HU225427B1

HU225427B1 - A method for plant protection against insects or nematodes

Info

Publication number: HU225427B1
Application number: HU0001839A
Authority: HU
Inventors: Vito Turk; Kristina Gruden; Maarten Anthonie Jongsma; Borut Strukelj; Brigita Lenarcic; Hendrik J Bosch; Willem Johannes Stiekema
Original assignee: Plant Res Int Bv
Priority date: 1997-06-18
Filing date: 1998-06-18
Publication date: 2006-11-28
Also published as: CZ300639B6; HUP0001839A2; WO1998058068A3; HUP0001839A3; CZ450399A3; EP0991769B1; AU752020B2; EP0991769A2; PL337826A1; AU8132498A; CA2294421A1; SK172499A3; BR9810192A; WO1998058068A2; PL189808B1; CA2294421C; ATE419365T1; US6861578B1; TR199903122T2; DE69840404D1

Description

A találmány tárgyát növény vagy növényi rész rovarvagy nematódafertőzés elleni védelmére szolgáló eljárás képezi, egy vagy több olyan rovar vagy nematóda ellen, amelyekben emésztőrendszeri cisztein- és/vagy aszparaginsavproteázok találhatók, mely eljárás során azon helyre, ahol rovarok vagy nematódák számának szabályozása kívánatos, cisztein- és/vagy aszparaginsavproteáz-inhibitor gátlóhatású mennyiségét kihelyezzük.

A találmány szerinti megoldás alkalmas új növényvédelmi eljárások kifejlesztésére.

Sok zöldségfélét, kertészeti és szántóföldi terményt támadnak meg rovar kártevők. A legtöbb növény valamely mértékű ellenálló képességet mutat bizonyos rovarokkal vagy nematódákkal szemben; az ellenálló képesség lehet fizikai vagy kémiai alapú, (gy például a levélszőrök sok növényen képesek megakadályozni, hogy a kisméretű rovarok eléggé közel kerüljenek a felülethez ahhoz, hogy azt képesek legyenek megrágni. Más esetekben a növények komplex molekulák széles körét alkalmazzák, hogy szöveteiket toxikussá vagy visszataszítóvá tegyék. Hagyományosan az ilyen növényfaló rovarok és nematódák visszaszorításának kérdését részben termesztési és nemesítési módszerekkel közelítették meg. Ezen veszteségek csökkentésének egyik hatásos módja lehet olyan termesztési változatok alkalmazása, amelyek rovar kártevőkkel szemben rezisztenciát biztosító génekkel rendelkeznek [lásd például: Painter „Insect Resistance in Crop Plants” Macmillan, New York, (1951)]. A növénynemesítők megpróbálkoztak a rovar- és nematódatámadás okozta veszteségek csökkentésével oly módon, hogy ellenálló képességet biztosító géneket építettek be a változataikba hagyományos nemesítési programok során.

A gazdanövény ellenálló képességének klasszikus megközelítése - bár jelentős mértékben eredményes néhány esetben - meglehetősen kísérleti jellegű. Miután az egyes ellenálló képesség „jellegeket” felfedezték, ezeket mezőgazdasági szempontból elfogadható vonalakba viszik át szelekciós eljárások útján. A klasszikus megközelítés egyik korlátja az, hogy az ellenálló képességért felelős gének átvitele az egyik növényről a másikra csak a keresztezhető fajok esetére korlátozódik. Továbbá az ilyen típusú ellenálló képesség több gén szabályozása alá eshet, és így a növénynemesítő számára nehézségeket okoz ezek kihasználása. Az ellenállóképes változatok gyakran mutatnak terméscsökkenést, és így gazdaságilag nem életképesek. Továbbá amennyiben nem azonosítható ellenálló képesség egy fajon belül vagy a rokon fajokon belül, akkor a klasszikus nemesítés útján történő rovar kártevővel szembeni ellenálló képesség javítás nem lehetséges.

Nagymértékben támaszkodunk kémiai peszticidekre a rovarok és nematódák számának korlátozásához. Ezeket a szereket tipikusan a talajon vagy abba beleforgatva alkalmazzuk, vagy a növények levelein, illetve csapdákban alkalmazzuk. A kémiai peszticidek rendelkezésünkre álló nagy választéka ellenére a növényfaló rovarok és növényi parazita nematódák továbbra is súlyos problémát jelentenek. Sok kémiai peszticid hátrányos tulajdonsága, hogy ismételt alkalmazásukra van szükség. Sok peszticid alkalmazása során lényeges problémát jelent a rovarok azon képessége, hogy az alkalmazott szerekkel szemben ellenállóvá válnak. Ez a jelenség a rovarpopuláció leginkább ellenálló tagjainak a kiválasztódásán alapul a szer ismételt alkalmazása során. Továbbá ezek a kémiai anyagok károsítják a természetes környezetet, és szennyezik a talajvizet. Szükség van tehát új, rovarok elleni védekezésben alkalmazható szerekre, közelebbről olyan szerekre, amelyek hatásmódja eltér a hagyományos inszekticidek és nematódaellenes szerek hatásmódjától.

A szintetikus vegyületek alternatívájaként bizonyos, természetes körülmények között előforduló szert izoláltak és fejlesztettek ki, mint peszticidet. Ezek közé tartoznak növényi és mikrobiális szekunder metabolitok és fehérjék, valamint a rovarok vagy a nematódák természetes ellenségei vagy patogénjei (beleértve más rovarokat, gombákat, baktériumokat és vírusokat). Továbbá ahogy a rekombináns DNS technológia fejlődött, donor szervezetből származó géneket vihetünk át befogadó szervezetre, így a befogadó szervezet új fenotípusát állítva elő. A transzgenikus növények esetében ez a fenotípus ellenállóképes lehet a rovarok okozta kártétel vagy a nematódafertőződés ellen, amennyiben a bejuttatott gén olyan polipeptidet kódol, amelynek aktivitása a kártevőt károsító hatást vált ki. Ennek következtében nagyfokú érdeklődés követi - és nagy haszonnal kecsegtet - olyan polipeptidek megtalálása, amelyek ilyen hatással rendelkeznek. Ezen polipeptidek génjei alkalmazhatók élő szervezetek - közelebbről növények és mikrobák - módosítására, hogy azok képesek legyenek károsan befolyásolni a rovar kártevők növekedését és kifejlődését. Számos ilyen polipeptid került leírásra Bacillus thüringiensis-bő\, valamint különböző fehérjeszerű proteáz- és amilázinhibitorok és különböző növényi lektinek kerültek leírásra.

A rovarok és nematódák egy olyan fiziológiai rendszere, amelyről ismert, hogy specifikus inhibitorok gátlóhatására fogékony, az emésztőrendszeri proteázok működése. Az emésztőrendszeri proteázok az elfogyasztott fehérjéket és polipeptideket hidrolizálják a peptidkötések hasítása útján. A „proteáz” kifejezés a leírás szerint specifikusan magában foglalja a négy fő katalitikus osztály endopeptidázait és exopeptidázait: szerinproteázok, ciszteinproteázok, aszparaginsavproteázok és metalloproteázok [lásd például: Laskowski és munkatársai: Ann. Rév. Biochem. 49 593 (1983)]. Az osztály - amelyhez egy adott proteáz tartozik meghatározható azon pH-tartomány alapján, amelyben aktív, adott fehérjéken kifejtett hidrolizálóképessége alapján, más jól jellemzett proteázokkal való hasonlósága alapján és a különböző inhibitorokkal szemben mutatott érzékenysége alapján.

Különböző típusú rovar és nematóda emésztőenzimek szabadítanak fel peptideket és aminosavakat a táplálékul szolgáló fehérjékből. Az emésztőenzimek egy osztályát képezi a ciszteinproteázok osztálya. A „ciszteinproteáz” kifejezés a leírás során olyan pro2

HU 225 427 Β1 teázt jelent, amely cisztein aminosav erősen reaktív tiolcsoportját hordozza az enzim katalitikus helyén. Bizonyítékok vannak arra, hogy sok növényfaló rovar és növényi parazita nematóda támaszkodik - legalábbis részben - az emésztőrendszer középtáján található ciszteinproteázokra a fehérjék lebontásában. Ezek nem korlátozó jelleggel magukban foglalják az alábbiakat: Hemiptera nemzetség, közelebbről tökbogarak (Anasa tristis); zöld bűzösbogarak (Acrosternum hilare); Riptortus clavatus; és csaknem az összes eddig megvizsgált Coleoptera, közelebbről kolorádóbogár (Leptinotarsa decemlineata); háromcsíkos burgonyabogár (Lema trilineata); spárgabogár (Crioceris asparagi); mexikói babbogár (Epilachna varivestis); vörös lisztbogár (Tribolium castaneum); összetéveszthető lisztbogár (Tribolium confusum); a bolhabogarak (Chaetocnema fajok, Haltica fajok és Epitrix fajok); kukorica-gyökérféreg (Diabrotica fajok); tehénborsózsizsik (Callosobruchus maculatus); gyapotmagzsizsik (Anthonomus grandis); rizszsizsik (Sitophilus oryza); kukoricazsizsik (Sitophilus zea-mais); gabonazsizsik (Sitophilus granarius); egyiptomi lucernazsizsik (Hypera postlca); babzsizsik (Acanthoscelides obtectus); kis gabonafúró (Rhyzopertha dominica); sárga lisztféreg (Tenebrio molitor); Thysanoptera-félék, közelebbről nyugati virágtripsz (Frankliniella occidentalis); Diptera-félék, közelebbről levélfúró fajok (Liriomyza trifolii): növényi parazita nematódák, közelebbről a burgonya ciszta nematódák (Globodera fajok), a cékla ciszta nematóda (Heterodera schachtii) és gyökérgümő nematódák (Meloidogyne fajok).

Az emésztőenzimek egy másik osztályát alkotják az aszparaginsavproteázok. Az „aszparaginsavproteáz'’ kifejezés alatt a leírás során olyan proteázt értünk, amely két nagymértékben reaktív aszparaginsav aminosavat tartalmaz az enzim katalitikus helyén, és amelyet leggyakrabban a pepstatin - csaknem az összes ismert aszparaginsavproteáz kis molekulatömegű inhibitora - okozta specifikus gátlás alapján azonosítunk. Bizonyítékok vannak arra, hogy sok növényfaló rovar támaszkodik - legalábbis részben - az emésztőrendszer középső részén található aszparaginsavproteázokra a fehérjék lebontásában, leggyakrabban a ciszteinproteázokkal együtt. Ezek nem korlátozó jelleggel magukban foglalják az alábbiakat: Hemiptera nemzetség, közelebbről Rhodnius prolixus és ágybogár (Cimex fajok), valamint a Phymatidae, Pentatomidae, Lygaeidae és Belostomatidae családok; Coleoptera-félék a Meloidae, Chrysomelidae, Coccinelidae és Bruchidae családokban, amelyek mind a Cucujiformia csoportba tartoznak, közelebbről a kolorádóbogár (Leptinotarsa decemlineata); háromcsíkos burgonyabogár (Lema trilineata); déli és nyugati kukorica-gyökérféreg (Diabrotica undecimpunctata és D. virgifera); gyapotmagzsizsik (Anthonomus grandis); tökbogár (Anasa tristis); bolhabogár (Phyllotreta crucifera) zsizsikszerű bogár (Callosobruchus maculatus); mexikói babbogár (Epilachna varivestis); szójalevélfúró (Odontota horni); szegélyes hólyagbogár (Epicauta pestifera) és a vörös lisztbogár (Tribolium castaneum);

Diptera-félék, közelebbről házi légy (Musca domestica) [Terra és Ferreira: Comp. Biochem. Physiol. 109B 1 (1994); Wolfson és Murdock: J. Chem. Ecol. 16 1089 (1990)].

Az olyan vegyületek, amelyek proteázokkal komplexeket alakítanak ki és proteolitikus aktivitásukat gátolják, a természetben széles körben elterjedtek. Különböző „alacsony molekulatömegű” proteázinhibitorok ismertek, nagyobbrészt nem természetes eredetű, szintetikus módszerekkel előállított vegyületek. Számos természetes körülmények között előforduló alacsony molekulatömegű inhibitort izoláltak és jellemeztek bakteriális és gombaeredetű forrásokból; ez a csoport magában foglal olyan inhibitorokat, mint az E-64 [N-(L-3-transz-karboxi-oxirán-22-karbomil)-L-leucil-amido-4-guanidino-bután], leupeptinek, antipainok és pepstatinok.

Számos fehérjeszerű proteázinhibitort izoláltak növényfajokból, és ezek azon védelmet biztosító kémiai anyagok közé tartoznak a növényi szövetekben, amelyek mind fejlődési vonalon szabályozottak, és hasonlóképpen indukálódnak rovar- és patogéntámadás esetében adott válasz során. Szerin-, cisztein-, aszparaginsav- és metalloproteázokat találtak már növényekben, közelebbről azok tárolószerveiben, mint például gumókban és magokban. A növényi proteázinhibitorok leggyakoribb és széles körben tanulmányozott csoportját alkotják azok, amelyek az állati eredetű szerinproteázokat gátolják, amelyek közé tartozik a tripszin és a kimotripszin [lásd például: Ryan: Annu. Rév. Phytopathol. 28425 (1990)].

