JPH09509842A - 新規チオールプロテアーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 チオールプロテアーゼの新規阻害ペプチド(バージフェリンと命名)がジアブロティカ・バージフェラから単離される。バージフェリンおよび修飾バージフェリンのペプチドをコードするＤＮＡが請求される。これらの配列はベクター中にクローン化され、植物の形質転換に使用され得て、昆虫および線虫、特に鞘翅目昆虫を含む、チオールプロテアーゼを消化酵素として有する植物害虫による損傷を受け難くする性質を付与する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規チオールプロテアーゼ阻害剤 本発明は、プロテアーゼの新規阻害ペプチド、ペプチドをコードする核酸配列 、植物ゲノム中へのプロテアーゼ阻害遺伝子の挿入、植物中での阻害遺伝子また は遺伝子群の発現に関し、その植物は、昆虫および線虫を含む植物害虫による損 傷が受け難くなる性質を有するものである。本発明は、更に、このような阻害ペ プチドの生物工学的製造法、阻害ペプチド含有殺虫組成物および植物に損傷をも たらす害虫の駆除または減少のためのペプチドの使用を記載する。 ある植物害虫、特に鞘翅目(Ｃoleopteran)昆虫および双翅目(Ｄiabrotica)属 の昆虫は特に作物の大きな損傷をもたらす。過去および現在において、化学燻蒸 剤がこのような昆虫損傷を制御するために使用されている。加えて、作物の輪作 の実施が双翅目集団を制御できる。しかしながら、殺虫化学物質の過剰な使用は 環境的に望ましくなく、作物輪作の実施はすべての栽培者に実行可能ではない。 一年の作物輪作は、ある双翅目集団においては延長休眠が広く増大するために、 双翅目からの完全な保護を提供し得ないという証拠も増加している。したがって 、このような昆虫損傷から、化学的制御または作物輪作以外の機構により保護す る手段は非常に有益である。 以後まとめてプロテアーゼと呼ぶプロテアーゼまたはペプチダーゼは、タンパ ク質またはペプチド中のペプチド結合を加水分解する酵素であり、ペプチドの末 端で(エキソペプチダーゼ)またはペプチド鎖内(エンドペプチダーゼ)でこの活性 を示す。エンドペプチダーゼは、特定のアミノアシル残基について異なった程度 の特性で内部ペプチド結合を開裂する。プロテアーゼ酵素は、その触媒残基を基 本にして分類される。したがって、チオールプロテアーゼでは、システインスル フィドリル基が直接、基質ペプチド結合の開裂に関係する。プロテアーゼは、天 然の至るとこに存在し、これらの酵素は昆虫および他の植物害虫に存在すること が広く文献に記載されている。 ペプチドは、消化中のプロテアーゼの作用により生物の胃腸管中でタンパク質 から産生される。これらの生物は、すべてのアミノ酸を得るために有効な消化管 プロテアーゼの一組の活性に依存している。最高に特徴付された昆虫プロテアー ゼはセリンプロテアーゼである(Ａpplebaum，Ｓ.Ｗ.(1985)Ｂiochemistry of Ｄ igestion，in Ｃomprehensive Ｉnsect Ｐhysiology．Ｂiochemistry and Ｐhar macology，Ｋerkut，Ｇ.Ａ.およびＧilbert，Ｌ.編 4:279-311、Ｐergamon Ｐr ess，Ｏxford)。比較して、あまり多食でない昆虫は、酸プロテアーゼ(Ｐendola , Ｓ.およびＢ．Ｇreenburg，(1975)Ａnn．Ｅnt．Ｓoc．Ａm．69:341-345)また はチオールプロテアーゼ(Ｍurdock et al.，(1987)，Ｃomp．Ｂiochem．Ｐhysio l. 87B783-787)をタンパク質消化の主要貢献物として使用し得る。ジアブロティ カ・ビルギフェラ(Ｄiabrotica virgifera)、通称名ウェスタン・コーン・ルー トウォーム(western corn rootworm)(ｗＣＲＷ)は特にチオールプロテアーゼが 豊富なことが知られている(Ｍurdock et al．前掲)。 プロテアーゼと複合体を形成し、そのタンパク質分解活性を阻害する分子もま た天然に広く存在し、これらはタンパク質分解活性の制御剤である。シスタチン として知られているチオールプロテアーゼのペプチド阻害剤の存在は、最初１９ ５７年に記載された。この最初の発見から、多くのシスタチン型阻害剤が特徴付 され、これらの阻害剤は一般に、シスタチンスーパーファミリーのメンバーと呼 ばれる。スーパーファミリーの３つのサブグループは：ジスルフィド結合を有す るシスタチン；システイン残基を欠くステフィン；およびジスルフィド結合を有 する高分子量糖タンパク質であるキニノーゲンを含む。 プロテアーゼ阻害剤は、昆虫および／または病原体攻撃に対して発育的に制御 および誘発の両方がなされる、植物組織中の防御的化学物質である。トランスジ ェニックトマト中のセリンプロテアーゼ阻害剤発現の抑制は、昆虫食餌に対する 減少した耐性をもたらすことが証明されている。 昆虫、特に鞘翅目に有毒である、あるチオール阻害剤は、よく特徴付されてい る。Ｍurdock et al.(前掲)により研究された甲虫の３種において、中腸抽出物 における多くのまたはほとんどのタンパク質分解活性は、チオールプロテアーゼ の特異的、有効な非タンパク質阻害剤である、Ｅ−６４、[Ｎ−(Ｌ−３トランス カルボキシオキシラン−２−カルボニル)−Ｌ−ロイシル]−アミド(４−グアニ ド)−ブタンにより阻害されることが判明した。 本発明は、特に、有効なチオールプロテアーゼ阻害剤としての、バージフェリ ン(virgiferin)と名付けられた新規ペプチドの発見に関する。バージフェリンお よび修飾バージフェリンのアミノ酸配列は、これらのペプチドを、シスタチンス ーパーファミリーのチオールプロテアーゼ阻害剤メンバーから区別する。 本発明により、以後バージフェリンと称するチオールプロテアーゼ阻害剤が提 供され、それは、配列番号１および配列番号２のアミノ酸１位から始まり、アミ ノ酸８３位で終わる、約１１.５kＤaペプチドである。バージフェリンは新規で 独特なペプチドと信じられる。前述のアミノ酸配列および組み合わさった特性を 有するペプチドは前に記載されていないと信じる。配列番号１および２はまたア ミノ酸−１７位から−１位に伸びるシグナルペプチドのアミノ酸配列もまた提供 する。 本発明の他の態様は修飾バージフェリンペプチドであり、修飾ペプチドはバー ジフェリンと機能的に同等であり、バージフェリンと実質的に類似のアミノ酸配 列を有するペプチド；バージフェリンの切断体(truncations)；およびバージフ ェリンと実質的に類似のアミノ酸配列を有するペプチドの切断体を含む。 したがって、本発明はまた、配列番号２に記載のタンパク質と実質的に類似の 活性／機能を有し、配列に記載のタンパク質と少なくとも５０％類似であるアミ ノ酸配列を有する純粋タンパク質も含む。