを有し、かつ無神経
昆虫組織または哺乳類、クモ類または甲殻類など別の動
物の組織に対してほとんどまたは全くアフィニティーを
もたないことが示された。Ａａ ＩＴポリペプチドは昆
虫神経膜上のある種の非相互作用結合部位に対し特異的
に、可逆的に、かつ高アフィニティーで結合することが
報告された。また別の人は以前にＡａ ＩＴペプチドが
特定の昆虫の幼虫に高レベルで局所的に適用されるか、
注入されるか、または摂取された特種々の昆虫に対して
毒性を示すことを報告した。アジアサソリブサスエベウ
ス（Ｂｕｔｈｕｓ ｅｐｅｕｓ）から単離されるＢｅｌ
Ｔ１およびＢｅｌＴ２と称する２つのトキシンの毒性お
よび特異性を明確にした同様の研究が報告された。−度
Ａａ ＩＴのようなトキシンが選択されたら次は標的植
物細胞中でペプチドを発現するのに適したキメラ発現カ
セットを調製することが必要となる。当分野でよく知ら
れているようにこのようなキメラ発現カセットを構築し
得る多くの方法がある。少なくともこのような発現カセ
ットの構築には植物細胞中で下流のコード領域の転写を
開始するプロモーターが必要である。植物中のそのコー
ド領域の下流にはポリアデニル化配列など転写ターミネ
ータ−または翻訳ターミネータ−があることが必要であ
り、それらの例のいくつかは植物の遺伝子工学において
有用であることが知られている。プロモーターとコード
領域の間には５′非コード翻訳エンハンサ−配列が存在
してもよい。
２０ ｐ、 ３２０（１９８２）。別の人の以前の仕
事はＡａ ＩＴペプチドが昆虫のンナブトソーム膜ベシ
クルに対する特異的アフィニティーを有し、かつ無神経
昆虫組織または哺乳類、クモ類または甲殻類など別の動
物の組織に対してほとんどまたは全くアフィニティーを
もたないことが示された。Ａａ ＩＴポリペプチドは昆
虫神経膜上のある種の非相互作用結合部位に対し特異的
に、可逆的に、かつ高アフィニティーで結合することが
報告された。また別の人は以前にＡａ ＩＴペプチドが
特定の昆虫の幼虫に高レベルで局所的に適用されるか、
注入されるか、または摂取された特種々の昆虫に対して
毒性を示すことを報告した。アジアサソリブサスエベウ
ス（Ｂｕｔｈｕｓ ｅｐｅｕｓ）から単離されるＢｅｌ
Ｔ１およびＢｅｌＴ２と称する２つのトキシンの毒性お
よび特異性を明確にした同様の研究が報告された。−度
Ａａ ＩＴのようなトキシンが選択されたら次は標的植
物細胞中でペプチドを発現するのに適したキメラ発現カ
セットを調製することが必要となる。当分野でよく知ら
れているようにこのようなキメラ発現カセットを構築し
得る多くの方法がある。少なくともこのような発現カセ
ットの構築には植物細胞中で下流のコード領域の転写を
開始するプロモーターが必要である。植物中のそのコー
ド領域の下流にはポリアデニル化配列など転写ターミネ
ータ−または翻訳ターミネータ−があることが必要であ
り、それらの例のいくつかは植物の遺伝子工学において
有用であることが知られている。プロモーターとコード
領域の間には５′非コード翻訳エンハンサ−配列が存在
してもよい。
これまでに効果的に使用されてきたこのような配列には
アルファルファモザイクウィルスコートたんばく質遺伝
子由来の５′非コ一ド配列がある。
アルファルファモザイクウィルスコートたんばく質遺伝
子由来の５′非コ一ド配列がある。
コード配列自身は様々な方法で作り得る。このようなコ
ード配列生成のための１つの戦術は昆虫捕食者の細胞中
で発現されるトキシン遺伝子のｍＲＮＡを単離し、つい
でこのトキシンの本来の宿主である生物中のコード配列
に対応するｃＤＮＡコード領域を生成することであろう
。しかし特定のコード配列は植物細胞中でのたんぱく質
の発現に関し池のものよりもうまく働くことが分ってい
るので該ペプチドトキシンのアミノ酸配列を決定し、つ
いで植物細胞中でのトキシンたんばく質の発現を最大と
するように構築したコード領域を合成するのが好ましい
戦術である。もしもアミノ酸配列が合理的な大きさなら
ば本研究で行なわれたようにこのようなコード領域を合
成することは現時点の当分野の技術の範囲内にある。こ
れらのシステムの翻訳効率を至適なものにするために通
常豊富に発現される植物遺伝子によるコドン使用パター
ンを分析することができる。効率的に、もしくは非常に
活発に発現する天然の植物遺伝子によるコドン使用頻度
を調べることにより植物中に通常存在する翻訳システム
内で基本的に優先されるコドンを決定し得る。それゆえ
ペプチド中の各アミノ酸に対するコドンとして植物細胞
内で最も優先されるコドンを含むいかなるペプチドの合
成コード領域も構築し得る。このような優先されるコド
ンの使用により天然にそのペプチドを産生ずる生物から
直接そのコード配列を取り出すことにより行うことと比
較して有意に翻訳効率の高いたんばく質コード配列を構
築できる。
ード配列生成のための１つの戦術は昆虫捕食者の細胞中
で発現されるトキシン遺伝子のｍＲＮＡを単離し、つい
でこのトキシンの本来の宿主である生物中のコード配列
に対応するｃＤＮＡコード領域を生成することであろう
。しかし特定のコード配列は植物細胞中でのたんぱく質
の発現に関し池のものよりもうまく働くことが分ってい
るので該ペプチドトキシンのアミノ酸配列を決定し、つ
いで植物細胞中でのトキシンたんばく質の発現を最大と
するように構築したコード領域を合成するのが好ましい
戦術である。もしもアミノ酸配列が合理的な大きさなら
ば本研究で行なわれたようにこのようなコード領域を合
成することは現時点の当分野の技術の範囲内にある。こ
れらのシステムの翻訳効率を至適なものにするために通
常豊富に発現される植物遺伝子によるコドン使用パター
ンを分析することができる。効率的に、もしくは非常に
活発に発現する天然の植物遺伝子によるコドン使用頻度
を調べることにより植物中に通常存在する翻訳システム
内で基本的に優先されるコドンを決定し得る。それゆえ
ペプチド中の各アミノ酸に対するコドンとして植物細胞
内で最も優先されるコドンを含むいかなるペプチドの合
成コード領域も構築し得る。このような優先されるコド
ンの使用により天然にそのペプチドを産生ずる生物から
直接そのコード配列を取り出すことにより行うことと比
較して有意に翻訳効率の高いたんばく質コード配列を構
築できる。
そのキメラ植物発現カセットが構築された後は植物細胞
にその構築遺伝子をトランスホームすることが必要であ
る。現在植物中に外来遺伝子を挿入するメカニズムには
いくつか方法がある。本明細書で使用している１つの方
法はアグロバクテリウム゛ンメファシエンス（八ｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）として
知られている植物の病原性細菌を用いるものである。野
生型アグロバクテリウムツメファシェンス（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）はＴｉプ
ラスミドと呼ばれるプラスミドを宿しており感染した植
物細胞のゲノムＤＮＡにＴ−ＤＮＡと呼ばれるそのＤＮ
Ａの一部を転移し得る能力を有する。アグロバクテリウ
ム（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）のＴ−ＤＮＡ内に
通常含まれている腫瘍活性をコードする遺伝子を除去す
ることにより、および合成的に構築した外来発現カセッ
トをＴｉプラスミドと置換することにより植物細胞中に
望ましい外来遺伝子をトランスホームするのにアグロバ
クテリウムツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の天然の遺伝子工学的
能力を使用することが可能である。また植物の遺伝子工
学のための他の技術も開発されており、これはアグロバ
クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）の欠点の
いくつかを除外するものであり、かつ全部ではないにし
ろ多くの植物をトランスホームする理論的能力を提供す
る。このような技術には植物のプロトプラストのエレク
トロポレーションおよび再生、植物の花へのＤＮＡ自体
の直接的注入および加速粒子による植物トランスホーメ
ーションを用いる新しく開発された技術などが含まれる
。粒子仲介植物トランスホーメーションを用いた遺伝子
工学的植物の技術では、植物発現カセットのコピーを含
むＤＮＡを非常に小さなキャリヤー粒子にコートする。
にその構築遺伝子をトランスホームすることが必要であ
る。現在植物中に外来遺伝子を挿入するメカニズムには
いくつか方法がある。本明細書で使用している１つの方
法はアグロバクテリウム゛ンメファシエンス（八ｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）として
知られている植物の病原性細菌を用いるものである。野
生型アグロバクテリウムツメファシェンス（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）はＴｉプ
ラスミドと呼ばれるプラスミドを宿しており感染した植
物細胞のゲノムＤＮＡにＴ−ＤＮＡと呼ばれるそのＤＮ
Ａの一部を転移し得る能力を有する。アグロバクテリウ
ム（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）のＴ−ＤＮＡ内に
通常含まれている腫瘍活性をコードする遺伝子を除去す
ることにより、および合成的に構築した外来発現カセッ
トをＴｉプラスミドと置換することにより植物細胞中に
望ましい外来遺伝子をトランスホームするのにアグロバ
クテリウムツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の天然の遺伝子工学的
能力を使用することが可能である。また植物の遺伝子工
学のための他の技術も開発されており、これはアグロバ
クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）の欠点の
いくつかを除外するものであり、かつ全部ではないにし
ろ多くの植物をトランスホームする理論的能力を提供す
る。このような技術には植物のプロトプラストのエレク
トロポレーションおよび再生、植物の花へのＤＮＡ自体
の直接的注入および加速粒子による植物トランスホーメ
ーションを用いる新しく開発された技術などが含まれる
。粒子仲介植物トランスホーメーションを用いた遺伝子
工学的植物の技術では、植物発現カセットのコピーを含
むＤＮＡを非常に小さなキャリヤー粒子にコートする。
それからこのキャリヤー粒子を電気的誘導発射などで行
なわれるような爆発力により物理的に植物組織の生細胞
中に打ち込まれる。粒子仲介トランスホーメーション技
術により容易にトランスホームし得るＵ織には植物の生
育増殖組織、植物胚および花粉などの植物胚細胞が含ま
れる。
なわれるような爆発力により物理的に植物組織の生細胞
中に打ち込まれる。粒子仲介トランスホーメーション技
術により容易にトランスホームし得るＵ織には植物の生
育増殖組織、植物胚および花粉などの植物胚細胞が含ま
れる。
上述の植物トランスホーメーション技術のいずれも本発
明で使用し得ることは明らかである。植物の遺伝子工学
における今日までの経験によると１度植物細胞に挿入さ
れれば遺伝子の発現は植物トランスホーメーション法自
体には依存しないようである。あるトランスホーメーシ
ョン技術では１つ以上のコピーが挿入し得るし、また外
来ＤＮＡ挿入部位はどの方法を用いてもランダムである
と思われるので植物細胞中に挿入した外来遺伝子の活性
はキメラ調節領域（プロモーター、ポリアゾニレ−ジョ
ン領域、エンハンサ−等）およびキメラ挿入物に隣接す
る植物本来のＤＮＡの両方から影響を受ける各挿入遺伝
子の発現特性および植物に遺伝子を挿入する技術よりも
コピー数に依存するようである。
明で使用し得ることは明らかである。植物の遺伝子工学
における今日までの経験によると１度植物細胞に挿入さ
れれば遺伝子の発現は植物トランスホーメーション法自
体には依存しないようである。あるトランスホーメーシ
ョン技術では１つ以上のコピーが挿入し得るし、また外
来ＤＮＡ挿入部位はどの方法を用いてもランダムである
と思われるので植物細胞中に挿入した外来遺伝子の活性
はキメラ調節領域（プロモーター、ポリアゾニレ−ジョ
ン領域、エンハンサ−等）およびキメラ挿入物に隣接す
る植物本来のＤＮＡの両方から影響を受ける各挿入遺伝
子の発現特性および植物に遺伝子を挿入する技術よりも
コピー数に依存するようである。
本方法に従う昆虫耐性植物の作成プロセスは外来遺伝子
のコード配列を植物細胞に挿入し、かつその植物を完全
な植物に再生しただけでは完全とはいえない。その後昆