A fehérjeszerű ciszteinproteáz-inhibitorok csökkentik vagy megszüntetik egy ciszteinproteáz katalitikus aktivitását. Egy ciszteinproteáz pH-optimuma rendszerint a 3,5-7 pH-tartományba esik, ami azon rovarok tápcsatornája középrészének a pH-tartománya, amelyek ciszteinproteázokat használnak. A ciszteinproteáz-inhibitorokat a cisztatincsalád uralja, amelyet molekulatömeg szerint, a diszulfidkötések száma szerint, a sejten belüli elhelyezkedés szerint és a primer struktúra jellemzői alapján négy alcsaládra osztanak. A besorolási rendszer főképp a gerincesekre és a növényi cisztatinokra vonatkozó ismeretekre alapozódik. A cisztatinokat vizsgálták már rovarok és nematódák ellen mind in vitro és in vivő körülmények között.

Napjainkig a ciszteinproteázok fehérjeszerű inhibitorainak nagyon kevés egyéb példáját ismerjük. A burgonyából a ciszteinproteáz-inhibitorok egy további családja ismert, amely az inhibitorok növényi Kunitz-családjába tartozik, és amely úgyszintén magában foglal aszparaginsavproteáz-inhibitorokat is [Strukelj: Bioi. Chem. Hoppe-Seyler 373 477 (1992); Krizaj és munkatársai: FEBS Letters 333 15 (1993)]. Ez az inhibitor, a Kunitz PCPI8.3, a katepszin-L szorosan kötődő inhibitora (Κ,=0,07 nM), és jó inhibitora a papainnak (K|=3,3 nM). A Diabrotica virgiferá-bó\ egy tökéletesen új típusú tiolproteáz-inhibitort izoláltak [World Patent WO 95/24479]. Ez az inhibitor nem mutat szerkezeti hasonlóságokat más ismert ciszteinproteáz-inhibitorokkal.

HU 225 427 Β1

Mostanában a ciszteinproteáz-inhibitorok egy új osztálya alakult ki. Ezekben a fehérjékben közös az I. típusú ismétlődő tiroglobulindomén [Malthierry és Lissitzky: Eur. J. Biochem. 165 491 (1987)]. Emberekből a humán MHC II. osztállyal kapcsolatos p41 invariáns láncból származó fehérjefragmenst izoláltak [Ogrinc és munkatársai: FEBS Letters 336 555 (1993); Bevec és munkatársai: J. Exp. Med. 783 1331 (1996)]. Ez a katepszin-L egy szorosan kötődő inhibitora (1^=0,0017 nM) és jó inhibitora a papainnak (K,=1,4 nM). Egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindoménnel rendelkező hasonló cisztatinproteáz-inhibitort izoláltak a „chum” lazac ikráiból [Yamashita és Konagaya: J. Bioi. Chem. 271 1282 (1996)]. Végül az Actinia equina tengeri rózsából egy equistatin elnevezést kapott ciszteinproteáz-inhibitort izoláltak, amely három I. típusú ismétlődő tiroglobulindoménnel rendelkezik [Lenarcic és munkatársai: J. Bioi. Chem. 272 13899 (1997); Lenarcic és munkatársai: J. Bioi. Chem. 273 12682 (1998)].

A humán invariáns lánctól, az ECI-től (tojás ciszteinproteáz-inhibitor) és equistatintól eltekintve más fehérjék részei is tartalmaznak az I. típusú ismétlődő tiroglobulindoménekkel homológ doméneket, beleértve olyan fehérjéket, mint például a patkány invariáns lánc [McKnight és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 77 3983 (1989)], saxifilin [Morabito és Moczydlowski: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 2478 (1994)], nidogen [Mann és munkatársai: EMBO J. 8 65 (1989)], epiteliális glikoprotein [Simon és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2755 (1990)], IGF-kötő fehérje-3 [Brewer és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 752 1287 (1988)], testican [Aliiéi és munkatársai: Eur. J. Biochem. 274 347 (1993)] és entactin [Durkin és munkatársai: J. Cell. Bioi. 107 2749 (1988)] (3. ábra). Az entactin és a tiroglobulin esetében már leközölték, hogy ezek nem gátolják a ciszteinproteázokat [Yamashita és Konagaya: J. Bioi. Chem. 277 1282 (1996)]. Ezek a fehérjék tartalmazzák a konzervált szekvenciákat, és a gátlás hiányának oka ismeretlen.

A fehérjeszerű aszparaginsavproteáz-inhibitorok csökkentik vagy megszüntetik egy aszparaginsavproteáz katalitikus aktivitását. Az aszparaginsavproteázok pH-optimuma általában a 2-5 pH-érték-tartományba esik, amely megfelel a tápcsatorna azon részeiben található pH-értéknek, ahol az aszparaginsavproteázok aktívak. Az aszparaginsavproteázok esetében nagyon kevés fehérjeszerű inhibitor ismert. A katepszin-D inhibitorok egyik jól jellemzett családja a burgonyában és a vele rokon Solanaceae fajokban fordul elő [Strukelj és munkatársai: Bioi. Chem. Hoppe-Seyler 373 477 (1992)]. Nem került közlésre in vitro enzimes vizsgálati eljárás vagy in vivő biológiai vizsgálati eljárás a burgonya aszparaginsavproteáz-inhibitorok alkalmazásáról rovarokkal vagy nematódákkal szemben.

A 36568/89 azonosító számú ausztrál szabadalmi bejelentés kitanítása szerint az állati eredetű cisztatinok (mint például a tojásfehérje cisztatin és a kininogének), valamint alacsony molekulatömegű, nem peptid természetű ciszteinproteáz-inhibitorok (mint például E-64, antipain és leupeptin) hatékonyak lehetnek különféle Coleoptera fajok számának szabályozásában, amelyek az emésztési folyamat során ciszteinproteázokat használnak fel.

A WO 92/21753 azonosító számú szabadalmi bejelentés kitanítása szerint a multicisztatin - egy 8 doménből álló fitocisztatin a burgonyából - hatékonyabb, mint más cisztatinok különféle rovarok számának szabályozása terén, amelyek ciszteinproteázokat vesznek igénybe a fehérjeemésztéshez a tápcsatorna középrészén, mert a multicisztatin nagyobb ellenálló képességet mutat a karboxipeptidázok okozta proteolízissel szemben.

A WO 96/16173 azonosító számú szabadalmi bejelentés kitanítása szerint a módosított cisztatinok képesek növényeket nematódákkal szemben megvédeni.

A WO 95/24479 azonosító számú szabadalmi bejelentés kitanítása szerint egy új, a kukorica-gyökérféregből izolált tiolproteáz-inhibitor - amely a virgiferin elnevezést kapta - képes növényeket olyan rovarokkal és nematódákkal szemben megvédeni, amelyekben emésztőenzimekként tiolproteázok találhatók.

Ezen kijelentések bizonyítékait a tudományos irodalomban is leközölték különböző Coleoptera és Hemiptera rovarokra éppúgy, mint nematódákra [Chen és munkatársai: Protein Express Purification 3 41 (1992); Edmonds és munkatársai: Entomol. Exp. Appl. 78 83 (1996); Elden: J. Econ. Entomol. 88 1586 (1995); Orr és munkatársai: J. Insect Physiol. 40 893 (1994); Kuroda és munkatársai: Biosci. Biotech. Biochem. 60 209 (1996); Leple és munkatársai: Molecular Breeding 7 319 (1995); Urwin és munkatársai: Plánt J. 8 121 (1995)]. Magas koncentrációk esetén a cisztatinok pusztulást okoztak vagy csökkentették néhány rovar és nematóda termékenységét és növekedését (1. táblázat). Azonban a mezőgazdaságilag érdeklődésre számot tartó védelmi szint eléréséhez szükséges ciszteinproteázinhibitor-koncentrációk a mesterséges étrendben (200-2000 μΜ, lásd a 1. táblázatot) a legtöbb esetben sokkal nagyobbak annál, mint ami transzgenikus növények esetében elérhető (10-40 μΜ, lásd az 1. táblázatot), és úgyszintén sokkal nagyobb, mint a tényleges proteázkoncentrációk, amelyek gátlását ezektől elvárjuk (10-30 μΜ). Legnagyobb valószínűséggel a magas koncentrációkra azért van szükség, mert ezek nem kötődnek eléggé szorosan a ciszteinproteázok összes különböző, a tápcsatornában előforduló molekuláris formájához. A gyenge inhibitorok továbbra is képesek gátolni a proteázokat, amikor a proteázhoz képest nagy feleslegben vannak jelen. Becslések szerint körülbelül 10 és 30 közötti számú különböző proteolitikus enzim aktív a tápcsatornában, és a nem gátolt proteázok transzkripciója aktív módon indukálható a rovar szervezetében, hogy ellensúlyozza a többi proteáz gátlását [Jongsma és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 8041 (1995); Bolter és Jongsma: J. Insect Physiol. 47 1071 (1995)]. A toxicitásuk hiányának egy második oka lehet, hogy ezek a tápcsatorna környezetében nem stabilisak, és lebontásra kerülnek olyan proteázok által, amelyek nincsenek gátlás alatt.

HU 225 427 Β1

Az egyszerű tény tehát, hogy egy proteázinhibitor gátolja a cisztein- vagy aszparaginsavproteázokat, nem jelenti szükségszerűen, hogy hatékony lesz in vitro olyan rovarok ellen, amelyek ezeket a proteázokat használják az emésztés során (lásd még a WO 92/21753 azonosító 5 számú szabadalmi bejelentést). Általánosságban kijelenthető, hogy egyetlen önmagában álló inhibitor ritkán képes teljes mértékben gátolni a cisztein- vagy aszparaginsavproteáz-aktivitás teljes skáláját rovar vagy nematóda tápcsatornájában olyan normálkoncentrációnál, amely 10 növényekben elérhető (10-40 μΜ). Olyan inhibitorok, amelyek egy időben képesek mind cisztein-, mind aszparaginsavproteázokat gátolni kívánt rovar esetében, még sohasem kerültek leírásra, bár alkalmazhatóságuk nyilvánvaló, mert sok rovar alkalmazza a proteolitikus enzimek ezen két osztályának kombinációját emésztésre. Az 1. táblázatban a felsorolt rovarok közül sok alkalmazza a proteázoknak mindkét típusát, és az a tény, hogy az inhibitorok gyakran csak kismértékben toxikusak a rovarokra, valószínűleg annak köszönhető, hogy az aszparaginsavproteázok szabadon maradnak, hogy lebontsák a táplálékfehérjét és a ciszteinproteáz-inhibitorokat.

1. táblázat

Ciszteinproteáz-inhibitorok, amelyek befolyásolják rovarok „egészségi” paramétereit, amikor az étrendben bejuttatásra kerülnek vagy transzgenikus gazdanövényekben expresszióra kerülnek

Rovarfaj	Pl-szint táplálékban/növényben (μΜ)	Hatás	Hivatkozás
Mesterséges táplálék cisztatinokkal kiegészítve
Tribolium castaneum (Col.)	10 000	35% WR	Chen és munkatársai, (1992)
Hepara postica (Col.)	200	RF	Elden, (1995)
Diabrotica undecimpunctata (Col.)	100-200	40-70% M	Edmonds és munkatársai, (1996)
Diabrotica undecimpunctata (Col.)	125 pg/cm²	50% WR	Orr és munkatársai, (1994)
Diabrotica virgifera (Col.)	125 pg/cm²	50% WR	Orr és munkatársai, (1994)
Callosobruchus chinensis (Col.)	100-2000	10-100% M	Kuroda és munkatársai, (1996)
Riptortus clavatus (Hem.)	100-2000	0-100% M	Kuroda és munkatársai, (1996)
Cisztatinokat expresszáló transzgenikus növények
Globodera pallida (Némát.)	10 (paradicsom)	üres ciszták	Urwin és munkatársai, (1995)
Chrysomela tremulae (Col.)	40 (nyárfa)	40% M	Leplé és munkatársai, (1995)

WR=súlycsökkenés; RF=csökkentett termékenység; M=pusztulás

Létezik korábbi irodalmi adat, amely kimutatja, hogy néhány rovar, mint például a kolorádóbogár különösen érzéketlen a proteázinhibitorokra, még akkor is, ha azokat a rokonságot teljes mértékben nélkülöző fór- 45 rásokból izoláljuk, mint például rizsből vagy emberekből [Michaud és munkatársai: Insect Biochem. Molec.

Bioi. 25 1041 (1995); Michaud és munkatársai: Archives of Insects Biochemistry and Physiology 31 451 (1996); Michaud és munkatársai: FEBS Letters 50 331 173 (1993)]. Ezen proteázinhibitorok közül néhány - amikor más rovarokkal szemben vizsgálták - meglehetősen hatékonynak bizonyult [Leplé és munkatársai: Molecular Breeding 1 319 (1995)]. A kolorádóbogárban azonban ezekről az inhibitorokról kimutatták, hogy 55 vagy túl specifikusak voltak csupán egyetlen proteázaktivitás-típusra, vagy az aszparaginsavproteázok ezeket lebontották.