好ましくは類似度が少なくとも７０％ 、更に好ましくは類似度が少なくとも９０％および更に好ましくは類似度が少な くとも９５％である。本発明の内容において、少なくとも５０％の類似度の２個 のアミノ酸配列は、少なくとも５０％同一または、並べた場合、類似の位置に保 存置換アミノ酸残基を有するが、最適には５個までのギャップを有する(ただし 、ギャップに関して全部で１０個以上のアミノ酸残基は影響を受けない)。本発 明の目的において、保存置換は以下の群のアミノ酸の間でなし得る： (ｉ)アラニン、セリンおよびスレオニン； (ii)グルタミン酸およびアスパラギン酸； (iii)アルギニンおよびリジン； (iv)アスパラギンおよびグルタミン； (ｖ)イソロイシン、ロイシン、バリンおよびメチオニン； (vi)フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。 タンパク質配列に関して“切断体”の用語が使用されている場合、この用語は 配列番号２に記載の配列から成り、少なくとも１０個のアミノ酸を有するペプチ ドを意味する。更に好ましくは、ペプチドは少なくとも３５アミノ酸、更に好ま しくは少なくとも５５アミノ酸、更に好ましくはペプチドは少なくとも７０アミ ノ酸を有する。 本発明の更に別の態様は、バージフェリンまたは修飾バージフェリン(下記定 義)をコードする組換え核酸配列およびバージフェリンまたは修飾バージフェリ ンをコードする核酸配列に類似する核酸配列である。類似とは、本発明の配列と ハイブリダイズできる試験配列に相補的な配列を意味する。試験および本発明の 配列が二本鎖である場合、試験配列を構築する核酸配列は、本発明の配列と、好 ましくは１０℃以内のＴＭを有する。試験および本発明の配列を互いに混合し、 同時に変性する場合、配列のＴＭ値は、好ましくは互いに５℃以内である。更に 好ましくは、ハイブリダイゼーションを、試験または本発明のＤＮＡのいずれか を好ましくは支持して、ストリンジェントな条件下で行う。したがって、変性試 験または本発明の配列を、最初に支持体と結合し、ハイブリダイゼーションを温 度が５０から６０℃の間で、０.１％ＳＤＳ含有２強度クエン酸緩衝化食塩水中 で一定時間行い、次いで同じ温度であるが、減少したＳＣ濃度を有する緩衝液で 支持体をすすぐ。必要な強度の割合、すなわち配列の類似度に依存して、このよ うな減少した濃度の緩衝液は、典型的には０.１％ＳＤＳ含有１強度ＳＣ、０.１ ％ＳＤＳ含有半強度ＳＣおよび０.１％ＳＤＳ含有１／１０強度ＳＣである、最 も高い類似度を有する配列は、そのハイブリダイゼーションが減少した濃度の緩 衝液による洗浄に最も影響されないものである。試験および本発明の配列が、そ れらの間のハイブリダイゼーションが、０.１％ＳＤＳ含有クエン酸ナトリウム 緩衝液による洗浄またはインキュベーションに実質的に影響されないほど類似で あるものが最も好ましい。 更なるＤＮＡ構築物が、宿主細胞中で機能するプロモーターおよび１個または それ以上のバージフェリンペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むように提供さ れる。 昆虫または線虫害虫による損傷が受け難くなる特性を有する遺伝子形質転換植 物を製造することを含む、昆虫または線虫感染を駆除する方法もまた本発明の態 様であり、それは植物細胞のゲノムに本発明のＤＮＡ構築物を挿入し、形質転換 植物細胞を得、植物細胞から昆虫または線虫害虫による損傷、特にコレオプテラ による損傷が受け難くなる特性を有する遺伝子形質転換植物を再生することを含 む。 昆虫または線虫感染の駆除法はまた、バージフェリンまたは修飾バージフェリ ンの遺伝子を発現するように形質転換された植物転移増殖微生物の提供も含み得 、微生物を植物または制御が好ましい植物の場所に挿入し、遺伝子を殺虫または 殺線虫有効量発現させる。 本発明はまた上記定義の遺伝子形質転換植物の繁殖または再生および昆虫害虫 、特にジアブロティカのような鞘翅目昆虫による損傷に対する減少した感受性を また示す子孫を産生するための植物細胞、組織切片または種子の使用を意図する 。本発明は、繁殖または再生により産生された子孫も更に含む。 本発明の別の態様は、特にエシェリキア・コリ(Ｅ．coli)および根転移増殖微 生物を含む、宿主微生物細胞中のバージフェリンおよび修飾バージフェリンの発 現に由来するタンパク質の産生を含む。 本発明の他の目的および特性は、以下の詳細な説明により明白となるであろう 。詳細な記載および具体的実施例は説明するためのみであることは理解されるべ きである。実施例において： 図１はｗＣＲＷサナギから抽出し、cm-パパインクロマトグラフィーに付した タンパク質のＬaemmliゲルを記載する； 図２はｗＣＲＷ腸プロテアーゼの不可逆的阻害剤Ｅ−６４および２つの濃度の ＭＡＮ−バージフェリンによる活性部位滴定を記載する； 図３はバージフェリンペプチドをコードするエシェリキア・コリ発現構築物ｐ ＥＶ４のプラスミド地図を記載する； 図４はバージフェリンペプチドをコードする植物発現構築物ｐＺＯ１７３１の プラスミド地図を記載する； 図５はＰＲＭＳ(Ｐ１４)先導ペプチドと融合したバージフェリンペプチドをコ ードする植物発現構築物ｐＺＯ１７３２のプラスミド地図を記載する； 図６は各バージフェリンコード構築物と同時に誘導される、植物発現構築物ｐ ＺＯ１５２２のプラスミド地図を記載する。 新規チオールプロテアーゼ阻害剤、バージフェリンは、アミノ酸１位で始まり 、アミノ酸８３位で終わる配列番号１および２のアミノ酸配列により定義される 。位置の番号付は、バージフェリンのＮ−末端セリン(Ｓer)からである。バージ フェリンは双翅目消化プロテアーゼの有効な阻害剤である。プレ−バージフェリ ンは、アミノ酸−１７位で開始し、−１位までの配列番号１および２の信号先導 配列を伴う前駆体タンパク質としてコードされる。本明細書で使用する限り、先 導配列とも称する“信号配列”は、約１１から約２２アミノ酸である。これらの アミノ酸はプロテアーゼ阻害剤の成熟の間に開裂される。先導配列は当分野で既 知であり、小胞体膜を通る転位により成熟ペプチドを小胞体、小胞または細胞外 空間に効率的に向け、転位の間に切除される特異的Ｎ−末端配列ある。先導配列 の例は、本明細書で使用のｐＺＯ１７３２に使用したＰＲＭＳ(Ｐ１４)だけでな く、エンドプロテイナーゼＢ遺伝子およびタバコＰＲＩＧ遺伝子由来のものがと りわけ含まれる。本明細書で使用する限り、プロテアーゼはプロテイナーゼなら びにエキソおよびエンド−ペプチダーゼならびにタンパク質を含み、ペプチド中 のペプチド結合を加水分解する酵素を意味する。更に、本明細書で使用する限り 、“プロテアーゼ阻害剤”は、プロテアーゼ酵素のタンパク質分解活性またはエ ラスターゼ活性のレベルを減少させる分子を意味する。 