虫飼育による適当な生物学的検定を通して、作成したト
ランスジエニ・ツク植物をテストする必要がある。昆虫
に対する植物の毒性を実験的にテストすることによって
のみ望ましい毒性が得られたか否かが真に決定される。
のコード配列を植物細胞に挿入し、かつその植物を完全
な植物に再生しただけでは完全とはいえない。その後昆
虫飼育による適当な生物学的検定を通して、作成したト
ランスジエニ・ツク植物をテストする必要がある。昆虫
に対する植物の毒性を実験的にテストすることによって
のみ望ましい毒性が得られたか否かが真に決定される。
（実施例１）
トキシン発現カセット
植物細胞におけるサソリトキシンＡａ ＩＴの発現用の
発現カセットの合成は植物細胞におけるＢ、ｔ、デルタ
内毒素の発現用に以前に構築した植物発現カセットを修
正することで始めた。以前にｐＡＭＶＢＴＳと命名され
たこのプラスミドにはカリフラワーモザイクウィルス３
５Ｓ遺伝子（ｃａＭＶ３５Ｓ）由来のプロモーター配列
、つづいて植物組織における合成遺伝子の効果的な発現
を促進することが以前に発見されたアルファルファモザ
イクウィルスコートたんばく質由来の５′非コード領域
に対応するよう合成的に構築された５′コード領域が含
まれている。５′非コード翻訳エンハンサ−につづいて
Ｂ、ｔ、デルタ内毒素をコードする短縮化したトキシン
配列があり、そのあとにＰｓｔ１部位を含む制限酵素の
切断部位およびアグロバクテリウムツメファシェンス（
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ＋ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）のＴｉプラスミド由来のツバリンシンテース遺伝子
由来のポリアゾニレ−ジョン領域がある。またプラスミ
ドｐＡＭＶＢＴＳには逆方向に読んで原核性宿主細胞中
で発現するよう構築されたアンピシリン耐性の選択可能
なマーカーがある。このプラスミドｐＡＭＶＢＴＳは１
９８７年６月２４日受理番号第５３６３７号としてアメ
リカンタイプカルチャーコレクション（メリーランド、
ロックビル）に保管された。このプラスミドの詳細はバ
ートン（Ｂａｒｔｏｎ）等（Ｐｌａｎｔ、 Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、 ８５． ｐｐ、 １１（１３１１（１９ （１
９８７） ）およびＰＣＴ特許出願ＷＯ８９１０４８６
８（１９８９年６月１日公開）により報告されており、
いずれも本明細書では参考として引用している。
発現カセットの合成は植物細胞におけるＢ、ｔ、デルタ
内毒素の発現用に以前に構築した植物発現カセットを修
正することで始めた。以前にｐＡＭＶＢＴＳと命名され
たこのプラスミドにはカリフラワーモザイクウィルス３
５Ｓ遺伝子（ｃａＭＶ３５Ｓ）由来のプロモーター配列
、つづいて植物組織における合成遺伝子の効果的な発現
を促進することが以前に発見されたアルファルファモザ
イクウィルスコートたんばく質由来の５′非コード領域
に対応するよう合成的に構築された５′コード領域が含
まれている。５′非コード翻訳エンハンサ−につづいて
Ｂ、ｔ、デルタ内毒素をコードする短縮化したトキシン
配列があり、そのあとにＰｓｔ１部位を含む制限酵素の
切断部位およびアグロバクテリウムツメファシェンス（
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ＋ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）のＴｉプラスミド由来のツバリンシンテース遺伝子
由来のポリアゾニレ−ジョン領域がある。またプラスミ
ドｐＡＭＶＢＴＳには逆方向に読んで原核性宿主細胞中
で発現するよう構築されたアンピシリン耐性の選択可能
なマーカーがある。このプラスミドｐＡＭＶＢＴＳは１
９８７年６月２４日受理番号第５３６３７号としてアメ
リカンタイプカルチャーコレクション（メリーランド、
ロックビル）に保管された。このプラスミドの詳細はバ
ートン（Ｂａｒｔｏｎ）等（Ｐｌａｎｔ、 Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、 ８５． ｐｐ、 １１（１３１１（１９ （１
９８７） ）およびＰＣＴ特許出願ＷＯ８９１０４８６
８（１９８９年６月１日公開）により報告されており、
いずれも本明細書では参考として引用している。
Ａａ ＩＴ昆虫トキシンポリペプチドに対する７０個の
アミノ酸からなるたんばく質配列が以前にダーボン（Ｄ
ａｒｂｏｎ）等（Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｐｅｐ、 Ｒｅｓ、
）２０、ｐｐ、３２０−３３０ （１９８２））によっ
て報告された。この目的は節足動物細胞とは反対に植物
細胞中でこのたんぱく質が至適効率で発現するように発
現カセットを構築することであるのでトキシンのコード
領域はその本来の宿主からクローン化されず、その代り
に植物中でこのたんぱく質コード領域の翻訳効率を上げ
るよう合成した。
アミノ酸からなるたんばく質配列が以前にダーボン（Ｄ
ａｒｂｏｎ）等（Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｐｅｐ、 Ｒｅｓ、
）２０、ｐｐ、３２０−３３０ （１９８２））によっ
て報告された。この目的は節足動物細胞とは反対に植物
細胞中でこのたんぱく質が至適効率で発現するように発
現カセットを構築することであるのでトキシンのコード
領域はその本来の宿主からクローン化されず、その代り
に植物中でこのたんぱく質コード領域の翻訳効率を上げ
るよう合成した。
それゆえまず人ニドキシンコードＤＮＡ配列は公表され
たアミノ酸配列に基づいて誘導した。この合成コード配
列を作成するため効率的に生産される天然の植物たんば
く質の発現において本来の植物遺伝子によって利用され
るコドンの出現頻度をリストしたリストを参考にした。
たアミノ酸配列に基づいて誘導した。この合成コード配
列を作成するため効率的に生産される天然の植物たんば
く質の発現において本来の植物遺伝子によって利用され
るコドンの出現頻度をリストしたリストを参考にした。
第１図は植物細胞中で効率的に発現されると測定され、
配列決定された植物遺伝子に関する公表されている配列
データに基づき本研究者により確認されたアミノ酸コド
ン使用頻度表が示されている。このように望ましいペプ
チド中の各アミノ酸部位に本来の植物遺伝子中で特定の
アミノ酸を発現するよう本来の植物細胞中で使用されて
いる最も頻度の高いコドンを代表するコドンが選択され
た。各アミノ酸に対して好ましいコドンが第１図の輪郭
で示されている。好ましいコドン使用に関する規則に基
づきサソリ中で産生される同じ７０個のアミノ酸ポリペ
プチドをコードする２１０塩基対からなる合成ヌクレオ
チド配列を誘導した。この長さのＤＮＡ配列を合成する
ために望ましい全配列に対応する６個の重複する相同合
成オリゴヌクレオチドを作成した。ＭＭ６２〜６７と命
名された６個のオリゴヌクレオチドにコードされる全た
んばく質配列を第２図に示した。ヌクレオチド４８２〜
６９４のＡａＩＴトキシンコート領域でＢ、ｔ、のＡａ
ＩＴペプチドコード領域を置換することによりプラス
ミドｐＡＭＶＢＴＳから誘導した植物細胞におけるＡａ
ＩＴトキシン発現カセットを第３図に示し、これをｐＡ
ＭＶｓＴｌと命名した。
配列決定された植物遺伝子に関する公表されている配列
データに基づき本研究者により確認されたアミノ酸コド
ン使用頻度表が示されている。このように望ましいペプ
チド中の各アミノ酸部位に本来の植物遺伝子中で特定の
アミノ酸を発現するよう本来の植物細胞中で使用されて
いる最も頻度の高いコドンを代表するコドンが選択され
た。各アミノ酸に対して好ましいコドンが第１図の輪郭
で示されている。好ましいコドン使用に関する規則に基
づきサソリ中で産生される同じ７０個のアミノ酸ポリペ
プチドをコードする２１０塩基対からなる合成ヌクレオ
チド配列を誘導した。この長さのＤＮＡ配列を合成する
ために望ましい全配列に対応する６個の重複する相同合
成オリゴヌクレオチドを作成した。ＭＭ６２〜６７と命
名された６個のオリゴヌクレオチドにコードされる全た
んばく質配列を第２図に示した。ヌクレオチド４８２〜
６９４のＡａＩＴトキシンコート領域でＢ、ｔ、のＡａ
ＩＴペプチドコード領域を置換することによりプラス
ミドｐＡＭＶＢＴＳから誘導した植物細胞におけるＡａ
ＩＴトキシン発現カセットを第３図に示し、これをｐＡ
ＭＶｓＴｌと命名した。
ｐＡＭＶｓＴｌのための発現カセットを構築するため始
めに２つの対で６個の重複合成オリゴヌクレオチドをア
ニールし２本鎖分子を形成した。
めに２つの対で６個の重複合成オリゴヌクレオチドをア
ニールし２本鎖分子を形成した。
それから最初の中央の二本鎖（ＭＭ６３とＭＭ６６）の
各５′端をリン酸化した。３個の二本鎖オリゴヌクレオ
チドをライゲーションした後予めＨｉｎｄ ＩＩＩとＰ
ｓｔＩで切断したプラスミドｐＵｃ１８に挿入した。ｐ
ＵｃｓＴｌと命名したこのプラスミドを配列決定しその
挿入物が第２図に示したとおりの望ましい配列になって
いることを確認した。
各５′端をリン酸化した。３個の二本鎖オリゴヌクレオ
チドをライゲーションした後予めＨｉｎｄ ＩＩＩとＰ
ｓｔＩで切断したプラスミドｐＵｃ１８に挿入した。ｐ
ＵｃｓＴｌと命名したこのプラスミドを配列決定しその
挿入物が第２図に示したとおりの望ましい配列になって
いることを確認した。
第２図に示しであるように昆虫トキシンコード領域の開
始メチオニンコドン（ＡＴＧ）の直ぐ隣りに酵素Ｂｓｐ
Ｍ Ｉ ５ ’側制限酵素部位を含むよう合成り Ｎ
Ａ配列を設計した。まずプラスミドｐＵｃｓＴ１をＰｓ
ｔＩで消化し昆虫トキシンコード領域の３′末端を放出
させ、かつｐＵｃ１８に由来するポリリンカー内に存在
するＢｓｐＭＩＩ位を破壊した。このようにして作った
線状ＤＮＡフラグメントをＢｓｐＭＩで消化し、プラス
ミドｐＡＭＶＢＴｓ中で都合よく使用し得るＮｃｏｌ制
限部位とのライゲーションに適合し得る” ＣＡ Ｔ
Ｇ”粘着末端をもつコード領域の５′末端部分を放出さ
せた。
始メチオニンコドン（ＡＴＧ）の直ぐ隣りに酵素Ｂｓｐ
Ｍ Ｉ ５ ’側制限酵素部位を含むよう合成り Ｎ
Ａ配列を設計した。まずプラスミドｐＵｃｓＴ１をＰｓ
ｔＩで消化し昆虫トキシンコード領域の３′末端を放出
させ、かつｐＵｃ１８に由来するポリリンカー内に存在
するＢｓｐＭＩＩ位を破壊した。このようにして作った
線状ＤＮＡフラグメントをＢｓｐＭＩで消化し、プラス
ミドｐＡＭＶＢＴｓ中で都合よく使用し得るＮｃｏｌ制
限部位とのライゲーションに適合し得る” ＣＡ Ｔ
Ｇ”粘着末端をもつコード領域の５′末端部分を放出さ
せた。
それからプラスミドｐＡＭＶＢＴＳをＮｃｏＩおよびＰ
ｓｔＩで消化し、そのベクターの発現カセット部分をＢ
ＴＳコード領域から単離した。その後合成サソリトキシ
ンコード領域をベクターにライゲーションした。このプ
ロセスを第４図に示した。
ｓｔＩで消化し、そのベクターの発現カセット部分をＢ
ＴＳコード領域から単離した。その後合成サソリトキシ
ンコード領域をベクターにライゲーションした。このプ
ロセスを第４図に示した。
生成したプラスミドｐＡＭＶｓＴ１はプラスミドｐＡＭ
ＶＢＴＳから由来する植物発現カセットを含んでいる。
ＶＢＴＳから由来する植物発現カセットを含んでいる。
この発現カセットはＣａ Ｍ Ｖ ３５ Ｓ転写プロモ
ーター、アルファルファモザイクウィルスコートたんば
く質のｍＲＮＡ非コード領域と同じ配列の５′非コード
翻訳エンハンサ−Ａａ ＩＴ昆虫トキシンのたんぱく質
配列をコードする合成りＮＡフラグメントおよびツバリ
ンシンテースのポリアゾニレ−ジョン領域を含んでいる
。
ーター、アルファルファモザイクウィルスコートたんば
く質のｍＲＮＡ非コード領域と同じ配列の５′非コード
翻訳エンハンサ−Ａａ ＩＴ昆虫トキシンのたんぱく質
配列をコードする合成りＮＡフラグメントおよびツバリ
ンシンテースのポリアゾニレ−ジョン領域を含んでいる
。
また細菌の選択のためのアンピシリン耐性の選択マーカ
ーがプラスミドｐＡＭＶｓＴＩの中に含まれている。
ーがプラスミドｐＡＭＶｓＴＩの中に含まれている。
アグロバクテリウムを用いた植物細胞のトランスホーメ
ーションを行うため、プラスミドｐ Ａ Ｍ Ｖ Ｂ
Ｔ Ｓ Ｈに関してハードン（Ｂａｒｔｏｎ）等および
ＷＯ３９１０４８６８（いずれも参考として引用してい
る）に報告されているアグロバクテリウムツメファシェ
ンス（八ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ）バイナリ−ベクター９ＴＶ４に組込んだ。この
