CZ300639B6 - Zpusob ochrany rostliny nebo cásti rostliny proti hmyzu a nematodám, transgenní rostlina a hostitelská bunka - Google Patents

Abstract

Zpusob ochrany rostliny nebo cásti rostliny proti hromadnému hmyzímu nebo cervovému napadení jedním nebo více druhy hmyzu nebo nematod, jež mají trávicí cysteinové proteázy, podle kterého se na rostlinu aplikuje zemedelský ochranný prostredek obsahující inhibicní množství inhibitoru cysteinové proteázy, což je protein ekvistatin se SEKV ID C: 2. Transgenní rostlina a její pohlavní potomstvo rezistentní k napadení jedním nebo více druhy hmyzu nebo nematod, jež mají trávicí cysteinové proteázy, která exprimuje množství bílkoviny se SEKV ID C: 2 kontrolující hmyz nebo nematody. Biologicky funkcní vektor exprese, který obsahuje promotor úcinný v rízení pod ním zarazené kódující sekvence v rostlinných bunkách, DNA kódující oblast, jež kóduje bílkovinu se SEKV ID C: 2 a terminacní sekvenci úcinnou pro terminaci transkripce nebo translace produktu genetické konstrukce v rostlinných bunkách, pricemž genetická konstrukce je úcinná v expresi hmyz kontrolujících množství bílkoviny se SEKV ID C: 2.

Description

Způsob ochrany rostliny nebo části rostliny proti hmyzu a nematodám, transgenní rostlina a hostitelská buňka

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobů ochrany rostliny nebo části řečené rostliny proti hromadnému napadení jedním nebo více druhy hmyzu nebo nematod, jež mají trávicí cysteinové nebo aspartátové proteázy, přičemž způsob zahrnuje aplikaci inhibičního množství inhibitoru cysteinové a/nebo aspartátové proteázy na lokus, kde má být hmyz nebo nematoda kontrolován.

Dosavadní stav techniky

Mnohé druhy zeleniny, zahradních a polních plodin jsou napadány hmyzími škůdci. Většina rostlin vykazuje nějakou odolnost vůči určitým druhům hmyzu nebo nematod. Odolnost může být fyzikální nebo chemická. Například: Vlasy na listech mnoha rostlin mohou zastavit drobný hmyz v přibližování k povrchu, jež by dostačovalo kjeho požírání. V jiných případech rostliny používají řadu složitých molekul k tomu, aby jejich tkáně byly nepřitažlivé nebo jedovaté. Ke kontrole takovéhoto fytofágního hmyzu nebo nematod se částečně přistupovalo pomocí tradičních kultivačních nebo Šlechticích metod. Účinnou cestou ke snižování takovýchto ztrát je používání takových kultivarů plodin, které mají geny pro odolnost vůči škůdcům (viz Painter (1951), Insect Resistance in Crop Plants, Macmillan: New York). Šlechtitelé rostlin se snažili snižovat ztráty způsobované napadením hmyzem nebo nematodami vnesením genů rezistence do jejich variet pomocí konvenčních šlechtitelských programů.

Klasické přístupy k hostitelské rostlinné rezistenci jsou spíše empirické, ale mají v některých případech znamenitý úspěch. Jakmile jsou objeveny „znaky“ rezistence, přenesou se selekčními postupy do zemědělsky přijatelných linií. Jedním omezením tohoto klasického přistupuje, že tento přenos genů pro rezistenci je omezen na druhy, jež lze křížit. Navíc mohou být tyto typy rezistence pod kontrolou mnoha genů, a proto je pro rostlinného šlechtitele obtížné je využívat. Odolné variety často vykazovaly pokles výnosu a nebyly schopné ekonomického přežití. Navíc není možné klasickým šlechtěním zlepšovat rezistenci k hmyzím škůdcům tehdy, když nelze identifikovat rezistenci v rámci druhu nebo příbuzných druhů.

Kontrola hmyzu a nematod se významně spoléhala na chemické pesticidy. Tato činidla jsou typicky aplikována nebo pokládána na půdu, nebo na rostlinné listoví nebo do staničních pastí. Navzdory dostupnosti velké řady chemických pesticidů, fytofágní hmyz a parazitní nematody rostlin zůstávají vážným problémem. Mnohé chemické pesticidy mají nevýhodu v tom, že vyžadují opakované aplikace. Velkým problémem při používání mnohých pesticidů je schopnost hmyzu stávat se rezistentním k aplikovanému činidlu. Tento fenomén nastává prostřednictvím selekce nej rezistentnějších členů hmyzí populace při opakované aplikaci daného činidla. Navíc tyto chemikálie poškozují životní prostředí a znečišťují povrchovou vodu. Proto existuje potřeba nových činidel ke kontrole hmyzu, obzvláště činidel, jež mají charakter působení jiný než konvenční insekticidy a nematicidy.

Jako alternativa k syntetickým sloučeninám byla izolována a vyvinuta jako pesticidy některá přirozeně se vyskytující činidla. Ta zahrnují rostlinné a mikrobiální sekundární metabolity a bílkoviny, a přirozené predátory nebo patogeny hmyzu a nematod (včetně jiného hmyzu, hub, bakterií a virů). Navíc, jak postupovala technologie rekombinantní DNA, bylo možné přenášet geny z donorového organismu do recipientního organismu, což vedlo k novému fenotypu recipienta. V případě transgenních rostlin může tímto fenotypem být rezistence k poškození hmyzem nebo k infekci nematodami, pokud vnesený gen kóduje polypeptid, jehož účinek vede k zasažení škůdce. V důsledku toho má velký význam a užitečnost nalézat polypeptidy s takovýmto účinkem. Geny pro tyto polypeptidy lze použít k modifikaci organismů, obzvlášť rostlin a mikrobů,

- 1 CZ 300639 B6 tak aby negativně působily na růst a vývoj hmyzích škůdců. Byla popsána řada takovýchto polypeptidů zBacillus thuringiensis, různé bílkovinné inhibitory proteáz a amylas a různé rostlinné lektiny.

Jedním fyziologickým systémem hmyzu a nematod, o němž je známo, že podléhá rozbití specifickými inhibitory, je působení trávicích proteáz. Trávicí proteázy hydrolyzují pozřené bílkoviny a polypeptidy štěpením peptidových vazeb. Výraz „proteáza“ je konkrétně zamýšlen k označení endopeptidas a exopeptidas čtyř hlavních katalytických tříd: serinových proteáz, cysteinových proteáz, aspartátových proteáz a metaloproteáz (viz Laskowski et al. (1983), Ann, Rev. Biochem., 49: 593-626). Třída, k níž konkrétní proteáza patří, může být určena pomocí rozsahu pH, v němž je aktivní, schopnosti štěpit specifické bílkoviny, podobnosti s jinými, dobře charakterizovanými proteázami a citlivosti k různým inhibitorům.

Různé typy trávicích enzymů hmyzu a nematod uvolňují z bílkovin obsažených v dietě peptidy a aminokyseliny. Jednou třídou trávicích enzymů jsou cysteinové proteázy. Výraz „cysteinová proteáza“ je zamýšlen k popisu proteázy, jež má v katalytickém centru enzymu vysoce reaktivní thiolovou skupinu cysteinového zbytku. Existují důkazy, že mnohý fytofágní hmyz a parazitní nematody rostlin se spoléhají, přinejmenším částečně, na cysteinové proteázy prostředního střeva pro trávení bílkovin. Sem spadají, ale bez omezení, ploštice (Hemiptera), obzvláště ploštice Anasa tristis, Acrosternum hilare, Riportus clavatus, a téměř všichni brouci (Coleoptera) dosud zkoumaní, obzvláště mandelinka bramborová (Leptinotarsa decemlineata), kohoutek (Lema trilineata), chřestovníček obecný (Crioceris asparagi), brouk Epilachna varivestis, potemník (Tribolum castaneum), potemník skladištní (Tribolum confusum), dřepčíci (Chaetocnema spp., Haltica spp. a Epitrix spp.), Diabrotica spp., zrnokaz (Callosobruchus maculatus), květopas (Anthonomus grandis), nosatci (Sitophylus oryza, Sitophylus zeamais, Sitophylus granarius, Hyper postica), zrnokaz (Acantoscelides obtectus), Rhyzoptera dominica, potemník moučný (Tenbrio molitor), třásněnky, obzvláště třásněnka západní Frankliniella occidentalis), dvoukřídlí, obzvláště vrtalkovití (Agromyzidae species), květomilka (Liriomyza trifolii), rostlinné parazitní nematody, obzvláště červi Globodera spp., Heterodera schachtii a Meloidogyne spp.

Jinou třídou trávicích enzymů jsou aspartátové proteázy. Výraz „aspartátová proteáza“ je zamýšlen k popisu proteázy, jež má v katalytickém místě enzymu dva vysoce reaktivní zbytky kyseliny asparagové a jejíž nejčastější charakteristikou je specifická inhibice pepstatinem, nízkomolekulámím inhibitorem téměř všech známých aspartátových proteáz. Existují důkazy, že mnohý fytofágní hmyz a parazitní nematody rostlin se částečně spoléhá na aspartátové proteázy prostředního střeva pro trávení bílkovin, velmi často ve spojení s cysteinovými proteázami. Sem spadají, ale bez omezení, Hemiptera, obzvláště Rhodnius prolixus a štěnice (Cimex spp.), a členové čeledí Phymatidae, Pentatomidae (knčžovcovítí), Lygacidae (ploštičkovití) a Belostomidae, Coleoptera (brouci) čeledí Meloidae (majkovití) Chrysomelídae (mandel inkovítí), Coccinelidae (slunéčkovití) a Bruchidae (zrnokazovití), všichni náležející k řadě Cucujiformia, obzvláště mandelinka bramborová (Leptinotarsa decemlineata), kohoutek (Lema trilineata), Diabrotica undecimpunctata, D. virgifera, květopas (Anthonomus grandis), ploštice Anasa tristis, brouci phyllotreta crucifera, Callosobruchus maculatus, Epilachna varivestis, Ontodonta horni, Epicaute pestifera a potemník Tribolium castaneum, Dvoukřídlí, obzvláště moucha domácí (Musea domestica) (Terra a Ferreira (1994) Comp. Biochem. PhysioL 109B: 1—62, Wolfson a Murdock (1990) J. Chem. Ecol. 16: 1 089-1 102).

Sloučeniny, které tvoří komplexy s proteázami a inhibují jejich protcolytickou aktivitu jsou v přírodě široce rozšířené. Je známa řada proteázových inhibitorů o „nízké molekulové hmotnosti“, většinou syntetického, ne přirozeného, původu. Určitý počet přirozeně se vyskytujících inhibitorů o nízké molekulové hmotnosti byl izolován z bakteriálních nebo houbových zdrojů a charakterizován. Jato skupina zahrnuje takové inhibitory, jako jsou E64 (N-(L-3-transkarboxypyran-22-karbamoyl)-L-leucyl-amido-4-guanidobutan), leupeptiny, činidla proti bolestem a pepstatiny.

-2 CZ 300639 B6

Z rostlinných druhů bylo izolováno několik bílkovinných inhibitorů proteáz. Patří mezi obranné chemické látky rostlinných tkání, jež jsou jak vývojově regulovány, tak indukovány v odezvě na napadení hmyzem a patogeny. V rostlinách byly nalezeny inhibitory serinových, cysteinových, aspartátových proteáz a metal oproteáz, obzvláště v zásobních orgánech, jako jsou hlízy a semena.

Nej běžnější a nej šíře studovanou skupinou rostlinných proteázových inhibitorů jsou ty, které inhibují zvířecí serinové proteázy, jež zahrnují trypsin a chymotrypsin (viz Ryan (1990) Annu. Rev. Phytopathol. 28: 425—449).

Bílkovinné inhibitory cysteinových proteáz snižují nebo eliminují katalytickou aktivitu cystě iio nové proteázy. Optimum pH cysteinových proteáz je obvykle v rozmezí 3,5 až 7, což je rozsah pH v lumenu prostředního střeva hmyzu, jenž používá cysteinové proteázy. Mezi inhibitory cysteinových proteáz převažuje cystatinová rodina, jež se dále dělí na čtyři pod-rodinv s ohledem na molekulovou hmotnost, počet disulfidových vazeb, subcelulámí lokalizaci, a charakteristiky primární struktury. Tento klasifikační systém je založen hlavně na informacích, jež se týkají obratlověích a rostlinných cystatinů. Cystatiny byly testovány jak in vitro, tak in vivo proti hmyzu a nematodám.

Příkladů jiných bílkovinných inhibitorů cysteinových proteáz existuje dnes velmi málo. Z brambor je známa jedna další rodina inhibitorů cysteinových proteáz, jež patří k rodině rostlinných

Kunitzových inhibitorů a jež rovněž zahrnuje inhibitory aspartátových proteáz (Strukelj (1992) Biol. Chem. Hope-Seyler 373: 477^82; Krizaj etal. (1993) FEBS Letters333: 15-22). Tento inhibitor, Kunitz PCPI8.3 je pevně se vážícím inhibitorem kathepsinu L (Ki = 0,07 nM) a dobrým inhibitorem papainu (Ki = 3,3 nM). Úplně nový typ inhibitoru sulfhydrylových proteáz byl izolován z Diabrotica virgifera (světový patent WO 95/24479). Tento inhibitor nemá žádnou struktur25 ní podobnost s jinými inhibitory cysteinových proteáz.

Nedávno se objevila nová třída inhibitorů cysteinových proteáz. Tyto bílkoviny mají společný rys opakované thyrog lobu li nové domény typu I (Malthiery a Lissitzky (1987) Eur. J. Biochem. 165: 491 -498). Z lidí byl izolován invariantní řetězec odvozený od p41 spojeného s lidským MHC třídy II (Ogrinc etal. (1993) FEBS Letters336: 555-559, Bevec etal. (1996) J. Exp. Med. 183:

331-1 338). Je pevně se vážícím inhibitorem kathepsinu L (Ki = 0,0017 nM) a dobrým inhibitorem papainu (Ki = 1,4 nM). Podobný inhibitor cysteinových proteáz s opakující se thyroglobulinovou doménou typu I byl izolován z lososích vajíček (Yamashita a Konagaya (1996) J. Biol. Chem. 271: 1 282-1 284). Konečně: Z mořského měkkýše Actinia equina byl izolován podobný inhibitor cysteinových proteáz, označený jako ekvistatin, s třemi opakujícími se thyroglobulínovými doménami typu I (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13899, Lenarcic et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 12682).

Kromě lidského invariantního řetězce, ECI (vaječného inhibitoru cysteinových proteáz) a ekvis40 tatinu mají domény homologické k opakujícím se thyroglobulinovým doménám typu I též části jiných bílkovin, včetně bílkovin jako jsou potkaní invariantní řetězec (McKnight etal., (1989) Nucleic Acids Res. 17: 3 983-3 984), saxifilin (Morabito a Moczydlowski (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 2 478-2 482), nidogen (Mann etal., (1989) EMBO J. 8: 65-72), epiteliální glykoprotein (Simon etal. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2755-2759), IGF-vážící protein-3 (Brewer etal. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 152: 1287-1289), testican (Alliel et al., Eur. J. Biochem. 214: 347-350) a entactin (Durkin et al. (1988) J. Cello Biol. 107:

749-2 756) (Obr. 3). Pro entactin a thyroglobulin bylo publikováno, že neinhibují cysteinové proteázy (Yamashita a Konagaya (1996) J. Biol. Chem. 271: 1282-1284). Tyto bílkoviny obsahují dané konzervované sekvence a důvod proč neinhibují je temný.