Teljes mértékben ismeretlenek egy cisztein- vagy aszparaginsavproteáz esetében azok a szerkezeti köve- 60 telmények, amelyek szükségesek, hogy hatékonyabban gátolja a rovar vagy nematóda emésztőrendszeri proteázokat. A növények - különösen amennyiben rokonságban vannak a gazdanövénnyel - szegényes forrásai a hatékony inhibitoroknak, mert a rovarok ezek ellen már kifejlesztettek proteázinhibitorokra érzéketlen proteázokat. Elképzelhető, hogy növényektől különböző forrásokból származó ciszteinproteáz-inhibitorokat próbáljunk ki, de napjainkig még nem írtak le más fehérjeszerű aszparaginsavproteáz-inhibitort, mint a Solanaceae fajokból izolált inhibitorokat. Az emésztéshez cisztein- és/vagy aszparaginsavproteázokat alkalmazó rovar kártevők számának korlátozására szolgáló leginkább kívánatos proteázinhibitor-típushoz szükséges, hogy mindkét aktivitás több mint 90%-át egyidejűleg gátolja gazdanövényükön tenyésztett rovarokban, annak érdekében, hogy specifikusan megcélozza a gazdanövény proteázinhibitorra érzéketlen proteázkomplemenst. Ilyen inhibitorok a technika állása szerint nem ismertek.

HU 225 427 Β1

Azt találtuk, hogy az olyan fehérjék csoportjából kiválasztott ciszteinproteáz-inhibitorok, amelyek legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmaznak, in vivő hatékonyak ciszteinproteázokat alkalmazó rovarok vagy nematódák ellen, és meglepő módon azt találtuk, hogy ezek az inhibitorok különösen aktívak olyan rovar ciszteinproteázokkal szemben, amelyek érzéketlenek a gazdanövényből származó ciszteinproteáz-inhibitorokkal szemben. Az ilyen tulajdonság előzmények nélkül áll a ciszteinproteáz-inhibitorok többi típusa között, beleértve a nem növényi eredetű inhibitorokat. Ennek eredményeképpen ezen inhibitorok nagymértékben toxikusak például kolorádóbogár-lárvával szemben.

A találmány egy aspektusa szerint a találmány tárgyát eljárás képezi növény vagy a növény részének védelmére egy vagy több rovar vagy nematóda okozta rovar- vagy nematódafertőzés ellen, ahol ezek emésztőrendszeri ciszteinproteázokat tartalmaznak, amelynek során arra a helyre, ahol a rovar (rovarok) vagy nematóda (nematódák) száma szabályozásra kerül, egy ciszteinproteáz-inhibitor gátlóhatású mennyiségét juttatjuk ki, és a proteázinhibitort olyan fehérjék csoportjából választjuk ki, amelyek legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmaznak.

Továbbá azt találtuk, hogy néhány I. típusú ismétlődő tiroglobulindomén úgyszintén hatékony lehet aszparaginsavproteázokkal szemben. Nagyra értékelhető, hogy az aszparaginsavproteázokkal és a ciszteinproteázokkal szemben megnyilvánuló aktivitások hasonló szerkezeti doméneken helyezkednek el, és egyetlen fehérjébe összekombinálhatók, mint például az equistatin esetében, mert a feltalálók megállapították, hogy ezek szinergikusan hatnak, és ezzel még jobban gátolják az összes rovar proteáz aktivitást.

Ennek megfelelően a találmány egy második aspektusa szerint a találmány tárgyát képezi aszparaginsavproteázokkal szemben aktivitást mutató I. típusú ismétlődő tiroglobulindomén-inhibitor peptid, amely peptid az 1. ábrán bemutatott equistatin 68-199. aminosavpozícióinak megfelelő aminosavszekvenciával rendelkezik, vagy egy módosított I. típusú ismétlődő tiroglobulin aszparaginsavproteáz-inhibitor peptid, amelyben a módosított peptid olyan pepiidet tartalmaz, amely jelentős mértékű aminosavazonosságot mutat az equistatin 68-199. aminosavpozícióival; az equistatin 68-199. aminosavpozíciónak a lerövidített változatai; vagy az olyan peptid lerövidített változatai, amely peptid jelentős mértékű aminosavazonosságot mutat az equistatin 68-199. aminosavpozícióival, ahol a módosított peptid funkcionálisan egyenértékű az equistatin aszparaginsavproteázinhibitor-aktivitást mutató 68-199. aminosavpozíciókkal.

A találmány egy harmadik aspektusa szerint a találmány tárgyát képezi inszekticid vagy nematocid készítmény, amely legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét tartalmaz, ahol a készítmény képes olyan növényi szövet ellenálló képességét javítani, amely egyébként fogékony emésztőrendszeri cisztein- és/vagy aszparaginsavproteázokat tartalmazó egy vagy több rovar vagy nematóda okozta fertőzésre.

Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi olyan mezőgazdasági készítmény, amely hordozót és rovarvagy nematódaszámot szabályozó vagy azokkal szemben hatást mutató mennyiségű, leírás szerinti ciszteinés/vagy aszparaginsavproteáz-inhibitort tartalmaz.

A találmány egy negyedik aspektusa szerint a találmány tárgyát képezik olyan vektorok, amelyek egy vagy több I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó peptidet kódolnak, és képesek a peptidet növényi sejtben expresszálni.

Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi biológiailag funkcionális expressziós egység, amely az alábbiakat tartalmazza: promoter, amely hatékonyan elősegíti 3'-irányban elhelyezkedő kódolószekvencia expresszióját növényi sejtekben, DNS kódolórégió, amely legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje expresszióját biztosítja növényi sejtekben, és terminálószekvenciát tartalmaz, amely hatékonyan terminálni képes a genetikai konstrukciós termék transzkripcióját vagy transzlációját növényi sejtekben, és amely genetikai konstrukció hatékonyan expresszálja a növény sejtjeiben a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje rovarok számát szabályozni képes mennyiségét.

Továbbá a találmány tárgyát képezi eljárás növény vagy a növény részének védelmére rovar- vagy nematódafertőzés ellen, amelynek során a növény genomjába legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét kódoló szekvenciát illesztünk be, a növényben aktív promoterszekvenciával együtt, hogy a fehérje expresszióját hozzuk létre olyan szinten, amely a fehérje rovar- vagy nematódaszámot szabályozni képes mennyiségét hozza létre.

Közelebbről az eljárás a következő lépésekből áll:

(a) a növényből sejteket vagy szöveteket tenyésztünk;

(b) a sejtekbe vagy a szövetbe a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét kódoló gén legalább egy kópiáját bejuttatjuk;

(c) a sejt- vagy szövettenyészetből ellenállóképes teljes növényeket regenerálunk.

A találmány egy ötödik aspektusa szerint a találmány tárgyát képezik transzformált sejtek és olyan sejtek sejttenyészetei, amelyek egy vagy több I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó peptidet kódoló géneket hordoznak, amely peptid képes védelmet biztosítani egyébként egy vagy több rovar vagy nematóda okozta fertőzésre fogékony növényi szövet számára, ahol a rovarok vagy nematódák emésztőrendszeri cisztein- és/vagy aszparaginsavproteázokat tartalmaznak.

A találmány tárgyát képezi továbbá transzgenikus növény és annak szexuális úton létrejött leszármazottai, amelyek emésztőrendszeri ciszteinproteázokat tartalmazó egy vagy több rovar vagy nematóda támadása ellen védelemmel rendelkeznek, ahol a transzgenikus növény legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje rovar- vagy nematódaszámának szabályozását biztosító mennyiségét expresszálja.

A találmány egy hatodik aspektusa szerint a találmány tárgyát képezi egy vagy több I. típusú ismétlődő

HU 225 427 Β1 tiroglobulindomént tartalmazó peptid inszekticid vagy nematocid készítményének előállítására szolgáló eljárás, ahol a készítmény képes egyébként egy vagy több rovar vagy nematóda okozta fertőzésre fogékony növényi szövet ellenálló képességének javítására, ahol a rovarok vagy nematódák emésztőrendszeri ciszteinés/vagy aszparaginsavproteázokat tartalmaznak.

A találmány számos további aspektusát illusztráljuk továbbá a leíráshoz csatolt rajzokban, amelyekben:

Az 1. ábra az Actinia equina L. fajból származó equistatingén nukleotidszekvenciáját és kikövetkeztetett aminosavszekvenciáját mutatja be.

A 2. ábra a cDNS-ben kódolt equistatin és az Actinia equina L. fajból származó tisztított equistatinfehérje aminosavszekvenciája mindhárom doménjének az összevetését mutatja be, ismert és ismeretlen proteázinhibitor-aktivitást mutató, I. típusú ismétlődő tiroglobulindoménekkel rendelkező további fehérjék aminosavszekvenciáival.

A 3. ábra különböző ciszteinproteáz-inhibitorok széles tartományának in vitro hatásait mutatja be kolorádóbogár- (Leptinotarsa decemlineata) lárvák ciszteinproteázaival szemben, amelyek érzéketlenek a burgonya gazdanövény endogén ciszteinproteáz-inhibitoraival szemben.

A 4. ábra mutatja be az equistatin hatásait kolorádóbogár-lárvák növekedésére és pusztulására.

Az 5. ábra az equistatin hatását mutatja be más ciszteinproteáz-inhibitorokhoz viszonyítva a nyugati virágtripsz (Frankliniella occidentalis) in vitro proteolitikus aktivitására.

A 6. ábra az equistatin hatását mutatja be tripsz nőstények termékenységére két nappal azután, hogy az inhibitort tartalmazó étrendre fogtuk a rovarokat.

A 7. ábra a pB3-equistatin plazmid térképét mutatja be.

A 8. ábra a pCAB1-equistatin plazmid konstrukcióját mutatja be.

A 9. ábra az equistatin HPLC-analíziseit mutatja be. A kromatogramok az equistatin HPLC elúciós profilját mutatják be, különböző enzimekkel történő inkubálást követően. Az A-panelban az equistatint katepszin-D-vel inkubáltuk, 2:1 végső moláris koncentráció aránnyal, és a B-panelban az equistatint 1 % (tömeg/tömeg) β-tripszin alkalmazásával fragmentáltuk. A csúcsok azonosítását az N-terminális szekvenciák alapján végeztük.

A 10. ábra az equistatin elektroforetikus analízisét mutatja be.

A: szétvágott equistatin SDS-PAGE. Sávok: 1., molekulatömeg-standardok;

2., az equistatin első doménje (eq d-1);

3., az equistatin kombinált második és harmadik doménje (eq d-2,3).

B: equistatin-katepszin-D komplex létrejötte, natív PAGE. Sávok: 1., katepszin-D; 2., equistatin és katepszin-D az elektroforézis előtt 30 perccel összekeverve; 3., equistatin. A géleket Coomassie Blue-val festettük.

A 11. ábra az alkalmazott equistatinfragmensek funkciójának vázlatos diagramja. A proteolitikus hasítási helyeket üres szakaszok jelzik, és mint aminosavszámok kerültek feltüntetésre. A β-tripszin működése során kapott hasítási helyeket nyilakkal jelöljük. A diszulfidhídba kapcsolódó cisztein aminosavpárokat a cisztein aminosavakat összekötő vízszintes vonallal jelöljük.

A 12. ábra az equistatin aktív hely titrálását mutatja be katepszin-D-vel. 77 nM katepszin-D gátlása natív equistatin növekvő koncentrációival. A visszamaradó aktivitást az inhibitort nem tartalmazó minták kontrollaktivitásának százalékában fejezzük ki.

Az összes itt idézett hivatkozás teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintendő.

Mostanra már meghatározásra került, hogy az I. típusú ismétlődő tiroglobulindomének között léteznek olyan domének, amelyek mind humán, mind rovareredetű aszparaginsavproteázokkal szemben aktivitást mutatnak. Fehérjéket (P41 invariáns lánc fragmens és equistatin I. dómén) és olyan doméneket összekombinálva, amelyek ciszteinproteázokkal szemben aktivitást mutatnak, ezek erős inhibitoraktivitást mutatnak különböző rovarrendekbe tartozó rovarfajok széles körének „proteázinhibitor-érzéketlen” emésztőrendszeri cisztein- és aszparaginsavproteázaival szemben, amely rovarfajok magukban foglalják az alábbiakat: kolorádóbogár, tripsz, levélfúró és kukorica-gyökérféreg. Ezek lárvaölő hatást mutattak, amikor emésztőrendszeri cisztein- és aszparaginsavproteázokkal rendelkező rovarok lárváinak enterálisan beadtuk - mint például a kolorádóbogár és erősen lecsökkentette tripszek termékenységét, amelyek főleg a ciszteinproteázoktól függnek a fehérjék emésztése során. Kimutatásra került, hogy az I. típusú ismétlődő tiroglobulindoméneknek ez a tulajdonsága egyedülálló a cisztein- és aszparaginsavproteáz-inhibitorok nagyon széles körében, amelyek a cisztein- és aszparaginsavproteáz-inhibitorok csaknem az összes ismert típusát átfogják. Kimutatható tehát, hogy a korábban javasolttal szemben nem elegendő, ha olyan inhibitorokat alkalmazunk, amelyek a növényektől nagy evolúciós távolságban helyezkednek el, mert ezek azonos mértékben inaktívaknak bizonyultak, mint a növényi eredetű inhibitorok. Ezek helyett kizárólag csak az I. típusú ismétlődő tiroglobulindomén konzervált jellegzetességeit tartalmazó cisztein- és/vagy aszparaginsavproteáz-inhibitorok vol7

HU 225 427 Β1 tak képesek arra, hogy a különböző rovarfajokból származó „Pl-érzéketlen tisztein- és aszparaginsavproteázokat” teljes mértékben inaktiválják. így a találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás rovarok és nematódák elpusztítására, amelyek „proteázinhlbitor-érzéketlen emésztőrendszeri tisztein- és/vagy aszparaginsavproteázokat tartalmaznak - beleértve a kolorádóbogár lárváját -, amelynek során a lárvának vagy a nematódának enterálisan beadjuk egy vagy több I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje lárvaölő vagy nematódaölő mennyiségét, attól függően, hogy a rovar az emésztés során egy vagy több osztályba tartozó proteázt használ fel.