登録済プラスミドｐＶＴ４ＡＭＶＢＴＳＨ（ＡＴＣＣ受
理番号第５３６３６号）はＸｈｏｒによる組込みプラス
ミドｐ ＶＴ４ＡＭＶＢＴＳＨの消化、消化産物のライ
ゲーションによる２つの生成プラスミドｐＴＶ４および
ｐＡＭＶＴＢＴＳの再閉環およびスルフアジアゼン耐性
を用いた大腸菌へのトランスホーメーションによる便利
なプラスミドｐＴＶｄ源である。小規模調製でｐＴＶ４
の単離が確認されよう。アンピシリン耐性を用いた同様
の操作は植物中の発現ベクターとしてｐＡＭＶＢＴＳを
誘導するのに使用し得る。
ーションを行うため、プラスミドｐ Ａ Ｍ Ｖ Ｂ
Ｔ Ｓ Ｈに関してハードン（Ｂａｒｔｏｎ）等および
ＷＯ３９１０４８６８（いずれも参考として引用してい
る）に報告されているアグロバクテリウムツメファシェ
ンス（八ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ）バイナリ−ベクター９ＴＶ４に組込んだ。この
登録済プラスミドｐＶＴ４ＡＭＶＢＴＳＨ（ＡＴＣＣ受
理番号第５３６３６号）はＸｈｏｒによる組込みプラス
ミドｐ ＶＴ４ＡＭＶＢＴＳＨの消化、消化産物のライ
ゲーションによる２つの生成プラスミドｐＴＶ４および
ｐＡＭＶＴＢＴＳの再閉環およびスルフアジアゼン耐性
を用いた大腸菌へのトランスホーメーションによる便利
なプラスミドｐＴＶｄ源である。小規模調製でｐＴＶ４
の単離が確認されよう。アンピシリン耐性を用いた同様
の操作は植物中の発現ベクターとしてｐＡＭＶＢＴＳを
誘導するのに使用し得る。
ｐＴＶ４中にｐＡＭＶＴＳＴｌを組込むためには両プラ
スミドをＸｈｏｌで消化し、線状ＤＮＡを合せて再結合
する。この産物を大腸菌にトランスホームし、スルフア
ジアゼンおよびアンピシリン耐性で選択した後、小規模
調製分析により確認した。
スミドをＸｈｏｌで消化し、線状ＤＮＡを合せて再結合
する。この産物を大腸菌にトランスホームし、スルフア
ジアゼンおよびアンピシリン耐性で選択した後、小規模
調製分析により確認した。
このトキシンを用いたインビトロでの毒性研究を行うた
めＡａＩＴトキシンをシグマ社から入手した。
めＡａＩＴトキシンをシグマ社から入手した。
（植物のトランスホーメーション）
プラスミドｐＡＭＶＳＴ１をバイナリーヘクターｐＴＶ
４に組込み、バートン（Ｂａｒ ｔｏｎ）等により報告
されているようにアグロバクテリウム（八ｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ） Ｅ ＨＡ １０１株に取り込ませた。
４に組込み、バートン（Ｂａｒ ｔｏｎ）等により報告
されているようにアグロバクテリウム（八ｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ） Ｅ ＨＡ １０１株に取り込ませた。
タバコの種子にコチアナタパカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｔａｂａｃｕｍ）、ハハナ４２５）の表面を滅菌し、Ｍ
Ｓ培地中で発芽させ、無菌的に生育した葉および茎に対
する植物トランスホーメーション操作を可能とした。無
菌的に生育したタバコ組織にトランスホーメーションヘ
クターを含むアグロバクテリウム（八ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ）を接種した後この植物を再生してから当分
野でよく知られている方法でカナマイシン耐性トランス
ホーマントを選択した。
ｔａｂａｃｕｍ）、ハハナ４２５）の表面を滅菌し、Ｍ
Ｓ培地中で発芽させ、無菌的に生育した葉および茎に対
する植物トランスホーメーション操作を可能とした。無
菌的に生育したタバコ組織にトランスホーメーションヘ
クターを含むアグロバクテリウム（八ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ）を接種した後この植物を再生してから当分
野でよく知られている方法でカナマイシン耐性トランス
ホーマントを選択した。
ＲＯ植物と命名したトランスホーマントについて以下に
述べるようにこれらの植物細胞における適切なトキシン
ＤＮＡ、ＲＮＡおよびたんばく質の分析を行った。
述べるようにこれらの植物細胞における適切なトキシン
ＤＮＡ、ＲＮＡおよびたんばく質の分析を行った。
（毒性実験）
トランスジェニック植物を使って行なわれる最初の毒性
実験はカリホルニアバイオロジカルサプライ社から卵と
して購入したタバコスズメガを使って行った。再生した
ＲＯ植物によるタバコスズメガの最初の飼育ではこの昆
虫に対する明確な毒性を示すことができなかった。
実験はカリホルニアバイオロジカルサプライ社から卵と
して購入したタバコスズメガを使って行った。再生した
ＲＯ植物によるタバコスズメガの最初の飼育ではこの昆
虫に対する明確な毒性を示すことができなかった。
飼育昆虫の不感受性がトランスホーメーション技術の失
敗というよりもむしろそのトキシンの無効性によるもの
であることを確証するため作成した約４０個のＲＯ植物
についてＲＮＡスクリーニングを行った。このスクリー
ニングは各トランスホーマント由来のＲＮＡのスロット
プロットハイブリダイゼーションによって行った。トラ
ンスホーマント内のハイブリダイズＲＮＡの組込みを確
認するためにノーザンプロノトを行った。これらのスロ
ットプロットおよびノーザンゲルに用いた操作はバート
ン（Ｂａｒｔｏｎ）等により議論されている（上述）。
敗というよりもむしろそのトキシンの無効性によるもの
であることを確証するため作成した約４０個のＲＯ植物
についてＲＮＡスクリーニングを行った。このスクリー
ニングは各トランスホーマント由来のＲＮＡのスロット
プロットハイブリダイゼーションによって行った。トラ
ンスホーマント内のハイブリダイズＲＮＡの組込みを確
認するためにノーザンプロノトを行った。これらのスロ
ットプロットおよびノーザンゲルに用いた操作はバート
ン（Ｂａｒｔｏｎ）等により議論されている（上述）。
最も高いレベルでハイブリダイズＲＮＡを有するいくつ
かのＲＯ植物を自己授粉させＲ１実生分析用の種子を提
供した。まず１つの植物はＡａ ＩＴたんばく質をコー
ドする遺伝子の非常に活発な転写を行っていることが同
定された。
かのＲＯ植物を自己授粉させＲ１実生分析用の種子を提
供した。まず１つの植物はＡａ ＩＴたんばく質をコー
ドする遺伝子の非常に活発な転写を行っていることが同
定された。
植物Ｔ２６３６と命名されたこの植物はＡａ ＩＴプロ
ーブとｔ目間的なその全ｍＲＮＡのおよそ０、００１％
を有していると測定され、一方性の再生物はより低い様
々なレベルの発現を示した。植物中に挿入された異種遺
伝子からの遺伝子発現の変化および活性はアグロバクテ
リウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ） トランスホ
ーメーションまたは植物に遺伝子を挿入する他の従来法
に際しては全く一般的なものである。その後事も高い発
現植物を植物２６３６およびその自家授粉で生成した子
孫に関する原則で検定した。これらの植物に由来するＲ
Ｎ Ａの転写分析はポリＡテールを含む予想された５
３０ヌクレオチドサイズのｍＲＮＡとハイブリダイズす
ることを示した。Ａａ ＩＴおよび、八ＰＨ−ＩＩ（カ
ナマイシン耐性）コード領域由来の転写物の相対量の測
定は、１へＰＨ−ｎＲＮＡ！＝比べ、へａ ＩＴＲＮＡ
濃度は１０倍の差を示した。
ーブとｔ目間的なその全ｍＲＮＡのおよそ０、００１％
を有していると測定され、一方性の再生物はより低い様
々なレベルの発現を示した。植物中に挿入された異種遺
伝子からの遺伝子発現の変化および活性はアグロバクテ
リウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ） トランスホ
ーメーションまたは植物に遺伝子を挿入する他の従来法
に際しては全く一般的なものである。その後事も高い発
現植物を植物２６３６およびその自家授粉で生成した子
孫に関する原則で検定した。これらの植物に由来するＲ
Ｎ Ａの転写分析はポリＡテールを含む予想された５
３０ヌクレオチドサイズのｍＲＮＡとハイブリダイズす
ることを示した。Ａａ ＩＴおよび、八ＰＨ−ＩＩ（カ
ナマイシン耐性）コード領域由来の転写物の相対量の測
定は、１へＰＨ−ｎＲＮＡ！＝比べ、へａ ＩＴＲＮＡ
濃度は１０倍の差を示した。
このことはプロモーター領域の差によるものかもしれな
いが（ＡＰＨ−１１遺伝子のノパリンンンテースプロモ
ーターに比べＡａＩＴ遺伝子のＣ，ＡＭＶ３５Ｓプロモ
ーターはより強い）、これは確かではない。
いが（ＡＰＨ−１１遺伝子のノパリンンンテースプロモ
ーターに比べＡａＩＴ遺伝子のＣ，ＡＭＶ３５Ｓプロモ
ーターはより強い）、これは確かではない。
Ｒ１およびＲ２植物組織によるタバコスズメガの継続的
飼育ではこの昆虫の死亡は見られず摂取も有意に減少し
なかった。しかし、昆虫毒性検定を他の候補でも行ない
その結果を第９図に示した。
飼育ではこの昆虫の死亡は見られず摂取も有意に減少し
なかった。しかし、昆虫毒性検定を他の候補でも行ない
その結果を第９図に示した。
特に昆虫毒性実験は綿みのむしくへりオシスジ−（Ｈｅ
ｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ ＞およびビートあわよとう（
スポドプテラエクシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘ
ｉｇｕａ）を用いて行った。植物Ｔ２６３２の子孫Ｒ１
およびＲ２由来の組織を供給したとき、棉みのむしおよ
びあわよとうの両方共非常に高い死亡率を示し摂取も劇
的に減少した。同様の知見は植物Ｔ２６３６よりも低い
レベルでＡａ ＩＴ転写物を発現することが先に測定さ
れた元々のＲＯ植物の子孫である別の植物でも見い出さ
れた。
ｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ ＞およびビートあわよとう（
スポドプテラエクシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘ
ｉｇｕａ）を用いて行った。植物Ｔ２６３２の子孫Ｒ１
およびＲ２由来の組織を供給したとき、棉みのむしおよ
びあわよとうの両方共非常に高い死亡率を示し摂取も劇
的に減少した。同様の知見は植物Ｔ２６３６よりも低い
レベルでＡａ ＩＴ転写物を発現することが先に測定さ
れた元々のＲＯ植物の子孫である別の植物でも見い出さ
れた。
植物細胞中で産生されるペプチドとは別に標的昆虫に関
しＡａ ＩＴペプチドの効果を確認するためアンドロフ
トナスオーストラリス（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓａｕｓ
ｔｒａｌｉｓ）の粗毒の市販調製物（シグマケミカル社
）を局所的および摂取により取り込ませた。局所的使用
の場合Ａａ ＩＴペプチドをミリリットル当りおよそ５
ミリグラムの濃度となるよう５０％ＤＭＳＯに熔解し、
この溶液約１ミリリツトルを直接標的昆虫の皮膚に使用
した。コントロール処理に対するマヒ、行動変化および
死亡率を使用後２４時間までモニターした。このトキシ
ンは植物組織内にあって摂取の形では比較的に効果的で
はないようだが局所的にスズメガに使用したときには活
性があることが発見された。処理したスズメガ幼虫の活
力の減少やしばしば見られるけいれん応答が局所的処理
後に観測され、−船釣にはその後完全に回復した。ト：
トシンの注射は活性の減退が長期間持続したが死亡は起
こさなかった。わたみのむしなど別の生物は導入経路が
局所的、注入または摂取のいずれであろうとこのトキシ
ンに対し感受性を示した。
しＡａ ＩＴペプチドの効果を確認するためアンドロフ
トナスオーストラリス（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓａｕｓ
ｔｒａｌｉｓ）の粗毒の市販調製物（シグマケミカル社
）を局所的および摂取により取り込ませた。局所的使用
の場合Ａａ ＩＴペプチドをミリリットル当りおよそ５
ミリグラムの濃度となるよう５０％ＤＭＳＯに熔解し、
この溶液約１ミリリツトルを直接標的昆虫の皮膚に使用
した。コントロール処理に対するマヒ、行動変化および
死亡率を使用後２４時間までモニターした。このトキシ
ンは植物組織内にあって摂取の形では比較的に効果的で
はないようだが局所的にスズメガに使用したときには活
性があることが発見された。処理したスズメガ幼虫の活
力の減少やしばしば見られるけいれん応答が局所的処理
後に観測され、−船釣にはその後完全に回復した。ト：