Bílkovinné inhibitory aspartátových proteáz snižují nebo eliminují katalytickou aktivitu aspartátové proteázy. Optimum pH aspartátových proteáz je obvykle v rozmezí 2 až 5, což je pH rozmezí v těch částech střeva, kde jsou aspartátové proteázy aktivní. Je známo velmi málo bílkovinných inhibitorů aspartátových proteáz. Jedna dobře charakterizovaná rodina inhibitorů kathepsi55 nů D se nachází v bramborách a příbuzných Solanceae (Strukelj etal. (1992) Biol, Chem.

-3CZ 300639 B6

Hoppe-Seyler 373: 477-482). Nebyly publikovány žádné in vitro enzymatické testy nebo in vivo biotesty o použití bramborových inhibitorů aspartátových proteáz proti hmyzu nebo nematodám.

Australská patentová přihláška č. 36568/89 zveřejňuje, že zvířecí cystatiny (jako jsou cystatin slepicího vaječného bílku a kininogeny) a nízkomolekulámí nepeptidové inhibitory cysteinových proteáz (jako jsou E-64, antipaín a leupeptin) mohou být účinné v kontrole řady brouků, kteří používají cysteinové proteázy k trávení.

WO 92/21753 zveřejňuje, že multicystatin, 8 doménový cystatin z brambor, je účinnější než jiné cystatiny při kontrole různého hmyzu, jenž používá cysteinové proteázy k trávení ve středním střevě, protože je odolnější k proteolýze karboxypeptidasami.

WO 96/16173 zveřejňuje, že modifikované cystatiny mohou ochraňovat rostliny proti nematodám.

WO 95/24479 zveřejňuje, že nový inhibitor thiolových proteáz, izolovaný z kukuřičného červa a nazvaný virgiferin může ochraňovat rostliny proti hmyzu a nematodám, jež mají thiolové proteázy jako trávicí enzymy.

Důkazy pro tyto nároky byly publikovány též ve vědecké literatuře pro různý coleopterní ahemipterní hmyz, jakož i pro nematody (Chen etal. (1992) Protein Express. Purifícation 3: 41-49, Edmonds etal. (1996) Entomol. Exp. Appl. 78: 83-94, Elden (1995) J. Econ. Entomol. 88: 1586-1590, Orr etal. (1994) J. Insect Physiol. 40: 893-900, Kurod etal. (1996) Biosci. Biotech. Biochem. 60: 209-212, Leplé et al. (1995) Molecular Breeding 1: 319-328, Urwin et al. (1995) Plant. J. 8: 121-131). Ve vysokých koncentracích cystatiny způsobovaly mortalitu nebo snižovaly fertilitu a růst některých druhů hmyzu a nematod (Tabulka 1). Avšak: Koncentrace inhibitorů cysteinových proteáz potřebné k dosažení agronom íčky zajímavých hladin ochrany v umělých dietách (200 - 2000 μΜ, viz Tabulku 1) jsou ve většině případů mnohem vyšší než lze dosáhnout v transgenních rostlinách (10 — 40 μΜ, viz Tabulku 1) a rovněž mnohem vyšší než aktuální koncentrace proteáz, u nichž se očekává inhibice (10 — 30 μΜ). Vysoké koncentrace jsou potřebné nej pravděpodobněji proto, že se neváží dostatečně pevně k různým molekulárním formám cysteinových proteáz přítomných ve střevě. Slabé inhibitory mohou stále inhibovat proteázy, když jsou přítomné ve velkém nadbytku k proteáze. Odhaduje se, že ve střevě je aktivních něco mezi 10 a 30 různými proteolytickými enzymy a že může být aktivně indukována transkripce proteáz, jež nejsou inhibovány, jako kompensace inhibice jiných proteáz (Jongsma etal. (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 8 041-8 045, Bolter a Jongsma (1995) J. Inscct Physiol. 41: 1 071-1 078). Druhým důvodem chybějící toxicity může být nestálost v prostředí střeva a degradace proteázami, jež nejsou inhibovány.

Pouhá skutečnost, že proteázový inhibitor je inhibitorem cysteinových nebo aspartátových proteáz tedy nutně neznamená, že bude účinný in vitro proti hmyzu, jenž používá tyto proteázy k trávení (viz též WO 92/21753). Obecně lze říci, že je vzácné, když jednotlivý inhibitor inhibuje plně celé spektrum aktivit cysteinových nebo aspartátových proteáz ve střevě hmyzu nebo nematod v normálních koncentracích, jichž lze v rostlinách dosahovat (10-40 μΜ). Inhibitory, které současně inhibují jak cysteinové, tak aspartátové proteázy určitého hmyzu nebyly nikdy dříve popsány, i když jejich užitečnost je zřejmá, protože mnohý hmyz se u trávení spoléhá na kombinaci těchto dvou tříd proteolytických enzymů. Mnohý hmyz uváděný v Tabulce 1 se spoléhá na oba typy proteáz a skutečnost, že tyto inhibitory jsou často nedostatečně toxické pro hmyz je pravděpodobně způsobována skutečností, že aspartátové proteázy zůstávají volné pro trávení bílkovin potravy a inhibitorů cysteinových proteáz.

-4 CZ 300639 B6

Tabulka 1. Inhibitory cysteinových proteáz, jež ovlivňují životní parametry hmyzu při podávání v potravě nebo pří expresi v transgenních hostitelských rostlinách

Hmyzí druh	PI-hladina v potravě/ rostlině (μΜ)	Účinek	Odkaz
Umělá potrava doplněná cystatiny
Tríbolium castaneum (Col.)	10 000	35 % WR	Chen et al., 1992
Hepera posti ca (Cul.)	200	RF	Elden 1995
Diabrotica undecímpunctata (Col.)	100-200	40-70 % M	Edmonds et al., 1996
Diabrotica undecímpunctata (Col.)	125 pg/cm2	50 % WR	Orr et al., 1994
Diabrotica virgifera (Col.)	125 pg/cm2	50 % WR	Orr et al. , 1994
Callosobruchus chinensis (Col.)	100 - 2 000	10-100 % M	Kuroda et al., 1996
Riptorus clavatus (Hem.)	100 - 2 000	0-100 % M	Kuroda et al., 1996
Transgenní rostliny exprimující cystatiny
Globodera pallida (Nemát.)	10 (rajče)	Prázdné cysty	Urwin et al. , 1995
Chrysomela tremulae (Col.)	40 (poplar)	40 % M	Leple et al., 1995

WR = redukce hmotnosti, RF = snížená fertilita, M = snížená mortalita.

Existuje dřívější literatura, která předvádí, že některé druhy hmyzu, jako mandě linka bramborová, jsou obzvláště necitlivé k proteázovým inhibitorům, i když jsou izolované z úplně nepříbuzných zdrojů, jako z rýže nebo člověka (Michaud et al. (1995) Insect Biochem. Mol. Biol. 25: 1041-1048, Michaud etal. (1996) Archives of Insects Biochemistry and Physiology 31: 451— io 464, Michaud etal. (1993) FEBS Letters 331: 173-176). Některé ztěchto proteázových inhibitorů byly při testování proti jinému hmyzu shledány dosti účinnými (Leplé et al. (1995) Molecular Breeding 1: 319—328). Ll mandelinky bramborové však bylo zjištěno, že tyto inhibitory jsou bud’ příliš specifické pro pouze jeden typ proteázové aktivity nebo že jsou rozkládány aspartátovými proteázami.

Strukturní požadavky pro vyšší účinnost inhibitorů cysteinových nebo aspartátových proteáz k střevním proteázám hmyzu nebo nematod jsou úplně neznámé. Rostliny, obzvláště příbuzné hostitelské rostlině, jsou špatným zdrojem účinných inhibitorů, protože hmyz proti nim vyvinul proteázy necitlivé k inhibitorům proteáz. Inhibitory cysteinových proteáz ze zdrojů jiných než rostliny je možné testovat, ale dosud nebyly popsány žádné bílkovinné inhibitory aspartátových proteáz jiné než ze Solanaceae. Nejvíce žádoucí typ proteázových inhibitorů ke kontrole škodlivého hmyzu, používajícího cysteinové nebo aspartátové proteázy k trávení, aby současně inhiboval víc než 90 % obou aktivitu hmyzu, jenž se živí na hostitelské rostlině, tak, aby byl specificky zaměřen na proteázy necitlivé k proteázovým inhibitorům hostitelské rostliny. V oboru nejsou takovéto inhibitory známé.

-5CZ 300639 B6

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že inhibitor cysteinové proteázy, vybraný ze skupiny bílkovin, jež obsahují přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, je účinný in vivo proti hmyzu nebo nematodám používajícím cysteinové proteázy a překvapivě bylo zjištěno, že řečený inhibitor je obzvláště aktivní k hmyzím cysteinovým proteázám, jež jsou necitlivé vůči inhibitorům cysteinových proteáz, odvozených z hostitelské rostliny. Takováto vlastnost nemá předchůdce u jiných typů inhibitorů cysteinových proteáz, včetně inhibitorů nerostlinného původu. Výsledně je řečený inhibitor vysoce toxický například k larvám mandelinky bramborové.

V jednom ohledu se tento vynález týká způsobu ochrany rostliny nebo části rostliny proti hromadnému hmyzímu nebo červovému napadení jedním nebo více druhy hmyzu nebo nematod, jež mají trávicí cysteinové proteázy, který spočívá v tom, že se aplikuje inhibiční množství inhibitoru cysteinové proteázy, cožje protein se SEKV ID Č: 2.

Nyní bylo dále zjištěno, že některé opakující se thyroglobulinové domény typu 1 mohou být účinné rovněž proti aspartátovým proteázám. Je velmi cenné, že aktivity proti aspartátovým proteázám a cysteinovým proteázám jsou přítomné na podobných strukturních doménách a mohou být kombinovány v jedné bílkovině, jako ekvistatin, protože je vynálezci zjištěno, že působí synergicky úplnější inhibiei všech hmyzích proteázových aktivit.

Ve druhém aspektu se vynález týká vektorů kódujících a schopných exprimovat jednu nebo více opakujících se thyroglobulinových domén typu I v rostlinné buňce.

V souladu s tím vynález poskytuje biologicky funkční vektor exprese, který obsahuje promotor účinný v řízení pod ním zařazené kódující sekvence v rostlinných buňkách, DNA kódující oblast, jež kóduje expresi bílkoviny se SEKV ID Č: 2 v rostlinných buňkách a terminační sekvenci účinnou pro terminaci transkripce nebo translace produktu genetické konstrukce v rostlinných buňkách, přičemž genetická konstrukce je účinná v expresi bílkoviny se SEKV ID Č: 2.

Dále vynález poskytuje způsob přípravy transgenní rostliny proti napadení hmyzem nebo nematody, při kterém se zavede kódující sekvence do genomu dané rostliny, která kóduje bílkovinu, se SEKV IDC: 2, s promotorovou sekvencí aktivní vdané rostlině pro způsobení exprese řečené bílkoviny v hladinách, jež poskytují hmyz nebo nematodu kontrolující množství bílkoviny.

Při tomto způsobu se

a) kultivují buňky nebo tkáně z dané rostliny,

b) zavede sc do buněk nebo tkáně alespoň jedna kopie genu kódujícího bílkovinu se SEKV ID Č: 2

c) regeneruje se rezistentní celá rostlina z kultury buněk nebo tkání.

Ve čtvrtém aspektu se vynález týká hostitelské buňky, transformované biologicky funkčním vektorem exprese, který obsahuje promotor účinný v řízení pod ním zařazené kódující sekvence v rostlinných buňkách, DNA kódující oblast, jež kóduje expresi bílkoviny se SEKV ID Č: 2 v rostlinných buňkách a terminační sekvenci účinnou pro terminaci transkripce nebo translace produktu genetické konstrukce v rostlinných buňkách, přičemž genetická konstrukce je účinná v expresi hmyz kontrolujících množství bílkoviny se SEKV ID Č: 2.

Dále vynález poskytuje transgenní rostlinu a její pohlavní potomstvo rezistentní k napadení jedním nebo více hmyzy nebo nematodami, jež mají trávicí cysteinové proteázy, přičemž řečená transgenní rostlina exprimuje transgenní rostlina exprimuje množství bílkoviny se SEKV ID Č: 2 kontrolující hmyz nebo nematody.

-6CZ 300639 B6

Řada aspektů vynálezu je dále vysvětlena v doprovodných obrázcích, v nichž;

Obrázek 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci a odvozenou aminokyselinovou sekvenci ekvistatino5 vého genu zActinia equina L.

Obrázek 2 ukazuje srovnání všech tří domén cDNA kódovaných aminokyselinových sekvencí ekvistatínu SEKV ID C: 2 a purifikované ekvistatinové bílkoviny zActinia equina L. s aminokyselinovými sekvencemi jiných bílkovin s opakujícími se thyroglobulinovými doménami typu I io se známou a neznámou aktivitou inhibice proteáz.

Obrázek 3 ukazuje in vitro účinky velké řady různých inhibitorů cysteinových proteáz na cysteinové proteázy larev mandelinky bramborové (Leptinotarsa decemlineata), jež jsou necitlivé k endogenním inhibitorům cysteinových proteáz hostitelské rostliny, brambor.

Obrázek 4 ukazuje účinky ekvistatínu na růst a mortalitu larev mandelinky bramborové.

Obrázek 5 ukazuje účinek ekvistatínu v porovnání s jinými inhibitory cysteinových proteáz na in vitro proteolytickou aktivitu třásněnky západní Frankliniella occidentalis.

Obrázek 6 ukazuje účinek ekvistatínu na produkční plodnost samiček třásněnek dva dny po umístění na potravu obsahující inhibitor.

Obrázek 7 ukazuje mapu plasmidu pB3-ekvistatin.

Obrázek 8 ukazuje konstrukci plasmidu pCABl-ekvistatin.

Obrázek 9 ukazuje HPLC analýzy ekvistatínu. Chromatogramy ukazují HPLC eluční profil ekvistatínu po inkubaci s různými enzymy. V panelu A byl ekv i stati n inkubován s kathepsinem D v konečné molární koncentraci 2:1, a v panelu B byl ekvistatin fragmentován s použitím 1 % (hmotn. /hmotn.) β—tiypsinu. Identity vrcholů jsou založeny na N—koncových sekvencích.

Obrázek 10 ukazuje elektroforetické analýzy ekvistatínu A, SDS-PAGE rozštěpeného ekvistatinu. Dráhy: 1, standardy molekulové hmotnosti, 2, první doména ekvistatínu (eq d-1), 3, spojená druhá a třetí doména ekvistatínu (eq d-2,3). B, nativní PAGE tvorby komplexu ekv i stát i nkathepsin D. Dráhy: 1, kathepsin D, 2, ekvistatin a kathepsin D smíchány dohromady 30 minut před elektroforézou, 3, ekvistatin. Gely byly vybarveny Coomassie blue.