本発明は、標準技術により単離または構築し得る修飾バージフェリンペプチド を含む。修飾バージフェリンペプチドは、バージフェリンと機能的に同等であり 、バージフェリンについて同定された本質的な配列を有するかまたはバージフェ リンの切断体またはそれについて同定された本質的なアミノ酸配列(上記参照)を 有 するペプチドの切断体である。機能的に同等なペプチドは、１個またはそれ以上 のアミノ酸が、バージフェリンと比較して、実質的にペプチドプロテアーゼ阻害 活性を減少させることなく添加、置換または欠失されるものである。当業者は、 種々のアミノ酸がペプチド中で置換または欠失でき、まだそのペプチドがその機 能を維持することに気付く。この点に関して、修飾した機能的に同等なペプチド は、バージフェリンより殺虫または殺線虫活性が高いレベルでさえあるペプチド を含み得る。このような修飾ペプチドは、バージフェリンのアミノ酸配列と、好 ましくは少なくとも５０％の類似性、好ましくは少なくとも７０％の類似性、更 に好ましくは少なくとも９０％の類似性を有する。 修飾バージフェリンペプチドおよびチオールプロテアーゼのタンパク質は、パ パイン型プロテアーゼに対する結合親和性を有するＳＥＤ ＰＡＧＥで分子量約 １０−１５kＤaであることにより特徴付得る。パパインは当業者に３次構造が定 義されたチオールプロテアーゼとして既知である(Ｄrenth，Ｊ．et al.，(1976) Ｂiochemistry 15:3731-3738)。チオールプロテアーゼのプロペプチドは、プロ テアーゼの活性化または成熟により触媒プロテアーゼペプチドから酵素開裂され た前駆体チオールプロテアーゼの一部と定義される。パパイン型チオールプロテ アーゼの場合、プロペプチドは酵素ペプチドへのアミノ−末端で発生する。加え て、修飾バージフェリンペプチドは、コレプテラン昆虫、特に双翅目から単離さ れたペプチドを含み得る。 この点において、本発明はバージフェリンの多形クローンを含む。特に、配列 番号１の６４位で、プロリンまたはロイシン；およびアミノ酸７３位で、バリン またはロイシンが発生し得る。これらの多形性の要約は表１に示す。 本発明は、バージフェリンの切断により産生されたペプチドおよび遺伝子的ま たは化学的手段で修飾されたバージフェリンペプチドをも含み、これらはプロテ アーゼ阻害剤機能をなお維持している。切断は、ペプチドのアミノ末端および／ またはカルボキシ末端からのアミノ酸配列の除去を意味する。更に、本発明はバ ージフェリン配列または修飾バージフェリン配列が化学的または遺伝指摘手段で 他のタンパク質またはペプチドの配列に結合している融合タンパク質も含む。融 合タンパク質は、縦列で結合しているペプチドまたはバージフェリン配列もしく は修飾バージフェリンが中断されているいずれかを含み得る。 記載されるように、本発明の一つの態様は、組換えＤＮＡ技術によるバージフ ェリンおよびその修飾物の産生およびバージフェリンおよびその修飾物をコード する核酸配列で遺伝子的に形質転換した宿主細胞の提供である。宿主細胞は植物 細胞および細菌細胞を含み得る。 形質転換に好適なＤＮＡ構築物は、プロモーダおよびバージフェリンまたは修 飾バージフェリンのコード配列を含む異種遺伝子を最低含む。本発明のＤＮＡ配 列は、種々の慣用法を使用して得ることができる。ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖 反応、化学的合成または、本配列を含むゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ(ｃＤ ＮＡ)由来の二本鎖ＤＮＡからの単離により合成し得る。バージフェリンのｃＤ ＮＡは配列番号１に記載する。 当業者に既知のように、遺伝子暗号の縮重は、同じタンパク質をコードするた めの種々の核酸配列、ＤＮＡおよびＲＮＡを考慮に入れなければならならず、ほ とんどの場合、アミノ酸は２個またはそれ以上の同義コドンによりコードされ、 例えばアミノ酸アラニンはＧＣＵ、ＧＣＣおよびＧＣＡによりコードされる。本 発明のペプチドを他の宿主生物にクローニングした場合、宿主生物が用いるのに 好ましいように核酸コドンを置換するが、翻訳産物には変化がないことが望まし いことが証明され得る。この点に関して、本発明はまたこれらの同義コドン配列 も含む。本発明は更に宿主生物による使用に最も好ましいコドンだけでなく、ポ リアデニル化配列およびイントロンスライス配列への変化も含む。 本発明は、本明細書に記載のｃＤＮＡバージフェリン配列またはその一部とス トリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列 を含む、“ストリンジェントなハイブリダイーゼション条件”は、ハイブリダイ ゼーションを、食塩緩衝化溶液中で５０から６０℃の間で行うものである(上記 参照)。ハイブリダイゼーションに使用するＤＮＡは、慣用法で製造し得、当分 野で既知の方法により同定可能なハイブリダイゼーションブローブを形成するた めの標的とし得る。このようなプローブは、好適なプローブとしてまた使用し得 、 慣用的にはバージフェリン対立遺伝子のヌクレオチドを位置付けおよび単離する ための、または他の鞘翅目害虫におけるバージフェリンまたはその修飾物の対立 遺伝子のヌクレオチドを位置付けおよび単離するためのクローンバンクを製造す る。特に、核酸セグメントまたはプローブは、化学的または放射化学的に標識し 得、ノーザン・ハイブリダイゼーション、サザン・ハイブリダイゼーションおよ びコロニーまたはプラークハイブリダイゼーションに使用し、双翅目種のと類似 または同様のセグメントを同定する。 上記の核酸配列を含むベクターは、本発明の他の態様を代表する。発現ベクタ ーは、典型的にプラスミドである。プラスミドは、一般に、ＤＮＡ配列または興 味の対象のタンパク質をコードする配列に作業可能に結合するプロモーター、転 写停止配列および３'および５'因子を伴う残りのベクターを含む、環状二本鎖Ｄ ＮＡループである。当業者は、ウイルスベクター、バキュロウイルス；ファージ ベクター；アグロバクテリウム−Ｔｉプラスミド；バイナリーベクターおよび植 物形質転換に好適な他のベクターを含む多くの型のベクターを知っている。ＤＮ Ａ配列の本発明の微生物および植物宿主細胞への挿入は、当分野で既知の技術に より起こる。 プロモーターは、転写の開始を指示し、ｍＲＮＡの先導配列をコードする領域 を含む転写に必要なすべての制御領域を含む、構造遺伝子の５'末端ヌクレオチ ド配列を意味する。微生物および植物細胞中で活性な多くのプロモーターが文献 に記載されている。