トシンの注射は活性の減退が長期間持続したが死亡は起
こさなかった。わたみのむしなど別の生物は導入経路が
局所的、注入または摂取のいずれであろうとこのトキシ
ンに対し感受性を示した。
第９図はタバコ植物Ｔ３３７６の子孫に関する種々の昆
虫の幼虫の飼育試験をまと約たものである。最初のＲ○
の子孫Ｒ１は植物Ｔ２６３６を再生する。第９図にまと
めたテストに使用する植物を作成するため植物Ｔ３３７
６を自家授粉、昆虫毒性ｉのバチルススリンジエンシス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｒ＋ｎｇｉｅｎｓｉｓ）デルタ
内毒素を発現する単一ＢＴＳの相同的挿入を有するＲ２
植物Ｔ３２１９への花粉供与体または雌の花粉受容体と
しての交雑およびさらに植物Ｔ３２１９の自家授粉によ
る３種の方法で繁植させた。飼育試験前、これらの異種
交配体の子孫全てをポリメラーゼチェーンリアクンン（
ＰＣＲ）で分析し、適当なＡａ ＩＴまたはＢ、ｔ、配
列の存在を確認した。植物Ｔ３２１９の自己子孫はＢ、
ｔ、 と相同的であると期待される一方両方の関連遺
伝子を１コピー含んでいるＴａ２（１５およびＴ３３７
６の交配物も単離された。
虫の幼虫の飼育試験をまと約たものである。最初のＲ○
の子孫Ｒ１は植物Ｔ２６３６を再生する。第９図にまと
めたテストに使用する植物を作成するため植物Ｔ３３７
６を自家授粉、昆虫毒性ｉのバチルススリンジエンシス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｒ＋ｎｇｉｅｎｓｉｓ）デルタ
内毒素を発現する単一ＢＴＳの相同的挿入を有するＲ２
植物Ｔ３２１９への花粉供与体または雌の花粉受容体と
しての交雑およびさらに植物Ｔ３２１９の自家授粉によ
る３種の方法で繁植させた。飼育試験前、これらの異種
交配体の子孫全てをポリメラーゼチェーンリアクンン（
ＰＣＲ）で分析し、適当なＡａ ＩＴまたはＢ、ｔ、配
列の存在を確認した。植物Ｔ３２１９の自己子孫はＢ、
ｔ、 と相同的であると期待される一方両方の関連遺
伝子を１コピー含んでいるＴａ２（１５およびＴ３３７
６の交配物も単離された。
Ａａ ＩＴ遺伝子を含んでいない植物Ｔ３３７６の子孫
はこの実験から除いた。
はこの実験から除いた。
第９図のグラフで“Ｓｔ”は植物Ｔ２６３６の自家授粉
による子孫由来の組織で飼育した幼虫を示しており、“
Ｈ４２５”はコントロールとして野生型（非トランスジ
ェニック）のハバナ４２５タバコ組織で飼育した幼虫を
示しており、“Ｂｔ”は単一のＢ、ｔ、遺伝子（Ｔａ２
（１５とＴａ２（１５の交配から生成した）をもつ見か
け上異質植物体の組織で飼育した幼虫を示しており、“
Ｂ、ｔ、＋Ｂ、ｔ、”は見かけ上相量的Ｂ、ｔ、遺伝子
を含むタバコ植物（自家授粉したＴ３２１９に由来する
）の組織で飼育した幼虫、“Ｂ、 ｔ、 ＋ｓ、 ｔ、
”はＢ、ｔ、遺伝子含有体（Ｔａ２（１５）およびＡａ
ＩＴ遺伝子含有体（Ｔａ２（１５）の交配体に由来す
る植物の組織で飼育した幼虫を示している。
による子孫由来の組織で飼育した幼虫を示しており、“
Ｈ４２５”はコントロールとして野生型（非トランスジ
ェニック）のハバナ４２５タバコ組織で飼育した幼虫を
示しており、“Ｂｔ”は単一のＢ、ｔ、遺伝子（Ｔａ２
（１５とＴａ２（１５の交配から生成した）をもつ見か
け上異質植物体の組織で飼育した幼虫を示しており、“
Ｂ、ｔ、＋Ｂ、ｔ、”は見かけ上相量的Ｂ、ｔ、遺伝子
を含むタバコ植物（自家授粉したＴ３２１９に由来する
）の組織で飼育した幼虫、“Ｂ、 ｔ、 ＋ｓ、 ｔ、
”はＢ、ｔ、遺伝子含有体（Ｔａ２（１５）およびＡａ
ＩＴ遺伝子含有体（Ｔａ２（１５）の交配体に由来す
る植物の組織で飼育した幼虫を示している。
３つのグラフはこれらの組織で０〜８日間飼育したマン
ダカセクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ ５ｅｘｔａ）、ヘリオ
シス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）およびスボドブテラ（Ｓｐ
ｏｄｏｐ ｔｅｒａ）の生存率を示している。この実験
でマンダカ（Ｍａｎｄｕｃａ）に関してはＡａ ＩＴ遺
伝子の効果はないが、Ａａ ＩＴはコントロールと比ベ
ヘリオシス（ｔｌｅ Ｉ ｉｏ Ｌｈ ｉｓ）およびス
ボドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）に対し有意な死滅
を引き起こしたことが分る。さらに植物中にＢ、ｔ、お
よびＡａ ＩＴの両方が存在すると昆虫に対し、それら
のトキシン各々よりも大きい毒性を与え、相乗効果が示
されている。したがって両トキシンの存在は各トキシン
に対する耐性の発達を抑制することが期待される。
ダカセクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ ５ｅｘｔａ）、ヘリオ
シス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）およびスボドブテラ（Ｓｐ
ｏｄｏｐ ｔｅｒａ）の生存率を示している。この実験
でマンダカ（Ｍａｎｄｕｃａ）に関してはＡａ ＩＴ遺
伝子の効果はないが、Ａａ ＩＴはコントロールと比ベ
ヘリオシス（ｔｌｅ Ｉ ｉｏ Ｌｈ ｉｓ）およびス
ボドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）に対し有意な死滅
を引き起こしたことが分る。さらに植物中にＢ、ｔ、お
よびＡａ ＩＴの両方が存在すると昆虫に対し、それら
のトキシン各々よりも大きい毒性を与え、相乗効果が示
されている。したがって両トキシンの存在は各トキシン
に対する耐性の発達を抑制することが期待される。
これらの実験はキメラ遺伝子の構築は少なくともＲ２世
代までは安定であり、メンデル的遺伝により子孫植物へ
引き継がれうる遺伝性を有することを明らかにした。こ
の観察は植物の幼芽へのトランスジェニック遺伝子の挿
入に関する以前の実験結果と一致する。
代までは安定であり、メンデル的遺伝により子孫植物へ
引き継がれうる遺伝性を有することを明らかにした。こ
の観察は植物の幼芽へのトランスジェニック遺伝子の挿
入に関する以前の実験結果と一致する。
（実施例２）
昆虫に対して神経毒性を有する殺虫性ポリペプチド（イ
ンセクトトキシン■またはＢｅ１Ｔ１）を中央アジアサ
ソリバサスエピウス（Ｂｕｔｈｕｓ ｅｐｉｕｓ）の毒
から単離したくズダノバ（２ｈｄａｎｏｖａ）等、Ｂｉ
ｏｏｒｇａｎｉｃｈｅｓｋａｙａ Ｋｈｉｍｉｙａ、
３ ｐｐ、 ４８５４９３（１９７７）、グリシン
（Ｇｒｉｓｈｉｎ）、ｒｎｔ、 Ｊ、Ｑｕａｎｔ、 Ｃ
ｈｅｍ、） １９、ｐｐ２９１−２９８（１９８１）
）。このペプチドの精製および生活性テストの後、ア
ミノ酸配列を決定し、以下に示したものであることが分
った（アミノ酸の１文字コードによる）。
ンセクトトキシン■またはＢｅ１Ｔ１）を中央アジアサ
ソリバサスエピウス（Ｂｕｔｈｕｓ ｅｐｉｕｓ）の毒
から単離したくズダノバ（２ｈｄａｎｏｖａ）等、Ｂｉ
ｏｏｒｇａｎｉｃｈｅｓｋａｙａ Ｋｈｉｍｉｙａ、
３ ｐｐ、 ４８５４９３（１９７７）、グリシン
（Ｇｒｉｓｈｉｎ）、ｒｎｔ、 Ｊ、Ｑｕａｎｔ、 Ｃ
ｈｅｍ、） １９、ｐｐ２９１−２９８（１９８１）
）。このペプチドの精製および生活性テストの後、ア
ミノ酸配列を決定し、以下に示したものであることが分
った（アミノ酸の１文字コードによる）。
ＭＣＭＰＣＦＴＴＲＰＤＭ八ＱＱＣＲＡＣＣＫＧＲへＪ
ＣＦＧＰＱＣＬＣＧＹＤＡａ ＩＴペプチドをコードす
る遺伝子の合成を示す実施例１と同様にキメラ遺伝子を
構築して合成コード領域を含むＢｅ１Ｔ１の植物中での
発現を可能にした。植物中で最も頻繁に使用されるコド
ンに基づき（第１図）、ＭＭ８３〜８６と命名され、該
ペプチドのアミノ酸コード領域に対応する４個のオリゴ
ヌクレオチドを合成した。第５図には合成コード領域と
オリゴヌクレオチドの両方が示しである。オリゴヌクレ
オチドＭＭ８３とＭＭ８５は相補的であり、そのペプチ
ドのコード配列の７ミノ末端部分に相当する。オリゴヌ
クレオチド”ＭＭ８４とＭＭ８６は相補的でそのコード
領域のカルボキシ末端部分に相当する。植物中での発現
のための機能性遺伝子構築のためまず４個のオリゴヌク
レオチドをその相補的ベアと結合させ、２組のベアを合
せて重複部分をアニールした。それからこのオリゴヌク
レオチドをＡＴＰの存在下でポリヌクレオチドキナーゼ
で処理しライゲーションが可能となるようにそのオリゴ
ヌクレオチドの水酸基末端を５′モノリン酸化した。ア
ニールしたオリゴヌクレオチドを予めＨｉｎｄＩ［およ
びＢａｍＨｒで消化したｐＵｃ１８プラスミドベクター
と合せた。ＤＮＡ’Ｊガーゼでそのベア同士をライゲー
ションし、その合成りｅＩＴ１コード領域をベクターｐ
Ｕｃ１８に結合した。大腸菌をアンピシリン耐性にトラ
ンスホームし、つづいてそのＤ Ｎ Ａ ８１ｉ製物か
ら適当なプラスミドを同定した。
ＣＦＧＰＱＣＬＣＧＹＤＡａ ＩＴペプチドをコードす
る遺伝子の合成を示す実施例１と同様にキメラ遺伝子を
構築して合成コード領域を含むＢｅ１Ｔ１の植物中での
発現を可能にした。植物中で最も頻繁に使用されるコド
ンに基づき（第１図）、ＭＭ８３〜８６と命名され、該
ペプチドのアミノ酸コード領域に対応する４個のオリゴ
ヌクレオチドを合成した。第５図には合成コード領域と
オリゴヌクレオチドの両方が示しである。オリゴヌクレ
オチドＭＭ８３とＭＭ８５は相補的であり、そのペプチ
ドのコード配列の７ミノ末端部分に相当する。オリゴヌ
クレオチド”ＭＭ８４とＭＭ８６は相補的でそのコード
領域のカルボキシ末端部分に相当する。植物中での発現
のための機能性遺伝子構築のためまず４個のオリゴヌク
レオチドをその相補的ベアと結合させ、２組のベアを合
せて重複部分をアニールした。それからこのオリゴヌク
レオチドをＡＴＰの存在下でポリヌクレオチドキナーゼ
で処理しライゲーションが可能となるようにそのオリゴ
ヌクレオチドの水酸基末端を５′モノリン酸化した。ア
ニールしたオリゴヌクレオチドを予めＨｉｎｄＩ［およ
びＢａｍＨｒで消化したｐＵｃ１８プラスミドベクター
と合せた。ＤＮＡ’Ｊガーゼでそのベア同士をライゲー
ションし、その合成りｅＩＴ１コード領域をベクターｐ
Ｕｃ１８に結合した。大腸菌をアンピシリン耐性にトラ
ンスホームし、つづいてそのＤ Ｎ Ａ ８１ｉ製物か
ら適当なプラスミドを同定した。
その挿入Ｄ Ｎ Ａを配列決定して第５図に示されてい
る配列を確認した。第５図を参照して分るように二本鎖
オリゴヌクレオチドの５′末端はエンドヌクレアーゼＨ
ｉｎｄ［Ｉによって生成するものと同じヌクレオチドの
粘着末端（重複）を有し、一方３′末端はエンドヌクレ
アーゼＥ３ａｍＨＩで生成するものと同じ粘着末端を有
する。合成挿入物中のＨｉｎｃｌ■部位の直ぐ隣りにヘ
キサヌクレオチド認識部位から刈れた場所を切断するエ
ンドヌクレアーゼＢｓｐＭＩの切断認識部位がある。こ
のことはこのオリゴヌクレオチド中にエンドヌクレアー
ゼＮｃｏｌと適合する４ヌクレオチド粘着末端を生ずる
。Ｎｃｏｌは機能性キメラ遺伝子を構築を目的としたｐ
ＡＭＶＢＴＳ由来の調節ＤＮＡ配列への１３ｅ ＩＴＩ
コード配列の結合に使用される認識部位をもつ酵素であ
る。Ｎｃｏｌ認識配列“ＣＣＡＴＧＧ”の中央の“ＡＴ
Ｇ″は１３ ｅ Ｉ Ｔ １コ一ド配列の最初のコドン
を示している。ＢｅｌＴ１の第２コドンはシスティン（
ｃｙｓ、ＴＧＣ）であるのでコドンの最初のヌクレオチ
ドが“Ｇ”であることを必要とすることから（Ｎｃｏｌ
認識配列ＣＣＡＴＧＧを完全させるために）、ＮＣ０Ｉ
切断部位を提供し得ない。それゆえ、ＢｅｌＴ１フラグ
メントに最適する“ＣＡＴＧ”粘着末端を生成し、Ｎｃ
ｏｌ認識部位がライゲーションにより破壊されてしまう
がＮｃｏＩにより生成した部位にライゲーションし得る
ようにＢｓｐＭＩを使用した。コード領域のカルボキシ
末端でＢａｍＨ１部位の直ぐ隣りにＰｓｔＩの認識配列
（ｃＴＧＣＡＧ）がある。この酵素：まキメラ遺１云子
構築を目的とした発現プラスミドへのカルボキン末端の
ライゲーションのだｅｐｉｃ１８由来のコード配列を切
断するのに使用される。
る配列を確認した。第５図を参照して分るように二本鎖
オリゴヌクレオチドの５′末端はエンドヌクレアーゼＨ
ｉｎｄ［Ｉによって生成するものと同じヌクレオチドの
粘着末端（重複）を有し、一方３′末端はエンドヌクレ
アーゼＥ３ａｍＨＩで生成するものと同じ粘着末端を有
する。合成挿入物中のＨｉｎｃｌ■部位の直ぐ隣りにヘ
キサヌクレオチド認識部位から刈れた場所を切断するエ
ンドヌクレアーゼＢｓｐＭＩの切断認識部位がある。こ