Kifejezések meghatározása

A leírás során a proteázinhibitor és proteinázinhibitor kifejezések egyenértékűnek tekintendők. A leírás során a „proteázinhibitor-érzéketlen proteáz” alatt olyan proteázt értünk, amely a gazdanövénynek a támadó kártevő elleni védelem érdekében termelt proteázinhibitoraival szemben érzéketlen, de ugyanakkor nem zárjuk ki azt, hogy ezek gátolhatok olyan proteázinhibitorokkal, amelyeket a gazdanövénytől különböző forrásokból izoláltak. A rovar és lárva kifejezések a leírás során - bár ezek nem egyenértékűek specifikus használat esetén magukban foglalják egy fajnak mind a kifejlett, mind a lárva formáját, amikor általánosságban alkalmazzuk, így a leírás során a rovar ellenálló képesség kifejezés alatt egyaránt értjük a lárvaformákkal szembeni ellenálló képességet és a kifejlett egyedekkel szembeni ellenálló képességet, és a lárvaölő anyagok alatt egyaránt értjük az inszekticidhatású anyagokat, közelebbről azért is, mert a lárvák elpusztítása ennek megfelelően a kifejlett egyedek hiányához vezet.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az Actinia equina tengeri rózsából származó clsztein/aszparaginsav proteáz inhibitorokat - amelyeket equistatin néven ismerünk - alkalmazzuk. A leírás során „equistatin” kifejezés alatt olyan fehérjét értünk, amelyet az 1. ábrán feltüntetett szekvencia szerinti gén, vagy annak funkcionális származéka kódol. Az Actinia equina tengeri rózsából tisztított equistatinpeptid három I. típusú ismétlődő tiroglobulindomén jelenlétét mutatta [Lenarcic és munkatársai: J. Bioi. Chem. 272 13899 (1997); Lenarcic és munkatársai: J. Bioi. Chem. 273 12682 (1998)]. Az Actinia eguiná-bó\ származó cDNS-klóntár szkrínelése teljes cDNS-en alkalmazott két degenerált primer segítségével végzett PCR reakcióból nyert radioaktívan jelölt próba segítségével olyan kiónt eredményezett, ahol a kódolószekvencia tartalmazott egy szignálpeptidet a szekrécióhoz, és egy érett fehérjerészt, amely három, a tisztított fehérjével összehasonlítva közel azonos fehérjeszekvenciával rendelkező doménből állt.

Az equistatin cDNS amplifikációjára szolgáló primerek: El-deg1: CT (A, C, G, T) AC (A, C, G, Τ) AA (A, G) TG (T, C) CA (A, G) CA (A, G) El-deg2: ATT (A, G) AC (A, G, C, T) TG (A, C, G, T) GG (A, C, G, T) CG (T, C) TT (A,G) AA

Ahogyan ez látható az 1. és a 2. ábrán, az equistatin érett fehérjekomponense 3 doménből áll, amelyek úgy tűnik - a genetikai anyag megkettőződéséből származnak. Az előzetes cDNS-szekvencia-analízis alapján az equistatin számos szerkezeti izoformája fordul elő az Actinia equiná-ban. A három dómén egy 22 kDa nagyságú polipeptidet alkot. Mindegyik dómén körülbelül 65-68 aminosavból áll, három feltételezhető diszulfidhíddal. A domének szekvenciái alapján nyilvánvaló, hogy a fehérje az I. típusú konzervált Ismétlődő tiroglobulindomének csoportjába tartozik, ismétlődő I. típusú doméneket tartalmazva. Közelebbről meghatározva a doménszekvenciák az alábbi aminosavszekvencia nagymértékű konzerválódását mutatják: Cys(Xxx)i₈_29-Pro-Xxx-Cys-(Xxx)₃-Gly-(Xxx)₅-Gln-Cys(Xxx)₆-Cys-Thr-Cys-Val-(Xxx)₃-Gly-(Xxx)₁ q_i 5-Cys. Az Actinia equiná-bó\ tisztított, három doménből álló inhibitort proteolitikusan két fő peptidre hasítottuk, és fordított fázisú HPLC segítségével elválasztottuk. Mindkét fragmens N-terminálisának meghatározása lehetővé tette azonosításukat a szekvencián belül. Az egyik peptid amelyet eq d-1 jelöléssel láttunk el - az első domént tartalmazta az 1-67. aminosavak között, míg a második peptid - amelyet az eq d-2,3 jelöléssel láttunk el - a 2. és a 3. domént tartalmazta, a 68-199. aminosavak között. A teljes equistatinmolekulát csak egy papain és egy katepszin-D molekula tudja gátolni. Az Eqd-1 és az Eqd-2,3 molekulákkal végzett gátlási vizsgálatok kimutatták, hogy az Eqd-1 csak papainnal gátolható, és az Eqd-2,3 csak katepszin-D-vel gátolható. Az inhibíciós konstansok a szétválasztott domének esetében hasonlók voltak, mint a teljes equistatinmolekula esetében. Ez azt mutatta, hogy bár ezek a domének szerkezetileg konzerválnak tűnnek, a proteázokkal szemben mutatott specifitások teljes mértékben különböző proteázosztályokra váltak szét. A jelenlegi bizonyítékok alapján nem ismerhető fel, hogy melyik aminosav határozza meg ezt a specifitásokban megnyilvánuló különbséget.

Egyértelmű, hogy a jelen kitanítás alapján a szakember megszintetizálhatja vagy izolálhatja a természetben előforduló equistatinmolekulák lényegében tiszta funkcionális származékait. Az equistatin „funkcionális származéka” alatt olyan vegyületet értünk, amely rendelkezik az equistatinmolekula biológiai aktivitásával lényegében hasonló biológiai aktivitással. A funkcionális származék kifejezés magában foglal „fragmenseket” vagy „gyakorlatilag homológ variánsokat”.

A leírás során egy molekula „fragmense” kifejezés alatt egy equistatinmolekula bármely inhibitorhatású polipeptidalrészét értjük.

A leírás során egy molekula - mint például az equistatinmolekula - „gyakorlatilag homológ variánsa” kifejezés alatt olyan molekulát értünk, amely szekvenciáját és funkcióját tekintve lényegében hasonló akár a teljes molekulával, akár annak fragmensével. Ezeket a molekulákat akkor tekintjük találmány szerinti molekuláknak, amikor tartalmazzák az I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént. Általánosságban a gyakorlatilag homológ szekvenciák magas fokú konzerválódást tartanak fenn a konzervált szekvencia természetes körülmények között előforduló pozícióiban: Cys(Xxx)₁₈_29-Pro-Xxx-Cys-(Xxx)₃-Gly-(Xxx)₅-Gln-Cys8

HU 225 427 Β1 (Xxx)₆-Cys-Thr-Cys-Val-(Xxx)3-Gly-(Xxx)₁₀_₁₅-Cys. A konzervált szekvencia mindegyik végén található két cisztein konzerválódott, de nem rendelkeznek konzervált pozíciókkal. Azonban feltételezhetően szerkezetileg fontos diszulfidhidakat hoznak létre a többi cisztein bármelyikével, és ezért szerepeltetjük a konzervált szekvenciában. A találmányi leírás szerint egy aminosavszekvencia szerkezete gyakorlatilag akkor homológ egy második aminosavszekvenciával, ha az aminosavszekvenciák aktív részeinek legalább 70 százaléka, előnyösen legalább 80 százaléka és legelőnyösebben legalább 90 százaléka azonos vagy egyenértékű. A potenciálisan egyenértékű aminosavak általános kategóriái az alábbiakban láthatók, amelyben az egy csoportba tartozó aminosavak az azonos csoportba tartozó egyéb aminosavakkal helyettesíthetők: (1) glutaminsav és aszparaginsav; (2) lizin, arginin és hisztidin; (3) alanin, valin, leucin és izoleucin; (4) aszparagin és glutamin; (5) treonin és szerin; (6) fenil-alanin, tirozin és triptofán; valamint (7) glicin és alanin. Még fontosabb és a meghatározás szempontjából kritikus, hogy egy második aminosavszekvencia funkciója gyakorlatilag akkor homológ egy másik aminosavszekvenciával, amennyiben a második aminosavszekvencia olyan tercier struktúrát hoz létre, amely képes emésztőrendszeri cisztein- és/vagy aszparaginsavproteáz katalitikus aktivitását lecsökkenteni vagy megszüntetni.

A leírás szerint a „lényegében tiszta” kifejezés alatt olyan fehérjét értünk, amely legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmaz, amely homogénnek tekinthető egy vagy több tisztasági vagy homogenitási jellemző alapján. így például egy lényegében tiszta equistatinpeptid-molekula állandó és reprodukálható jellemzőket mutat a standard kísérleti eltéréseken belül olyan paraméterek esetében, mint például molekulatömeg, kromatográfiás viselkedés és más hasonlók. A kifejezés fenti megfogalmazása azonban nem zárja ki az equistatinpeptid-molekula mesterséges vagy szintetikus keverékeit más vegyületekkel. A kifejezés fenti megfogalmazása úgyszintén nem zárja ki kisebb mennyiségű szennyezők jelenlétét, amelyek nem zavarják az equistatinpeptid-molekula biológiai aktivitását, és amelyek előfordulhatnak például a nem tökéletes tisztítás következtében. Egy lényegében tiszta equistatinpeptid-molekula izolálható például abból a forrásból, amelyben természetes körülmények között előfordul, bármely megfelelő fehérjetisztítási eljárás segítségével. A példaként szolgáló eljárások közé tartoznak az alábbiak: kromatográfiás eljárások, mint például gélszűréses folyadékkromatográfia, ioncserés kromatográfia, affinitáskromatográfia, nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia, fordított fázisú kromatográfía vagy izolálható equistatin elleni antitesteket alkalmazó immunológiai reagensek segítségével.

Génizolálás

Egy equistatinpeptid in vitro megszintetizálható az alkotóaminosavakból [lásd: Merrifield: J. Amer. Chem. Soc. 85 2149 (1963); valamint Merrifield: Solid Phase Peptid Synthesis, szerk.: Stewart és Young, (1969)]. Az így előállított peptidek a technika állása szerint ismert eljárások segítségével izolálhatok és tisztíthatok [lásd: Current Protocols in Molecular Biology, szerk.:

Ausubel és munkatársai, (1989), valamint Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989)].

Bár megvalósítható az equistatinpeptid teljes aminosavszekvenciájának a meghatározása és szintézise, előnyösebb az equistatlngén teljes szekvenciáját izolálni. Equistatinpeptidet kódoló DNS előállítható kromoszómaeredetű DNS-ből, cDNS-ből vagy szintetikus eredetű DNS-ből önmagukban ismert eljárások alkalmazásával.

Equistatinpeptidet kódoló genomi eredetű DNS izolálható standardeljárások segítségével [Sambrook és munkatársai, lásd fentebb, (1989)]. A találmány tárgyát képezik közelebbről meghatározva olyan genomi eredetű DNS-szekvenciák, amelyek az equistatingén alléi variáns formáit kódolják, és hasonlóképpen ennek 5’és 3’-határolórégiói.

Úgyszintén lehetőség van primerek alkalmazására és a DNS exponenciális amplifikálására in vitro, szekvencia alapján meghatározott oligonukleotidok segítségével polimeráz-láncreakcióban (PCR) [lásd: Mullis és munkatársai: Meth. Enz. 155 335 (1987); Horton és munkatársai: Gene 77 61 (1989), valamint PCR Technology: Principles and Applications fór DNA Amplification, szerk.: Erlich, (1989)].

A cDNS-készítményeket rekombináns vektorokba ligáljuk, hogy génklóntárat hozzunk létre. Alternatív módon a cDNS-ek expresszálhatók olyan vektorban, mint például lambda gt 11, és a klóntárt szkrínelhetjük az equistatinpeptid ellen termeltetett antitestek alkalmazásával.

Megfelelő oligonukleotid, ollgonukleotidkészlet vagy PCR-eredetű DNS-fragmensek alkalmazhatók a technika állása szerint jól ismert eljárások során - a genomi eredetű DNS- vagy cDNS-klóntárak szkrínelésére. A kívánt szekvencia kimutatásának elősegítésére a DNS-próbát bármely olyan anyaggal jelölhetjük, amely kimutatható fizikai vagy kémiai tulajdonsággal rendelkezik. A technika állása szerint jól ismertnek tételezhetők fel a kívánt szekvencia izolálására, tisztítására és szekvenálására szolgáló eljárások [lásd például: Current Protocols in Molecular Biology, (1989), fentebb; valamint Sambrook és munkatársai, (1989), fentebb].

A legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét kódolni képes genetikai szekvencia előállításának alternatív útja lehet annak elkészítése oligonukleotidszintézls segítségével, miután meghatároztuk a kívánt génszekvenciát [lásd például Caruthers, In: Methodology of DNA and RNA, szerk.: Weissman, (1983); Beaucage és munkatársai: Tetrahedron Letters 22 1859 (1981)]. Oligonukleotidok sorozata szintetizálható annak érdekében, hogy átfedő fragmensek egy sorozatát állítsuk elő, amely anneálás és ligálás után a gén mindkét szálát létrehozza. Ezeket a fragmenseket ezt követően anneáljuk és összeligáljuk a technika állása szerint jól ismert eljárások segítségével [lásd például: Sambrook és munkatársai,

HU 225 427 Β1 (1982), fentebb). Alternatív eljárás szerint a gén előállítható oly módon, hogy prímért szintetizálunk, amely a target DNS-sel nem hlbridizáló úgynevezett „lengőfarokkal” rendelkezik; ezt követően a genomi szekvenciákat ampliflkáljuk és átfedő extenziók segítségével összeillesztjük [lásd Korton és munkatársai: Gene 77 61 (1989)]. Az előre jelzett mérettel rendelkező kapott DNS-fragmenst elektroforézis segítségével izoláljuk, és amplifikáláshoz, valamint további manipulációkhoz megfelelő klónozóvektorba ligáljuk [lásd Mullis és munkatársai, (1987), fentebb, valamint: PCR Technology: Principles and Applications fór DNA Amplification, lásd fentebb].

Természetesen a szakember beépíthet módosításokat is az izolált szekvenciákba, beleértve különböző nukleotidok korlátozott számának a hozzáadását, delécióját vagy nem konzervatív szubsztitúcióját; vagy sok nukleotid konzervatív szubsztitúcióját, amennyiben a megfelelő leolvasási fázis fennmarad. A megfelelő pontokon transzlációs stop- és startszignálokat adunk hozzá, és könnyen kezelhető klónozóhelyek létrehozásához szekvenciákat adunk hozzá a végeken. Az oligonukleotidszekvenciák módosítására példaként szolgáló eljárások magukban foglalják a polinukleotidközvetített helyspecifikus mutagenezist [lásd Zoller és munkatársai: DNA 3 479 (1984); Higuchi és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 16 7351 (1988); Ho és munkatársai, (1989), lásd fentebb, valamint PCR Technology: Principles and Applications fór DNA Amplification, szerk.: Erlich, (1989)].

Génexpresszió

Annak érdekében, hogy tovább jellemezzük az ilyen genetikai szekvenciákat, kívánatos a szekvencia bejuttatása egy megfelelő gazdaszervezetbe, hogy az ezen szekvenciák által kódolt fehérjéket expresszáljuk és megerősítsük, hogy az equlstatinpeptid-molekula jellemzőivel rendelkeznek. Az ilyen manipulációkra alkalmas eljárások a technika állása szerint jól ismertek és leírásra kerültek [Sambrook és munkatársai, (1989), lásd fentebb].

Rendelkezésre állnak vagy könnyen elkészíthetők vektorok a vírusok, prokarióta vagy eukarióta sejtek transzformációjára. Általánosságban a plazmid- vagy víruseredetű vektoroknak egyaránt tartalmazniuk kell a kívánt gazdaszervezetben egy heterológ DNS-szekvencia fenntartásához és expressziójához szükséges összes DNS-szabályozó szekvenciát. Az ilyen szabályozószekvenciák általánosságban magukban foglalnak promoterszekvenciát, transzkripciós start- vagy vezetőszekvenciát, a transzlációs startszignálkodont kódoló DNS-szekvenciát, transzlációs terminátorkodont és egy, a 3’-végi transzlációra nem kerülő régiót kódoló DNS-szekvenciát, amely az RNS-szintézis befejezését és/vagy a hírvivő RNS módosítását szabályozó szignálokat tartalmaz. Végül kívánt esetben a vektorok rendelkezzenek markergénnel, amely képes olyan fenotípusos tulajdonságot biztosítani, amely lehetővé teszi a vektort tartalmazó gazdasejtek azonosítását, és monocot transzformáció esetében egy intront tartalmaz az 5’-végi transzlációra nem kerülő régióban, mint például az 1. intront a kukorica alkohol-dehidrogenáz génből, amely megnöveli az mRNS egyensúlyi szintjeit.

A példaként említhető gazdasejtek magukban foglalnak prokarióta és eukarióta szervezeteket. Egy kiválasztott gazdasejt transzformációjához a megfelelő eljárás az alkalmazott gazdasejtnek megfelelően választható ki. A jelenlegi tapasztalatok alapján úgy tűnik, hogy miután sejtekbe beillesztjük, a transzformációs módszernek önmagának betudhatóan csak kis különbségek jönnek létre a gének expressziója között.

A biológiai anyag gazdasejtekbe történő bejuttatására szolgáló hagyományos eljárások magukban foglalják a következőket: elektroporáció [lásd Shigekawa és Dover: Biotechniques 6 742 (1988); Miller és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 856 (1988); valamint Powell és munkatársai: Appl. Environ. Microbiol. 54 655 (1988)]; közvetlen DNS-felvételi mechanizmusok [lásd Mandel és Higa: J. Mól. Bioi. 53 159 (1972); Dityatkin és munkatársai: Biochimica et Biophysica Acta 281 319 (1972); Wigler és munkatársai: Cell 16 77 (1979); valamint Uchimiya és munkatársai, In: Proc. 5^thInti. Cong. Plánt Tissue and Cell Culture, szerk.: A. Fujiwara, Jap. Assoc. fór Plánt Tissue Culture, Tokyo, 507-508. oldalak, (1982)]; fúziós mechanizmusok [lásd Uchidax és munkatársai, In: Introduction of Macromolecules Intő Viable Mammalian Cells, szerk.: C. Baserga, G. Crose és G. Rovera, Wistar Symposium Series, 1. kötet, A. R. Liss Inc., NY, 169-185. oldalak, (1980)]; fertőző ágensek [lásd Fraley és munkatársai: CRC Crit. Rév. Plánt Sci. 4 1 (1986); valamint Anderson: Science 226 401 (1984)]; mikroinjekciós mechanizmusok [lásd Crossway és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 202 179 (1986)] és nagy sebességű lövedékes mechanizmusok [lásd EPO 0 405 696 lajstromszámú európai szabadalom],

A transzformánsokat a hagyományos módszereknek megfelelően izoláljuk, általánosságban szelekciós eljárást alkalmazva, amely lehetővé teszi a kívánt élő szervezetek kiválasztását a módosítatlan élő szervezetek közül. Általánosságban a transzformálás után a gazdasejteket körülbelül 48 órán keresztül növesztjük, hogy lehetővé tegyük a markergének expresszióját. Ezt követően a sejteket szelektív és/vagy szkrínelhető táptalajra visszük, ahol a transzformálás nélküli sejtek a transzformált sejtektől megkülönböztethetők, akár pusztulás következtében, akár biokémiai tulajdonság alapján. A kiválasztott sejtek szkrínelhetők az equistatinpeptid-molekula expressziójára, vagy annak funkcionális származékára különböző vizsgálati eljárások segítségével, mint például az alábbiak: immunblot-analízis, inhibitoraktivitási vizsgálati eljárás, enzimkapcsolt immunoszorbens vizsgálati eljárás, radioimmun vizsgálati eljárás vagy fluoreszcenciaaktivált sejtosztályozó analízis, immunhisztokémia és más hasonlók. A transzformált szöveteket ezt követően megvizsgáljuk a rovarok számának szabályozásában mutatott aktivitásra.

Egy gazdasejt transzformálható annak érdekében, hogy forrást biztosítson, amelyből a kívánt gént tartalmazó vektor jelentős mennyiségét izolálhatjuk az ezt

HU 225 427 Β1 követő bejuttatásra a kívánt gazdasejtekbe, vagy annak érdekében, hogy a fehérje jelentős mennyiségeit tudjuk expresszálni és izolálni. A példaként szolgáló rekombináns gazdasejtek magukban foglalnak egysejtű prokarióta és eukarióta törzseket. A gazdaszervezetként alkalmazható prokarióta mikrobák közé tartoznak az alábbiak: Escherichia coli és más Enterobacteriaceae, Bacilli és különböző Pseudomonas fajok. A gyakori eukarióta mikrobák közé tartoznak az alábbiak: Saccharomyces cerevisiae és Pichia pastoris. A gyakori magasabb rendű eukarióta gazdasejtek közé tartoznak az alábbiak: Sp2/0 vagy CHO-sejtek. További előnyösen alkalmazható gazdasejtek a rovarsejtek, mint például Drosophila lárva, amelyben a vektor a Drosophila alkohol-dehidrogenáz promotert tartalmazza.

Alternatív módon bakulovírusvektorok, mint például az Autographa californica nukleáris polihedrózis vírus [lásd Miller és munkatársai: Science 219 715 (1983)] szerkeszthető meg oly módon, hogy az equistatinpeptid-molekulát vagy funkcionális származékának nagy mennyiségeit expresszáljuk tenyésztett rovarsejtekben [lásd Andrews és munkatársai: Biochem. J. 252 199 (1988)].

Mezőgazdasági készítmény

A találmány tárgyát képezi növényeken vagy azok rovar- vagy nematódafertőzésre fogékony részein alkalmazható mezőgazdasági készítmény, ahol a rovarok vagy nematódák emésztőrendszere ciszteinproteázokat tartalmaz; és a mezőgazdasági készítmény legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindoménnel rendelkező fehérjét tartalmaz. A mezőgazdasági készítmény gyakran tartalmaz mezőgazdaságilag elfogadható hordozót is. A „mezőgazdaságilag elfogadható hordozó” kifejezés alatt a leírás során olyan anyagot értünk, amely alkalmazható egy aktív vegyület feloldására, szétoszlatására vagy diffundálására a készítményben a vegyület hatékonyságának az akadályozása nélkül, és amely önmagában nem mutat káros hatást a talajra, készülékre, termesztett növényekre vagy a mezőgazdasági környezetre.

A mezőgazdasági készítmények különböző formák széles skálájában alkalmazhatók, beleértve porokat, kristályos anyagokat, szuszpenziókat, porozószereket, pasztillákat, granulátumokat, kapszulázott anyagokat, mikrokapszulázott anyagokat, aeroszolokat, oldatokat, géleket vagy egyéb diszperziókat. A megfelelő folyékony vagy szilárd hordozók mellett a készítmények tartalmazhatnak adjuvánsokat, mint például emulziót képező és nedvesítőszereket, a szétterítést segítő anyagokat, diszpergálóanyagokat, tapadást segítő anyagokat vagy olyan szereket, amelyek stimulálják a rovarok táplálkozását a hagyományos mezőgazdasági eljárásoknak megfelelően. Az inszekticidek formulázásához rendelkezésre álló adjuvánsok a szakember számára ismertnek tételezhetők fel.

A legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje koncentrációja nagymértékben változhat az adott formulázás természetének függvényében, közelebbről figyelembe véve, hogy az adott formulázás koncentrátum, vagy közvetlen felhasználásra kerül. A legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje koncentrációja általánosságban legalább 1 százalék (tömeg/tömeg) lehet, és fel egészen 100 százalék (tömeg/tömeg) lehet.

A mezőgazdasági készítmény kijuttatása megoldható külső alkalmazással, akár közvetlenül a növényre, akár a növények vagy a növényi részek szomszédságába. A mezőgazdasági készítmények alkalmazhatók a rovar kártevő(k) környezetében, azaz a növények talajában vagy öntözővizében, permetezéssel, porozással, kiszórással vagy más hasonló módon.

A találmány tárgyát képezi továbbá a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét kódoló génnel transzformált rekombináns gazdaszervezetek alkalmazása (azaz mikroorganizmus-gazdaszervezetek és rovarvírusok) és azok alkalmazása a megcélzott rovar támadására fogékony kiválasztott növényen vagy növényi részen vagy annak közelében. A gazdaszervezeteket úgy választjuk ki, hogy képesek legyenek egy rovarfertőzésre fogékony növényi szövetbe betelepülni, vagy alkalmazhatók legyenek mint elpusztult vagy életképtelen sejtek, amelyek a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét hordozzák. A mikrobiális gazdaszervezetek közül közelebbi érdeklődésre tarthatnak számot a prokarióták és az alsóbb rendű eukarióták, mint például a gombák.

A legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét magába záró mikrobiális gazdaszervezet jellemzői közé tartoznak a fehérje védelmére szolgáló tulajdonságok, mint például vastag sejtfalak, pigmentáció és intracelluláris pakolás vagy inklúziós testek létrehozása; levelekkel szemben mutatott affinitás, az emlősökkel szemben mutatott toxicitás hiánya; a kártevők szempontjából mutatott vonzó tulajdonságok, hogy azt elfogyasszák; a mikroorganizmus egyszerű elpusztíthatósága és fixálása a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje károsodása nélkül; és az a kezelési lehetőség, ami meghosszabbítja a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje aktivitását. Egy növényre betelepülő mikrobiális gazdaszervezet jellemzői közé tartoznak az alábbiak: a fitotoxicitás hiánya; a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét kódoló genetikai szekvencia bejuttatásának az egyszerűsége; expressziós rendszerek hozzáférhetősége; az expresszió hatékonysága és az inszekticid stabilitása a gazdaszervezetben.