好適な植物プロモーターは；クロロフィルａ／ｂ結合タンパ ク質、ノパリン・シンターゼ(noparine synthase)(ＮＯＳ)、オクトピン・シン ターゼ(octopine synthase)(ＯＣＳ)、カリフラファー・モザイク・ウイルス(ca uliflower mozaic virus)(ＣａＭＶ)１９Ｓおよび３５Ｓ、リブロース・ビスホ スヘート・カルボキシラーゼ(ribose biphosuphate carboxylase)(ＲＵＢＩＳＣ Ｏ)および熱ショックブラシカ(Brassica)プロモーター(ＨＳＰ８０)をコードす る遺伝子のプロモーターを含む。エシェリキア・コリの形質転換に使用するのに 好適なプロモーターは、商業的に入手可能なＰ_Tac、λ_prおよびＴ₇を含むが、こ れらに限定されない。本発明で使用するプロモーターは、制御特性に影響をあた えるように修飾し得、更に天然発生または合成の１個以上の源由来のセグメント の混合物であり得る。停止配列は、転写停止の信号を発する転写単位の末端のヌ クレオチド配列を意味する。ターミネーターは、ポリアデニル化信号を含む３' −非翻訳ＤＮＡ配列である。ターミネーターの例は既知であり、文献に記載され 、nos(ノパリン・シンターゼ・ターミネーター)、ＣａＭＶの３５Ｓターミネー ターおよびゼインターミネーターを含むがこれらに限定されない。 本発明のベクターは、ａ）安定配列；ｂ）１個またはそれ以上のマーカー配列 、例えば、cat(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)、nptII(ネ オマイシンホスホトランスフェラーゼII)、ＰＡＴ(その発現が除草剤ベスタに対 する耐性を付与する、ホスホイノスリシンアセチルトランスフェラーゼ)、ＥＰ ＳＰＳ(グリホサートにより阻害される酵素であり、除草剤ラウンドアップの活 性成分である５−エノールピルビル−シキメート−３−ホスフェートシンターゼ )およびbxn(ブロモキシニル特異的ニトリラーゼ)を含む抗生物質または除草剤耐 性マーカー；ｃ）バチルス・スリンギエンシスのデルタ内毒素配列のような他の 殺虫タンパク質遺伝子；ｄ）イントロン配列；およびｅ）エンハンサーまたはあ る条件下で植物の特定の部位で得られる発現のレベルを増加または減少させるた めに必要な他の因子を含むがこれらに限定されない、当分野で既知の他のＤＮＡ 配列もまた有し得る。これらの例は本発明をいかなる意味でも限定するものでは ない。 実際の形質転換および形質導入を行うための多くの技術が当分野で利用でき、 知られている。これらは、所望によりＤＮＡの細胞透過性を増加させるための化 学的または物理的試薬、例えばポリエチレングリコールおよび硫酸デキストラン による処理により促進される、全細胞、組織または原形質への直接のＤＮＡの転 移；エレクトロポレーション、熱ショックおよびＤＮＡ被覆粒子への弾道移植を 含むが、これらに限定されない。形質転換は、またアグロバクテリウム(Ａgroba cterium)株、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Ａ．tumefaciens)に より、またアグロバクテリアの癌含有プラスミドのＴ−ＤＮＡの一部を含む種々 の遺伝子工学形質転換プラスミドにより媒介される。ＤＮＡの細胞への挿入を行 う他の手段は、ウイルスベクターの使用、アグロインフェクション(agroinfecti on)、バイナリーベクターおよび共形質転換を含む。(Ｊ ensen et al.，(1993) ，Ｔechniques for Ｇene Ｔransfer，Ｔlansgenic Ｐlants，Ｖol．1，125-146 頁，ＫingおよびＷu編、Ａcademic Ｐress参照)。形質転換または形質導入細菌 細胞、例えばエシェリキア・コリおよびバチルス・スリンギエンシス(Ｂ.ｔ.)は 、本発明に含まれる。生物工学におけるかなりの経験がすでに積まれ、広範囲の 好適な有効に機能するプラスミドおよび転移発現ベクター系が知られ、これらの 生物のために入手可能である。 本明細書で使用する限り、“遺伝子的形質転換”は、核酸処理植物原形質、細 胞または組織から再生した植物のゲノム中への異種遺伝子の安定な統合を意味す る。本明細書で使用される“トランスジェニック植物”は、安定に統合された異 種遺伝子を有する植物を意味する。“異種遺伝子”は、宿主細胞または宿主植物 以外の源由来の、宿主細胞または宿主植物に形質転換される遺伝子または遺伝子 のグループを意味するために当分野で使用される用語である。“トランスジーン ”または“外来性遺伝子”の用語は、本発明で使用される限り、異種遺伝子の用 語と同じ意味を有する。 事実上、農学的および園芸的価値のあるすべての植物は、形質転換可能および 再生可能であるとして知られている。技術は、当業者によく知られているように 、種により個々に詳細は変化する。植物形質転換および再生のレビューのために 、ＲitchieおよびＨodges，Ｔransgenic Ｐlants，Ｖol．1，1993，147-178頁， ＫingおよびＷu編、Ａcademic Ｐress参照。植物組織は、根、芽、葉、花粉、胚 乳、種子およびカルスを含む植物細胞の種々の集合形を含む、植物の分化および 未分化組織および細胞を含む。 本発明は、宿主細胞中、特に植物細胞中で機能する組換えＤＮＡ分子の製造を 含み、植物昆虫害虫および、システイン消化プロテアーゼを利用する植物害虫に よる損傷の感受性を減少させる。このような昆虫害虫は、特にチューブリオニダ エ(Ｔeuebrionidae)、クルクリオニダエ(Ｃurculionidae)、ブルチダエ(Ｂruchi dae)およびクリソメリダエ(Ｃhrysomelidae)のファミリーの昆虫を含む。記載は 双翅目属の昆虫について成す。このような植物昆虫害虫の例は、一般にバンデッ ド・ククンバー・ビートル(banded cucumber beetle)、ノーザン・コーン・ルー トウォーム(northern corn rootworm)、スポッテッド・ククンバー・ビートル(s potted cucumber beetle)、サザン・コーン・ルートウォーム(southern corn ro otworm)、ウェスタン・コーン・ルートウォーム(western corn rootworm)および メキシカン・コーン・ルートウォーム(Ｍexican corn rootworm)と呼ばれるアデ ルファ(adelpha)、バルテアタ(balteata)、バーベリ(barberi)、スペシオサ(spe ciosa)、ウンデシンプンクタタ(undecimpunctata)、ハウアリジ(howaridi)、バ ージフェラ(virgifera)およびビリドゥラ(viridula)種である。他の具体的な昆 虫は、メキシカン・ビーン・ビートル(Ｍexican bean beatle)、コロラド・ポテ ト・ビートル(Colorado potato beatle)、ワイヤーワーム(wireworms)、グラブ( grubs)、ボールウィービル(bollweevils)、メイズ(maize)、グレイナリー(grain ery)およびライス・ウイービル(rice weevils)およびブルチド(Ｂruchids)であ る。 