のことはこのオリゴヌクレオチド中にエンドヌクレアー
ゼＮｃｏｌと適合する４ヌクレオチド粘着末端を生ずる
。Ｎｃｏｌは機能性キメラ遺伝子を構築を目的としたｐ
ＡＭＶＢＴＳ由来の調節ＤＮＡ配列への１３ｅ ＩＴＩ
コード配列の結合に使用される認識部位をもつ酵素であ
る。Ｎｃｏｌ認識配列“ＣＣＡＴＧＧ”の中央の“ＡＴ
Ｇ″は１３ ｅ Ｉ Ｔ １コ一ド配列の最初のコドン
を示している。ＢｅｌＴ１の第２コドンはシスティン（
ｃｙｓ、ＴＧＣ）であるのでコドンの最初のヌクレオチ
ドが“Ｇ”であることを必要とすることから（Ｎｃｏｌ
認識配列ＣＣＡＴＧＧを完全させるために）、ＮＣ０Ｉ
切断部位を提供し得ない。それゆえ、ＢｅｌＴ１フラグ
メントに最適する“ＣＡＴＧ”粘着末端を生成し、Ｎｃ
ｏｌ認識部位がライゲーションにより破壊されてしまう
がＮｃｏＩにより生成した部位にライゲーションし得る
ようにＢｓｐＭＩを使用した。コード領域のカルボキシ
末端でＢａｍＨ１部位の直ぐ隣りにＰｓｔＩの認識配列
（ｃＴＧＣＡＧ）がある。この酵素：まキメラ遺１云子
構築を目的とした発現プラスミドへのカルボキン末端の
ライゲーションのだｅｐｉｃ１８由来のコード配列を切
断するのに使用される。
第６図に示されているように、植物中で発現し得るキメ
ラ遺伝子を構築するためプラスミドｐＡ〜１ＶＢＴｓを
酵素ＮｃｏｌおよびＰｓｔＩで完全に消化し電気泳動後
そのベクターをアガロースゲルから単離した。Ｂｅ１Ｔ
１をコードするオリゴヌクレオチドのＢｓｐＭＩおよび
ＰｓｔＩ消化物を同様の方法でｐＵｃ１８から精製し、
この２つのフラグメントを合せてライゲーションした。
ラ遺伝子を構築するためプラスミドｐＡ〜１ＶＢＴｓを
酵素ＮｃｏｌおよびＰｓｔＩで完全に消化し電気泳動後
そのベクターをアガロースゲルから単離した。Ｂｅ１Ｔ
１をコードするオリゴヌクレオチドのＢｓｐＭＩおよび
ＰｓｔＩ消化物を同様の方法でｐＵｃ１８から精製し、
この２つのフラグメントを合せてライゲーションした。
大腸菌をトランスホームし、アンピシリン耐性で選択し
た後、うまく構築できたプラスミドｐＡＭＶＢｅＩＴ
１を同定した。基本的にこのプラスミドは異なるアミノ
酸コード領域が２つの異なる昆虫トキシンを指定してい
ること以外は同じものである。５′から３′の方向にこ
の発現カセットはＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、アルフ
ァルファモザイクウィルスコートたんばく質ｍ ＲＮ
ｉＡのエンハンサ−に相当するｍＲＮＡ５’非コード翻
訳エンハンサ−領域、Ｂｅ ＩＴＩの合成コード配列お
よびツバリンシンテース由来のポリアゾニレ−ジョン領
域を含んでいる。
た後、うまく構築できたプラスミドｐＡＭＶＢｅＩＴ
１を同定した。基本的にこのプラスミドは異なるアミノ
酸コード領域が２つの異なる昆虫トキシンを指定してい
ること以外は同じものである。５′から３′の方向にこ
の発現カセットはＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、アルフ
ァルファモザイクウィルスコートたんばく質ｍ ＲＮ
ｉＡのエンハンサ−に相当するｍＲＮＡ５’非コード翻
訳エンハンサ−領域、Ｂｅ ＩＴＩの合成コード配列お
よびツバリンシンテース由来のポリアゾニレ−ジョン領
域を含んでいる。
ｐＡＭＶＢｅＩＴ１を植物細胞に移すためにこのプラス
ミドをＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの５′側に隣接する
唯一のＸｈｏｌエンドヌクレアーゼ部位で消化し、つい
でこのプラスミドをＸｈｏＴで消化したアグロバクテリ
ウムベクタープラスミドｐＴＶ４とのライゲーションで
組込んだ。大腸菌へのトランスホーメーションとスルフ
アジアゼンおよびアンピシリン耐性による選択の後、う
まく組込まれたプラスミドｐＴＶ４ＡＭＶＢｅ ＩＴｌ
をＤ Ｎ Ａ ｇｌ製物により同定した。これらのプラ
スミドをアグロバクテリウムに組込み、実施例１および
ハードン（Ｂａｒｔｏｎ）等（バートン（Ｂａｒｔｏｎ
）、ホワイトリー（Ｗｈ ｉ ｔｅ １ｅｙ）およびヤ
ン（Ｙａｎｇ） ）により以前に報告された方法による
植物組織のトランスホーメーションに使用した。
ミドをＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの５′側に隣接する
唯一のＸｈｏｌエンドヌクレアーゼ部位で消化し、つい
でこのプラスミドをＸｈｏＴで消化したアグロバクテリ
ウムベクタープラスミドｐＴＶ４とのライゲーションで
組込んだ。大腸菌へのトランスホーメーションとスルフ
アジアゼンおよびアンピシリン耐性による選択の後、う
まく組込まれたプラスミドｐＴＶ４ＡＭＶＢｅ ＩＴｌ
をＤ Ｎ Ａ ｇｌ製物により同定した。これらのプラ
スミドをアグロバクテリウムに組込み、実施例１および
ハードン（Ｂａｒｔｏｎ）等（バートン（Ｂａｒｔｏｎ
）、ホワイトリー（Ｗｈ ｉ ｔｅ １ｅｙ）およびヤ
ン（Ｙａｎｇ） ）により以前に報告された方法による
植物組織のトランスホーメーションに使用した。
ＡＭＶＢｅＴＴｌでトランスホームした植物の再生後、
およそ５０個の植物をｍＲＮＡスロット−プロントを用
いてスクリーニングし最もよくＢｅｌＴｌ遺伝子を発現
する植物を同定した。最も多く Ｂｅ ｆＴｌｍＲＮ、
Ａを有する４個の植物は花を咲かせ実を結ぶことが可能
となるであろうし、またその子孫は昆虫飼育試験に供さ
れることになろう。Ａａ ＩＴと同様にある種の昆虫に
対する毒性が存在することが期待される。Ｂｅ ＩＴＩ
を含む植物の自家授粉に加え、最も高い発現を示す４個
の植物はＡａＩＴ（実施例１）、Ｂ、ｔ、デルタ内毒素
、またはＢｅ１Ｔ２（実施例３）を有意なレベルで発現
することが予め同定されている植物と交配されよう。こ
れらの交配物の子孫の昆虫毒性バイオアッセイが行なわ
れ、そして各トキシン活性はそれらの子孫においても機
能的でありかつ、さらにいくつかのトキシン間では付加
的な効果が明白となることが期待される。このことは付
加的な昆虫耐性を生ずることになる。受容昆虫のこれら
のトキシンに対する耐性の発達は同一植物体内の２つの
異なるトキシンの存在により有意に遅延することが期待
される。
およそ５０個の植物をｍＲＮＡスロット−プロントを用
いてスクリーニングし最もよくＢｅｌＴｌ遺伝子を発現
する植物を同定した。最も多く Ｂｅ ｆＴｌｍＲＮ、
Ａを有する４個の植物は花を咲かせ実を結ぶことが可能
となるであろうし、またその子孫は昆虫飼育試験に供さ
れることになろう。Ａａ ＩＴと同様にある種の昆虫に
対する毒性が存在することが期待される。Ｂｅ ＩＴＩ
を含む植物の自家授粉に加え、最も高い発現を示す４個
の植物はＡａＩＴ（実施例１）、Ｂ、ｔ、デルタ内毒素
、またはＢｅ１Ｔ２（実施例３）を有意なレベルで発現
することが予め同定されている植物と交配されよう。こ
れらの交配物の子孫の昆虫毒性バイオアッセイが行なわ
れ、そして各トキシン活性はそれらの子孫においても機
能的でありかつ、さらにいくつかのトキシン間では付加
的な効果が明白となることが期待される。このことは付
加的な昆虫耐性を生ずることになる。受容昆虫のこれら
のトキシンに対する耐性の発達は同一植物体内の２つの
異なるトキシンの存在により有意に遅延することが期待
される。
（実施例３）
昆虫に対する神経毒性マヒ活性を有する殺虫性ポリペプ
チド（インセクトトキシン■２またはＢｅ ＩＴ２）が
中央アジアサソリバサスエピウス（Ｂｕｔｈｕｓ ｅｐ
ｉｕｓ）の毒から単離された（グリシン（Ｇｒｉｓｈｉ
ｎ）等、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃｈｅｓｋａｙａ ｋｈｉ
ｍｉｙａ）、５、ｐρ、１２８５−１２９４ （１９７
９）；グリシン（Ｇｒｉｓｈｉｎ）、Ｉｎｔ、 Ｊ、Ｑ
ｕａｎｔ、 Ｃｈｅｍ、 １９、ｐｐ２９１−２９８
（１９８１））。このペプチドの精製および生理活性
検定後アミノ酸配列が以下のように決定されたくアミノ
酸１文字コードによる）ＭＡＤＧＹＶＫＧＫＳＧＣＫＩ
ＳＣＦＬＤＮＤＬＣＮＡＤＣＫＹＹＧＧＫＬＮＳＷＣＩ
ＰＤＫＳＧＹＣＩｌｉＣＰＮＫＧＷＮＳＩＫＳＥＴＮＴ
ＣＡａＩＴおよびＢｅ ＩＴＩペプチドをコードする遺
伝子の合成を示す実施例１および２におけるように、植
物中でＢｅ ＩＴ２を発現し得るようにキメラトキシン
遺伝子を構築した。植物中で最も頻繁に使用されるコド
ンに基づき（第１図）、このペプチドのアミノ酸コード
領域に対応する６個のオリゴヌクレオチドを合成した。
チド（インセクトトキシン■２またはＢｅ ＩＴ２）が
中央アジアサソリバサスエピウス（Ｂｕｔｈｕｓ ｅｐ
ｉｕｓ）の毒から単離された（グリシン（Ｇｒｉｓｈｉ
ｎ）等、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃｈｅｓｋａｙａ ｋｈｉ
ｍｉｙａ）、５、ｐρ、１２８５−１２９４ （１９７
９）；グリシン（Ｇｒｉｓｈｉｎ）、Ｉｎｔ、 Ｊ、Ｑ
ｕａｎｔ、 Ｃｈｅｍ、 １９、ｐｐ２９１−２９８
（１９８１））。このペプチドの精製および生理活性
検定後アミノ酸配列が以下のように決定されたくアミノ
酸１文字コードによる）ＭＡＤＧＹＶＫＧＫＳＧＣＫＩ
ＳＣＦＬＤＮＤＬＣＮＡＤＣＫＹＹＧＧＫＬＮＳＷＣＩ
ＰＤＫＳＧＹＣＩｌｉＣＰＮＫＧＷＮＳＩＫＳＥＴＮＴ
ＣＡａＩＴおよびＢｅ ＩＴＩペプチドをコードする遺
伝子の合成を示す実施例１および２におけるように、植
物中でＢｅ ＩＴ２を発現し得るようにキメラトキシン
遺伝子を構築した。植物中で最も頻繁に使用されるコド
ンに基づき（第１図）、このペプチドのアミノ酸コード
領域に対応する６個のオリゴヌクレオチドを合成した。
これらはアニールして完全なコード配列を形成する。こ
れらのオリゴヌクレオチドを第７図に示した。オリゴヌ
クレオチドＭＭ７４とＭＭ７７、ＭＭ７５とＭＭ７８、
およびＭＭ８８とＭＭ８９は相補的ペアであり、合成り
ｅｌＴ２コード配列のアミノ末端部分、中央部分および
カルボキシ末端部分に対応している。植物中で発現する
機能性遺伝子を構築するため、まずこれら６個のオリゴ
ヌクレオチドのうち相補的ペアを３組別々に合せアニー
ルする。中央のオリゴヌクレオチドペア（ＭＭ７５とＭ
Ｍ７８）を含む反応物をＡＴＰの存在下ポリヌクレオチ
ドキナーゼで処理しこれら２つのオリゴヌクレオチドの
５′水酸基をリン酸化して他の２つのペアへのライゲー
ションを可能にする。３つのペアのアニールしたオリゴ
ヌクレオチドをｐｔＪｃ１８ （予め旧ｎｄｎｌおよび
ＢａｍＨＩで消化したもの）と合わせ、その重複部分を
アニールさせた。それからＤＮＡリガーゼを与えて３つ
のペアを一つにライゲーションさせるとともにこの合成
Ｂｅ ＩＴ２コード配列をｐＵｃ１８ベクター中に挿入
した。大腸菌をトランスホームしアンピシリン耐性で選
択して適当なプラスミドをＤＮＡ調製物から同定した。
れらのオリゴヌクレオチドを第７図に示した。オリゴヌ
クレオチドＭＭ７４とＭＭ７７、ＭＭ７５とＭＭ７８、
およびＭＭ８８とＭＭ８９は相補的ペアであり、合成り
ｅｌＴ２コード配列のアミノ末端部分、中央部分および
カルボキシ末端部分に対応している。植物中で発現する
機能性遺伝子を構築するため、まずこれら６個のオリゴ
ヌクレオチドのうち相補的ペアを３組別々に合せアニー
ルする。中央のオリゴヌクレオチドペア（ＭＭ７５とＭ
Ｍ７８）を含む反応物をＡＴＰの存在下ポリヌクレオチ
ドキナーゼで処理しこれら２つのオリゴヌクレオチドの
５′水酸基をリン酸化して他の２つのペアへのライゲー
ションを可能にする。３つのペアのアニールしたオリゴ
ヌクレオチドをｐｔＪｃ１８ （予め旧ｎｄｎｌおよび
ＢａｍＨＩで消化したもの）と合わせ、その重複部分を
アニールさせた。それからＤＮＡリガーゼを与えて３つ
のペアを一つにライゲーションさせるとともにこの合成
Ｂｅ ＩＴ２コード配列をｐＵｃ１８ベクター中に挿入
した。大腸菌をトランスホームしアンピシリン耐性で選
択して適当なプラスミドをＤＮＡ調製物から同定した。
挿入ＤＮＡを配列決定して第７図に示した配列を’ｆｌ
ｌＪした。
ｌＪした。
第７図に示したようにＢｅ ＩＴ２に対する完全なオリ
ゴヌクレオチドの５′端はエンドヌクレアーゼＨｉｎｄ
Ｉ［によって生ずる末端に適合する粘着末端を有する。
ゴヌクレオチドの５′端はエンドヌクレアーゼＨｉｎｄ
Ｉ［によって生ずる末端に適合する粘着末端を有する。
もっともこの部位はｐＵｃ１８ベクターへのライゲーシ
ョンで破壊される。合成りＮＡの３′端はＢａｍＨＩに
よって生ずる末端に適合する粘着末端を有しており、こ
の部位はｐＵＣ由来のプラスミド中でも保存される。合
成挿入物中のＨｉｎｄＩＩＩ適合部位の直ぐ隣りにエン