Obrázek 11 ukazuje schematický diagram funkce použitých fragmentů ekvistatínu. Místa proteolytického štěpení jsou ukázána jako mezery a vyznačena čísly aminokyselin. Štěpící místa získaná působením β-trypsinu jsou ukázána Šipkami. Párování cysteinových zbytků v d i sulfidových vazbách je ukázáno vodorovnou čarou spojující cysteinové zbytky.

Obrázek 12 ukazuje titraci aktivního místa ekvistatínu kathepsinem D. Inhibice 77 nm kathepsi45 nu D rostoucími koncentracemi nativního ekvistatínu. Zbytková aktivita je vyjádřena jako procento kontrolní aktivity ve vzorcích neobsahujících žádný inhibitor.

Nyní bylo stanoveno, že mezi opakujícími se thyroglobulinovými doménami typu I existují domény, jež jsou aktivní vůči aspartátovým proteázám jak lidského, tak hmyzího původu.

V kombinaci s bílkovinami (fragmentem invariantního řetězce P41 a doménou I ekvistatínu) s doménami, jež jsou aktivní vůči cysteinovým proteázám mají silnou inhibiční aktivitu vůči trávicím „k proteázovým inhibitorům necitlivým“ cysteinovým a aspartátovým proteázám v širokém rozsahu hmyzích druhů náležících k různým hmyzím řádům včetně mandelinky bramborové, třásněnek, vrtalovitých druhů a červů. Při enterálním podávání jsou larvicidální vůči larvám hmyzu majícího trávicí cysteinové a aspartátové proteázy, jako je mandelinka bramborová a silně

-7CZ 300639 B6 snižují produktivní plodnost hmyzu, jež při trávení bílkovin závisí hlavně na cysteinových proteázách. Prokazuje se, že tato vlastnost opakující se thyroglobulinové domény typu I je unikátní ve velice širokém souboru inhibitorů cysteinových a aspartátových proteáz, odvozeném téměř ze všech známých typů inhibitorů cysteinových a aspartátových proteáz. Proto se prokazuje, že nepostačuje, jak se navrhovalo dříve, používat inhibitory, jež mají velkou evoluční vzdálenost od rostlin, protože ty jsou stejně neaktivní jako inhibitory odvozené z rostlin. Namísto toho pouze inhibitory cysteinových nebo aspartátových proteáz obsahující konzervované vlastnosti opakující se thyroglobulinové domény typu I byly schopné plně inaktívovat „PInecitlivé cysteinové a aspartátové proteázy různých druhů hmyzu. Tento vynález tedy poskytuje io způsob zabíjení hmyzu a nematod, jež mají „k proteázovým inhibitorům necitlivé“ trávicí cysteinové nebo aspartátové proteázy, včetně larev mandelinky bramborové, přičemž způsob zahrnuje enterální podávání larvicidálního nebo nematocidálního množství bílkoviny se SEQ IDC: 2 larvám nebo nematodám v závislosti na tom, zda daný hmyz používá jednu nebo více tříd proteáz pro trávení.

Definice pojmů

Pojmy inhibitor proteáz a inhibitor proteinas se považují za ekvivalentní. Výraz „proteáza necitlivá k inhibitoru“ je míněn k označení takové proteázy, jež je necitlivá k proteázovým inhi20 bitorům hostitelské rostliny tvořícím se v obraně proti napadajícím škůdcům, ale není míněn tak, že by vylučoval, že proteáza může být inhibována proteázovými inhibitory izolovanými ze zdrojů jiných než hostitelská rostlina. Výrazům hmyz a larva, i když nejsou ekvivalentní pokud se užívají specificky, je třeba rozumět tak, že zahrnují jak dospělé, tak larvální formy některého druhu, pokud se užívají obecně. Tedy: Výrazu hmyzí rezistence je třeba rozumět tak, že zahrnuje rezistenci k larválním formám i dospělým, obzvláště když hubení larev vede k odpovídající nepřítomnosti dospělých forem.

Ve výhodném provedení je vynález zaměřen na inhibitory cysteinových/aspartátových proteáz z mořského měkkýše Actinia equina, na něž se odkazuje rovněž jako na „ekvistatin“. Pro účely tohoto vynálezu je „ekvistatin“ míněn tak, že zahrnuje bílkovinu kódovanou genem majícím sekvenci udávanou v obrázku 1. Ekvistatinový peptid, jenž byl purifikován z měkkýše Actinia equina vykazoval přítomnost tří opakujících se thyroglobulínových domén typu I (Lcnarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13899, Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 273: 12682). Prohledání knihovny cDNA z Actinia equina radioaktivně značenou sondou získanou PCR s použitím dvou degenerovaných primerů na celkovou cDNA vedlo ke klonu škodující sekvencí obsahující signální peptid k sekreci a maturní bílkovinnou část o třech doménách téměř shodné bílkovinné sekvence ve srovnání s purifikovanou bílkovinu.

Primery k amplifikaci ekvistatinové cDNA:

El-degl : CT (A, C, G, T) AC (A, C, G, T) AA (A, G)TG(T,C) CA(A,G) CA (A,G) EI-deg2:

₄₍₎ ATT (A, G) AC (A, C, G, T) TG (A, C, G, T) GG (A, C, G, T) CG (TC) TT (A, G) AA

Jak lze vidět v Obrázcích 1 a 2 složka maturní bílkoviny ekvistatinu je složena ze 3 domén, jež se zdají být důsledkem duplikace genetického materiálu. Podle předběžné analýzy sekvence cDNA se může v Actinia equina vyskytovat několik strukturních isoforem ekvistatinu. Dané 3 domény zahrnují 22 kD polypeptid. Každá doména obsahuje asi 65 - 68 aminokyselin, s p řed pokládaný45 mi třemi disulfidovými vazbami. Podle sekvence domén je zřejmé, že daná bílkovina je členem konzervovaného typu I opakujících se thyroglobu línových domén a obsahuje opakující se domény typu I. Konkrétně sekvence těchto domén vykazují vysokou konzervaci aminokyselinové sekvence Cvs (Xxx)|_S?9 -Pro-Xxx-Cys-(Xxx)_; Gly (Xxx)₅ Gin C\s-{Xxx)₍-Cys-nir-Cys(Xxx)₃-Gly-(XXX)₁₀,|5-CyS. Inhibitor o třech doménách purifikovaný z Actinia equina byl proteolyticky štěpen na dva hlavní peptidy a rozdělen HPLC s reverzní fází. Stanovení N-konců

-8CZ 300639 B6 obou fragmentů umožnilo jejich lokalizaci v sekvenci. Jeden peptid, nazvaný eq d l, sestával z první domény probíhající od zbytku 1 do 67, zatímco druhý peptid, nazvaný eqd-2,3, obsahoval domény 2 a 3 se zbytky 68- 199. Intaktní ekvistatínová molekula může být inhibována pouze jednou molekulou papainu a jednou molekulou kathepsinu D. Inhibiční testy s Eqd-1 a Eqd-2,3 určily, že Eqd-1 může být inhibována jen papainem a Eqd-2,3 jen kathepsinem D. Inhibiční konstanty pro separované domény byly podobné intaktní ekv i stati nové molekule. To prokázalo, že i když se tyto domény zdají být strukturně konzervované, specifity k proteázám divergovaly k úplně odlišným třídám proteáz. S existujícími důkazy není možné zjistit které zbytky určují tento rozdíl ve specifitách.

Musí se chápat, že za daných znalostí lze syntetizovat nebo izolovat v podstatě čisté funkční deriváty přirozeně se vyskytujících ekv i stát i nových molekul. „Funkční derivát“ ekvistatinu je sloučenina, jež má biologickou aktivitu v podstatě podobnou biologické aktivitě ekvistatinové molekuly. Výraz funkční derivát je zamýšlen tak, že zahrnuje „fragmenty“ nebo „účinně homolo15 gické varianty“.

„Fragment“ molekuly je míněn tak, že odkazuje na inhibiční polypeptidový sub-soubor ekvistatinové molekuly.

„Účinně homologické varianty“ molekuly, jako je ekvistatínová molekula, jsou míněny tak, že odkazují na molekulu v podstatě podobnou v sekvenci a funkci buď celé molekule, nebo jejímu fragmentu. Pro účely tohoto vynálezu jsou tyto molekuly identifikovány tím, že obsahují opakující se thyroglobulinovou doménu typu I. Obecně musí účinně homologické sekvence zachovat vysokou konzervaci v přirozeně se vyskytujících pozicích konzervované sekvence Cys-{Xxx)i825 2‘) “Pro Xxx-Cys—(XxxT-Gly—(Xxx)₅—Gln -Cys-(Xxx)_ň-Uys-rhr-<.y's—(Xxx)₂-(jly—(Xxx)io ,₅Cys. Dva cysteiny na koncích konzervované, sekvence jsou konzervovány, ale nemají konzervované pozice. Pravděpodobně však vytvářejí strukturně důležité disulfidové můstky s kterýmkoli z jiných cysteinů, cožje důvod proč jsou zahrnuty. Pro účely tohoto vynálezu je struktura jedné aminokyselinové sekvence účinně homologické k druhé aminokyselinové sekvenci, když alespoň 70 procent, s výhodou alespoň 80 procent, a nejvýhodněji alespoň 90 procent aktivní části aminokyselinové sekvence je shodných nebo ekvivalentních. Obecné kategorie potenciálně ekvivalentních aminokyselin jsou udány níže, přičemž aminokyseliny uvnitř skupiny mohou být substituovány jinou aminokyselinou této skupiny: 1) kyselina glutamová a asparagová, 2) lysin, arginin a histidin, 3) alanin, valin, leucin a izoleucin, 4) asparagin a glutamin, 5) threonin a serin,

6) fenylalanin, tyrosin a tryptofan, a 7) glyein a alanin. Významněji a kritičtěji pro definici, funkce druhé aminokyselinové sekvence je účinně homologická s jinou aminokyselinovou sekvenci když druhá aminokyselinová sekvence vyhovuje terciární struktuře mající schopnost snižovat nebo eliminovat katalytickou aktivitu trávicí cysteinové nebo aspartátové proteázy.

Jak se zde používá, výraz „v podstatě čistý“ je míněn tak,že popisuje bílkovinu obsahující alespoň jeden inhibitor cysteinové proteázy, kterým je protein obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, jež je homogenní podle ještě jedné charakteristiky čistoty nebo homogenity. Například: V podstatě čistá molekula ekv i stát in ového peptidú bude vykazovat konstantní a reprodukovatelné charakteristiky v rámci standardní experimentální odchylky pro parametry jako jsou molekulová hmotnost, ehromatografické chování a podobně. Výraz však není zamýšlen tak, aby vylučoval umělé nebo syntetické směsi molekul ekv i stát i nového peptidú s jinými sloučeninami. Výraz rovněž není zamýšlen tak, aby vylučoval přítomnost menších znečištění, jež neinterferují s biologickou aktivitou molekuly ekvistatinového peptidú a jež mohou být přítomné například z důvodu neúplné purifikaee. V podstatě Čisté molekuly ekvistatinového peptidú mohou být izolovány ze zdroje, v němž přirozeně existují, jakoukoli patřičnou technikou purifikaee bílkovin. Příklady technik zahrnují ehromatografické techniky, jako je gelová filtrace kapalinové chromatografie, ionexová chromatografie, afinitní chromatografie, vysoce výkonná kapalinová chromatografie, chromatografie s reverzní fází nebo použití imunologických činidel používajících anti-ekvístatinové protilátky.

-9CZ 300639 B6

Izolace genu

Ekvistatinový peptid je možné syntetizovat in vitro z aminokyselin, z nichž je složen (viz Merrifíeld (1963), J. Amer. Chem. Soc., 85: 2 149-2 154, a Solid Phase Peptide Synthesis (1969), (ed.) Stewart a Young). Takto připravené peptidy lze izolovat a purifikovat postupy dobře známými v oboru (viz Current Protocols in Moleeular Biology (1989), (ed.) Ausubel etal., a Sambrook ct al. (1989), Moleeular Cloning: A Laboratory Manual).

I když je možné stanovit a syntetizovat celou aminokyselinovou sekvenci ekv i stati nového peptidu, je výhodné izolovat celou sekvenci ekvistat ino vého genu. DNA kódující ekvistatinový peptid může být připravena z chromozomální DNA, cDNA nebo z DNA syntetického původu s použitím dobře známých technik.

Genomová DNA kódující ekvistatinový peptid může být izolována standardními technikami (Sambrook etal. (1989), výše). Konkrétně zamýšleny jako část tohoto vynálezu jsou genomové DNA sekvence kódující alelické variantní formy ekv i stát i nového genu, jakož i jejich 5' a 3' přilehlé oblasti. Rovněž je možné použít primery a exponenciálně amplifikovat DNA in vitro s použitím sekvenčně specifických oligonukleotidů a polymerázové řetězové reakce (PCR) (viz Mullis etal. (1987), Meth. Enz., 155: 335-350, Horton etal., (1989), Gene 77: 61, a PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (ed.) Erlich (1989)).

Preparáty cDNA se ligují do rekombinantních vektorů za tvorby genové knihovny. Alternativně mohou být cDNA exprimovány ve vektoru jako je lambda gtl 1 a knihovna prohledávána s použitím protilátek proti molekule ekvistatinového peptidu.

K prohledávání knihoven genomové DNA nebo cDNA mohou být v technikách, dobře známých v oboru, používány vhodné oligonukleotidy, soubor oligonukleotidů nebo z PCR odvozené fragmenty DNA. K umožnění detekce žádoucí sekvence může být DNA sonda značena jakýmkoli materiálem majícím detekovatelnou fyzikální nebo chemickou vlastnost. Obecné postupy pro izolaci, purifíkaci a sekvenování žádoucích sekvencí jsou v oboru dobře známé (viz Current Protocols in Moleeular Biology, (1989), výše a Sambrook et al. (1989), výše).

Alternativní cestou získání genetické sekvence, jež je schopna kódovat bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu 1, je její příprava oligonukleotidovou syntézou poté, co je sekvence genu, o nějž je zájem, stanovena (viz Caruthers (1983), v Methodology of DNA and RNA, (ed.) Weisstnan, Beaucage etal. (1981), Tetrahedron Letters 22: 1 859-1 962). Může být syntetizována série oligonukleotidů tak, aby poskytovala sérii překrývajících se fragmentů a pak hybridizována a ligována dohromady s použitím dobře známých technik (viz Sambrook etal. (1989), výše). Alternativně může být gen vytvořen syntézou primerú majícího takzvaný „vlající konec“, jenž se nehybridizuje k cílové DNA: Pak se genomové sekvence amplifikují a spojí dohromady extensí překryvů (viz Horton et al., (989), Gene 77: 61-68). Výsledný fragment DNS o předpověděné velikosti se izoluje elektroforézou a li guje do vhodného klonovacího vektru k amplifikaci a další manipulaci (viz Mullis etal. (1987), výše a Principles and Applications for DNA Amplification, (1989), výše).

Samozřejmě lze do izolovaných sekvencí inkorporovat modifikace, včetně adice, delece, nebo nckonzervativní substituce omezeného počtu různých nukleotidů nebo konzervativní substituce mnoha nukleotidů, za předpokladu, že se zachová správný čtecí rámec. V patřičných bodech se přidají signály translačního ukončení a startu a na konce se přidají sekvence vytvářející vhodná klonovací místa. Příklady technik pro modifikaci oligonukleotidových sekvencí zahrnují požití řízené mutageneze s zprostředkované polynukleotidy (viz Zoller et al. (1984, DNA 3: 479-488, Higuchi etal. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 7 351-7 367, Ho etal., (1989), výše, a Principles and Applications for DNA Amplification, (ed.) Erlich (1989).