植物害虫による損傷が受け難くなる特性は、根転移増殖生物における本発明の バージフェリンペプチドの一つの発現によりもたらされ、その生物は植物または 植物の周辺に使用され、植物における昆虫餌として、その生物により産生された バージフェリンペプチドの殺虫有効量を摂取する。根転移増殖生物は、細菌また は真菌であり得、更に表面コロニー形成または植物内部であり得る。 本発明の実施により昆虫または線虫による損傷が受け難くなる特性を有し得る 植物は、イネ科、ウリ科、マメ科、ナス科、キク科、カヤツリグサ科、ヒルガオ 科の仲間である。以下の植物についてまた具体的に記載する：トウモロコシ(メ イズ)、スイートコーン、カボチャ、メロン、キュウリ、サトウダイコン、ヒマ ワリ、コメ、綿、キャノーラ、サツマイモおよびピーナッツ、インゲン豆、ササ ゲ、ダイズ、アルファルファおよびソラマメ。 本発明の更なる一つの態様は、本発明で記載のペプチド、特にバージフェリン の殺虫有効量をその活性成分として含む殺虫組成物を含む。“殺虫有効量”また は“殺線虫有効量”の用語は、昆虫または線虫の数を致死、成育減少(発育阻止) 、 繁殖能力の減少などにより減少させることによる、昆虫または線虫植物昆虫の駆 除を達成するのに充分な量を意味する。バージフェリンまたはその修飾物は、当 業者に既知の多くの方法で製剤し得る。水分散濃縮物または水和剤のような噴霧 形に使用する製剤は、展着剤または分散剤のような界面活性剤を含み得る。他の 活性成分、例えば、抗菌剤、殺虫剤および除草剤を含む殺虫剤を、活性スペクト ルまたは農業的実用性を増加するために本発明のペプチドと共に使用し得る。製 剤は、駆除が望ましい場所に使用し得る。活性成分の量は、具体的製剤の特性を 含む多くの因子に依存して変化する。 以下の実施例は本発明を説明するために提供し、その範囲を限定する意図はな い。実施例は、分子生物学の分野で既知の多くの技術、特に、植物組織の付随す るを伴う形質転換植物組織内の組換えＤＮＡの複製に関するものを使用する。技 術は、本明細書に参考として包含する引用した文献に更に詳細に記載する。実施例１：ｗＣＲＷサナギからのバージフェリンの単離および精製 バージフェリンはｗＣＲＷサナギ均質物からcm−パパイン−アガロースクロマ トグラフィーを基本にして精製する。(Ｂarrett，Ａ．Ｊ．(1981) Ｍethods in Ｅnzymology 80:771-778)。cm−パパイン−アガロースの製造 。パパイン(Ｂoehringer-Ｍannheim)をＢarret t、前掲に記載のようにカルボキシメチル化により不活性化し、次いで一晩５０m Ｍ ＭＯＰＳ(ｐＨ７.５)−１０mＭ ヨウド酢酸で透析する。cm−パパインを５ ０mＭ ＭＯＰＳ(ｐＨ７.５)中のＡffi-Ｇel１５アガロース(ＢioＲad)と結合さ せ、連続してＰＢＳ５０ml、５０mＭ 炭酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ１０.５)５０ mlおよびＰＢＳ５０mlで洗浄し、その後、ＰＢＳ含有ナトリウムアジド中に保存 する。サナギ均質物 。約５０のｗＣＲＷサナギ(Ｆrench Ａgricultural Ｒesearch)を ＰＢＳで洗浄し、土壌を除去する。サナギをＰＢＳ１５ml中でホモジナイズし、 均質物は、遠心により破片を取り除く。上清を５６℃に５分加熱し、次いで遠心 する。上清をcm−パパイン−アガロース１.０mlと一晩４℃で混合する。スラリ ーを使い捨てカラム１０mlに注ぎ、検出可能なタンパク質が溶出液に明白でなく なるまでＰＢＳで洗浄する。カラムを５０mＭ炭酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ１０． ５)で洗浄する。フラクション１mlを回収し、４−２０％アクリルアミドゲルの Ｌaemmili電気泳動による可視化により、明確なペプチドの存在を評価する。１ １.５kＤaペプチドが図１に示すように存在し、そのペプチドをバージフェリン と命名する。実施例２：バージフェリンＮ−末端アミノ酸配列の決定 相対的に高い濃度のバージフェリンを含有するcm−パパインフラクションを溜 め、凍結乾燥する。バージフェリンを先に述べたようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより 少ない汚染物から分析する。Ｍatsudaira(Ｍatsudaira，Ｐ.(1987)Ｊ．Ｂiol． Ｃhem．262:10035-10038)により開発された方法を使用して、バージフェリンを 電気泳動で、下記のように低分子量タンパク質の移動のために調製したポリビニ リデンジフロリド膜(Ｍillipore)に移す。アクリルアミドゲルを移動緩衝液(４ ０％メタノール、１０mＭトリス(ｐＨ８.８))に１時間浸す。タンパク質を、一 晩、３０mＡで移動緩衝液からＰＶＤＦ膜に電気泳動で移動させる。タンパク質 の強いバンドを膜を染色して可視化する。バンドを除去し、自動タンパク質配列 分析に付す。配列は自動化エドモンド分解により測定し、配列番号３に示す。配 列番号３に列記のアミノ酸に加えて、他の残基か少ない量で存在し、これらはＳ er(アミノ酸残基１)の他にＡsn、Ａla；Ｇln(アミノ酸残基２)の他にＩle、Ｐro ；Ｔhr(アミノ酸残基３)の他にＡlaおよびＬeu；Ｇlu(アミノ酸５)の他にＧly； Ｇly(アミノ酸残基８)の他にＡsp；およびＡla(アミノ酸残基１７)の他にＡrgを 含む。実施例３：ｃＤＮＡ合成およびクローニング ＰＣＲ技術をバージフェリンをコードするｃＤＮＡクローンを産生するのに使 用する。特記しない限り、ＰＣＲ反応のための出発鋳型は以下のようにｗＣＲＷ 組織から精製されたＲＮＡである；ＲＮＡ単離およびポリＡ＋選択： ＰＣＲおよびノーザンブロット分析のための全 ＲＮＡをＷＣＲ第３齢腸およびサナギから単離する。組織をＲＮazol(Ｔel-Ｔes t)中で供給者のプロトコールに従い均質化する。ポリＡ＋ＲＮＡを全ＲＮＡから Ｐoly(Ａ)Ｑuikオリゴ−ｄＴセルロース(Ｓtratagene)により精製する。ポリメラーゼ連鎖反応： ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲプロトコール)をＰerkin- Ｅlmer Ｃetus 9600 ＤＮＡ Ｔhermal Ｃyclerで行う。反応条件は以下の通りで ある：酵素緩衝液中の２Ｕ Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼ(Ｐharmacia)、０.２μＭ ｄＮＴＰ混合物、０．４μＭの各センスおよびアンチセンスプライマーおよび 最終量５０μlの水中のＤＮＡ鋳型。