ドヌクレアーゼＮＣ０Ｉの認識部位がある。これは、Ｎ
ｃｏｌ認識配列“”ＣＣＡＴＧＧ”中の中央の“ＡＴＧ
″がＢｅ ＩＴ２コード配列の最初のコドンを表す機能
性キメラ遺云子構築を目的としたｐ Ａ Ｍ Ｖ Ｂ
Ｔ Ｓ由来の調節ＤＮＡ配列−１のＢｅ ＩＴ２コード
配列の結合に使用される酵素認識部位である。コード領
域のカルボキシ末端のＢａｍＨ１部位および停止コドン
の間にＰｓｔｌの認識部位がある（ｃＴＧＣＡＧ）。
ョンで破壊される。合成りＮＡの３′端はＢａｍＨＩに
よって生ずる末端に適合する粘着末端を有しており、こ
の部位はｐＵＣ由来のプラスミド中でも保存される。合
成挿入物中のＨｉｎｄＩＩＩ適合部位の直ぐ隣りにエン
ドヌクレアーゼＮＣ０Ｉの認識部位がある。これは、Ｎ
ｃｏｌ認識配列“”ＣＣＡＴＧＧ”中の中央の“ＡＴＧ
″がＢｅ ＩＴ２コード配列の最初のコドンを表す機能
性キメラ遺云子構築を目的としたｐ Ａ Ｍ Ｖ Ｂ
Ｔ Ｓ由来の調節ＤＮＡ配列−１のＢｅ ＩＴ２コード
配列の結合に使用される酵素認識部位である。コード領
域のカルボキシ末端のＢａｍＨ１部位および停止コドン
の間にＰｓｔｌの認識部位がある（ｃＴＧＣＡＧ）。
この酵素はキメラ遺伝子構築用の発現プラスミドへの該
カルボキシ末端のライゲーションを目的としたｐＵｃ１
８由来のコード配列の切り出しに使用された。
カルボキシ末端のライゲーションを目的としたｐＵｃ１
８由来のコード配列の切り出しに使用された。
第８図に示したように、植物中で発現し得るキメラ遺伝
子を構築するためプラスミドｐＡＭＶＢＴＳを酵素Ｎｃ
ｏｌおよびＰｓｔ Ｉで完全消化しそのベクターを電気
泳動後アガロースゲルから単離した。
子を構築するためプラスミドｐＡＭＶＢＴＳを酵素Ｎｃ
ｏｌおよびＰｓｔ Ｉで完全消化しそのベクターを電気
泳動後アガロースゲルから単離した。
［３ｅ ＩＴ２をコードし、ＮｃｏｌおよびＰｓｔｌで
消化した二本鎖オリゴヌクレオチドを同様の方法でｐＵ
ｃ１８から精製した後これら２つのＤＮＡフラグメント
を合せてライゲーションした。大腸菌をトランスホーム
しアンピシリン耐性で選択した後正しく構築されたプラ
スミドｐＡＭＶＢｅｌＴ２を同定した。このプラスミド
は別の殺虫性トキシンを指定する別のアミノ酸コード領
域を有すること以外は基本的にｐＡＭＶｓＴｌと同じで
ある。
消化した二本鎖オリゴヌクレオチドを同様の方法でｐＵ
ｃ１８から精製した後これら２つのＤＮＡフラグメント
を合せてライゲーションした。大腸菌をトランスホーム
しアンピシリン耐性で選択した後正しく構築されたプラ
スミドｐＡＭＶＢｅｌＴ２を同定した。このプラスミド
は別の殺虫性トキシンを指定する別のアミノ酸コード領
域を有すること以外は基本的にｐＡＭＶｓＴｌと同じで
ある。
５′側から３′側にこの発現カセットばＣａＭＶ３５Ｓ
プロモーター、アルファルファモザイクウィルスコート
たんハ＜質ｍＲＮＡのエンハンサ−に相当するｍＲＮＡ
５ ’非コード翻訳エンハンサー領域、Ｂｅ ＩＴ２の
合成コード配列およびツバリンシンテース由来のポリア
ゾニレ−ジョン領域を含んでいる。
プロモーター、アルファルファモザイクウィルスコート
たんハ＜質ｍＲＮＡのエンハンサ−に相当するｍＲＮＡ
５ ’非コード翻訳エンハンサー領域、Ｂｅ ＩＴ２の
合成コード配列およびツバリンシンテース由来のポリア
ゾニレ−ジョン領域を含んでいる。
植物細胞にｐＡＭＶＢｅ ＩＴ２を移すためこのプラス
ミドをＣａＭＶプロモーターの直ぐ５′側にある唯一の
Ｘｈｏｌエンドヌクレアーゼ部位で消化し、ついでこの
プラスミドを実施例１で述べたハードン（Ｂａｒｔｏｎ
）等の方法によりＸｈｏｌで消化したアグロバクテリウ
ムベクタープラスミドｐＴ■４のＤＮＡとのライゲーシ
ョンで合せた。大腸菌パ・のトランスホーメーションと
スルフアジアゼンおよびアンピシリン耐性による選択に
つづいて正しく組込まれたプラスミドｐ ＴＶ ４ Ａ
ＭＶＢｅｌＴ２をＤＮＡＩ製物から同定した。それから
これらのプラスミドをアグロバクテリウムと合せ、実施
例１およびハードン（Ｂａｒｔｏｎ）等により先に述べ
られているように植物組織のトランスホーメーションに
使用した。
ミドをＣａＭＶプロモーターの直ぐ５′側にある唯一の
Ｘｈｏｌエンドヌクレアーゼ部位で消化し、ついでこの
プラスミドを実施例１で述べたハードン（Ｂａｒｔｏｎ
）等の方法によりＸｈｏｌで消化したアグロバクテリウ
ムベクタープラスミドｐＴ■４のＤＮＡとのライゲーシ
ョンで合せた。大腸菌パ・のトランスホーメーションと
スルフアジアゼンおよびアンピシリン耐性による選択に
つづいて正しく組込まれたプラスミドｐ ＴＶ ４ Ａ
ＭＶＢｅｌＴ２をＤＮＡＩ製物から同定した。それから
これらのプラスミドをアグロバクテリウムと合せ、実施
例１およびハードン（Ｂａｒｔｏｎ）等により先に述べ
られているように植物組織のトランスホーメーションに
使用した。
ｐＴＶ４ＡＭＶＢｅ ＩＴ２でトランスホームした植物
の再生後ｍＲＮＡスロットプロットによりおよそ５０個
の植物をスクリーニングして最も強（ＢｅｌＴ２遺伝子
を発現するものを同定した。
の再生後ｍＲＮＡスロットプロットによりおよそ５０個
の植物をスクリーニングして最も強（ＢｅｌＴ２遺伝子
を発現するものを同定した。
最も多いＢｅ ＩＴ２ｍＲＮＡをもつ４個の植物を開花
させ種を作らせて、その子孫を昆虫飼育テストで分析す
る。自家授粉に加え、Ｂｅ ＩＴ２遺伝子を最も多く発
現する４個の植物をＡａ ＩＴペプチド、Ｂ、ｔ、デル
タ内毒素、またはＢｅ１Ｔ１ペプチド（実施例２）のい
ずれかを有意に発現することを同定した植物と交配させ
る。これら交配体の子孫をバイオアッセイにかけ、各々
のトキシン活性がその子孫において機能を示し、さらに
それらのトキシンのいくつかは付加的効果を示し昆虫耐
性をさらに増加することが期待される。またひきつづく
実験で昆虫によるこれらトキシンへの耐性の発達は同一
植物中に異種トキシンが２個存在することにより有意に
遅延されることが期待された。
させ種を作らせて、その子孫を昆虫飼育テストで分析す
る。自家授粉に加え、Ｂｅ ＩＴ２遺伝子を最も多く発
現する４個の植物をＡａ ＩＴペプチド、Ｂ、ｔ、デル
タ内毒素、またはＢｅ１Ｔ１ペプチド（実施例２）のい
ずれかを有意に発現することを同定した植物と交配させ
る。これら交配体の子孫をバイオアッセイにかけ、各々
のトキシン活性がその子孫において機能を示し、さらに
それらのトキシンのいくつかは付加的効果を示し昆虫耐
性をさらに増加することが期待される。またひきつづく
実験で昆虫によるこれらトキシンへの耐性の発達は同一
植物中に異種トキシンが２個存在することにより有意に
遅延されることが期待された。
（実施例４）
昆虫に対する神経毒性を有する殺虫性ポリペプチドは（
アガトキシンＩ〜■）ファネルウェブスノマイグー、ア
ゲレノブシスアペルり（八ｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓａｐｅ
ｒｔａ ） （スキナー（Ｓｋｉｎｎｅｒ）等、Ｊ、
Ｂｉｏｌ。
アガトキシンＩ〜■）ファネルウェブスノマイグー、ア
ゲレノブシスアペルり（八ｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓａｐｅ
ｒｔａ ） （スキナー（Ｓｋｉｎｎｅｒ）等、Ｊ、
Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、２６４、ｐｐ２１５０〜２１５５（１９８９
））の毒から単離した。このペプチドの精製および生理
活性テストの後、各６個のペプチドについてアミノ酸配
列を決定し、それらが非常にホモロジーが高いことが分
った。数種の昆虫に注入したとき殺虫性を示すアガトキ
シンＩＶ（ＡｇａｌＶ）のアミノ酸配列を以下に示す（
−文字アミノ酸コード使用）： ＡＣＶＧＥＮＱＱＣＡＤＷＡＧＰＩＩＣＣＤＧＹＹＣＴ
ＣＲＹＦＰＫＣＩＣＲ１ｕＪＮＡａＴＴペプチドをコー
ドする遺伝子の合成を示す実施例１と同様に植物中でＡ
ｇａｌＶを発現し得る遺伝子を構築する。植物中で最も
よく使用されているコドンに基づき（第１図）、このペ
プチドのアミノ酸コード領域に対応する２つの相補的オ
リゴヌクレオチド（ＫＢ１５２およびＫＢ１５３）を合
成する。ＡｇａｌＶトキシンを発現する合成ヌクレオチ
ド配列を第１Ｏ図に示す。植物中で発現する遺伝子の構
築および該遺伝子の植物細胞への移行の操作を第１１図
に示す。植物中で発現する機能性遺伝子を構築するため
、２個の合成オリゴヌクレオチドを合せアニールする。
））の毒から単離した。このペプチドの精製および生理
活性テストの後、各６個のペプチドについてアミノ酸配
列を決定し、それらが非常にホモロジーが高いことが分
った。数種の昆虫に注入したとき殺虫性を示すアガトキ
シンＩＶ（ＡｇａｌＶ）のアミノ酸配列を以下に示す（
−文字アミノ酸コード使用）： ＡＣＶＧＥＮＱＱＣＡＤＷＡＧＰＩＩＣＣＤＧＹＹＣＴ
ＣＲＹＦＰＫＣＩＣＲ１ｕＪＮＡａＴＴペプチドをコー
ドする遺伝子の合成を示す実施例１と同様に植物中でＡ
ｇａｌＶを発現し得る遺伝子を構築する。植物中で最も
よく使用されているコドンに基づき（第１図）、このペ
プチドのアミノ酸コード領域に対応する２つの相補的オ
リゴヌクレオチド（ＫＢ１５２およびＫＢ１５３）を合
成する。ＡｇａｌＶトキシンを発現する合成ヌクレオチ
ド配列を第１Ｏ図に示す。植物中で発現する遺伝子の構
築および該遺伝子の植物細胞への移行の操作を第１１図
に示す。植物中で発現する機能性遺伝子を構築するため
、２個の合成オリゴヌクレオチドを合せアニールする。
これはそのコード配列のアミノ末端およびカルボキシ末
端にそれぞれＮｃｏｌおよびＰｓｔｌ適合末端を生ずる
。別の反応でプラスミドｐＡＭＶＢＴＳを酵素Ｎｃｏｌ
およびＰｓｔｌで完全に消化し、ついでこのベクタを電
気泳動後アガロースゲルから精製する。
端にそれぞれＮｃｏｌおよびＰｓｔｌ適合末端を生ずる
。別の反応でプラスミドｐＡＭＶＢＴＳを酵素Ｎｃｏｌ
およびＰｓｔｌで完全に消化し、ついでこのベクタを電
気泳動後アガロースゲルから精製する。
ＡｇａｌＶをコードし、アニールしたオリゴヌクレオチ
ドをｐＡＭＶＢＴＳヘクターフラグメントと合せ、これ
にＤＮＡリガーゼを加えてそのヘクターとコード領域を
ライゲーションする。大腸菌をアンピシリン耐性とし、
ＤＮＡ調製物で適正なプラスミドｐＡＭＶＡｇａＴＶを
同定し得る。挿入ＤＮＡを配列決定し第１０図に示しで
ある配列を確認する。５′から３′方向にこの発現カセ
ットはＣａ Ｍ Ｖ ３５ Ｓプロモーター、アルファ
ルファモザイクウィルスコードたんばく質ｍＲＮＡのエ
ンハンサ−に対応するｍＲＮＡ５ ’非コード領域、Ａ
ｇａｌＶの合成コード配列、およびツバリンシンテース
由来のポリアゾニレ−ジョン部位を含む。
ドをｐＡＭＶＢＴＳヘクターフラグメントと合せ、これ
にＤＮＡリガーゼを加えてそのヘクターとコード領域を
ライゲーションする。大腸菌をアンピシリン耐性とし、
ＤＮＡ調製物で適正なプラスミドｐＡＭＶＡｇａＴＶを
同定し得る。挿入ＤＮＡを配列決定し第１０図に示しで
ある配列を確認する。５′から３′方向にこの発現カセ
ットはＣａ Ｍ Ｖ ３５ Ｓプロモーター、アルファ
ルファモザイクウィルスコードたんばく質ｍＲＮＡのエ
ンハンサ−に対応するｍＲＮＡ５ ’非コード領域、Ａ
ｇａｌＶの合成コード配列、およびツバリンシンテース
由来のポリアゾニレ−ジョン部位を含む。
植物にｐＡＭＶＡｇａＩＶを導入するためＣａＭＶ３５
Ｓプロモーターの５′側の直前の唯一のＸｈｏｌエンド
ヌクレアーゼ部位でこのプラスミドを切断し、Ｘｈｏｌ
消化したアグロバクテリウムヘクタープラスミドｐＴＶ
４とライゲーションして合せる。大腸菌へのトランスホ
ーメーションおよびスルフアジアゼンおよびアンピシリ
ンへの両耐性による選択の後適正に結合したプラスミド
ｐＴＶ４ＡＭＶＡｇａＩ Ｖを同定した。これらのプラ
スミドをアグロバクテリウムに導入し実施例１およびバ
ートン（Ｂａｒｔｏｎ）等（上述）の方法により植物組
織にトランスホームした。
Ｓプロモーターの５′側の直前の唯一のＸｈｏｌエンド
ヌクレアーゼ部位でこのプラスミドを切断し、Ｘｈｏｌ
消化したアグロバクテリウムヘクタープラスミドｐＴＶ
４とライゲーションして合せる。大腸菌へのトランスホ
ーメーションおよびスルフアジアゼンおよびアンピシリ
ンへの両耐性による選択の後適正に結合したプラスミド
ｐＴＶ４ＡＭＶＡｇａＩ Ｖを同定した。これらのプラ
スミドをアグロバクテリウムに導入し実施例１およびバ
ートン（Ｂａｒｔｏｎ）等（上述）の方法により植物組
織にトランスホームした。
ＡＭＶＡｇａｌＶでトランスホームした植物の再生の後
ｍ ＲＮ Ａスロットプロットを用いおよそ５０個の植