- 10CZ 300639 B6

Genová exprese

Pro další charakterizaci takovýchto genetických sekvencí je žádoucí zavedení dané sekvence do 5 vhodného hostitele k expresi bílkovin, jež tyto sekvence kódují, a potvrzení, že obsahují charakteristiky ekv i stát i nových peptidových molekul. Techniky pro takovou manipulaci jsou dobře známé a jsou zveřejněny Sambrookem et al. (1989), výše.

Vektory k transformaci virů, prokaryotických a eukaryotických buněk jsou dostupné, nebo io mohou být snadno připraveny. Obecně musí plasmidové nebo virové vektory obsahovat všechny řídicí DNA sekvence potřebné jak k udržování, tak k expresi heterologní DNA sekvence v daném hostiteli. Takovéto řídicí sekvence obecně zahrnují promotorovou sekvenci, tranckripční start nebo zaváděcí sekvenci, sekvenci DNA kódující signál kodonu trans lační ho startu, trans lační terminační kodon, a sekvenci DNA kódující 3'-netranslatovanou oblast obsahující signály řídicí terminaci RNA syntézy nebo modifikaci messenger RNA. Konečně je žádoucí, aby vektory měly markerový gen, jenž je schopen poskytovat fenotypovou vlastnost, která dovoluje identifikací hostitelských buněk obsahujících daný vektor, a v případě monokotní transformace, intron v 5'—netranslatované oblasti, např. intron 1 z genu kukuřičné alkohol dehydrogenázy, jenž zvyšuje rovnovážné hladiny mRNA.

Příklady hostitelských buněk zahrnují prokaryotní a eukaryotní organismy. Vhodné postupy k transformaci vybrané hostitelské buňky mohou být nalezeny v souladu s použitou hostitelskou buňkou. Podle současných zkušeností se rozdíly v expresi genů zavedených do buněk, jež by bylo možné přičítat samotnému způsobu transformace, zdají být malé.

Konvenční technologie pro zavádění biologického materiálu do hostitelských buněk zahrnují elektroporaci (viz Shigekawa a Dower (1988), Biotechniques 6: 742, Miller et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 856-860, a Powell etal., Appl. Environ. Microbiol. 54: 655—660), mechanismus přímého zachycení DNA (viz Mendel a Giga (1972) J. Mol. Biol. 53: 159-162,

Dityatkin etal. (1972) Biochimica et Biophysica Acta281: 319-323, Wigler etal. (1979) Cell 16: 77, a Uchimiya etal. (1982) v Proč. 5^th Intl. Conf. Plant Tissue and Cell Culture, ed. A. Fujiwara, Jap. Assoc. for Plant Tissue Culture, Tokyo, str. 507-508), fúzní mechanismus (vizUchidax etal. (1980) v Introduction of Macromo leču les into Viable Mammalian Cells, ed. C. Baserga, G. Crose, a G. Rovera, Wistar Symposium Series, sv. 1, A. R. Liss lne., NY, str. 169-185), infekční agens (viz Fraley (1986) CRC Crit. Rev. Plant Sci. 4: 1-46, a Anderson (1984) Science 226: 401^409), Crossway etal.. (1986) mikroinjekční mechanismus (viz Mol. Gen. Genet. 202: 179-185) a mechanismus s projektily o vysoké rychlosti (viz EP 0 405 696).

Transformanti se izolují podle konvenčních metod, obvykle s použitím selekční techniky, jež umožňuje selekci žádoucích organismů proti nemodifikovaným organismům. Obecně po transformaci se hostitelské buňky rozrůstají po asi 48 hodin k umožnění exprese markerových genů. Buňky se pak dají do selekčního nebo „probíracího“ média, kde se netransformované buňky rozliší od trans formovaných buď podle zániku nebo biochemické vlastnosti. Selektované buňky mohou být hodnoceny na expresi molekuly ekvistatinového peptidů nebo jeho funkčních derivátů testovacími technikami, jako je „imunob lotová“ analýza, test inhibiční aktivity, ELISA, radioimunologické stanovení nebo analýza na fluorescenčně aktivovaném buněčném sorteru, imunohistochemicky a podobně. Transformované tkáně jsou pak testovány na aktivitu v kontrole hmyzu.

Hostitelské buňky mohou být transformovány k poskytnutí zdroje, z nějž lze izolovat významná množství vektoru obsahujícího gen, jenž je předmětem zájmu, k následnému zavedení do žádoucích buněk, nebo k expresi a izolaci významných množství bílkoviny. Příklady rekombinantních hostitelských buněk zahrnují jednobuněčné prokaryontní a eukaryontní kmeny. Prokaryontní mikrobi, jež mohou být použity jako hostitelé, zahrnují Escherichia eoli a jiné Entrobacte55 riaceae, Radili a různé druhy pseudomonas. Běžné eukaryontní mikrobi zahrnují Saccharomyces

- 11 CZ 300639 B6 cerevisiae a Pichia pastor is. Běžné vyšší eukaryontní hostitelské buňky zahrnují buňky Sp2/0 nebo CHO. Jiným výhodným hostitelem jsou hmyzí buňky, například z larev Drosophila, v nichž vektor obsahuje Drosophila promotor alkohol dehydrogenázy.

Alternativně mohou být bakulovirové vektory, například virus jaderné polyhedrosy Autographa californica (viz Miller et al. (1983) Science 219: 715-721) sestaveny tak, aby exprimovaly velká množství molekul ekvistatinového peptidů nebo jeho funkčních derivátů v kultivovaných hmyzích buňkách (viz Andrews et al. (1988) Biochem J. 252: 199-206).

io Hostitelé jsou vybráni tak, aby byli schopni kolonizovat rostlinnou tkáň podléhající napadení hmyzem, anebo se aplikují jako mrtvé nebo neživotaschopné buňky obsahující bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu 1. Mikrobiálními hostiteli obzvláštního zájmu budou prokaryonty a nižší eukaryonty, jako jsou houby.

Charakteristiky mikrobiálních hostitelů uzavírajících bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I zahrnují ochranné kvality pro tuto bílkovinu, jako je silná buněčná stěna, pigmentace a intracelulární sbalení nebo tvorba inklusních tělísek, afinita k listům, netoxičnost pro zvířata, atraktivita pro škůdce k pozření, snadnost umrtvení nebo fixace bez poškození bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, a schopnost úpravy k prodloužení aktivity bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I. Charakteristiky mikrobiálních hostitelů ke kolonizaci rostliny zahrnují absenci fytotoxicity, snadnost zavedení genetické sekvence kódující bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, dostupnost systémů exprese, účinnost exprese a stabilita insekticidu v hostiteli.

Ilustrativní prokaryonty, jak Gram-negativní, tak -pozitivní, zahrnují Enterobacteriaceae, jako jsou Escherichia, Bacillaceae, Rhizoboceae jako je Rhizobium a Rhizobacter, Spirilaceae (jako je fotobakterium), Zymmonas, Serratia. Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum, Lactobacillaceae, Pseudomonadceae (jako je Pseudomonas a Acetobacter), Azotobacteriaceae a Nitrobacteriaceae. Mezi eukaryonty jsou houby (jako Phyeomycetes a Ascomycetes), jež zahrnují kvasinky (jako Saccharomyces a Sehizosaccharomyces), a Basidiomycetes kvasinky (jako je Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces) a podobně.

Vynález rovněž uvažuje použití bakulovirů obsahujících gen kódující bílkovinu obsahující přinej35 menším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I. Bakuloviry, zahrnující bakulovíry, jež infikují hmyz (motýly, mouchy) Heliothis virescens, Orgyla pseudotsugata, Ly man tria dispar, Autographica californica, Neodiprion serfiter a Laspeyresia pomonella, jsou registrovány a používány jako pesticidy (viz US 4 745 051 a EP 175 852).

Rekombinantní hostitel může být formulován v řadě způsobů. Může být používán ve zvlhčitelných prášcích, granulích nebo prachu, nebo míchán s různými inertními materiály, jako jsou anorganické minerály (fylosilikáty, uhličitany, sírany, fosfáty, a podobně) nebo botanickými materiály (práškované kukuřičné palice, rýžové plevy, ořechové slupky, a podobně). Přípravky mohou zahrnout adjuvans k šírení/přichycení, stabilizační činidla, jiné insekticidní přídatné povr45 chove aktivní látky, bakteriální živiny nebo jiné látky k podpoře růstu nebo stability bakteriálních buněk. Kapalné přípravky mohou být vodnc nebo nevodné, a používány jako pěny, gely, suspenze, emulgovatelné koncentráty, nebo podobně. Složky mohou zahrnovat rheologická činidla, povrchově aktivní látky, cmulgátory, dispersanty, nebo polymery.

Transgenní rostliny

Alternativně může být bílkovina obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I inkorporována do tkání přijímající rostliny tak, že v průběhu napadení rostliny hmyz konsumuje hmyz-kontrolující množství vybrané bílkoviny se SEKV ID Č 2. Tento způsob nabízí obzvláštní výhody při zasahování rostlinné tkáně trávené hmyzem nebo nematodami, jež

-12 CZ 300639 B6 je normálně velmi obtížné dosáhnout konvenční aplikací pesticidů. Navíc existují důležité ekonomické a environmentální výhody, jež se získají když se může snížit potřeba aplikace pesticidů.

Tento způsob rovněž poskytuje výhody, když se uváží potenciál hmyzu stát se rezistentním. Silná aplikace insekticidních materiálů obecně na pole nebo geografickou oblast prachem nebo sprejem nebo inkorporací do půdy má tendenci navozovat silný selekční tlak, protože hmyz nemá žádný „azyl“, kde by mohli přežívat neřeži stentní jednotlivci. Avšak: Mnozí hmyzí škůdci plodinových rostlin napadají rovněž neplodinové druhy. Omezení insekticidního materiálu pouze na plodinové rostliny v oblasti pomocí exprese insekticidního materiálu pouze v těchto rostlinách dovoluje, aby pokračovalo přežívání neřežistentního hmyzu v asociovaných plevelnýeh rostlinách, jež poskytují nejen „azyl“ před toxickými sloučeninami, ale i potravu pro hmyz. To významně snižuje selekční tlak a zpomaluje rozvoj a rozšiřování rezistentního hmyzu.

Tento způsob rovněž nabízí výhody z pozice kontaminace půdy a spodní vody, protože není potřeba žádného vehikula k aplikaci. Insekticidní složky jsou samy o sobě přírodního původu a přirozeně se rozkládají, když je rostlina trávena nebo když se rozkládá. Tento způsob nabízí další výhody z pozice nákladů, protože insekticidní materiál je součástí ceny semen nebo jiného reprodukčního materiálu, jenž si pěstitel kupuje.

Jedním způsobem provádění je inkorporace bílkoviny se SEKV ID Č 2 ve vehikulu netoxíckém pro rostlinu, jenž je uzpůsoben pro systémové podávání přijímající rostlině. Avšak: Protože geny kódující bílkovinu se SEK V ID Č 2 lze izolovat, vynález uvažuje, ve výhodném provedení, transgenní rostliny, jež jsou schopné biologicky syntetizovat bílkoviny se SEKV ID Č 2 a poskytovat rostlině nový, nebo dodatečný, mechanismus ochrany proti útoku hmyzem nebo nematodami.

Vynález poskytuje způsoby přípravy transgenní rostliny s odolností k napadení hmyzem, majícím trávicí cysteinové nebo aspartátové proteázy, jež zahrnuje: a) kultivaci buněk nebo tkání z alespoň jedné rostliny z daného taxonu, b) zavedení, do dané buněčné nebo tkáňové kultury, strukturního genu kódujícího bílkovinu se SEKV ID Č 2 obsahující ve funkčním spojení s rostlinnými regulačními sekvencemi, jež způsobí expresi daného genu v daných buňkách, a c) regenerace celé rostliny rezistentní k hmyzu z buněčné nebo tkáňové kultury.

Exprese unikátně vysokých množství bílkovin se SEKV ID Č: 2 může být škodlivá pro samotnou rostlinu. Použití signálních sekvencí k sekreci nebo sekvestrování do vybrané organely umožňuje bílkovině být v metabolicky inertním místě dokud není uvolněna ve střevním prostředí hmyzího patogenu.

Tato DNA sekvence bude obecně taková, jež pochází z organismu odlišného od cílového, nebo jež má podstatnou sekvenční homologii k bílkovině obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I pocházející z organismu odlišného od cílového.

Optimální exprese v rostlinách

Pro optimalizaci transkripční a trans lační účinnosti takovýchto systémů lze podrobit zkoumání frekvenci využití kodonů a stanovit, které kodony jsou v podstatě preferovány v transkripčních a translačních systémech normálně přítomných v dané rostlině. Když se použije takovéto preferované využití kodonů, lze konstruovat sekvenci kódující bílkovinu, která povede k významně zvýšené hladině transkripční a trans lační účinnosti ekv i stati nového genu nebo funkčního derivátu tohoto genu ve srovnání stím, čeho by se dosáhlo, kdyby se vzala kódující sekvence přímo v nemodifikované formě donorového organismu. Navíc může být kódující sekvence dále optimalizována odstraněním potenciálních rostlinných polyadenylačních signálů, kryptických sestřihových míst a motivů nestability mRNA, jak bylo ukázáno pro geny toxínu Bacillus thuringiensis.

Obecně se inzerce heterologních genů při použití kterékoli transformační techniky jeví jako náhodná, ale v současnosti existují technologie k produkci rostlin s místně specifickou rekombi- 13 CZ 300639 B6 nací DNA do rostlinných buněk (viz WO 91/09957). Aktivita cizorodého genu zavedeného do rostlinných buněk je závislá na charakteristikách exprese jednotlivých zavedených genů, pocházejících z řídicích oblastí (promotory, polyadenylační oblasti, zesilovače, atd.) a z vlivů endogenní rostlinné DNA, přilehlé k chimémímu insertu, a počtu kopií.

Vybraný promotor musí být schopen způsobovat dostatečnou expresi vedoucí k produkci hmyz-kontrolujícího množství bílkoviny. Vhodné promotory mohou zahrnovat jak ty, jež jsou odvozeny z některého genu, jenž je přirozeně exprimován v rostlinách, tak syntetické promotorové sekvence, které mohou zahrnout redundantní nebo herologní zesilovací sekvence. Řada promotorů, jež jsou aktivní v rostlinách, zahrnuje promotory nopalin synthasy, oktopin synthasy a mannopin synthasy z nádory indukujících plasmidů Agrobacterium tumefaciens. Tento vynález uvažuje konstitutivní promotory tak, že transformovaná rostlina bude mít zvýšenou toleranci k hmyzím škůdcům. Příklady konstitutivních promotorů zahrnují promotory CaMV 19S a 35S (JP 63287485), ubiquitinový promotor, rýžový aktinový promotor (WO 91/099948).