水中の鋳型を９４Ｃ／ｌ分で変性し、その 後反応混合物を８２℃で加える。反応サイクルは９４Ｃ／１５秒、５５Ｃ／３０ 秒、７２Ｃ／４５秒で３０サイクル、続いて７２Ｃ／３分伸長である。鋳型ＤＮＡ合成： ＰＣＲのための鋳型ＤＮＡは、Ｆirst-strand cＤＮＡ Ｓynth esis Ｋit(Ｐharmacia)を使用して合成した一本鎖ｃＤＮＡである。ポリＡ＋Ｒ ＮＡ(ｗＣＲＷ腸およびサナギ)をキットのＮotＩ-d(Ｔ)18 Ｂifunctional Ｐrim erで始める。最初のＰＣＲのためのセンスプライマーは、上記で定義の１１.５ ｗＣＲＷタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列をコードする変性オリゴヌクレオチ ド、ＰＫＹ：５'ＧＡ(Ａ／Ｇ)ＧＡ(Ａ／Ｇ)ＧＣ(Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ)Ｇ(Ａ／Ｇ)(Ａ ／Ｃ／Ｇ／Ｔ)ＣＣ(Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ)ＡＡ(Ａ／Ｇ)ＴＡ(Ｔ／Ｃ)ＡＡ(Ａ／Ｇ)Ａ Ｃ３'、配列番号４である。 アンチセンスプライマー、ＴＬＥＳＳ：５'ＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧ ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡ３'(配列番号５)はＮotＩ-d(Ｔ)18 Ｂifunctional Ｐ rimerの一部に基づく。 ６００塩基対ＰＣＲ産物が得られる。ＰＣＲ産物の精製およびクローニング： ＰＣＲ産物をＴＢＥ中の１.２％アガロ ースゲルでゲル精製する。ＤＮＡを電気溶出(electorelution)により除去ゲルか ら溶出する。ゲル精製ＰＣＲ産物を、標準法(Ｍaniatis、前掲)を使用してＴ− ベクターｐＴ７Ｂlue(Ｒ)(Ｎovagen)にライゲートする。ＤＮＡ配列決定： 組換えクローンをＰＣＲ技術を使用して選択し、３ml容量で培 養する。ＤＮＡをこれらの培養物から製造し、標準法を使用して配列決定する。 植物発現ベクター内にクローンされた配列決定鋳型のプライマーは、イントロン ６の３'末端を基にしたＩＶＳ６ＥＮＤ：５'ＣＴＧＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＣ ＡＡ３'(配列番号６)で、アンチセンスプライマーは完全ＯＣＳターミネーター の５'末端を基にしたＯＣＳrev：５'ＧＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＴＡＴＣＡ ＴＧＣＧ３'(配列番号７)である。これらの２つのプライマーは植物発現ベクタ ーｐＺＯ１７３１およびｐＺＯ１７３２(それぞれ図４および図５)のクローニン グ部位の横にある。構築物ｐＺＯ１７３２、ＰＲＭＳ(Ｐ１４)信号配列をコード するＤＮＡは配列番号１のアミノ酸１位から８３位に記載されるように、バージ フェリンと枠内で融合する(Ｃasacuberta，et al.，(1991)Ｐlant Ｍol．Ｂiol. 16.527-536)。バージフェリンｃＤＮＡの５'−末端のクローニング： ２つの一組のアンチセン スプライマーを最初のＰＣＲ−増幅ＤＮＡの配列データ由来の遺伝子の５'末端 にクローニングするのに設計する：ＶＴＷrev：５'ＣＡＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＴ ＡＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＧ３'(配列番号８)およびＤＱrev：５'ＧＴＴＧ ＴＧＴＧＣＴＴＣＧＡＴＣＴＧＧＴＣＧ３'(配列番号９)。５'末端を、５'ＲＡ ＣＥ Ｓystem(Ｇibco ＢＲＬ)を使用して、製造者のプロトコールに従いクロー ン化する。完全ＤＮＡ配列および推測されるプロペプチド(プレ−バージフェリ ン)のアミノ酸配列を配列番号１に示し、５'ＤＮＡによりコードされる１７アミ ノ酸先導ペプチドを含む。実施例５：エシェリキア・コリ中でのバージフェリンの発現 発現ベクターの構築のために、ＰＣＲプライマーを合成し、それはメチオニン 開始コドンおよび好適な制限部位を挿入する。センスプライマーＳＱＴ：５'Ｇ ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡ ＡＧＣ３'(配列番号１０)はＮcoＩおよびＥcoＲＩ部位およびＭＡＮ残基をバー ジフェリンペプチドの最初のアミノ酸(Ｓer残基で開始、配列番号１のアミノ酸 １位)のちょうどＮ−末端に挿入する。ＭＡＮ残基はアミノ酸メチオニン、アラ ニンおよびアスパラギンをそれぞれ示す。アンチセンスプライマー；ＧＶＨrev ：５'ＣＣＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＴＡＧ ＣＡＣＣ３'(配列番号１１)は停止コドンの後にＨindIIIおよびＰstＩ部位を挿 入する。両方のプライマーは、制限消化を容易にするためにその５'末端に４ヌ クレオチド“クランプ”を含む。 バージフェリンをコードするＤＮＡ配列は、ｗＣＲＷ腸から前記のように単離 したＲＮＡのＰＣＲ技術を使用して、ＳＱＴおよびＧＶＨrevプライマーを使用 して増幅する。これらのプライマーはメチオニン開始コドンおよび好適な制限部 位を挿入する。得られるＰＣＲ産物を精製し、pＴＢlue(Ｒ)にライゲートし、ス クリーニングおよび配列決定を前記のように行う。 ＤＮＡ配列はクローンの集団中に３つの多形現象を明らかにする；アミノ酸６ ４位でプロリンまたはロイシン；７３位でバリンまたはロイシン；および７５位 でプロリンまたはアルギニン。７３位および７５位について、一つのクローン、 Ｖ７−３のみがロイシンおよびアルギニンをそれぞれ有する。バリンからロイシ ンの塩基転移は２つの塩基変化を必要とし、プロリンからロイシンの塩基転移は ２つの塩基変化を必要とする(ＣＣＡからＴＴＡ)。２つの多形クローン、Ｖ７− ３およびＶ７−９は特徴付され、更に細菌および植物発現構築物に発達する。こ れらの多形現象の要約を表１に示す。 上記の、Ｎ−末端ＭＡＮ残基を伴うバージフェリンをコードするpＴ７Ｂlue( Ｒ)構築物を制限酵素ＥcoＲＩおよびＨindIIIで消化する。バージフェリンをコ ードするＤＮＡフラグメントを精製し、エシェリキア・コリ発現ベクターｐＥＴ −２０b(＋)(Ｎovagen)にライゲートし、このようにＭＡＮ−バージフェリンを コードするＤＮＡ配列を、枠内でエシェリキア・コリpelＢ先導配列をコードす るＤＮＡ配列と融合する。形質転換培養物を先述のＰＣＲ法を使用してスクリー ニングする。