物をスクリーニングして最も強くＡｇａｌＶを発現する
植物を同定した。最も多くＡｇａｌＶｍＲＮＡを有する
４個の植物を開花させ種を結ばせた。この子孫を昆虫飼
育テストで分析した。Ａａ ＩＴと同様にいくつかの昆
虫に対する毒性が期待される。ＡｇａｌＶを含む植物の
自家授粉に加え、最も高い発現の４個の植物を先にＡａ
ＴＴ（実施例１）、Ｂ、ｔ、デルタ内毒素、Ｂｅ１Ｔ１
（実施例２） 、Ｂｅ ＩＴ２ （実施例３）または他
の殺虫性トキシンを有意に発現すると同定された植物と
交配させ得る。これらの交配体の子孫をハイオアソセイ
にかけ、それらの子孫の中でも各トキシン活性が機能し
ており、かつさらにいくつかのトキシン間に付加的効果
があり、昆虫の耐性レベルを高げることが観察された。
ｍ ＲＮ Ａスロットプロットを用いおよそ５０個の植
物をスクリーニングして最も強くＡｇａｌＶを発現する
植物を同定した。最も多くＡｇａｌＶｍＲＮＡを有する
４個の植物を開花させ種を結ばせた。この子孫を昆虫飼
育テストで分析した。Ａａ ＩＴと同様にいくつかの昆
虫に対する毒性が期待される。ＡｇａｌＶを含む植物の
自家授粉に加え、最も高い発現の４個の植物を先にＡａ
ＴＴ（実施例１）、Ｂ、ｔ、デルタ内毒素、Ｂｅ１Ｔ１
（実施例２） 、Ｂｅ ＩＴ２ （実施例３）または他
の殺虫性トキシンを有意に発現すると同定された植物と
交配させ得る。これらの交配体の子孫をハイオアソセイ
にかけ、それらの子孫の中でも各トキシン活性が機能し
ており、かつさらにいくつかのトキシン間に付加的効果
があり、昆虫の耐性レベルを高げることが観察された。
ひきつづく実験においてテストした混合によるこれらの
トキシンに対する耐性の発達が同一植物中に２種のトキ
シンが存在することで有意に遅延されることが分った。
トキシンに対する耐性の発達が同一植物中に２種のトキ
シンが存在することで有意に遅延されることが分った。
（実施例５）
昆虫に対する神経毒性を有する殺虫性ポリペプチド（本
実施例では“５ｆｌＴ”と呼ぶ）を細胞性クモ、セゲス
テリアフロレンチナ（Ｓｅｇｅｓ ｔｒ ｉａｆ Ｉｏ
ｒｅｎ ｔｉｎａ）の毒から単離したくサグシェフ（Ｓ
ａｇｄ １ｅｖ）等、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃｈｅｓｋａ
ｙａ Ｋｈｉｍｉｙａ 。
実施例では“５ｆｌＴ”と呼ぶ）を細胞性クモ、セゲス
テリアフロレンチナ（Ｓｅｇｅｓ ｔｒ ｉａｆ Ｉｏ
ｒｅｎ ｔｉｎａ）の毒から単離したくサグシェフ（Ｓ
ａｇｄ １ｅｖ）等、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃｈｅｓｋａ
ｙａ Ｋｈｉｍｉｙａ 。
１３、ｐｐ、 １０１３−１０１８ （１９８７） ）
。該ペプチドの精製および生理活性試験につづいてその
アミノ酸配列を決定した。分子量３９８８ダルトンで３
５個のアミノ酸からなる５ｆＩＴのアミノ酸配列（以下
の実施例で付加されているアミノ末端のメチオニンは除
かれている）を−文字アミノ酸コードで以下に示す： ＲＱＤＭＶＤＥＳＶＣＹ ＩＴＤＮＮＣＮＧＧＫＣＬＲ
５ＫＡＣＩＩＡＤＰＷＥＬＡａ ＩＴペプチドをコード
する遺伝子の合成を示した実施例１と同様に植物中で５
ｆｌＴを発現し得るキメラ遺伝子を構築した。植物中で
最もよく使用されるコドンに基づき（第１図）、本ペプ
チドのアミノ酸コード領域に相当する２つの相補的オリ
ゴヌクレオチド（ＫＢ１５４およびＫＢ１５５）を合成
した。メチオニンの付加的コドン、ＡＴＧがこのコード
領域のアミノ末端に含まれ適当な翻訳が開始し得る（第
１２図）。発現カセットを構築し植物中にそれを移すた
めのこれらのオリゴヌクレオチドの取扱い方を第１３図
に示す。
。該ペプチドの精製および生理活性試験につづいてその
アミノ酸配列を決定した。分子量３９８８ダルトンで３
５個のアミノ酸からなる５ｆＩＴのアミノ酸配列（以下
の実施例で付加されているアミノ末端のメチオニンは除
かれている）を−文字アミノ酸コードで以下に示す： ＲＱＤＭＶＤＥＳＶＣＹ ＩＴＤＮＮＣＮＧＧＫＣＬＲ
５ＫＡＣＩＩＡＤＰＷＥＬＡａ ＩＴペプチドをコード
する遺伝子の合成を示した実施例１と同様に植物中で５
ｆｌＴを発現し得るキメラ遺伝子を構築した。植物中で
最もよく使用されるコドンに基づき（第１図）、本ペプ
チドのアミノ酸コード領域に相当する２つの相補的オリ
ゴヌクレオチド（ＫＢ１５４およびＫＢ１５５）を合成
した。メチオニンの付加的コドン、ＡＴＧがこのコード
領域のアミノ末端に含まれ適当な翻訳が開始し得る（第
１２図）。発現カセットを構築し植物中にそれを移すた
めのこれらのオリゴヌクレオチドの取扱い方を第１３図
に示す。
植物中で発現する機能性遺伝子を構築するため、まず２
つの合成オリゴヌクレオチドを合せアニルした。これは
コード配列のアミノ末端およびカルボキシ末端に各々Ｎ
ｃｏｌおよびＰｓｔＩ適合末端をもつ二本鎖オリゴヌク
レオチドが生成する。別にプラスミドｐＡＭＶＢＴＳを
酵素ＮｃｏｌおよびＰｓｔｌで完全に消化しこのベクタ
ーを電気泳動後アガロースゲルから精製する。５ｆｌＴ
をコードするアニールしたオリゴヌクレオチドをｐＡＭ
ＶＢＴＳヘクターのフラグメントと合せＤＮＡリガーゼ
を加えてそのベクターとコード領域をライゲーションし
た。大腸菌へのトランスホーメーションとアンピシリン
耐性での選択につづいて発現カセットを含むプラスミド
ｐＡＭＶＳｆＩＴをＤＮＡ調製物から同定した。その挿
入ＤＮＡの配列決定を行ない第１２図に示した配列を確
認した。５′から３′の方向にこの発現カセットはＣａ
ＭＶ３５Ｓプロモーター、アルファルファモザイクウィ
ルスのコートたんばく質のｍＲＮＡのものに相当するｍ
ＲＮＡ５’非コード領域、５ｆｌＴの合成コード配列お
よびツバリンシンテースのポリアゾニレ−ジョン領域を
含んでいる。
つの合成オリゴヌクレオチドを合せアニルした。これは
コード配列のアミノ末端およびカルボキシ末端に各々Ｎ
ｃｏｌおよびＰｓｔＩ適合末端をもつ二本鎖オリゴヌク
レオチドが生成する。別にプラスミドｐＡＭＶＢＴＳを
酵素ＮｃｏｌおよびＰｓｔｌで完全に消化しこのベクタ
ーを電気泳動後アガロースゲルから精製する。５ｆｌＴ
をコードするアニールしたオリゴヌクレオチドをｐＡＭ
ＶＢＴＳヘクターのフラグメントと合せＤＮＡリガーゼ
を加えてそのベクターとコード領域をライゲーションし
た。大腸菌へのトランスホーメーションとアンピシリン
耐性での選択につづいて発現カセットを含むプラスミド
ｐＡＭＶＳｆＩＴをＤＮＡ調製物から同定した。その挿
入ＤＮＡの配列決定を行ない第１２図に示した配列を確
認した。５′から３′の方向にこの発現カセットはＣａ
ＭＶ３５Ｓプロモーター、アルファルファモザイクウィ
ルスのコートたんばく質のｍＲＮＡのものに相当するｍ
ＲＮＡ５’非コード領域、５ｆｌＴの合成コード配列お
よびツバリンシンテースのポリアゾニレ−ジョン領域を
含んでいる。
ｐＡＭＶＳｆＩＴを植物細胞に移すためにこのプラスミ
ドをＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの５′側に隣接する唯
一のＸｈｏｌエンドヌクレアーゼ部位で切断しこのプラ
スミドを予めＸｈｏｌで消化したアグロハクテリウムヘ
クターブラスミドｐＴ■４とライゲーションした。大腸
菌へのトランスホーメーションとサルファジアゼンおよ
びアンピシリンに対する両耐性による選択の後正しく組
込まれたプラスミドｐＴＶ４ＡＭＳ ｆ ＩＴをＤＮＡ
８周製物から同定した。これらのプラスミドをアグロバ
クテリウム中に入れ実施例１およびハードン（Ｂａｒｔ
ｏｎ）等（上述）により先に述べられている方法により
植物組織へのトランスホーメーションに使用した。
ドをＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの５′側に隣接する唯
一のＸｈｏｌエンドヌクレアーゼ部位で切断しこのプラ
スミドを予めＸｈｏｌで消化したアグロハクテリウムヘ
クターブラスミドｐＴ■４とライゲーションした。大腸
菌へのトランスホーメーションとサルファジアゼンおよ
びアンピシリンに対する両耐性による選択の後正しく組
込まれたプラスミドｐＴＶ４ＡＭＳ ｆ ＩＴをＤＮＡ
８周製物から同定した。これらのプラスミドをアグロバ
クテリウム中に入れ実施例１およびハードン（Ｂａｒｔ
ｏｎ）等（上述）により先に述べられている方法により
植物組織へのトランスホーメーションに使用した。
ＡＭＶＳｆｌＴでトランスホームした植物の再生後ｍＲ
ＮＡスロットプロットを用いておよそ５０個の植物をス
クリーニングし最も強＜ ５ｆＩＴ遺伝子を発現する
植物を同定した。最も多くのＳｆｌＴｍＲＮＡを有する
４個の植物を開花させ実を結ばせて、その子孫を昆虫飼
育テストで分析した。５ｆｌＴを含む植物の自家授粉に
加え、最も発現の高い４個の植物を先にＡａ ＩＴ （
実施例１）、Ｂ、ｔ、デルタ内毒素、Ｂｅ１Ｔ１（実施
例２） 、Ｂｅ ＩＴ２ （実施例３）または他の殺虫
性トキシンを有意に発現することが確認されている植物
と交配させた。これらの交配体の子孫をバイオアッセイ
にかけ各トキシン活性がその子孫においても機能性を有
し、さらにいくつかのトキシン間では付加的効果が存在
し、付加的昆虫耐性が現われることが観察された。ひき
つづく実験において昆虫によるこれらトキシンへの耐性
の発達は同−植物内の２種のトキシンの存在により有意
に遅延することが明らかになった。
ＮＡスロットプロットを用いておよそ５０個の植物をス
クリーニングし最も強＜ ５ｆＩＴ遺伝子を発現する
植物を同定した。最も多くのＳｆｌＴｍＲＮＡを有する
４個の植物を開花させ実を結ばせて、その子孫を昆虫飼
育テストで分析した。５ｆｌＴを含む植物の自家授粉に
加え、最も発現の高い４個の植物を先にＡａ ＩＴ （
実施例１）、Ｂ、ｔ、デルタ内毒素、Ｂｅ１Ｔ１（実施
例２） 、Ｂｅ ＩＴ２ （実施例３）または他の殺虫
性トキシンを有意に発現することが確認されている植物
と交配させた。これらの交配体の子孫をバイオアッセイ
にかけ各トキシン活性がその子孫においても機能性を有
し、さらにいくつかのトキシン間では付加的効果が存在
し、付加的昆虫耐性が現われることが観察された。ひき
つづく実験において昆虫によるこれらトキシンへの耐性
の発達は同−植物内の２種のトキシンの存在により有意
に遅延することが明らかになった。
第１図は植物細胞中におけるコドンの使用を示すよう開
発され、本発明の実施例におけるオリゴヌクレオチドの
構築に使用されるコドンの使用に関するチャートである
。 第２図はＡａＩＴトキシンをコードする合成領域とこれ
を構築するために用いたオリゴヌクレオチドの配列リス
トである。 第３図はｐＡＭＶｓＴ１由来のサソリトキシンの全発現
カセットの配列リストである。 第４図はプラスミドｐＴＶ４ＡＭＶｓＴ１構築を図式的
に説明している。 第５図はＢｅＴＴｌをコードする合成領域およびそれを
構築するのに用いるオリゴヌクレオチドの配列リストで
ある。 第６図はｐＴＶ４ＡＭＶＢｅ ＩＴＩ構築を図式的に説
明している。 第７図は１３ｅｌＴ２をコードする合成領域およびそれ
を構築するのに用いるオリゴヌクレオチドの配列リスト
である。 第８図はｐＴＶ４ＡＭＶＢｅ ＩＴ２構築を図式的に説
明している。 第９図はトランスジェニック植物を用いて行った昆虫飼
育試験をグラフで示したものである。 第１０図はＡｇａｌＶトキシンをコードする合成領域お
よびこれを構築するためのオリゴヌクレオチドの配列リ
ストである。 第１１図はｐＴＶ４ＡＭＶＡｇａｌＶ構築を図式的に説
明している。 第１２図は５ｆＩＴｌ−キシンをコードする合成領域お
よびこれを構築するためのオリゴヌクレオチドの配列リ
ストである。 第１３図はｐＴＶ ４ＡＭＶＳ ｆ ＩＴ構築を図式的
に説明している。 図面の浄書（内容に変贋 Ｆｉｇ、 １ アミノ酸 コドン 数 ／＋０００ ）うクンヨ。 ３６９．００ １７４ ２１４．００ ２１３．００ ３６９ １３．６２ １０４．００ １１９．００ ６５ ６１ ５なし） アミノ酸 コドン 数 ／ｉｏｏ。 つラクション １４７．０Ｏ １７９，００ １４５ １７４、ＯＯ ５００ ２３２，００ ６００ ６５，００ ３０ ９５７ １６ ２１，００ ＣＡＡＴＴＣＣＡｆ−ＣＴＣＧＣＣＣＴＣＣλＯｃλＡ
Ｏλ５０ ）０１ ５１ ＡＴＡ λＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＡｆ：ＴＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴ
ＴＧＣＣＣ１５０ ＣＣＴ ２００ ５１ ＣＣＣＣＡＣλＧＴＧＧＴＣＣＣＡＡＩυスＡ
ＴＣＧ