A példaként szolgáló, mind Gram-negatív és Gram-pozitív prokarióták magukban foglalják az alábbiakat: Enterobacteriaceae, mint például Escherichia; Bacillaceae; Rhizoboceae, mint például Rhizobium és Rhizobacter; Spirillaceae (mint például fotobaktérium), Zymomomas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum, Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae (mint például Pseudomonas és Acetobacter), Azotobacteriaceae és Nitrobacteriaceae. A példaként szolgáló eukarióták közé tartoznak gombák (mint például Phycomycetes és Ascomycetes), amelyek magukban foglalják az élesztőt (mint például Saccharomyces és

HU 225 427 Β1

Schizosacharomyces); és Basidiomycetes élesztőt (mint például Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces) és más hasonlók.

A találmány tárgyát képezi továbbá a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét kódoló gént tartalmazó bakulovírus alkalmazása. Bakulovírusok - beleértve az alábbi fajokat fertőző bakulovírusokat: Heliothis virescens (gyapotmag-bagolylepke), Orgyla psaudotsugata (duglászfenyő-szövőlepke), Lymantria dispar (gyapjas lepke), Autographica californica (lucernaaraszoló), Neodiprion serfiter (európai fenyőlégy) és Laspeyresia pomonella (szövőlepke) - már regisztrálásra kerültek, és peszticidként alkalmazzák ezeket [lásd például a 4,745,051 lajstromszámú US és az 175 852 lajstromszámú EP szabadalmakat],

A rekombináns gazdaszervezet különböző módokon formulázható. Alkalmazható nedvesíthető porokban, granulátumokban, porozószerekben, vagy különböző inért anyagokkal keverve, mint például szervetlen ásványok (filloszilikátok, karbonátok, szulfátok, foszfátok és más hasonlók) vagy növényi eredetű anyagokkal (elporított kukoricacsutka, rizshéj, dióhéj és más hasonlók). A formulázások tartalmazhatnak szétterülést és tapadást biztosító adjuvánsokat, stabilizálóágenseket, más inszekticidhatású adalékokat, felületaktív anyagokat és bakteriális tápanyagokat vagy más ágenseket a baktériumsejtek stabilizálására vagy a növekedés elősegítésére. A folyadékformulázások lehetnek vizes vagy nemvizes alapú formulázások, és alkalmazásra kerülhetnek mint habok, gélek, szuszpenziók, emulgeálható koncentrátumok vagy más hasonlók. A komponensek magukban foglalhatnak reológiai ágenseket, felületaktív anyagokat, emulgeálóanyagokat, diszpergálóanyagokat vagy polimereket.

Transzgenikus növények

Alternatív módon a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje beépíthető egy fogékony növény szöveteibe oly módon, hogy a növény megfertőzése során a rovar a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó kiválasztott fehérje rovarok számát szabályozni képes mennyiségét fogyasztja el. Ez az eljárás speciális lehetőséget biztosít olyan, rovarok vagy nematódák által fogyasztott növényi szövet elérésére, amelyet általában nagyon nehéz elérni a peszticidek hagyományos alkalmazása során. Továbbá fontos gazdasági és környezetvédelmi előnyökre tehetünk szert, amikor a peszticidek alkalmazásának szükséglete csökkenthető.

Az eljárás további előnyökkel jár akkor is, amikor figyelembe vesszük a rovarok rezisztenssé válásának a lehetőségét. Az inszekticid anyagok bőséges általános alkalmazása a termelési területen vagy egy földrajzi területen porozás, permetezés vagy a talajba történő bejuttatás útján hajlamos erős szelekciós nyomást gyakorolni, mivel a rovaroknak nincs „biztonságos menedékük”, ahol a nem ellenállóképes egyedek túlélhetnek. Azonban a termelésbe fogott növények sok rovar kártevője termelésbe nem vont fajokat is megtámad. Amennyiben az inszekticidhatású anyagokat a termelt növényekre korlátozzuk a területen oly módon, hogy az inszekticidhatású anyagokat csak ezekben a fajokban expresszáljuk, ez lehetővé teszi az ellenálló képességgel nem rendelkező rovarok folyamatos túlélését a társult gyomnövényeken, amelyek nemcsak biztonságos menedékhelyet nyújtanak a mérgező vegyületek elől, de táplálékot is biztosítanak a rovarok számára. Ez jelentős mértékben csökkenti a szelekciós nyomást, és így lassítja az ellenállóképes rovarok kifejlődését és elterjedését.

Az eljárás további előnyöket is kínál a talaj- és a talajvíz-szennyeződés szempontjából, mivel nincs szükség hordozóra a kijuttatáshoz. Az inszekticidhatású komponensek önmagukban természetes eredetűek és természetes úton lebomlanak, amikor a növényt elfogyasztják vagy komposztálódik. Az eljárás további előnyöket kínál a költségek szempontjából, mert nincsenek kijuttatási költségek és az inszekticidhatású anyagok költsége beépül a mag vagy más szaporítóanyag árába, amit a termesztő vásárol.

Az ennek végrehajtására szolgáló egyik eljárás során a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét nem fitotoxikus hordozóba beépítjük, amelyet adaptáltunk a szisztémás bejuttatáshoz a fogékony növényekbe. Azonban, mivel a legalább egy

I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét kódoló gének izolálhatok, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint olyan transzgenikus növényeket állítunk elő, amelyek képesek biológiailag szintetizálni a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjéket, hogy a növények részére biztosítsanak egy új vagy egy további védelmi mechanizmust rovarok vagy nematódák támadása ellen.

A találmány tárgyát képezik eljárások rovarok okozta fertőzésekkel szembeni ellenálló képesség átvitelére - amely rovarokban emésztőrendszeri ciszteinés/vagy aszparaginsavproteázok találhatók - egy fogékony taxonba tartozó növényekre, amelynek során: (a) a taxonba tartozó legalább egy növényből sejteket vagy szöveteket tenyésztünk; (b) a sejt- vagy szövettenyészet sejtjeibe a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét kódoló struktúrgént juttatunk be, amely funkcionálisan kapcsolt olyan növényi szabályozószekvenciákhoz, amelyek a gén expresszióját hozzák létre a sejtekben; és (c) a sejtvagy szövettenyészetből rovarokkal szembeni ellenálló képességet mutató teljes növényeket regenerálunk.

A legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjék szokatlanul nagy mennyiségben történő expressziója káros lehet magára a növényre nézve. A szignálszekvenciák alkalmazása - ezáltal a szekréció vagy az eloszlás egy kiválasztott szervecskében valósul meg - lehetővé teszi, hogy a fehérje metabolikusan közömbös helyre korlátozódjon, míg egy rovar kártevő tápcsatornájában felszabadul.

Általánosságban a DNS-szekvencia olyan szekvencia lehet, amely egy, a megcélzott élő szervezettől különböző élő szervezetből származó, legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjéből származik, vagy jelentős mértékű szekvenciahomológiát mutat ezzel a fehérjével.

HU 225 427 Β1

Optimális expresszió növényekben

Annak érdekében, hogy optimalizáljuk az ilyen rendszerek transzkripciós és transzlációs hatékonyságát, elképzelhető a kodonhasználat gyakoriságának vizsgálata és annak meghatározása, hogy az adott növényben általános esetben jelen levő transzkripciós és transzlációs rendszereken belül lényegében mely kodonok kerülnek előtérbe. Az ilyen előnyösen felhasznált kodonok alkalmazásával lehetővé válik olyan fehérje-kódolószekvencia megszerkesztése, amely az equistatingén vagy ezen gén funkcionális származéka transzkripciós és transzlációs hatékonyságának jelentős mértékben megemelkedett szintjéhez vezethet, olyan génnel összevetve, amelynek megszerkesztése során a kódolószekvenciát közvetlenül, módosítás nélküli formában vesszük át a donor szervezettől. Továbbá a kódolószekvencia úgy is optimalizálható, hogy eltávolítjuk a potenciális növényi poliadenilációs szignálokat, rejtett „splicing'' helyeket és mRNS-instabilitást okozó részegységeket, ahogyan ezt a Bacillus thüríngiensis toxingének esetében már kimutatták.

Általánosságban heterológ gének inszerciója véletlenszerű eloszlásban történik bármely transzformációs eljárást alkalmazva; azonban jelenleg már léteznek olyan, növények előállítására szolgáló eljárások, amelyek segítségével a DNS helyspecifikus rekombinációja érhető el növényi sejtekbe [lásd: WO/910 9957 lajstromszámú szabadalom], A növényi sejtekbe beillesztett idegen gén aktivitása függ az inszertált gének egyedi expressziós jellemzőitől, amely függ a szabályozórégióktól (promoterek, poliadenilációs régiók, enhanszerek stb.), és függ a kiméra inszerttel szomszédos endogén növényi DNS befolyásától, és függ a kópiaszámtól.

A kiválasztott promoter képes kell legyen elégséges mértékű expresszió létrehozására, hogy a fehérje rovarok számát szabályozni képes mennyiségének termelését biztosítsa. A megfelelő promoterek közé tartoznak mindazok, amelyek növényekben természetes úton expresszálódó génből származnak, és olyan szintetikus promoterszekvenciák is, amelyek magukban foglalhatnak redundáns vagy heterológ enhanszer szekvenciákat is. Számos, a növényi sejtekben aktív promoter közé tartoznak az alábbiak: nopalinszintáz, octopinszintáz és mannopinszintáz promoterek az Agrobacteríum tumefaciens tumorindukáló plazmidjaiból. A találmány tárgyát képezik konstitutív promoterek is oly módon, hogy a transzformált növény megnövekedett toleranciát mutat a rovar kártevőkkel szemben. A konstitutív promoterekre például szolgálhatnak a CaMV 19S és 35S promoterek [JP 63287485 lajstromszámú japán szabadalom], az ubiquitinpromoter és a rizs aktinpromoter [WO/9109948 lajstromszámú szabadalom].

Olyan fajokban, amelyek legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó természetes fehérjét termelnek - amely fehérje nem termelődik vagy nem kerül be olyan szövetekbe, amelyeket a rovarok általában megfertőznek -, szövetspecifikus promoter alkalmazható a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje helyspecifikus expressziójának vagy túltermelésének biztosítására. A szövetspecifikus promoterekre például szolgálhatnak az alábbiak: a gyökérspecifikus promoterek, mint például kukorica metallotionein [EP 452269 lajstromszámú szabadalom], a gyökérspecifikus promoter [WO/9113992 lajstromszámú szabadalom], a növényi mag raktározó test promoter [WO/9113993 lajstromszámú szabadalom], és az alkohol-dehidrogenáz-1 promoter. Az ismert, fénnyel indukálható promoterek közé tartozik a szójából származó ribulóz-1,5-bifoszfát karboxiláz kis alegységét (ss) kódoló gén promotere és a klorofill a/b kötő fehérjét kódoló gén promotere zöldülő levelekben [Coruzzi és munkatársai: J. Bioi. Chem. 258 1399 (1983); Dunsmuir és munkatársai: J. Molecular and App. Gén. 2 285 (1983), valamint Nap és munkatársai: Plánt Molec. Bioi. 23 605(1993)].

Végül egy sebzéssel vagy patogén hatására indukálható promoter alkalmazható a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjék expressziójának biztosítására, amikor egy növényi kártevő szövetet támad meg. Sebzéssel vagy patogén hatására indukálható promoterekre például szolgálhat a proteináz II. inhibitor promoter.

Növényi vektorok

Növényi szövet és protoplaszt transzformálására alkalmas vektorok már korábban leírásra kerültek a szakirodalomban, és az alábbi referenciák teljes egészükben a kitanítás részeként tekintendők: deFrammond és munkatársai: Biotechnology 1 262 (1983); An és munkatársai: EMBO J. 4 277 (1985); Potrykus és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 199 183 (1985); Rothstein és munkatársai: Gene 53 153 (1987), valamint a WO 90/08829 és WO 84/02913 nemzetközi szabadalmi bejelentések; és a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a pCAB1-vektort alkalmazzuk, ahogyan ez leírásra kerül a csatolt példákban. A gyakorlatban nem szükségszerű, hogy a szelektálható markergént hordozó vektor tartalmazza a kívánt gént is. Előnyösen az ilyen vektorokkal végzett együttes transzformáció alkalmazható növényi sejtek transzformálására.

Transzformációs eljárás

A kifejlett transzgenikus növények előállításához a megfelelő eljárás az alkalmazott növényfajnak megfelelően választható ki. A regeneráció a növények esetében fajról fajra változik. A hatékony regeneráció függ a táptalajtól, a genotípustól és a tenyészet előtörténetétől. Miután teljes növényeket nyertünk, ezek szexuális úton vagy klónozás segítségével szaporíthatok oly módon, hogy a szekvenciának legalább egy kópiája megtalálható a szaporításból kapott utódok sejtjeiben. Az ilyen eljárások az alkalmazott növényfajnak megfelelően választhatók ki.