ＰＣＲ陽性クローンのＤＮＡ配列分析は、pelＢ先導とＭＡＮ−バ ージフェリンの枠内融合を確認する。この構築物をプラスミドｐＥＶ４と命名し 、 図３に記載する。 ｐＥＶ４をエシェリキア・コリ株ＢＬ２１(ＤＥ３)を形質転換するのに使用す る。新たに形質転換したコロニーを液体培地に移し、Ｄubendorf，Ｊ.Ｗ.および Ｓtudier，Ｆ.Ｗ.，(1991)，Ｊ．Ｍol．Ｂiol.，219:45-59およびＳtudier，Ｆ. Ｗ.，(1991)，Ｊ．Ｍol．Ｂiol.，219:37-44に記載のように培養する。培養物の アリコートを誘導の時および誘導後３０分、６０分、２時間および４時間の間隔 で除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。１０−１２kＤaタンパク質の豊富な発 現が誘導後２時間またはそれ以降に取ったサンプルで明白である。実施例６：組換えバージフェリンの精製 製造目的のために、最適な収率の誘導後に、細菌培養５００mlを４時間、３７ Ｃでインキュベートする。培養物を回収し、低張ショックを与え、外側細胞壁を 融解する。Ｌin，Ｋ.およびＣheng，Ｓ.(1991)ＢioＴechniques 11:748-752参照 。スフェロプラストを周辺質タンパク質−豊富フラクションから遠心により分離 する。周辺質フラクションは殆ど純粋なＭＡＮ−バージフェリンを含み、それは ４℃で４週間まで安定である。ある場合、このＭＡＮ−バージフェリンの粗生産 物を、タンパク質分解阻害活性について試験する。 ＭＡＮ−バージフェリンのクロマトグラフィー精製のために、１Ｍトリス−Ｈ Ｃｌ(８.０)を周辺質フラクションに加え、最終濃度５０mＭトリス−ＨＣｌ(８. ０)にする。上清を、ＤＥＡＥ Ｓepharose Ｆast Ｆlow(Ｐharmacia)カラムに、 ５０mＭトリス−ＨＣｌ(８.０)、流速３ml／分でかける。タンパク質は、同緩衝 液中の０mＭから３５０mＭ ＮａＣｌ直線勾配で溶出する。カラムフラクション をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。ＭＡＮ−バージフェリンは、ＤＥＡＥカラムか ら、相対的に高いＮａＣｌ濃度で単一ピークで溶出する。バージフェリン含有Ｄ ＥＡＥカラムフラクションを溜め、５０mＭリン酸、１５０mＭ ＮａＣｌ(ｐＨ ７.０)に対して配管したＳpectrapor＃１(ＭＷ分離＝６−８kＤa)に、２時間透 析する。タンパク質を超濾過により濃縮し、Ｓuperose１２(Ｐharmacia)ゲル濾 過カラムにかける。Ｓuperoseカラムを５０mＭリン酸、１５０mＭ ＮａＣｌ緩 衝液、流速０.３ml／分で展開する。SuperoseフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ 分析は、ＭＡＮ−バージフェリンが少ない不純物から分離していることを確認す る。純粋ＭＡＮ−バージフェリン含有Ｓuperoseフラクションのタンパク質濃度 をＢradford検定により測定し、フラクションを直接ｗＣＲＷ腸プロテアーゼに 対する阻害を試験する。 抗体がエシェリキア・コリバージフェリンタンパク質から産生され、高品質で ウェスタン・ブロット分析で有効であることが示される。実施例７：バージフェリンのタンパク質分解阻害活性 脂肪体のない中腸をｗＣＲＷ第３齢幼虫(Ｆrench Ａgricultural Ｒesearch) から内蔵除去により切開する。次いで、ｗＣＲＷ中腸を１００mＭ ＭＥＳ(ｐＨ ６.３)に懸濁する(１腸／μl)。氷上での６０分のインキュベーションに続き、 組織を遠心(１３Ｋrpm、８分)によりペレット化し、上清を分析のために回収す る。このフラクションは、ｐＨ５.０からｐＨ８.０の広い範囲で有効なチオール プロテアーゼ活性を含む。 すべての調製物の酵素活性をアゾカゼインに対して、Ｍason，Ｒ.Ｗ.，Ｇal， Ｓ.およびＧottsman，Ｍ.Ｍ.(1987)Ｂiochem．Ｊ．248:449-454に記載のように 測定する。すべての酵素調製物の活性部位力価測定は、タンパク質分解基質とし てアゾカゼインを使用して行う。すべての検定を３７℃、６０分で行う。力価測 定曲線は、チオールプロテアーゼ阻害剤非存在における各酵素調製物の完全活性 に対して標準化する。酵素阻害は非可逆的チオールプロテアーゼ阻害剤Ｅ−６４ またはＭＡＮ−バージフェリンの計画した量の存在下で同じ条件下での完全タン パク質分解活性の割合として報告する。ｗＣＲＷ腸プロテアーゼの典型的活性部 位力価測定は図２に示す。繰り返して、力価測定曲線はｗＣＲＷ腸プロテアーゼ の有効な阻害を示唆するＭＡＮ−バージフェリンで得る。実施例８：メイズ組織の形質転換および再生 授粉９から１２日後のトウモロコシの実、Ｈi Ｔype IIを胚乳単離のために収 穫し、滅菌し滅菌水ですすぐ。胚乳を無菌的に穀粒から除去する(Ｒhodes，Ｃ． Ａ．et al.，(1988)Ｂio/Ｔech．6:56-60)。１０から５０の胚乳を固体Ｎ６ap１ Ｄ培地に移し、暗所で２７℃、０から５日間貯蔵する。 胚乳を、０.５Ｍマンニトールを添加した固体Ｎ６ap１Ｄ培地含有ペトリ皿に 移す。移動後４時間後、胚乳を粒子爆撃ＤＮＡ運搬または懸濁液の最終量が９０ ０μlになるようにエタノール(１００％)を粒子に加える以外、標準Ｓtanfordプ ロトコールを使用したＢiolistic ＰＤＳ-1000/Ｈe Ｐarticle Ｄelivery Ｓyst emで“撃つ”。 このメイズ組織の形質転換に使用するプラスミドをコードするバージフェリン は図４および図５に記載し、ｐＺＯ１７３１およびｐＺＯ１７３２に対応する。 ｐＺＯ１７３１はバージフェリンコード配列、３５ｓ ＣａＭＶプロモーター、 イントロンVIおよびocs停止配列を含む。ｐＺＯ１７３２はバージフェリンコー ド配列に加えて、信号先導ＰＲＭＳを含む。各バージフェリンコードプラスミド は、図６に記載のプラスミドｐＺＯ１５２２と同時に運搬される。ｐＺＯ１５２ ２は、その発現が形質転換組織にベスタ耐性を付与するストレプトマイセス・ヒ グロスコピクス(Ｓtreptomyces hygroscopicus)ホスホイノスリシンアセチルト ランスフェラーゼ(ＰＡＴ)遺伝子をコードする(Ｔhompson Ｃ.Ｊ．et al.，(198 7)ＥＭＢＯ Ｊ．6:2519-2523)。共通名グルフォシネート−アンモニウムである ベスタは、グルタミンシンターゼを阻害するホスホイノスリシン含有化学除草剤 である。粒子運搬のための共シューティングまたは混合プラスミドＤＮＡは当分 野で既知であり、記載されている(Ｇordon-Ｋamm et al.，1990，Ｐlant Ｃell 2:603-681)。ＤＮＡ被覆タングステン粒子およびエタノール含有最終量は、胚乳 に運搬される前は９００μＬである。 粒子運搬に続いて、胚乳を０.