V druzích, které produkují nativní bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, jež není produkována ve tkáních, jež jsou normálně napadány hmyzem, nebo není do nich distribuována, může být použit tkáňově specifický promotor k poskytnutí lokalizované exprese nebo nadprodukce bílkoviny se SEKV IDČ 2. Příklady tkáňově specifických promotorů zahrnují kořenově specifické promotory jako kukuřičného metalothioneninu (EP 452269), kořenově specifický promotor (WO 91/13992), promotor skladovacího tělíska rostlinného semene (WO 91/13993) a promotor alkohol dehydrogenázy-1. Promotory známé jako índukovatelné světlem zahrnují promotor genu kódujícího malou podjednotku (ss) ribuloso1,5-bisfosfát karboxylasy ze sójových bobů a promotor genu kódujícího chlorofyl a/b vážící protein v zelenajících se listech (Coruzzi etal. (1983) J. Biol. Chem. 259: 1 399. A Dunsmuir et al. (1983) J. Molecular and App. Gen. 2: 285, Nap et al. (1993) Plant. Molec. Biol. 23: 605612).

Konečně: K poskytnutí exprese bílkovin se SEKV ID Č 2 při napadení tkáně rostlinným škůdcem mohou být použity promotory índukovatelné poraněním nebo patogenem. Příklady promotorů indukovatelných poraněním nebo patogenem zahrnují promotor proteinasového inhibitoru II. Rostlinné vektory

Vhodné vektory pro transformaci rostlinné tkáně byly popsány a uvádějí se zde (viz deFrammond et al. (1983) Biotechnology 1: 262, An et al. (1985) EMBO J. 4: 277, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 183, Rothstein et al. (1987) Gene 53: 153, WO 90/08829 a WO 84/02913) a ve výhodném provedení pCABl (jak jc popsáno v Příkladech). V praxi není potřebné aby vektor obsahující gen selektovatelného markéru obsahoval rovněž gen, jenž je předmětem zájmu: Spíše se k transformaci rostlinných buněk používá kotransformace takovýmito vektory.

Transformační postupy

Patřičný postup k produkci dospělých transgenních rostlin lze vybrat v souladu s použitým rostlinným druhem. Regenerace kolísá od druhu k druhu rostlin. Účinná regenerace bude záviset na médiu, genotypu a historii kultury. Jakmile se získají celé rostliny, mohou být pohlavně nebo klonálně reprodukovány takovým způsobem, že alespoň jedna kopie sekvence je přítomna v buňkách potomstva reprodukce. Takovéto postupy lze vybrat v souladu s použitým rostlinným druhem.

Šlechtění transgenních rostlin

Dospělé rostliny, vyrostlé z transformovaných rostlinných buněk, mohou být rozmnoženy k produkci stejných inbredních rostlin. U diploidních rostlin může být typicky transformován jeden rodič a druhý rodič může být divokého typu. Rodiče budou zkříženi za tvorby hybridů první

- 14CZ 300639 B6 generace (Fl), jež se rozmnoží za produkce hybridů druhé generace (F2). Hybridy F2 sgenetickým profilem bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulínovou doménu typu I se vyberou a rozmnoží k produkci inbrední rostliny.

K přenosu ekv i stati nového strukturního genu nebo jeho funkčního derivátu lze použít konvenčních postupů šlechtění rostlin, křížení a zpětného křížení. Takovéto způsoby obsahují dále kroky

a) pohlavního křížení rostliny rezistentní k hmyzu s rostlinou z variety podléhající hmyzu,

b) získání reprodukčního materiálu z potomstva křížení a c) růstu rostlin rezistentních k hmyzu z daného reprodukčního materiálu. Když jeto žádoucí nebo potřebné, agronomické charakter i stíio ky variety podléhající hmyzu mohou být v podstatě zachovány rozšířením tohoto způsobu k zahrnutí dalších kroků opakovaně, d) zpětné křížení potomstva rezistentního k hmyzu s vnímavými rostlinami z variety podléhající hmyzu, a e) selekce na expresi rezistence k hmyzu (nebo na spojený markerový gen) mezi potomstvem zpětného křížení, dokud není přítomno žádoucí procento charakteristik variety podléhající hmyzu spolu s genem vnášejícím rezistencí k hmyzu.

Následně se mohou inbrední rostliny podle vynálezu křížit s jinou inbrední linií k produkci hybridu.

Potenciátory

Tento vynález dále uvažuje použití, spolu s bílkovinou, adjuvans, chemických nebo biologických aditiv, ve snaze rozšířit spektrum cílových škůdců, prodloužit trvání účinnosti bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, nebo pomoci stabilizovat zemědělský prostředek bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I. Příklady potenciátorů by zahrnovaly lektiny, amfipatické bílkoviny nebo komple25 mentámí proteázové inhibitory. Například: Přítomnost více než jednoho ochranného proteinu, v přítomnosti jiných ochranných proteinů, může mít důležitou roli v ochraně rostliny před útokem hmyzu. Ví se, že hmyz Hemiptera a Coleoptera si vyvinul alternativní cesty k trávení potravy obsahující vysoké hladiny určitých proteázových inhibitorů. Může být výhodné zahrnout inhibitory z rodin jako jsou cystatiny (typ I až II a fytocystatiny), inhibitory Kunítzova typu, virgiferínové inhibitory, Bowmanovy-Birkovy inhibitory, sladové trypsinové inhibitory, bramborové inhibitory I a II, inhibitory tykvovitých, bifunkční inhibitory Ragi 1-2/kukuřice, inhibitory karboxypeptidasy A a B a inhibitory aspartátových proteáz (viz Ryan (1990) Annu. Rev. Phytopathol. 28: 425—49.

Hmyz a nematody

Tento vynález uvažuje ochranu jakékoli rostliny taxonu, jenž je vnímavý k napadení a poškození hmyzem nebo nematodami majícími trávicí cystě i nové nebo aspartátové proteázy. Takovýto hmyzí škůdci zahrnují obzvláště coleoptemí hmyz čeledí Tenebrionidae, Curculionidae, Bruch i 40 dae a Chrysomelidae, thysanoptemí hmyz a diptemí hmyz. Takovéto rostlinné paraziti cké nematody zahrnují Globodera Pallida, Heterodera schachtii a Meloidogyne incognita. Speciálně je zmiňován hmyz Leptinotarsa decemlineata, Frankliniella Occidentalis, Diabrotica virgifera a Liriomyza trifolii, na nějž se běžně odkazuje jako na mandě linku bramborovou, třásněnky a vrtal kov ití (Agromyzidae species).

Jiné konkrétní druhy hmyzu zahrnují brouky potemníky, dřepčíky, chřestovnicky, zmokazy a ploštice. Výrazem „taxon“ se zde míní jednotka, botanická klasifikace rodu nebo nižší. Zahrnuje tedy rod, druh, kultivar, variety, varianty a jiné menší taxonomické skupiny, jež postrádají konsistentní nomenklaturu.

Rostliny

Příklady rostlin zahrnují brambory, kukuřici, rajčata, proso, bavlnu, fazole, řepku, jetel, chřest, sladké brambory a c hry san terny. Toto se však neklade jako omezení, protože tento hmyz může napadat určité jiné druhy úrody. Způsoby podle vynálezu jsou tedy snadno aplikovatelné na četné

- 15 CZ 300639 B6 rostlinné druhy se seznamu zde výše, včetně, bez omezení, druhů zrodů medicano, Trifolium, Vigna, Citrus, Dctucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Capsicum, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Helianthus, Bromus, Asparagus, Panicům, Pennisetum, Cucumis, Glycine, Lolium, Triticum a Zea.

Příklady provedení vynálezu

Tento vynález je vysvětlován do dalších podrobností následujícími příklady. Všechny sekvence

DNA jsou dány v konvenčním směru od 5' ke 3'. Všechny aminokyselinové sekvence jsou dány v konvenčním směru od N-konce k C-konci. Při provádění následujících příkladů byly všechny manipulace DNA provedeny podle standardních postupů, pokud není vyznačeno jinak. Viz Sambrook etal. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, vydaný Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A.

Příklad 1

Aktivita domény 2-3 ekvistatinu k aspartátovým proteázám typu kathepsinu D

Ekvistatin byl izolován z mořského měkkýše A. equina postupem, jenž byl dříve popsán, s využitím jeho inhibitorové aktivity kcysteinové proteáze, papainu (Lenarcic etal. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13899). Vedle cysteinových proteinas byl ekvistatin hodnocen na inhibiei dvou jiných tříd proteinas, aspartátových proteinas (kathepsin D) a serinových proteinas (trypsin).

Inhibiční účinek ekvistatinu byl pozorován jen když reagoval s kathepsinem D. Získaná inhibice byla neočekávaná, protože ekvistatin je znám jako silný inhibitor cysteinových proteinas podobných papainu. Navíc bylo ohlášeno, že p41 fragment nemá inhibiční účinek na kathepsin D (Bevec etal. (1996) J. Exp. Med. 183: 1 331-1 338). K určení, zda ekvistatin nepůsobí jako substrát kathepsinu D jsme inkubovali oba v různých molárních koncentracích po různá časová období a směsi podrobili HPLC systému s reverzní fází (Obr. 9A). U kathepsinu D nebyly pozorovány žádné degradační produkty. Naproti tomu bylo nalezeno, že ekvistatin je dobrým substrátem pro trypsin a tato skutečnost byla použita pro separaci thyroglobulinových domén typu I limitovanou proteolýzou β-trypsinem. 500 pg ekvistatinu bylo inkubováno s 5 pg β-trypsinu v 0,5 ml 0,1 M Tris/Hcl pufru pH 8,0 po 40 minut při 37 °C. Reakce byla zastavena přidáním kyseliny trifluoroctové. β-trypsinový digest ekvistatinu byl rozdělen pomocí HPLC (Milton Roy Co.) s použitím reverzně fázové kolony Vydac Cl8 ekvilibrované 5 % acetonitrilem obsahujícím 0,1 % (objem/objem) kyseliny trifluoroctové. Eluce se prováděla s použitím lineárního gradientu 80% (objem/objem) acetonitrilu obsahujícího 0,1 % (objem/objem) kyseliny trifluoroctové. Absorbance byla monitorována při 215 nm. Na HPLC s reverzní fází byly získány dva hlavní vrcholy (Obr. 9B). Molekulové hmotnosti, stanovené SDS PAGE za neredukujících podmínek, byly kolem 7000 a 14 000 (Obr. 10). Stanovení N-konců obou fragmentů umožnilo jejich lokalizaci v sekvenci ekvistatinové molekuly, jak je schematicky ukázáno v Obr. 11. C-konce daných fragmentů nebyly přímo identifikovány, ale jejich velikost, jak ukazuje SDS PAGE, byla konsistentní s tím, žc jsou jednoduchou a dvojitou doménou. Menší fragment začíná s N-koncem ekvis45 tatinu a proto odpovídá první doméně (eq d-1). Větší fragment odhalí dvě sekvence, začínající Ala68 a Val 152. Vazba Lys67-AIa68 je umístěna na začátku druhé domény, zatímco štěpení Argl 51—Valí52 nebylo výsledkem limitované proteolýzy (Obr. 11). Bylo ohlášeno, že izolovaný ekvistatin je podstatné narušen mezi Argl51 a Vall52, řetězce jsou vázány disulfidovou vazbou a oddělují se jen po redukci (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13 899-13 903). Těsný dvojitý pruh viditelný na SDS PAGE je nej pravděpodobněji výsledkem fragmentace velmi blízko C-konce, což znamená, že tento fragment představuje spojenou druhou a třetí doménu, eq d-2,3. Podle sekvenčních dat tyto tři sekvenčně homologické části ekvistatinu mohou mít tři potenciální proteinasová vazební místa. V dřívější práci bylo ukázáno, že vazebná stechiometrie ekvistatinu apapainu, jako představitele cysteinových proteinas, je 1:1 (Lenarcic etal. (1997) J. Biol.

Chem. 272: 13 899). Když byla aspartátová proteinasa, kathepsin D, titrována ekvistatinem, bylo

- 16CZ 300639 B6 stanoveno, že znovu je potřebný 1 mol ekvistatinu na saturaci 1 molu kathepsinu D (Obr. 12). Tato hodnota byla nezávislá přes široký koncentrační rozsah. Ke zkoumání inhibičních aktivit jednotlivých domén ekvistatinu byla provedena podrobná kinetická analýza inaktívace papainu a kathepsinu D. Všechny kinetické a rovnovážné konstanty jsou udány v Tabulce 2. První domé5 na, eqd-1, vykazovala prakticky stejné inhibitorové charakteristiky proti papainu jako intaktní ekvistatin, p41 fragment nebo ECI. Tato skupina inhibitorů, thyroglobulinových domén typu I, se považuje za kompetitivní, reverzibilní, pevně se vážící inhibitory cysteinových proteinas, jako papainu, kathepsinu B a L a cruzipainu. Dvoudoménový inhibitor, eq d-2,3, prakticky nevykazoval žádnou inhibici papainu.

io

Kinetika vazby ekvistatinu ke kathepsinu D byla prováděna s použitím syntetického substrátu, jenž obsahuje chromofor, jako je nitrofenylalaninový zbytek, v pozici Pl'. Citlivost stanovení, poskytovaná H-Pro-Thr-Glu-Phe*Nph-Arg-Leu-OH jako substrátem, nám umožnila použít 6,4 nm koncentraci enzymu jako minimální koncentraci v daném testu. Získaná rovnovážná diso15 ciaění konstanta pro interakci mezi kathepsínem D a ekvistatinem (Ki = 0,3 nm) ukazuje, že ekvistatin je znamenitým inhibitorem aspartátové proteinasy, kathepsinu D. Pro fragment aktivní k papainu, eq d-1, byla stanovena hodnota Ki přibližně 1 mM. Tato hodnota Je o několik řádů vyšší nežje hodnota Ki pro intaktní ekvistatin, což ukazuje, že inhibiění aktivní místo ekvistatinu musí být lokalizováno na jiných doménách. Eq d—2,3 skutečně vykazoval prakticky stejné inhi20 biění charakteristiky jako celý ekvistatin (Ki > 0,6 nm). Navíc byla tvorba pevného komplexu mezi kathepsínem D a ekvistatinem rovněž zviditelněna pomocí nativní PAGE (Obr. 10B).

Ekvistatin je prvním bílkovinným inhibitorem kathepsinu D zvířecího původu o známé primární struktuře. Dosud byly známy jen deriváty pepstatinu jako inhibitory kathepsinu D stejně silné jako ekvistatin.

Data poskytnutá v této studii jasně ukazují, že protein se SEKV ID Č: 2, přítomný v ekvistatinu, navzdory rozsáhlé podobnosti jejich aminokyselinových sekvencí, míří k různým třídám proteinas, buď cysteinovým nebo k aspartátové proteinase kathepsinu D.

Tabulka 2.

Kinetické konstanty pro interakci ekvistatinu, eq d-1, a eq d-2,3 s papainem a kathepsínem D

Enzym	Inhibitor	10‘e X ka	IQ4 x ]q s'1	Ki nM
Papaina	ekvistatin	12 + 0,6	12 + 0,6	12 + 0,6
	eq d-1	12 + 0,6	12 + 0,6	12 + 0,6
	eq d-2,3	NDd	ND	> 1000e
Kathepsin D*	ekvistatin	ND	ND	12 + 0,6
	eq d-1	ND	ND	> 1000
	eq d-2,3	ND	ND	12 + 0,6

^a Ke kinetické analýze interakce papainu s inhibitory byl použit test kontinuální rychlosti. Ki byla vypočtena z poměru k_d/k_a.