Transzgenikus növények nemesítése

A transzformált növényi sejtekből felnevelt kifejlett növények önbeporzással szaporíthatok, hogy beltenyésztett növényt állítsunk elő. Diploid növényekben tipikus esetben az egyik szülőnövényt transzformáljuk, és a másik szülőnövény lehet a vad típusú. A szülőnövényt keresztezzük, hogy létrehozzuk az első generá13

HU 225 427 Β1 ciós hibrideket (F-)), amelyeket ezután önbeporzással szaporítunk, hogy létrehozzuk a második generációs hibrideket (F₂). A legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét genetikailag tartalmazó F₂ hibrideket választjuk ki és önbeporzással szaporítjuk, hogy beltenyésztett növényt hozzunk létre.

Hagyományos növénynemesítési eljárások alkalmazhatók az equistatin-struktúrgén vagy annak funkcionális származéka átvitelére keresztezés és visszakeresztezés útján. Az ilyen eljárások az alábbi lépésekből állnak: (a) szexuális úton keresztezzük a rovarrezisztens növényt a rovarokra fogékony változatból vett növénnyel; (b) szaporítóanyagot nyerünk a keresztezés utódaiból; és (c) a szaporítóanyagból rovarrezisztens növényeket nevelünk. Ahol kívánatos vagy szükséges, a fogékony változat mezőgazdasági jellegzetességeit lényegében megőrizhetjük azzal, hogy ezt az eljárást a következő lépések megismétlésével kibővítjük: (d) a rovarrezisztens utódokat a fogékony változatból rovarokra fogékony növényekkel visszakeresztezzük; és (e) a rovarrezisztencia expressziójára (vagy egy társult markergénre) szelektálunk a visszakeresztezés utódai között, míg a fogékony változat jellemzőinek kívánt arányát érjük el az utódokban a rovarrezisztenciát biztosító gén jelenléte mellett. Ezt követően a találmány szerinti beltenyésztett vonalak másik beltenyésztett vonallal keresztezhetők, hogy a hibrideket előállítsuk.

Hatásfokozók

A találmány tárgyát képezi továbbá - a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjével együtt - adjuvánsok, azaz kémiai vagy biológiai adalékok alkalmazása annak érdekében, hogy kiterjesszük a megcélzott kártevők skáláját; hogy a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje hatékonyságának élettartamát kiterjesszük; vagy elősegítsük a legalább egy I. típusú Ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjéből előállított mezőgazdasági készítmény stabilizálását.

Hatásfokozókra például szolgálhatnak a következők: lektinek, amfipatikus fehérjék vagy kiegészítő proteázinhibitorok. [gy például a több mint egy védelmet szolgáló fehérje jelenlétének - más védelmet szolgáló fehérjék jelenlétében - fontos szerepe lehet a növények védekezésében rovartámadások ellen. Ismert, hogy Hemiptera és Coleoptera rovarfajokban a fehérjeemésztés alternatív útjai fejlődtek ki olyan táplálékok esetére, amelyek bizonyos proteázinhibitorokat magas szinten tartalmaznak. Előnyös lehet inhibitorokat alkalmazni olyan családokból, mint például a cisztatinok (l-lll. típusú inhibitorok és a fitocisztatinok), Kunitz típusú inhibitorok, virgiferin inhibitorok, Bowman-Birk-inhibitorok, árpa tripszin inhibitorok, burgonya I. és II. inhibitorok, tök inhibitorok, Ragi1-2/kukorica bifunkcionális inhibitorok, karboxipeptidáz-A és -B inhibitorok és aszparaginsavproteáz-inhibitorok [Ryan: Annu. Rév. Phytopathol. 28 425 (1990)].

Rovarok és nematódák

A találmány tárgyát képezi egy taxon bármely növényének védelme, amely fogékony emésztőrendszeri tisztein- és/vagy aszparaginsavproteázokkal rendelkező rovarok vagy nematódák okozta fertőzéssel és károsítással szemben. Az ilyen rovar kártevők közé tartoznak közelebbről a Tenebrionidae, Curculionidae, Bruchidae és Chrysomelidae családok Coleoptera rovarfajai, Thysanoptera rovarok és Diptera rovarok. Az ilyen növényi parazita nematódák közé tartoznak az alábbi fajok: Globodera pallida, Heterodera schachtii és Meloidogyne incognita. Külön kiemeljük az alábbi rovarokat: Leptinotarsa decemlineata, Frankliniella occidentalis, Diabrotica virgifera és Liriomyza trifolii, amelyeket közönségesen úgy ismerünk, mint: kolorádóbogár, nyugati virágtripsz, nyugati kukorica-gyökérféreg és levélfúró. További specifikusan említendő rovarok közé tartoznak az alábbiak: déli kukorica-gyökérféreg, mexikói babbogár, vörös lisztbogár, összetéveszthető lisztbogár, tehénborsózslzsik, gyapotmagzsizsik, rizszsizsik, kukoricazsizsik, gabonazsizsik, kis gabonafúró, a bolhabogarak, egyiptomi lucemazsizsik, babzsizsik, sárga lisztféreg, spárgabogár, tökbogár. A leírás során a „taxon” kifejezés alatt egy csoportot értünk, nemzetségszintű vagy annál kisebb botanikai osztályozást. így ez magában foglalhat nemzetséget, fajokat, termesztési változatokat, alfajokat, változatokat és más kisebb taxonómiai csoportokat, amelyek nem rendelkeznek következetes elnevezéssel.

Növények

A példaként említhető fajok közé tartoznak az alábbiak: burgonya, kukorica, paradicsom, cirok, gyapot, szója, szárazbabfélék, repce, lucerna, spárga, édesburgonya és krizantém. Azonban a fenti felsorolás nem korlátozó jelleggel értelmezendő, mivel ezek a rovarok bizonyos más termesztett növényeket is megfertőzhetnek. [gy a találmány szerinti eljárások könnyen alkalmazhatók számos növényfajra, amennyiben ezek a fentebb felsorolt növényfajokra fogékonyak, nem korlátozó értelemben beleértve az alábbi nemzetségekbe tartozó fajokat: Medicago, Trifolium, Vigna, Citrus, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Capsicum, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Helianthus, Bromus, Asparagus, Panicum, Pennisetum, Cucumis, Glycine, Lolium, Triticum és Zea.

A találmányt a továbbiakban részleteiben mutatjuk be az alább következő példák segítségével. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy az ismertetésre kerülő példák csupán a találmány jobb megérthetőségét szolgálják, és nem korlátozó értelemben kerülnek bemutatásra. Az összes DNS-szekvenciát a hagyományos 5’ -> 3’ irányításban mutatjuk be. Az összes aminosavszekvenciát a hagyományos, aminoterminálistól a karboxiterminális felé irányításban mutatjuk be. Az alább következő példák kivitelezése során az összes DNS-műveletet standardeljárások szerint végeztük, amennyiben ezt másként nem jelezzük. Lásd például: Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Egyesült Államok, (1989).

1. példa

Az equistatin 2-3 dómén aktivitása katepszin-D típusú aszparaginsavproteázokkal szemben Equistatint izoláltunk az A. equina tengeri rózsából egy korábban már leközölt eljárás segítségével, kihasználva annak ciszteinproteázzal, papainnal szem14

HU 225 427 Β1 ben mutatott inhibitoraktivitását [Lenarcic és munkatársai: J. Bioi. Chem. 272 13 899 (1997)]. A ciszteinproteázok mellett az equistatint a proteázok két másik osztálya, az aszparaginsavproteázok (katepszin-D) és a szerinproteázok (tripszin) gátlására is szkríneltük. Az equistatin gátlóhatását csak akkor figyeltük meg, amikor katepszin-D-vel reagált. A kapott gátlóhatás váratlan volt, mert az equistatinról ismert, hogy erős inhibitora a papainszerű ciszteinproteázoknak. Továbbá azt is leközölték, hogy a p41 fragmensnek nincs semmiféle gátlóhatása a katepszin-D-vel szemben [Bevec és munkatársai: J. Exp, Med. 183 1331 (1996)]. Annak bizonyítására, hogy az equistatin nem viselkedik szubsztrátként a katepszin-D esetében, mindkettőt különböző moláris koncentrációk mellett különböző időtartamig inkubáltuk, és a keveréket fordított fázisú HPLC rendszer segítségével vizsgáltuk (9A. ábra). Nem figyeltünk meg katepszin-D lebomlási termékeket. Ellenkezőleg, azt találtuk, hogy az equistatin jó szubsztrátja a tripszinnek, és ezt a tényt használtuk ki a tiroglobulin l. típusú domének elválasztására β-tripszinnel végzett részleges proteolízis segítségével. 500 pg equistatint inkubáltunk 5 pg β-tripszinnel 0,5 ml 0,1 M Trisz/HCI pufferben (pH 8,0) 40 percig 37 °C-on. A reakciót trifluor-ecetsav hozzáadásával állítottuk le. Az equistatin β-tripszinnel végzett emésztését nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (Milton Roy Co.) segítségével választottuk szét fordított fázisú Vydac C18 oszlopot alkalmazva, amit 0,1% (térf/térf) trifluor-ecetsavat tartalmazó 5% acetonitriloldattal hoztuk egyensúlyba. Az elúciót lineáris gradiens alkalmazásával hajtottuk végre 80% (térf/térf) acetonitrillel, ami 0,1% (térf/térf) trifluor-ecetsavat tartalmazott. Az abszorbanciát 215 nm-en követtük. A fordított fázisú HPLC során két fő csúcsot kaptunk (9B. ábra). Nem redukáló körülmények között - az SDS-PAGE alapján becsülve - molekulatömegeknek körülbelül 7000 Da és 14 000 Da értékeket kaptunk (10. ábra). Mindkét fragmens N-terminálisának meghatározása lehetővé tette azonosításukat az equlstatinmolekula szekvenciáján belül, amelyet vázlatosan a 11. ábrán mutatunk be. A fragmensek C-terminálisát nem határoztuk meg közvetlenül, de méretük alapján - ahogyan ezt az SDS-PAGE jelezte - egyértelmű volt, hogy ezek egy önmagában álló, illetve egy kettős domént képviselnek. A kisebb fragmens az equistatin N-terminálisával kezdődik, és ennek megfelelően az első domént képviseli (eq d-1). A nagyobb fragmens két szekvenciát mutatott, Ala68 és Vall 52 aminosavakkal kezdve. A Lys67-Ala68 kötés a második dómén kezdetén helyezkedik el, míg az Arg151-Val152 kötés hasítása nem a részleges proteolízis eredménye volt (11. ábra). Leközölték, hogy az izolált equistatin jelentős mértékben hasított az Arg151 és Vall 52 aminosavak között, a láncokat diszulfidhíd kapcsolja össze, és csak redukálás után esnek szét [Lenarcic és munkatársai: J. Bioi. Chem. 27213899 (1997)]. Egy SDS-PAGE analízis során látható, keskeny kettős sáv nagy valószínűséggel a C-terminálishoz nagyon közel bekövetkezett fragmentálódás eredménye, ami azt jelenti, hogy ez a fragmens képviseli a kombinált második és harmadik doméneket, eq d-2,3. A szekvenciaadatoknak megfelelően az equistatin három szekvencia szerint homológ része három potenciális proteináz-kötőhellyel rendelkezhet. Korábbi kutatások során kimutatták, hogy az equistatin és a papain - mint a ciszteinproteázok csoportjának reprezentatív tagja - kötési sztöchiometriája 1:1 arányú [Lenarcic és munkatársai: J. Bioi. Chem. 272 13899 (1997)]. Amikor egy aszparaginsavproteázt - katepszin-D - titráltunk equistatinnal, becslésünk szerint ismét 1 mól equistatinra volt szükség 1 mól katepszin-D telítésére (12. ábra). Ez az érték nem változott széles koncentrációs tartományban sem. Annak érdekében, hogy tanulmányozzuk az equistatin egyes doménjeinek inhibitoraktivitását, a papain és a katepszin-D Inaktiválásának részletes kinetikai analízisét hajtottuk végre. Az összes kinetikai és egyensúlyi konstanst a 2. táblázatban tüntettük fel. Az első dómén - eq d-1 - gyakorlatilag ugyanolyan inhibitori jellemzőket mutatott a papainnal szemben, mint a teljes equistatin, a p41 fragmens vagy ECI. A tiroglobulin I. típusú doméninhibitoroknak ezt a csoportját a ciszteinproteázok - papain, B- és L-katepszinek, cruzipain - kompetitív, reverzibilis és szorosan kötődő inhibitorainak tekintjük. A két domént tartalmazó inhibitor - eq d-2,3 - gyakorlatilag nem mutatott papaingátlást.