５Ｍマンニトール添加Ｎ６ap１Ｄ培地に約１６ 時間保持し、次いで選択試薬無しの新鮮Ｎ６ap１Ｄ培地に０から５日間移す。最 後に、胚乳を、１３から２４μg／Ｌベスタ添加固体Ｎ６１Ｄ培地に移す。移植 を新鮮選択培地に２週間毎または必要に応じて行う。 形質転換６０日後、ベスタ含有Ｎ６１Ｄ培地上で成育を続けているカルスおよ び胚乳組織を２４mg／Ｌベスタ含有新鮮培地に移す。これらの形質転換組織の少 なくとも約５０μgのサンプルを除去し、ＰＣＲ技術を使用して、粒子爆撃によ り本来運搬されたＤＮＡの存在を分析する。 植物を再生するために、カルスを成長ホルモン無しの固体ＭＳap培地含有ペト リ皿に移し、暗所に２７Ｃ、１５日貯蔵する。これらの条件下で形成される植物 新芽を箱内の新鮮培地に移し、３７Ｃで、１８時間／２４時間の明かりサイクル で貯蔵する。箱に移して１０日後、高さ３インチ以上で根を有する成長した植物 を土壌に移し、成育チャンバーで合計４８時間貯蔵する。相対湿度を約５０％に 調節し、植物を成育チャンバーに１から２週間維持し、次いで５ガロン植木鉢に 移植し、１８時間／２４時間の明かりサイクルの温室に維持する。繁殖力のある 形質転換植物を対照花粉と授粉させ、種を回収する。 バージフェリンの安定性および分離を発芽種子の分析により測定する。この結 果のいくつかを下に示す。各独立形質転換系はＰＣＲ分析によりバージフェリン 遺伝子を有することが示される。 実施例５でバージフェリンに対して製造した抗体を使用して、トランスジェニ ック植物をバージフェリン産生についてスクリーニングする。タンパク質発現は 標準技術に従ったウエスタン・ブロット分析により測定する(Ａntibodies，Ａ Ｌaboratory Ｍannual，1988，ＨarlowおよびＤavid Ｌar編，Ｃold Ｓpring Ｈ abor Laboratory)。ウエスタン分析はタンパク質が形質転換植物の葉および根の 両方で両方の遺伝子構築物を伴って産生されることを示唆する。実施例９：昆虫殺虫試験 ｗＣＲＷ卵(２００−５００)を消毒し、滅菌環境に置き、郷化させる。郷化１ から３日の幼虫をメイズカルスに移す。最初のカルスへの幼虫の暴露から７日後 、殺虫活性を評価する。死亡昆虫数および生存昆虫の大きさを記録する。実施例１０：人工餌生物検定 新生ｗＣＲＷ幼虫に、サザン・コーン・ルートウォームに使用される人工餌Ｂ ioＳerveを食べさせる。この餌は下記表３に示す処理が加えられる。２から３匹 の幼虫を処理ウェルに置き、処理当たり９ウェルである。幼虫に餌を食べさせ、 致死率を６日目に評価する。検定の結果を下に示す。 バージフェリンの効果がタンパク質の直接の摂取によるものであり、非餌反応 でないことを確認するため、商業的に入手可能な緑色色素の餌色素を餌に加えた 。結果は、色素は容易に取り込まれ、昆虫表皮を通して消化により観察されるこ とを示す。実施例１１：バージフェリンのカロソバーチェス・マクラトゥス(Callosobruche s maculatus)(カウピー・ウィービル)に対する効果 バージフェリンの用量反応分析を、種子を食べるカウピー・ウィービルである カロソバーチェス・マクラトゥスに対して行った。人工種子生物検定系および超 音波検出器をＳhade，Ｒ.Ｅ．et al.(1986)，Ｅnviron．Ｅntomol．15:1286-129 1に記載のように使用し、カウピー・ウィービルの正常食餌パターンの分散を食 事の平均の差により測定する。結果は下記表４に示す。 結果は、食事の平均数の減少が観察され、この最初の分析はバージフェリンが カウピー・ウィービルに対して活性であることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｋ 14/81 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/81 Ｃ１２Ｎ 1/21 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 9152−4Ｂ 9/99 9/99 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 デルカ−フラハーティ，カミーレ・レニー アメリカ合衆国94306カリフォルニア州 パロ・アルト、パーク・ブールバード4159 番 (72)発明者 スカラフィア，リリアナ・エステラ・クリ スティナ アメリカ合衆国94040カリフォルニア州 マウンテン・ビュー、バーシティ・コート 1031番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号１のアミノ酸１位から始まり８３位で終わるアミノ酸配列を有す るペプチドであるチオールプロテアーゼの阻害ペプチド−バージフェリンと命名 −、またはバージフェリンと実質的に類似のアミノ酸配列を有する修飾バージフ ェリンペプチド；バージフェリンの切断体；およびバージフェリンと実質的に類 似のアミノ酸配列を有するペプチドの切断体（ここで、修飾バージフェリンはバ ージフェリンプロテアーゼ阻害剤と機能的に同等である）。 ２．配列番号１に記載の完全アミノ酸配列を有することを特徴とするプレバー ジフェリンペプチドまたはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチド 。 ３．パパイン型プロテアーゼに対する結合親和性を有するＳＤＳ ＰＡＧＥで 分子量約１０−１５kＤaであることを特徴とする、均質プロテアーゼ阻害ペプチ ド。 ４．請求項１−３のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸配列を含む組 換えＤＮＡ分子。 ５．組換え分子がベクターであることを特徴とする、請求項４記載の組換え分 子。 ６．請求項４記載の組換え分子の発現に由来するタンパク質。 ７．請求項１記載のペプチドをコードする配列を含む核酸配列、または請求項 １記載のペプチドをコードする核酸配列とストリンジェントなハイブリダイゼー ション条件下でハイブリダイズする核酸配列のものと相補的な核酸配列。 ８．請求項１−３のいずれかに記載のペプチドをコードする異種遺伝子を含む トランスジェニック植物。 ９．ａ）請求項５記載の組換え分子を更に含む異種遺伝子を植物細胞ゲノムに 挿入する； ｂ）形質転換細胞を得る；および ｃ）形質転換細胞から、害虫による損傷が受け難くなった性質を有する遺伝子形 質転換植物を再生する ことを含む、害虫による損傷が受け難くなった性質を有する遺伝子形質転換植物 の製造法。 １０．遺伝子形質転換の結果、植物または植物転移増殖微生物で発現するペプ チドである請求項１−３のいずれかに記載のペプチドの殺虫有効量に害虫をさら すことを含む、害虫を駆除する方法。 １１．請求項１記載のペプチドの殺虫有効量および農学的に許容可能な担体を 含む、殺虫組成物。