Data byla stanovena z inhibičního účinku inhibitoru na ustálenou rychlost kathepsínem D 40 katalyzované hydrolýzy chromoforního substrátu

- 17 CZ 300639 B6 nebylo stanoveno ^e Významný vliv nevykazoval, dokonce i při 5 mM, ani eq d-2, 3 k papainu, ani eq d-1 ke kathepsinu D: inhibiční konstanty byly tedy odhadnuty jako větší než 1 mM.

Příklad 2 io Molekulární klonování ekvistatinu

Z jediného vzorku mořského měkkýše Actinia equina L. byla izolována celková RNA s rozbitím tkáně v kapalném dusíku. Dva gramy rozetřené, hluboce zmražené tkáně byly přeneseny do 20 ml roztoku guanidinium thiokyanátu (6,5 M GTC, 0,5 M EDTA, 0,2 M β-merkaptoethanol) a homogenizovány v elektrickém mixéru (16 000 obr./min., 4 x 30 vteřin). Následně byl roztok centrifugován při 6000 xg, 20 min., při 15 °C. Deset ml čirého supernatantů bylo přeneseno k 10 ml roztoku cesium TFA (p = 1,5 mg/ml), doplněného 2,5 ml 0,5 M EDTA, pH = 8,0. Vzorek byl centrifugován po 24 hodin při 125 000 xg, 15 °C. Supernatant byl odstraněn a celková RNA (peleta) byla rozpuštěna v 1 ml roztoku proteinasy K (0,5 mg/ml). Po inkubaci roztoku při

50 °C, 1/2 hodiny, byla celková RNA sražena 1/10 objemu 3 M KOAc, pH = 5,2, a 2,5 objemy % ethanolu a směs byla dána do mrazáku při -20 °C přes noc. Celková RNA byla usazena při 8000 x g a peleta rozpuštěna v 2 ml TE pufru, 1 ml rozpuštěného vzorku byl zahřát na 65 °C po 5 minut, ochlazen na ledu a následně bylo přidáno 0,2 ml TE pufru doplněného 3 M NaCI. Celý vzorek byl nanesen na vršek náplně oligo (dT)-celulosy v koloně. Poly(A)+ RNA byla eluována

1 ml TE pufru (rozděleným na 4alikvoty po 0,25 ml), předehřátého na 65 °C. Jedna třetina vzorku (přibližně 1 pg) se použil k syntéze cDNA podle postupu výrobce (Amersbam). Syntéza prvního vlákna cDNA se provedla s použitím 11 μΐ roztoku mRNA, 4 μΐ 5 x reakčního pufru, 1 μΐ roztoky Na-pyrofosfátu, 1 μΐ ribonukleasového inhibitoru z lidské placenty (5 U/μΙ), 2 μΙ roztoku směsi dNTP a roztoku oligo dT primerů (1 μΐ). Po přidání 2 μΐ reverzní transkriptasy (10 U/μΙ) byla směs inkubována při 42 °C po 40 minut. Druhé vlákno cDNA bylo syntetizováno přidáním následujících složek: 37,5 μ] reakčního pufru pro druhé vlákno, 7 μΐ E. coli DNA polymerázy I (4 U/1) a 1 μΐ E. coli ribonukleasy Η (1 U/μΙ). Reakční směs byla inkubována postupně při 12 °C po 60 minut a 22 °C po 60 minut. Po tepelné denaturaci (5 minut při 70 °C), bylo přidáno 0,5 μΐ T4 DNA polymerázy (2 U/μΙ) a reakční směs byla inkubována při 37 °C po

10 minut K 1 pg cDNA bylo ligováno 2,5 μΐ (250 pmol) EcoRI adaptorů za použití 2 μΐ DNA ligasy (4 LJ/μΙ) ν20μ1 ligační směsi. Po 8 hodinách při 16°C byla ligační směs podrobena kolonové purifikaci frakcionaci podle velikosti cDNA s navázanými adaptory za použití stáčeeíeh kolonek a TE pufru. Sebrané frakce purífíkované cDNA byly fosforylovány T4 polynuklotidkinasou (8 U/μΙ) a cDNA byla ligována do ramen defosforylovaného Zgtll bakteriofága za použití T4 DNA ligasy (40 U/μΙ). Nakonec byla celá ligační směs „sbalena“ in vitro s použitím „balícího“ extraktu od stejného výrobce (Amersham). Část 7gt 11 knihovny cDNA (10⁵ pfu) byla použita k infekci buněk E. coli Y1090 a směs nanesena na misky s LB agarem. Plaky byly přesáty na nitrocelulosové membrány. Membrány byly třikrát promyty v solném roztoku pufrovaném Tris s 0,01 % Tween-20 (TBST) a následně v blokovacím roztoku (20% (objem/objem) fetál4? ního séra v TBST). Po promyti membrán v TBST byla přidána první protilátka (králičí antiekvistatinové IgG) v TBST a na membrány se působilo přes noc při 4 °C. Potom byly membrány promyty třikrát s TBST a působilo se na ně druhou protilátkou (kozí anti—králičí IgG-krenová peroxidasa). Po finálním mytí v TBST byla provedena vizualizace s diamidobenzidinem jako substrátem. Z agarových misek byly izolovány tři positivní klony a po novém nanesení byly fágy eluovány z povrchu agarových misek TE pufrem (5 ml na jednu misku). Fágová DNA byla izolována s použitím izolační soupravy Wizard Lambda Preps DNA (promega) podle postupu výrobce. Po restrikční analýze s 2 μΐ restrikčního enzymu EcoRI (10 U/μΙ) na 3 pg ÁDNA a frakcionaci podle velikosti na 1 % agarosovém gelu byly cDNA inserty vyříznuty, purifikovány se skelným mlékem a subklonovány do EcoRI klonovacího místa plasmidu pUC19. Celá ligační směs (10 μΐ každého vzorku) byla transformována do buněk E. coli DH5a inkubací 100 μΙ vysoce

- 18CZ 300639 B6 kompetentních buněk (OD₅₅₀ = 0,6) a 10 μΐ ligační směsi ve vodné lázni (42 °C) po 45 vteřin. Po přidání LB média (900 μΐ) a 1 hodině inkubace (37 °C, 250 obr./min.) byly bakteriální směsi naneseny naLBA misky doplněné X-gal a IPTG a po inkubaci přes noc (37 °C) byly bílé kolonie přeneseny do 5 ml LB média a inkubovány po dalších 16 hodin (37 °C, 250 obr./min.). Plasmidy byly izolovány s použitím systému Wizard Plasmid Purification System (promega) podle instrukcí výrobce a analyzovány stanovením nukleotidové sekvence za použití T7 DNA polymerázy (T7 sekvenční souprava, Phlimacia) a [³⁵S]dATPaS (Amersham). Sekvenování vybraných cDNA klonů vedlo ke klonu cDNA plné délky, jak udává Obr. 1. Proteinová sekvence na obrázku 1 odpovídá SEKV ID Č: 2.

io

Příklad 3

Exprese rekombinantní ekvistatinové cDNA v Escherichia coli

Kamplifikaci matumího proteinu ekvistatínu a kjeho klonování jako Ncol-Ncol fragmentu za g3 signálním peptidem přítomným v E. coli vektoru exprese pB3 byly použity dva primery. Přiměř 1 byl PDEI-1: CGC GCC ATG GCG AGT CTA ACC AAA TGC CAA a primer2 byl PDEI-2: GG TGC GGC CGC GCA TGT GGG GCG TTT AAA. Správné inserty byly sekveno20 vány k prověření sekvenčních chyb a jeden klon byl vybrán k získávání rekombinantní bílkoviny.

Rekombinantní ekvistatin byl získán růstem jediné kolonie E. coli kmene HB2151 s plasmidem pB3 nesoucím ekvistatinovou cDNA, přes noc v 5 ml LB růstového média s ampicilinem (100 mg/ml, finální koncentrace) pří 37 °C, 250 obr./min. pět mililitrů kultury narostlé přes noc bylo použito k inokulaci 800 ml LB média s ampicilinem (100 mg/ml, finální koncentrace) v 2 1 baňce. Buňky rostly za třepání (30 °C, 250 obr./min.) do OD₆₀o⁼ 0,5. Poté se přidal zásobní roztok IPTG do finální koncentrace 1 mM a růst buněk pokračoval za použití stejných podmínek jako shora pod dalších 6 hodin. Buňky byly umístěny na led po 1 hodinu, pak stočeny při 4000 g po 10 minut při 4 °C a resuspendovány v 50 ml ledově chladného 10 mM MgSO₄. Suspenze se umístila do —20 °C dokud kapalina úplně nezmrzla a pak byt obsah roztát ponořením baňky s roztokem do vodné lázně (30 °C). Okamžitě po roztátí byly buňky odstraněny centrifugací při 6000 x g po 10 minut při 4 °C a supematant uschováván při -20 °C pro následnou afinitní purifikaci na papain-sepharose.

Příklad 4

Purifíkace a charakterizace rekombinantního ekvistatínu

A. Afinitní purifíkace s použitím papain-sepharosy:

ml šlemu papain-sepharosy se smíchá s 15 ml 0,02 M NaOH na 10 minut. Následně se šlem aplikuje do 15 ml kolony se skleněnou fritou. Kolona se promyje 3 x s 30 ml 100 mM Tris pufru, pH = 7,0 a nakonec s 10 ml 50 mM MES pufru, pH - 6,5 (s přídavkem cysteinu na finální kon45 centraci 0,6 mg/ml). Supernatant z 1 1 bakteriální kultury získané jak je popsáno shora (Příklad 3) se po kapkách aplikuje na kolonu. Papain—sepharosa se pak promývá s 20 ml 50 mM MES pufru, pH = 6,5 (bez cysteinu) a s 50 ml 20 mM Tris pufru, pH = 7,5. Vzorek se získá elucí kolony s 20 ml 20 mM Tris pufru, pH = 10,3 (bez adjustace pH s HCI), 20% DMSO. Purifikovaný ekvistatin se díalyzuje proti a koncentruje za použití minikoncentrátorů Sartricon k dosažení finální koncentrace 350 μΜ.

B. Stechiometrie a inhibiční konstanty pro rekombinantní ekvistatin

V mikrotitrační destičce se spojí 20 μ 1 roztoku papainu (čerstvý roztok 1 mg/ml (Sigma) v MES pufru titrovaný E-64 ke stanovení aktivní frakce, obvykle 17%) s 0 - 80 μΙ o známé bílkovinné

- 19CZ 300639 B6 koncentraci. Přidá se MES pufr (50 mM MES, pH 6,5, 0,6 mg/ml L-cysteinu, 1 mg/ml BSA frakce V) na konečný objem 150 μΐ. Směs se inkubuje po 30 minut za pokojové teploty a následně se přidá 50 μΙ roztoku substrátu (60 μΐ 15 mg/ml Z-Phe-Arg-pNA rozpuštěných v methanolu se zředí v 940 μΙ MES pufru před použitím). Destička se okamžitě umístí do čtečky mikrotitračních destiček a měří při 405 nm. Odečítané hodnoty až do OD600 hodnoty 0,3 jsou lineární. Změny rychlosti se použijí ke stanovení aktivity s rostoucími množstvími inhibitoru. Výsledky se graficky vynesou a při stechiometrických koncentracích je stanoveno množství disociovaného komplexu ke stanovení zdánlivé rovnovážné disociační konstanty (Ki). Tyto výsledky určily, že jedna molekula ekvistatinu bude inhibovat přibližně 1 molekulu papainu. Zdánlivá rovnovážná disoio ciační konstanta pro papain byla stanovena jako 0,6 nm v souladu s daty publikovanými pro puntíkovanou bílkovinu (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13 899-13 903).

Příklad 5

In vitro inhibiee proteázové aktivity středního střeva mandelinky bramborové

Střeva konečné instamí fáze larev mandelinky bramborové živené na methyIjasmonátem indukovaných rostlinách byla izolována a extrahována v podstatě jak je popsáno (Bolter a Jongsma (1995) J. Insect Physiol. 41: 1 071-1 078). V těchto střevních extraktech jsou již proteázy, jež jsou citlivé k proteázovým inhibitorům z brambor, vázány v komplexech. Zbývající proteázová aktivita je složena z proteáz necitlivých k bramborovým proteázovým inhibitorům, jež jsou indukovány v odezvě na methyljasmonátem indukované bramborové inhibitory. Tyto proteázy jsou proteázami, jež mohou přinést u larev brouků necitlivých k proteázovému inhibitoru ochranu bramborové rostliny. Testovali jsme velkou řadu inhibitorů cysteinových proteáz na aktivitu specificky proti těmto indukovaným cysteinovým proteázám necitlivým k bramborovým proteázovým inhibitorům. Skoro všechny tyto inhibitory byly purifikovány v Ústavu Jozefa Stefana ve Slovinsku. Testování jejich potenciálu proti mandelince bramborové se provádělo s použitím jak obecných bílkovinných substrátů (azokasein, Tabulka 2), tak specifických syntetických substrátů (L-Arg-pNA, Tabulka 3, pGlu-Phe-Leu-pNA, Tabulka 4, zPhe-ArgpNA, Tabulka 5, zArg-Arg-pNA, Tabulka 6). Ve specifických případech byly inhibitory testovány ve dvou koncentracích, ekvimolámí a v přebytku k proteáze, pro získání indikací o pevnosti daného komplexu. Většina testovaných inhibitorů byla bud’ neaktivní nebo jen slabě inhibiční. Pouze inhibitory cysteinových proteáz s opakující se thyroglobulínovou doménou typu I, jež byly testovány (purifikovaný p41 fragment invariantního řetězce a purifikovaný ekv i stát in) byly konsistentně vysoce aktivní proti testované end o- a exo- proteolytieké aktivitě larev mandelinky bramborové (Tabulky 2-6, Obrázek 4). Je důležité, že tato třída inhibitorů byla schopna inhibovat téměř veškerou obecnou cystě inově-proteázovou aktivitu. Molekula ekvistatinového peptidu a její funkční deriváty nebyly příliš aktivní proti aktivitě cysteinových proteáz podobné amidopeptidasové. Rekombinantní lidský stefin A byl vysoce aktivní proti tomuto typu aktivity. Nej lepší kombinací inhibitorů pro plnou toxicitu proti mandelince bramborové by tedy byla kombinace ekvistatinu nebo p41 fragmentu invariantního řetězce a inhibitorů podobných stefinu.