ＴにＧＡ３０１ λλλλＣλＡＣＡＣＧＴＴＣ
ＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣ−ＴＴＣＡＴＧＴＧＡＴＡ
３５（１３５１ ＴＣＴＣＣＩ：ＴＣＡＣＧＴ
ＡＡＧＧｃＡＴＣＡＣＧＣＡＣλＡＴＣＣＣＡＣＴλＴ
ＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣ４０００１ ５１ ０１ ＋”
ＴＡＣＴＧＣＮ
！ＪＱＣＴＫＶＨＹＡＤＫＧＹＣＣＬＴ Ｃ０ＡＣＴ
ＡＣＴ ＣＣＴＧＣＣ
ＴＬＳＣＹＣＦ’にＬＮＤＤＫＫＶＬ εＣＣＴ
０ＡＧＣＴＧＣτ 、−− 工 ５ＤＴＲＫＳＹＣＤＴＴ エ エ Ｎ、
ＪｃＣＣＧＣＡ
ＣＡＴＴＴＣＣＣＡλＴＡＩＪＬｌｌ；ＴＴＴＣ
ＴＴＡＡＧＡＴＴｃＡＡ ａ
−ＴＧＡＴＴＡＴＣＡＴλＴＡＡτＴＴＣＴＧＴＴＣ
ＡＡ７τλＣＧＴＴλＡＧＣλτＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡ
ＡＣＡＴＧＴｋＡＴＯＣＡＴＧｋＣＧＴＴｋＴＴ ＴＡ
ＴＣλＣλＴにＧＧＴＴＴＴＴＡＴＣλＴＴＡＣＡＩ：
、τＣＣＣＣＳλＡＴＴＡＴλＣλＴＴＴＡλＴｋＣＧ
ＣＧλＴＡＣλＡＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴλＧＣＧＣＣ二
λλＡＣτＡＧＦｉｇ、 ４ Ａａ１丁合、「叉コ ド頌誠 ｐＡＭＶＢＴＳ Ｆｉｇ、 ５ ＢａｌＴｉ合成コ ド領誠 ｐＡＭＶＢＴｓ Ｘ−Σノ Ｆｉｇ、 ８ Ｆｉｇ、１１ 手 続 補 正 書 （方式） ■、事件の表示 平成２年特許願第３２５１５０号 ２、発明の名称 植物の殺虫性トキシン ３、補正をする者 事件との関係 出 願人 名 称 アグラシ タス インコーボレ デッド ４、代 理 人
発され、本発明の実施例におけるオリゴヌクレオチドの
構築に使用されるコドンの使用に関するチャートである
。 第２図はＡａＩＴトキシンをコードする合成領域とこれ
を構築するために用いたオリゴヌクレオチドの配列リス
トである。 第３図はｐＡＭＶｓＴ１由来のサソリトキシンの全発現
カセットの配列リストである。 第４図はプラスミドｐＴＶ４ＡＭＶｓＴ１構築を図式的
に説明している。 第５図はＢｅＴＴｌをコードする合成領域およびそれを
構築するのに用いるオリゴヌクレオチドの配列リストで
ある。 第６図はｐＴＶ４ＡＭＶＢｅ ＩＴＩ構築を図式的に説
明している。 第７図は１３ｅｌＴ２をコードする合成領域およびそれ
を構築するのに用いるオリゴヌクレオチドの配列リスト
である。 第８図はｐＴＶ４ＡＭＶＢｅ ＩＴ２構築を図式的に説
明している。 第９図はトランスジェニック植物を用いて行った昆虫飼
育試験をグラフで示したものである。 第１０図はＡｇａｌＶトキシンをコードする合成領域お
よびこれを構築するためのオリゴヌクレオチドの配列リ
ストである。 第１１図はｐＴＶ４ＡＭＶＡｇａｌＶ構築を図式的に説
明している。 第１２図は５ｆＩＴｌ−キシンをコードする合成領域お
よびこれを構築するためのオリゴヌクレオチドの配列リ
ストである。 第１３図はｐＴＶ ４ＡＭＶＳ ｆ ＩＴ構築を図式的
に説明している。 図面の浄書（内容に変贋 Ｆｉｇ、 １ アミノ酸 コドン 数 ／＋０００ ）うクンヨ。 ３６９．００ １７４ ２１４．００ ２１３．００ ３６９ １３．６２ １０４．００ １１９．００ ６５ ６１ ５なし） アミノ酸 コドン 数 ／ｉｏｏ。 つラクション １４７．０Ｏ １７９，００ １４５ １７４、ＯＯ ５００ ２３２，００ ６００ ６５，００ ３０ ９５７ １６ ２１，００ ＣＡＡＴＴＣＣＡｆ−ＣＴＣＧＣＣＣＴＣＣλＯｃλＡ
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ＡＡ７τλＣＧＴＴλＡＧＣλτＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡ
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λλＡＣτＡＧＦｉｇ、 ４ Ａａ１丁合、「叉コ ド頌誠 ｐＡＭＶＢＴＳ Ｆｉｇ、 ５ ＢａｌＴｉ合成コ ド領誠 ｐＡＭＶＢＴｓ Ｘ−Σノ Ｆｉｇ、 ８ Ｆｉｇ、１１ 手 続 補 正 書 （方式） ■、事件の表示 平成２年特許願第３２５１５０号 ２、発明の名称 植物の殺虫性トキシン ３、補正をする者 事件との関係 出 願人 名 称 アグラシ タス インコーボレ デッド ４、代 理 人
Claims (40)
- （１）昆虫捕食性アースロポドにより天然に産生される
昆虫特異的ポリペプチドトキシンの植物細胞中での発現
をコードするコード領域を植物細胞中で発現させるのに
効果的なプロモーター、該プロモーターの下流の該コー
ド領域、および植物細胞中での該遺伝子構築産物の転写
または翻訳を停止するのに効果的な停止配列を含む遺伝
性キメラ遺伝子構築物で植物組織の食物摂取の際に特定
の昆虫に致命的な量のトキシンを該植物細胞中で発現す
るのに効果的な遺伝子構築物をゲノム内に含む植物。 - （２）産生する前記トキシンがＡａＩＴトキシンである
請求項１記載の植物。 - （３）産生する前記トキシンがＢｅＩＴ１トキシンであ
る請求項１記載の植物。 - （４）産生される前記トキシンがＢｅＩＴ２トキシンで
ある請求項１記載の植物。 - （５）産生される前記トキシンがＡｇａＩＶトキシンで
ある請求項１記載の植物。 - （６）産生される前記トキシンがＳｆＩＴトキシンであ
る請求項１記載の植物。 - （７）前記コード領域が植物細胞において良く発現する
天然の植物遺伝子により選択的に利用されるコドンを該
配列の各コドンに含むように選択された合成配列である
請求項１記載の植物。 - （８）前記プロモーターおよび前記コード領域の間に植
物細胞中で下流コード配列の翻訳を促進する植物ウィル
ス由来の５′非翻訳配列が存在する請求項１記載の植物
。 - （９）前記コード領域がｐＡＭＶＡａＩＴ、ｐＡＭＶＢ
ｅＩＴ１、ｐＡＭＶＢｅＩＴ２、ｐＡＭＶＡｇａＩＶお
よびｐＡＭＶＳｆＩＴからなる群から選ばれる植物発現
カセットのたんぱく質コード領域によりコードされるた
んぱく質と相同的なたんぱく質をコードする請求項１記
載の植物。 - （１０）前記植物がそのゲノム中に特定の昆虫に選択的
に毒性を持ち、かつ特定のトキシンに耐性を有する昆虫
を減少させうるように第１トキシンとは異なる毒性様式
の第２ポリペプチドトキシンを該植物細胞中で発現する
のに効果的な第２キメラ遺伝子構築物も含む請求項１記
載の植物。 - （１１）前記第２トキシンがバチルススリンジエンシス
のデルタ内毒素に由来する請求項１０記載の植物。 - （１２）前記遺伝性キメラ遺伝子構築物を有する請求項
１記載の植物の種子。 - （１３）ゲノム中に植物細胞中で下流コード配列を発現
させるのに効果的なプロモーター、昆虫捕食性サソリに
より天然に産生される昆虫特異的ポリペプチドトキシン
の植物細胞中での発現をコードする領域、および植物細
胞中での該遺伝子構築産物の転写または翻訳を停止する
のに効果的な停止配列を含む遺伝子キメラ遺伝子構築物
で、該植物組織の食物摂取に際し特定の昆虫に致命的な
量のトキシンを該植物細胞中で発現するのに効果的な遺
伝子構築物を含む植物。 - （１４）産生される前記トキシンがＡａＩＴトキシンで
ある請求項１３記載の植物。 - （１５）産生される前記トキシンがＢｅＩＴ１である請
求項１３記載の植物。 - （１６）産生される前記トキシンがＢｅＩＴ２である請
求項１３記載の植物。 - （１７）前記コード領域が植物細胞中で良く発現する天
然の植物遺伝子により選択的に利用されるコドンを該配
列の各コドンに含むように選択された合成配列である請
求項１３記載の植物。 - （１８）前記プロモーターおよび前記コード領域の間に
植物細胞中で下流コード配列の翻訳を促進する植物ウィ
ルス由来の５′非翻訳配列が存在する請求項１３記載の
植物。 - （１９）前記コード領域がｐＡＭＶＡａＩＴ、ｐＡＭＶ
ＢｅＩＴ１およびｐＡＭＶＢｅＩＴ２からなる群から選
ばれる植物発現カセットのたんぱく質コード領域にコー
ドされるたんぱく質に相同的なたんぱく質をコードする
請求項１３記載の植物。 - （２０）前記植物がそのゲノム中に特定の昆虫に選択的
に毒性があり、かつ特定のトキシンに耐性のある昆虫を
減少させうるように第１トキシンとは異なる毒性様式の
第２ポリペプチドトキシンを該植物細胞中で発現するの
に効果的な第２キメラ遺伝子構築物も含む請求項１３記
載の植物。 - （２１）前記第２トキシンがバチルススリンジエンシス
のデルタ内毒素に由来する請求項２０記載の植物。 - （２２）前記遺伝性キメラ遺伝子構築物を有する請求項
１３記載の植物の種子。 - （２３）ゲノム中にｐＡＭＶＡａＩＴ、ｐＡＭＶＢｅＩ
Ｔ１、ｐＡＭＶＢｅＩＴ２、ｐＡＭＶＡｇａＩＶおよび
ｐＡＭＶＳｆＩＴからなる群から選ばれる植物発現カセ
ットを含むキメラ植物発現カセットを含む植物。 - （２４）請求項２３記載の植物の種子。
- （２５）植物組織を摂取する昆虫に毒性を示すのに十分
な量の昆虫捕食性動物中で天然に産生されるトキシンを
該組織中で発現するトランスジェニック植物。 - （２６）摂取の際該植物組織で特定の昆虫に対し十分な
毒性を示すレベルで発現され、かつ毒性様式の異なる２
つの殺虫性トキシンの発現をコードする２つの遺伝性遺
伝子構築物がメンデル遺伝以外の機構で植物の生殖系列
中に挿入されたゲノムをもつトランスジェニック植物。 - （２７）１つのトキシンが昆虫捕食性動物により天然に
産生されるトキシンである請求項２６記載のトランスジ
ェニック植物。 - （２８）１つのトキシンがバチルススリンジエンシス由
来の内毒素である請求項２６記載のトランスジェニック
植物。 - （２９）請求項２６記載の植物の種子。
- （３０）昆虫摂取に対する耐性を改善した植物の作成法
で、 （ａ）昆虫捕食性動物のトキシン類を探索して少なくと
もいくつかの昆虫に対してのみ特異的に毒性を示すポリ
ペプチドトキシンを同定する、 （ｂ）該ポリペプチドトキシンのアミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列を合成する、 （ｃ）植物細胞中で効果的なプロモーターおよびターミ
ネーターを有する植物発現プラスミドベクター中に該ヌ
クレオチド配列を挿入して植物細胞中で該トキシンを発
現するキメラ遺伝子構築物を作成する、 （ｄ）植物細胞に該キメラ遺伝子構築物をトランスホー
ムし、ついでそのゲノム内に該キメラ遺伝子構築物を含
む増殖性トランスジェニック植物を回収する、 （ｅ）該トランスジェニック植物の子孫の組織を昆虫に
摂取させて該トランスジェニック植物組織の昆虫に対す
る毒性をテストする、および （ｆ）該トランスジェニック植物組織を摂取した昆虫に
対し効果的な毒性を示すトランスジェニック植物を選択
する、 以上（ａ）〜（ｆ）のステップを含む方法。 - （３１）ステップ（ａ）の探索をサソリトキシンのトキ
シン構成物について行う請求項３０記載の方法。 - （３２）ステップ（ａ）の探索をクモによって産生させ
るトキシン類について行う請求項３０記載の方法。 - （３３）ステップ（ｂ）のコード領域の合成が植物細胞
中で良く発現する天然の植物遺伝子により選択的に利用
されるコドンを合成コード配列の各コドンについて選択
することを含む請求項３０記載の方法。 - （３４）選択したトランスジェニック植物の自己授粉お
よび再度産生される子孫の昆虫に対する毒性テストのス
テップをさらに含む請求項３０記載の方法。 - （３５）選択したトランスジェニック植物と昆虫に対し
て致命的な他のトキシン発現の遺伝的特色を含む植物の
交配育種およびトキシン生産の両特色を有する子孫植物
の選択のステップをさらに含む請求項３０記載の方法。 - （３６）前記別の毒性の特色を含む植物がバチルススリ
ンジエンシスデルタ内毒素の発現の特色を含む請求項３
５記載の方法。 - （３７）ゲノム中に昆虫捕食性動物により天然に産生さ
れる殺虫性トキシンを種子から生育した植物の組織中で
発現するのに効果的なキメラ遺伝子構築物を含む植物種
子。 - （３８）前記トキシンがサソリに由来する請求項３７記
載の植物種子。 - （３９）前記トキシンが昆虫神経毒ＡａＩＴである請求
項３８記載の植物種子。 - （４０）前記トキシンがｐＡＭＶＡａＩＴ、ｐＡＭＶＢ
ｅＩＴ１、ｐＡＭＶＢｅＩＴ２、ｐＡＭＶＡｇａＩＶお
よびｐＡＭＶＳｆＩＴからなる群から選択される植物発
現カセットのたんぱく質コード配列によりコードされる
たんぱく質と相同的である請求項３７記載の植物種子。
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