-20CZ 300639 B6

Tabulka 3

Účinky různých inhibitorů cysteinových proteáz na obecnou proteolytickou aktivitu extraktů střev larev mandelinky bramborové měřenou s azokaseinem

Rodina inhibitoru cysteinových proteas	Jméno	Zbytková aktivita v přebytku ihibitoru
Cystatiny typu I	Lidský stefin A	90 %
Potkaní stefin A	90 %
Prasečí stefin B	100 %
Prasečí stefin Dl	105 %
Prasečí stefin D2	105 %
Cystatiny typu II	Kuřecí cystatin	105 %
Lidský cystatin C	105 %
Cystatiny typu III	Bovinní kininogen	110 %
Lidský LMW kininogen	65 %
3. doména lidského kininogenu	20 %
Fytostatiny	Cystatin Chalídonium majuB	100 %
	Cyst at in kravského bobu	75 %
Cystatin čočky	60 %
Sójový cystatin	65 %
Bramboi'ový multicystatin	90 %
Bromelainový inhibitor	110 %
Domény typu I thyroglobulinu	p41 fragment invariantního řetězce	10 %
Ekvistatin	10 %
Rostlinný Kunitz CPI	PCPI 6.6	120 %

-21 CZ 300639 B6

Tabulka 4

Účinek různých inhibitorů cysteinových proteáz na aminopeptidasovou aktivitu měřenou s LArg-pNA

	% zbytkové aktivity
přebytek inhibitoru	ekvimolární
Ekvistatin a p41 fragment invariantního řetězce	75 %	85 % t
Lidský stefin A	10 %	60 %
Kininogeny	75 %	nestanoveno
Fytostatiny z Fabaceae	75 %	nestanoveno

Tabulka 5

Účinek různých inhibitorů cysteinových proteáz na specifickou tri-peptidyl-peptidasovou io a endoproteázovou aktivitu měřenou s pGlu-Phe-Leu-pNA

	% zbytkové aktivity
přebytek inhibitoru	ekvimolární
Ekvistatin a p41 fragment invariantního řetězce	~5 %	10 %
Lidský stefin A	90 %	95 %
Kininogeny	20 %	nestanoveno
Fytostatiny z Fa.ba.ceae	70 %	nestanoveno

Tabulka 6

Účinek různých inhibitorů cysteinových proteáz na širokospektrální aktivitu měřenou endoproteázovou s Z-Phe-Arg-pNA

	% zbytkové aktivity
přebytek inhibitoru	ekvimolární
Ekvistatin a p41 fragment invariantního řetězce	20 %	30 %
Lidský stefin A	80 %	95 %
Kininogeny	—20 %	nestanoveno
Fytostatiny z Fabaceae	50 %	65 %

-22CZ 300639 B6

Tabulka 7

Účinek různých inhibitorů cysteinových proteáz na úzkospektrální endoproteázovou aktivitu měřenou s Z-Arg-Arg-pNA

	% zbytkové aktivity
přebytek inhibitoru	ekvimolární
Ekvistatin a p41 fragment invariantního řetězce	~5 %	20 %
Lidský stefin A	90 %	ne s t anoveno
Kininogeny	10 %	nestanoveno

Příklad 6

In vitro inhibice proteázové aktivity dospělých třásněnek západních a vrtalovitých květomilek ío a konečné instamí fáze larev mandelinky bramborové a mandelinky Diabrotica Spp. měřená s FITC-značeným hemoglobinem

Dospělé třásněnky západní (Frankliniella occidentalis) a dospělé vrtal ovité květilky (Liriomyza trifolii) byly sklizeny z kultury udržované na rostlinách chrysantém a kompletní třásněnky a květilky byly homogenizovány v extrakěním pufru (200 mM β-alanin-Hcl, pH 3,5) v objemu pětkrát větším než váha hmyzu. Hodnota pH pufru odpovídala dříve stanovenému pH optimu proteázové aktivity k hemoglobinu. Larvy konečné instamí fáze mandelinky bramborové udržované na rostlinách brambor jak je popsáno v Příkladu 5 byly testovány na střevní aspartátověproteázovou aktivitu s přípravou celkového střevního extraktu v pufru pH 3, jenž je optimální pro aspartátovou proteázu mandelinky bramborové (200 mM glycin, pH 3). Střeva byla homogenizována v 100 μΙ pufru najedno střevo. Larvy třetí instamí fáze mandelinky Diabrotica udržované na kukuřičných kořenech se použily k vytažení střeva. Deset střev bylo homogenizováno ve 100 μΐ vody a stočeno dvakrát k odstranění nerozpustného materiálu. K enzymovým testům byly použity dva typy pufrů. Jeden o pH 6 předpokládané upřednostňující cysteinové proteázy (50 mM MES, pH 6,5, 0,6 mg/ml L-cysteinu) a jeden k detekci aspartátových proteáz (200 mM glycin, pH 3). Supernatanty byly uschovány při -20°.

μΐ extraktu střeva byly spojeny s 2 μΐ inhibitoru (2 mM pepstatin v methanolu, 4 mM E64 ve vodě, 2 mg/ml rekombinantního ekvistatinu ve vodě. Koncentrace ostatních bílkovinných inhibi30 torů nebyly přesně známé). Patřičné pufiy byly přidány do konečného objemu 100 μΐ. Po patnáctiminutové preinkubaci bylo přidáno 20 μΐ substrátu (5 mg/ml FITC-hemoglobinu) a inkubováno po 30 - 45 minut při 37 °C. Reakce byla zastavena přidáním 100 μΙ 10 % TCA. Zkumavky byly centrifugovány a 100 μΐ supernatantu smíchaného s 100 μΐ 10N NaOH bylo měřeno na fluorimetru k určení rozsahu hydrolýzy hemoglobinu. Měření byla provedena v duplikátech na jednom (třásněnky, květilky a Diabrotica) nebo třech (mandelinka bramborová) různých extraktech střev a lišila se nejvýše o +/- 5 %.

Účinky různých inhibitorů cysteinových a aspartátových proteáz jsou vyneseny v Tabulce 8. Poskytují účinky různých proteázových inhibitorů (PI) k „PI-necitlivým proteázám“ třásněnek akvětilek na chiysantémách, mandelinek na bramborách a Diabrotica na kukuřici, protože indukované PI přítomné v rostlinném materiálu a pozřené daným hmyzem budou přítomné v extraktu v komplexu s vnímavými proteázami.

Proteázová aktivita třásněnek může být z 92% inhibována E64 (PI cysteinových proteáz) a z 16% pepstatinem (PI aspartátových proteáz) při pH 3,5, jež je optimální pro obecnou

-23 CZ 300639 B6 proteázovou aktivitu třásněnek. Aspartátové proteázy zřejmě nejsou dominantní v tomto hmyzu. Invariantní řetězec p41 vedl k 87 % inhibice zatímco ekvistatin poskytoval 95% inhibice proteázové aktivity. Dobrými inhibitory cysteinových proteáz třásněnek jsou jasně jak invariantní řetězec p41 (Pl cysteinových proteáz), tak ekvistatin (Pl cysteinových/aspartátových proteáz), i když ekvistatin by mohl být trochu lepší z důvodu dodatečné inhibice aspartátových proteáz.

Proteázy vrtalovité květilky lze plně inhibovat jen kombinací E64 (Pl cysteinových proteáz) a pepstatinu (Pl aspartátových proteáz). (97 %). Bramborový cystatin a Kunitz PCPI8.3 jsou oba inhibitory cysteinových proteáz, jež mají schopnost inhibovat z 63 %, srovnatelných s 73 % pro io E64. Přidání ekv i stati nu k těmto dvěma inhibitorům vede k 92 % inhibice, což dokládá, že ekvistatin musí mít vedle inhibiční aktivity k cysteinové proteáze květilky i inhibiční aktivitu k aspartátové proteáze květilky. K optimální kontrole květilky může být potřebné společné použití ekvistatinu s bramborovým cystatinem a Kunitzem PCPI8.3.

Proteázy mandelinky bramborové mohou být při pH 3 plně (97%) inhibovány kombinací E64 (24 %) a pepstatinu (82 %). Přídavek ekvistatinu buď k E64, nebo k pepstatinu zvyšuje inhibici o 42 % (24 % + 42 % = 66 %) respektive 12 % (82 % + 12 % - 94 %) což ukazuje, že ekvistatin inhibuje víc než 50 % aktivity jak aspartátové tak cysteinové proteázové aktivity za tohoto pH. Ekvistatin samotný inhibuje 62 % celkové proteázové aktivity za tohoto pH. Zdá se, že částečná inhibice při pH 3 spolu s téměř úplnou inhibici při pH 6,5 (Příklad 5) je dostatečná k plné kontrole tohoto hmyzu (Příklad 7).

O mandelince Diabrotica se ví, že má kombinaci jak cysteinových, tak aspartátových proteáz (Gillikin etal. (1992) Arch. Insect Biochem. Physiol. 19: 285-298). Účinky ekvistatinu, E64 a pepstatinu byly testovány při dvou různých hodnotách pH. Data v Tabulce 8 ukazují, že ekvistatin téměř úplně inhibuje veškerou aktivitu cysteinových a aspartátových proteáz (93 % při pH 6,5 a 98 % při pH 3) a je dokonce silnější než kombinace E64 a pepstatinu (79 % resp. 89 %). Tyto in vitro výsledky jsou dokonce lepší než in vitro výsledky pro mandel inku bramborovou v příkladech 5 a 6 a ukazují, že u ekvistatinu lze při expresi v kukuřičných kořenech očekávat toxicitu k mandelince Diahrotica.

-24CZ 300639 B6

Tabulka 8

In vitro inhibiční testy: měření zbytkové proteázové aktivity v extraktech různého hmyzu

Inhibitory	Irásněnka pH 3,5	; Květilka pH 3,5	Mandelínka bramborová pH 3	Mandelínka Diabrotica pH 6,5	Mandelínka Diabrotica pH3
kontrola	100%	100%	lóo %	100 %	100%
E64	8%	27%	76%	51 %	35%
E64/ekvistatin (El)	nestán.	nestán.	34%	29%	8%
Pepstatin	84%	46%	18%	58 %	45%
Pepstatin/EI	nestán.	nestán.	6%	6%	0%
E64/ Pepstatin	nestán.	3%	3%	21 %	11 %
El	5%	24%	38%	7%	2%
p41 invariantní řetězce	13 %	43%	nestán.	nestán.	nestán.
br. cystatin	nestán.	73%	nestán.	nestán.	nestán.
PCPI8.3	nestán.	43%	nestán.	nestán.	nestán.
API	nestán.	37%	nestán.	nestán.	nestán.
br. cystatin/ PCPI8.3	' nestán.	8%	nestán.	nestán.	nestán.
br. cystatin/ PCPI8.3/API	nestán.	7%	nestán.	nestán.	nestán.
br. cystatin/ PCPI8.3/EI	nestán.	nestán.	nestán.	nestán.	nestán.
cystatin fazole	14%	nestán.	nestán.	nestán.	nestán.

- Rekombinantní Kunitz PCPI8.3 (Stiekema et al. (1987) Plant. Molec. Biol. 11: 255-263) byl produkován v kvasinkách Pichia pastoris a purifikován ze supernatantu kultury katexovou chromatografií.

= Rekombinantní bramborový cystatin (br. cystatin) představuje monomer multicystatinu klonovaného RT-PCR z brambor cv. Superior a exprimovaného a purifikovaného jako fúzní protein s glutathion-S-transferasou (Pharmacia).

- Ekvistatin byl buď purifikován z mořského měkkýše (Lenarcic etal. (1997) J. Biol. Chem.

272: 13 899, Lenarcic et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 12 682) (testy třásněnky a květilky), nebo rekombinantní z E. coli (mandelinka bramborová a mandelinka Diabrotica).

- Inhibitor aspartátové proteázy (API) byl purifikován z brambor (Kreft etal. (1997) Phytochemistry44: 1001-1006).

Příklad 7

Toxicita ekvistatinu k larvám mandě linky bramborové 25

Hlízy brambor kultivaru Surprise (Solárním tuberosum) byly naklíčeny. Naklíčené hlízy byly zasazeny do 1 1 květináčů a nechány růst po 3 až 4 týdny při 22/18 °C, 16/8 hodin rytmu dne a noci. Rostliny vysoké 10 až 15 cm byly dány do sklenic spolu s papírovým knotem, na nějž bylo pipetováno 2 μΐ methyl—jasmonátu. Sklenice byly okamžitě uzavřeny parafilmem a dány do klimatizované komory s 30 °C a trvalým osvětlením. Kontrolní rostliny byly dány do komory

-25 CZ 300639 B6 s 25 °C a 16/8 hodinovým rytmem dne a noci. Po jednom dni při 30 °C byly rostliny vyňaty ze sklenic a umístěny do stejné komory jako kontroly. Rostliny byly použity v den 3. Pro každý následující den krmení byly použity čerstvě zpracované rostliny. Toto zpracování vedlo k vysokým hladinám endogenních PI v rostlinách, na něž působil methyl-jasmonát. Vrchní meristema byla oddělena z rostlin a potřena po obou stranách 175 μΜ roztokem rekombinantního ekvistatinu v 0,3 % agaru, získaného smícháním 1:1 zásobního 350 μΜ roztoku ekvistatinu a 0,6 % vodného agaru. Kontroly byly potřeny 0,3% agarem. Agarový roztok byl aplikován v koncentraci 30 μΙ/cm². Konečná koncentrace na listech byla odhadnuta na 70 μΜ, což je ekvivalent 1,4 mg/g listů. Potřené listy byly umístěny do zkumavky obsahující 0,4 % agar a dány na filtrační papír io uvnitř Petriho misky. Na listy bylo umístěno 21 až 26 čerstvě vylíhlých larev mandelinky bramborové a Petriho miska byla dána do inkubátoru nastaveného na 28 °C. Každý den čerstvé natřené listy nahradily staré.

V tabulkách 9 a 10 jsou shrnuty účinky na růst a mortalitu larev mandelinky bramborové.

Z těchto tabulek je zřejmé, že ekvistatin aplikovaný na kontrolní rostliny s nízkými hladinami endogenních proteázových inhibitorů je schopen prudce snížit vývoj a způsobovat vysoké mortality na larvách už po 4 dnech. Aplikace ekvistatinu na listy obsahující vysoké endogenní hladiny PI, indukované předchozím působením methyl-jasmonátu, však dále zesiluje toxické účinky tohoto inhibitoru. To potvrzuje očekávaný synergický účinek tohoto inhibitru, protože je specific20 ky zaměřen k „Pl-necitlivým proteázám“ larev mandelinky bramborové.

Tabulka 9

Účinek rekombinantního ekvistatinu na růst larev mandelinky bramborové

Působení	Den 1	Den 2	Den 3	Den 4
Kontrola	n.d.	n.d.	9	13,8
Kontrola + ekvistain	n.d.	n.d.	0,5	0,7
MeJa-kontrola	n.d.	n . d-	7,5	10
MeJa-kontrola + ekvistatin	n.d.	n.d.	n.g.	n.g.

V jednom experimentu bylo testováno 21 až 26 larev.

Udány jsou hmotnosti v mg/larvu.

n.d. znamená nebylo stanoveno, n.g. znamená nerostou nebo nežijí.

Tabulka 10

Účinek rekombinantního ekvistatinu na procentní mortalitu larev mandelinky bramborové

Působení	Den 1	Den 2	Den 3	Den 4
Kontrola	0	0	Ó	0
Kontrola + ekvi stain	0	10	52	76
MeJa kontrola	0	0	0	0
MeJa-kontrola + ekvistatin	0	23	77	92

V jednom experimentu bylo testováno 21 až 26 larev.

-26CZ 300639 B6

Příklad 8

In vivo účinek ekvistatinu na oviposici třásněnek 5

Vzorek 142 μΜ rekombinantního ekvistatinu purifikovaného jak je popsáno v příkladu 4 byl testován na aktivitu proti třásněnkám. Vzorek byl okyselen Hel na pH 3 ke stabilizaci ekv i slatinové bílkoviny. Kontroly obsahovaly okyselenou vodu nebo 2,5 mg/ml BSA rozpuštěného v okyselené vodě. Oviposiční rychlost samiček třásněnek byla testována s použitím takzvaných io Muraiho klícek. Ve stručnosti: Plexisklové trubice uzavřené na straně jemnou gázou byly inokulovány 10 samičkami a včelím pylem. Trubice byly uzavřeny parafilmem a na parafilm bylo umístěno 300 μΐ kapaliny. Kapalina byla uzavřena druhou vrstvou parafilmu. Pyl a kapalina vzorku byly vyměňovány každý den po dva dny. Vajíčka snesená do kapalného vzorku byla spočítána v den 2.

Tabulka 11

Oviposiční rychlost dospělých samiček dva dny poté, co byly umístěny na různou potravu

Potrava	Vaj íček na dospělou samičku za den	Relativní procento
BSA		100 %
Voda	1,5	83 %
Ekvistatin	0,3	17 %

Příklad 9

Modifikace ekvistatinového genu ke zlepšené expresi v rostlinách

Ekvistatinová cDNA obsahuje v kódující oblasti několik potenciálních rostlinných polyadenylačních signálů, motivy nestability mRNA a suboptimální využití kodonů pro expresi v rostlinách. Ke zlepšení hladiny genové exprese v rostlinách mohou být tyto motivy odstraněny a kodony mohou být optimalizovány řízenou mutagenezou bez změny primární bílkovinné sekvence. Níže je udán příklad modifikací potřebných k získání zlepšené genové exprese v bramborách. Horní vlákno představuje kódující část cDNA klonu, pod nímž je uvedena navrhovaná modifikace cDNA sekvence a pod tím je udána kódovaná bílkovinná sekvence s použitím jednopísmenných kódů pro aminokyselinové zbytky.

-27 CZ 300639 B6

I ATGGCTCTTAGCCAAAACCAAGCCAAOTTTTCCAAAGGATTCGTCGTGATOATTTÚG

G G G

-32 MALSQNQAKFSKGPVVMIW

GTACTATrCATTGCTTGTGCTATAAtrrrCAACTGAAGCTAGTCTAACCAAATGCCAACAG C G

-13 VLFI ACAI T S TE ASLTKCQQ -I +1

120 CTCCAGGCCTCGGCTAACAGTGGTCTGATAGGTACTTATGTACCACAATGCAAAGAAACG G T T T

LQASANSCLIOTYVPQCK..ET

180 GGAGAGTrCGAAGAAAAACAATGCTGGGGATCGACTGGTTACTGTrGGTGTGTGGATGAA TG T

GEFE E KQCWG STGYCWCVOE

240 gatggaaaagagattctaggaaccaagatccgtggatctocggattgcagccgcagaaaa TA ACT

OGKEILGTKIRGSPDCSRRK

300 gccgcgttaacactttgccagatgatgcaagccatcattgttaatgtccctggttggtgi T C G

AALTLCQMMQA 1 I V N V p C W C

360 GGCCCTCCATCGTGTAAAGC'lGACGGCAGTTTTGACGAGGTTCAGTCCrGCGCAAGTAAT A A

GPPSCKADGSFDEVQCCASN

420 GGAGAATGCTACTGTGTGGATAAGAAAGGAAAAGAACTTGAAGGCACAAGACAACAGGGA

108 GECYCVDKKGKELEGTRQQG

480 AGGCCAACCTGCGAAAGACACCTAAGCGAATGCGAGGAAGCTCGAATCAAGGCGCATTCA

G T A

128 RPTCERHLSECEEARIKAHS

540 AACAGTCTTCGTGTTGAGATGTTCGTGCCAGAGTGTTTAGAAGATGGATCATATAACCCA T C T

148 NSLRVEMFVPECLEDGSYNP

600 GTACAGTGCTGGCCTAGCACAGGATACTGTTGGTGCGTCGATGAAGGAGGGGTAAAGGTA

T

168 VQCWPS TGYCWCV DE GGV KV

660 CCAGGncCGATGTCAGATTTAAACGCCCCACATGCTAA C C T

188 P G S D V R F K R P T C --28CZ 300639 B6

Příklad 10

Konstrukce rostlinných vektorů pro expresi ekvistatínu

Bramborový Cab promotor (Nap etal. (1993) Plant. Mol. Biol. 23: 605-612) byl amplifíkován zplasmidu pPPG pomocí PCR s použitím příměrů Pl-POTCAB a P2-POTCAB. Podobně byl Nos terminátor amplifíkován z plasmidu pPPG pomocí PCR s použitím primerů NOS-TERMDN a NOS-TERM-UP. Promotorový a terminátorový fragment byly štěpeny restrikčními enzymy EcoRI a Sací a ligovány do EcoRI digerovaného vektoru pUCAP (Van Engelen et al. io (1995) Transgenic Research 4: 288-290). Správný klon byl vybrán a sekvenován. Tento klon, pUCCABl byl digerován Ncol a BglII a použit k subklonování ekvistatinové kódující oblasti, jež byla amplifíkována PCR z plasmidu pB3-ekvistatin s použitím primerů EQUISTAT-DN a EQUISTAT-UP, a rovněž štěpena Ncol a BglII. Byl vybrán správný klon a insert ekvistinové eDNA klonu byl sekvenován. Správný klon, pUCCABl-ekvistatin, byl digerován EcoRI. EcoRI fragment obsahující kazetu exprese ekvistatínu byl lígován do rostlinného vektoru pBINPLUS (Van Engelen et al. (1995) Transgenic Research 4: 288-290), jenž byl rovněž digerován EcoRI. Byl vybrán správný klon. Tento klon, pCABl-ekvistatin, byl elektroporován do buněk efektrokompetentního Agrobacterium tumefaciens AGL-0. Pozitivní klony byly selektovány na LB médiu obsahujícím 100 mg/1 kanamycinu.

Tabulka 12

PCR-primery použité k PCR amplifikaci Jméno DNA

Pl-POTCAB: P2-POTCAB: NOS-TERM-DW: NOS-TERM-UP: EQUISTAT-DN: EOOISTAT-3GL ' -GGCGťXSOAATTCCTCACCTCTTACT^ACTCG 5' -GGCCGGGACCTCACATCTTCCCATCGTTTrrC' 5' - agatctgaoctctcgttcaaacatttgcca 5' -AAGCTTGAATTCGATCTAGTAACATAO 5' -GGCGCCATOGCTCTTAGCCAAAAC 5' -GGGGGAGATCTTTACCATGTGGGCCGT7T.V-.-\

Příklad 11

Transformace brambor rostlinnými vektory obsahujícími ekvistatinovou eDNA

V den 1 byla nastartována kultura Agrobacterium tumefaciens AGL-0 obsahujícího binární vektor pCABl-ekvistatin v 50 ml LB média obsahujícího 50 mg/1 kanamycinu a třepána po dva dny pří 28 °C. V den 2 byly vnitřní uzlinky z in vitro kultury bramborového kultivaru Desiree linie v nařezány na 0,5 až 1 cm kousky a umístěny do R3B média (30 g/l sacharosy, 4,7 g/l

Murashigeho a Skoogových solí, pH 5,8 (KOH), 8 g/l čištěného agaru, 2 mg/1 NAA a 1 mg/1 BAP), jež bylo překryto 2 sterilními filtračními papíry, předem smočenými s 2 ml PACM média (30 g/l sacharosy, 4,7 g/l Murashigeho a Skoogových solí, 2 g/l kaseinového hydrolyzátu, pH 6,5 (KOH), 1 mg/1 2,4-D a 0,5 mg/1 kinetinu). Misky byly uzavřeny páskou parafilmu a inkubovány přes noc při 24 °C za režimu 16 hodin světla. V den 3 byla do sterilních Petriho misek obsahují40 cích tyto explantáty přilita kultura A. tumefaciens. Po 5 až 10 minutách byly explantáty vyňaty z kultury, umístěny na sterilní filtrační papír k odstranění přebytku Agrobakteria a umístěny zpět na misky obsahující R3B médium poté, co byl napřed odstraněn svrchní filtrační papír (a druhý ponechán) Misky s explantáty byly dále inkubovány při 24 °C a 16 hodinách světla do dne 5, kdy byly explantáty přeneseny do misek obsahujících ZCVK médium (20 g/l sacharosy, 4,7 g/l

Murashigeho a Skoogových solí, pH 5,8 (KOH), 8 g/l čištěného agaru, 1 mg/1 zeatinu, 200 mg/ml

-29CZ 300639 B6 vancomycinu, 100mg/l kanamycinu, 200 mg/l claforanu). V den 19 a následně každé 3 až 4 týdny byly explantáty přeneseny do nového ZCVK média. Když se objevily klíčky, byly klíčky přeneseny do Murashigeho a Skoogova média obsahujícího 20 % sacharosy (MS20). Po zakořenění byly rostliny přeneseny do skleníku,

Příklad 13

Biotesty s larvami mandelinky bramborové na transgenních rostlinách brambor exprimujících io ekvistatin

Ekvistatinová cDNA sekvence, optimalizovaná pro expresi v rostlinách brambor, byla klonována do vektrou pCABl a transformována do linie V. Na rezistenci k čerstvě vylíhlým larvám mandeli nky bramborové bylo testováno 8 různých primárních transformantů. Z mladých rostlin byly odděleny listy, vloženy do zkumavky obsahující 0,4 % vodný čištěný agar a umístěny do Petriho misky s filtračním papírem. Šest náhodně vybraných čerstvě vylíhlých larev bylo umísťováno na jeden list. Listy byly vyměňovány za čerstvé po dvou dnech. V den 3 byly měřeny hmotnosti každé larvy jednotlivě. Tabulka 13 poskytuje výsledky ukazující, že 3 z šesti transformantů významně retardují růst larev. Některé rostliny postrádají rezistenci nej pravděpodobněji pro nízkou expresi, způsobenou suboptímální insercí T-DNA do rostlinného genomu. Rostliny byly příliš mladé k delšímu prodlužování pokusu pro chybějící listový materiál, ale bylo pozorováno, že na pCABl-EIM-1 byly všechny larvy v den 4 mrtvé. Přítomnost ekv i stati nové bílkoviny byla potvrzena „western“ analýzou a odhadnuta v transgenech, jež vykazovaly rezistenci, na > 0,1 %.

Tabulka 13

Výsledky biotestů na transgenních rostlinách brambor transformovaných ekv i stati novým genem optimalizovaným pro expresi v rostlinách

Rostlina*	Larvální hmotnost15
Linie V	9,93 a
PBINPLUS	10,67 a
pCABl-EIM-1	4,03 b
pCABl-EIM-2	5,45 b
pCABl-EIM-3	8,77 a
pCABl-EIM-6	9,92 a
pCABl-EIM-7	8,55 a
pCABl-EIM-8	5,85 b
pCABl-EIM 9	9,18 a
pCABl-EIM-10	11,15 a

^a Testované rostliny byly: Linie V, in vitro rostlina přenesená do skleníku současně s transformanty, pBINPLUS, transformant s prázdným vektorem bez kazety promotor-gen, pCABl-10, prvních 8 transformantů linie V s optimalizovaných ekvistatinovým genem pod kontrolou CAB promotoru.

-30CZ 300639 B6

Průměrná larvální hmotnost (mg) šesti larev. Písmenkový kód za hmotností larev ukazuje významnost stanovenou pomocí ANOVA.

Příklad 13

Izolace homologických sekvencí z jiných organismů k nalezení nebo generování vylepšených inhibitorů

Šest aminokyselinových zbytků Gly-Tyr-Vys-Trp-Cys-Val, jež jsou silně konzervované mezi inibitory cysteinových a aspartátových proteáz s opakující se thyroglobul i no vou doménou typu 1, ať už z lidského, lososího a měkkýšího zdroje, lze použít k izolaci homologických sekvencí se zlepšenou specifitou. K těmto sekvencím mohou být navrženy degenerované PCR příměry kamplifikaci genomických nebo eDNA fragmentů, jež lze využít jako sondy k izolaci celých kódujících sekvencí, například z eDNA knihoven nebo pomocí 5' RACE experimentů z purifikované mRNA. Jako nový zdroj opakujících se thyroglobul inových domén typu I lze použít jakýkoli organismus. Sbírku genů lze použít k experimentům s „přehazováním“ genů k izolaci nových spec i fit.

Claims (12)

1. Způsob ochrany rostliny nebo části rostliny proti hromadnému hmyzímu nebo červovému napadení jedním nebo více druhy hmyzu nebo nematod, jež mají trávicí cysteinové proteázy, vyznačující se tím, že se na rostlinu aplikuje zemědělský ochranný prostředek obsahující inhibiění množství inhibitoru cysteinové proteázy, kterým je protein se SEKV ID Č: 2.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hmyz má cysteinové proteázy necitlivé k inhibitorům cysteinových proteáz odvozeným z hostitelské rostliny.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že hmyz je vybrán ze skupiny tvořené mandelinkou bramborovou (Leptinotarsa decemlineata), mandelinkou Diabrotica (Diabrotica spp.), třásněnkami (Frankliniella occidentalis) nebo vrtalkovitými (Agromyzidae species).

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že nematody jsou háďátka cyst (Heterodera spp,, Globodera spp.) nebo háďátka kořenových uzlíků (Meloidogyne spp.).

5. Způsob přípravy transgenní rostliny, vyznačující se tím, že se do genomu rostliny zavede kódující sekvence, která kóduje bílkovinu se SEKV ID Č: 2, s promotorovou sekvencí aktivní v rostlině pro způsobení exprese bílkoviny v hladinách, jež poskytují hmyz nebo nematodu kontrolující množství bílkoviny.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že hmyz má cysteinové proteázy necitlivé k inhibitorům cysteinových proteáz odvozeným z hostitelské rostliny.

7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že hmyz je vybrán ze skupiny tvořené mandelinkou bramborovou (Leptinotarsa decemlineata), mandelinkou Diabrotica (Diabrotica spp.), třásněnkami (Frankliniella occidentalis) nebo vrtalkovitými (Agromyzidae species).

-31 CZ 300639 B6

8. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že nematody jsou háďátka cyst (Heterodera spp., Globodera spp.) nebo háďátka kořenových uzlíků (Meloídogyne spp.).

9. Způsob podle některého z nároků 5 až 8, v y z n a Č u j í c í se t í m , že se dále

a) kultivují buňky nebo tkáně z rostliny,

b) zavede se do buněk nebo tkáně alespoň jedna kopie genu kódujícího bílkovinu se SEKV ID Č: 2,

c) regeneruje se rezistentní celá rostlina z kultury buněk nebo tkání.

10. Transgenní rostlina a její pohlavní potomstvo rezistentní k napadení jedním nebo více druhy hmyzu nebo nematod, jež mají trávicí cysteinové proteázy, která exprimuje množství bílkoviny se SEKV ID Č: 2, kontrolující hmyz nebo nematody.

11. Biologicky funkční vektor exprese, který obsahuje promotor účinný v řízení pod ním zařazené kódující sekvence v rostlinných buňkách, DNA kódující oblast, která kóduje expresi bílkoviny se SEKV ID Č: 2 v rostlinných buňkách, a terminační sekvenci účinnou pro terminaci transkripce nebo translace produktu genetické konstrukce v rostlinných buňkách, přičemž genetická konstrukce je účinná v expresi hmyz kontrolujících množství bílkoviny se SEKV ID Č: 2.

12. Hostitelská buňka, která je transformovaná biologicky funkčním vektorem exprese podle nároku 11.