Az equistatin és katepszin-D kötődési kinetikáját a PT pozícióban kromofort - mint például nitro-fenilalanin aminosav - tartalmazó szintetikus szubsztrát segítségével mértük meg. A vizsgálati eljárás érzékenysége - amit szubsztrátként a H-Pro-Thr-Glu-Phe*NphArg-Leu-OH tett lehetővé - biztosította számunkra, hogy az enzim 6,4 nM koncentrációját alkalmazzuk legkisebb koncentrációként a vizsgálat során. A kapott egyensúlyi disszociációs konstans a katepszin-D és az equistatin közötti kölcsönhatásra (Κ,=0,3 nM) azt jelzi, hogy az equistatin figyelemre méltóan jó inhibitora a katepszin-D aszparaginsavproteáznak. A papain aktív fragmens - eq d-1 - esetében a K, értékére körülbelül 1 mM koncentrációt határoztunk meg. Ez az érték számos nagyságrenddel nagyobb, mint a teljes equistatinra vonatkozó Kj-érték, ezzel jelezve, hogy az equistatin inhibitori aktív helye más doméneken kell hogy elhelyezkedjen. Az eq d-2,3 valóban gyakorlatilag ugyanazokat az inhibíciós jellemzőket mutatta, mint a teljes equistatin (K, >0,6 nM). Továbbá egy szoros komplex kialakulása katepszin-D és equistatin között hasonlóképpen láthatóvá volt tehető natív PAGE segítségével (10B. ábra).

Az equistatin a katepszin-D első olyan fehérjeinhibitora, amely állati eredetű ismert primer struktúrával rendelkezik. Mostanáig csak a pepstatin származékairól volt ismert, hogy olyan erős inhibitorai a katepszinD-nek, mint az equistatin.

Az ezen tanulmányban leközölt adatok egyértelműen megmutatják, hogy az equistatinban különböző I. típusú tiroglobulindomének találhatók, kiterjedt aminosavszekvencia-hasonlóságaik ellenére a proteázok különböző osztályait célozzák meg, akár ciszteinproteázról vagy a katepszin-D aszparaginsavproteázról van szó.

HU 225 427 Β1

2. táblázat

Kinetikai konstansok az equistatin, eq d-1 és eq d-2,3 kölcsönhatására papainnal és katepszin-D-vel

Enzim	Inhibitor	10-6xk_a M-¹s-¹	ΙΟΜς, S¹	Ki nM
papain³	equistain	12±0,6	65±1,5	0,57±0,04
	eq d-1	1,8±0,35	11 ±0,3	0,61±0,01
	eq d-2,3	ND^d	ND	>1000®
katepszin-D^b	equistain	ND	ND	0,3±0,16
	eq d-1	ND	ND	>1000³
	eq d-2,3	ND	ND	0,4±0,15

³ - Folytonos sebességi vizsgálati eljárást alkalmaztunk a papain inhibitorokkal való kölcsönhatásának kinetikai vizsgálatához.

A Kj-értéket a k_d/k_a arányból számítottuk.

^b - Az adatokat kromofór szubsztráttal, az inhibitornak az egyensúlyi állapotban mért katepszin-D katalizált hidrolízis sebességére kifejtett gátlóhatása alapján határoztuk meg. ^d - Nem került meghatározásra.

^θ - Sem az eq d-2,3 nem mutatott jelentős mértékű hatást papainra nézve, sem az eq d-1 katepszin-D-re nézve, még 5 mM koncentrációnál sem; így az inhibiciós konstans értékét 1 mM-nál nagyobbra becsültük.

2. példa

Equistatin molekuláris klónozása

Az Actinia equina L. tengeri rózsa egyetlen példá- 25 nyából teljes RNS-t izoláltunk oly módon, hogy a szövetet folyékony nitrogénben feltártuk. Két gramm őrölt, mélyfagyasztott szövetet vittünk át 20 ml guanidinium-tiocianát-oldatba (5,5 M GTC, 0,5 M EDTA, 0,2 M β-merkapto-etanol) és elektromos turmixgépben homo- 30 genizáltuk (16 000 ford./perc, 4*30 másodperc). Ezt követően az oldatot centrifugáltuk (6000 g, 20 perc, °C). 10 ml tiszta felülúszót vittünk át 10 ml cézium-TFA-oldatba (p=1,5 mg/ml), amit 2,5 ml 0,5 M EDTA-val (pH 8,0) egészítettünk ki. A mintát centrifu- 35 gáltuk (125 000 g, 24 óra, 15 °C). A felülúszót eltávolítottuk, és a teljes RNS-t (üledék) 1 ml proteáz-K oldatban (0,5 mg/ml) oldottuk fel. Az oldatot 50 °C-on fél órán át inkubáltuk, majd a teljes RNS-t 1/10 térfogat 3 M KOAc, pH 5,2 és 2,5 térfogat 96%-os etanol hoz- 40 záadásával kicsaptuk, és a keveréket éjszakán át mélyhűtőben tartottuk -20 °C-on. A teljes RNS-t centrifugálással ülepítettük (8000 g), és az üledéket 2 ml TE-pufferben feloldottuk. A feloldott minta 1 ml-ét 65 °C-on 5 percig melegítettük, jégen lehűtöttük, és ezt 45 követően 3 M NaCI-dal kiegészített 0,2 ml TE-puffert adtunk hozzá. A teljes mintát az oligo (dT)-cellulóz töltet tetejére vittük fel az oszlopban. A cellulózt háromszor mostuk a TE-pufferrel, sorrendben megfeleltetve 0,5 M NaCI és 0,1 M NaCI hozzáadásával kiegészítve. 50 Poli(A)⁺ RNS-t eluáltunk 1 ml (négy egyenlő részletben, 0,25 ml-0,25 ml) TE-pufferrel, amit előzetesen 65 °C-ra melegítettünk. A minta egyharmadát (körülbelül 1 pg) használtuk fel cDNS szintéziséhez a gyártó eljárását követve (Amersham). Az első cDNS-szál szín- 55 tézisét a következők szerint valósítottuk meg: 11 μΙ mRNS-oldat, 4 μΙ 5*reakció puffer, 1 μΙ Napirofoszfátoldat, 1 μΙ humán placentaeredetű ribonukleázinhibitor (5 U/μΙ), 2 μΙ dNTP keverék oldat és oligo dT primer oldat (1 μΙ). 2 μΙ (10 U/μΙ) reverz transzkriptáz hozzáadá- 60 sa után a keveréket 42 °C-on 40 percig inkubáltuk. A második cDNS-szál szintézisét a következő komponensek hozzáadásával valósítottuk meg: 37,5 μΙ második szál reakciópuffer, 7 μΙ E. coli DNS-polimeráz-l (4 U/μΙ) és 1 μΙ E. coli ribonukleáz-H (1 U/μΙ). A reakciókeveréket sorban egymás után 12 °C-on 60 percig és 22 °C-on 60 percig inkubáltuk. Hővel végzett denaturálás után (5 perc 70 °C-on) 0,5 μΙ T4 DNS-polimerázt (2 U/μΙ) adtunk hozzá, és a reakciókeveréket 37 °C-on 10 percig inkubáltuk. 2,5 μΙ (250 pmol) EcoRI-adaptorokat ligáltunk 1 pg cDNS-hez, 2 μΙ T4 DNS-ligázt (4 U/μΙ) alkalmazva 20 pl ligálási keverékben. 16 °C-on tartottuk 8 órán keresztül, majd a ligálási keveréket oszlopon tisztítottuk (az adaptorkapcsolt cDNS-t méret szerint frakcionáltuk) centrifugálható oszlopokat és TE-puffert alkalmazva. A tisztított cDNS összegyűjtött frakcióit T4 polinukleotid-kináz (8 U/μΙ) segítségével foszforiláltuk, és a cDNS-t defoszforilált Xgt11 bakteriofág karokba ligáltuk T4 DNS-ligáz segítségével (40 U/pg DNS). Végül a teljes ligálási keveréket in vitro pakoltuk ugyanazon gyártótól (Amersham) származó pakolási kivonatot alkalmazva. A Xgt11 cDNS-klóntár egy részét (10⁵ pfu „plaque forming unit”, tarfoltképző egység) alkalmaztuk Y1090 E. co/í-sejtek fertőzésére, és a keveréket LB agariemezekre szélesztettük. A tarfoltokat nitro-cellulóz-membránokra biotoltuk. A membránokat 0,01% Tween-20-at tartalmazó Trisz-pufferolt fiziológiás sóoldatban (TBST) öblítettük le háromszor, és ezt követően blokkolóoldatban [20% (térf/térf) fötális szérum TBST-ben], A membránokat TBST-ben mostuk, majd hozzáadtuk az első antitestet (nyúleredetű antiequistatin IgG) TBST-ben, és a membránokat az oldatban éjszakán át kezeltük 4 °C-on. Ezt követően a membránokat háromszor mostuk TBST-vel, és a második antitesttel kezeltük (kecskeeredetű antinyúl IgG tormaperoxidáz). A TBST-ben elvégzett végső mosás után szubsztrátként diamino-benzidint alkalmazva tettük láthatóvá. Három pozitív kiónt izoláltunk agarleme16

HU 225 427 Β1 zekről, és az újraszélesztést követően az agarlemezek felületéről tagokat eluáltunk ΤΕ-puffer segítségével (5 ml lemezenként). Fág DNS-t izoláltunk Wizard Lambda Preps DNS-izolálási reagenskészlet alkalmazásával (Promega) a gyártó eljárása szerint. Restrikciós analízist hajtottunk végre 2 μΙ EcoRI restrikciós enzimet alkalmazva (10 U/μΙ) 3 μg XDNS-hez, és méret szerint frakcionáltuk 1% agarózgélen, majd a cDNS-inszerteket kivágtuk, „üvegtej” segítségével tisztítottuk, és pUC19 plazmid EcoRI klónozóhelyébe szubklónoztuk. Teljes ligálási keveréket (mindegyik mintából 10 μΙ) transzformáltunk DH5a E. co//-sejtekbe oly módon, hogy a nagymértékben kompetens sejtek 100 μΙ-ét (O.D.₅₅₀=0,6) és a ligálási keverékből 10 μΙ-t vízfürdőben (42 °C) 45 másodpercig inkubáltuk. LB táptalaj (900 μΙ) hozzáadása és egy óra inkubálás után (37 °C, 250 ford./perc) a baktériumkeveréket X-gal- és IPTG-vel kiegészített LBA lemezekre szélesztettük, és éjszakán át tartó inkubálás után (37 °C) fehér telepeket vittünk át 5 ml LB táptalajba, és további 16 órán keresztül inkubáltuk (37 °C, 250 ford./perc). A Wizard Plasmid Purification System (Promega) segítségével plazmidokat izoláltunk a gyártó utasításai szerint, és nukleotidszekvenálással analizáltuk T7 DNS-polimerázt (T7 szekvenáló reagenskészlet, Pharmacia) és [³⁵S]dATPaS-t (Amersham) alkalmazva. A kiválasztott cDNS-klónok szekvenálása eredményeképpen megkaptuk az 1. ábrán bemutatott teljes hosszúságú cDNS-klónt.

3. példa

Rekombináns equistatin cDNS expressziója Escherichia coli-őan

Két prímért alkalmaztunk az equistatin érett fehérje amplifikálására és annak Nco\-Noti fragmensként történő klónozására az E. coli pB3 expressziós vektorban megtalálható g3 szignálpeptid mögé. A PDEI-1 primer-1 szekvenciája a következő volt: CGC GCC ATG GCG AGT CTA ACC AAA TGC CAA, és a PDEI-2 primer-2 szekvenciája a következő volt: GGG TGC GGC CGC GCA TGT GGG GCG TTT AAA. A megfelelő inszerteket a szekvenciahibák ellenőrzésére szekvenáltuk, és egy kiónt választottunk ki rekombináns fehérje előállításához.

Rekombináns equistatint oly módon állítottunk elő, hogy a HB2151 E. coli-törzs egyetlen telepét növesztettük az equistatint hordozó cDNS pB3-plazmiddal éjszakán keresztül, ampicillinnel kiegészített (100 mg/l végső koncentráció) 5 ml LB tenyésztési táptalajban 37 °C-on 250 ford./perc értéknél. Az éjszakán át növesztett tenyészetből 5 ml-t használtunk fel 800 ml ampicillinnel kiegészített (100 mg/l végső koncentráció) LB tenyésztési táptalaj beoltásához 2 I térfogatú palackban. A sejteket rázatás közben tenyésztettük (30 °C, 250 ford./perc) O.D.₆₀₀=0,5 értékig. Ezt követően IPTG törzsoldatot adtunk hozzá 1 mM végső koncentrációig, és a sejtek tenyésztését a fentiekkel azonos körülmények között folytattuk további 6 órán keresztül. A sejteket jégre helyeztük 1 óra időtartamra, majd ülepítettük (4000 g, 10 perc, 4 °C-on) és 50 ml mM jéghideg MgSO₄-oldatban újraszuszpendáltuk. A szuszpenziót -20 °C-on tartottuk, míg a folyadék tökéletesen megfagyott, és ezt követően a palack tartalmát felengedtük oly módon, hogy a palackot a mintával vízfürdőbe merítettük (30 °C). A felengedés után közvetlenül a sejteket centrifugálással eltávolítjuk (6000 g, 10 perc, 4 °C-on), és a felülúszót -20 °C-on tároltuk az ezt követő, papain-sepharose-on végzett affinitásalapú tisztításig.

4. példa

Rekombináns equistatin tisztítása és jellemzése

A) Affinitástisztítás papain-sepharose alkalmazásával: 10 ml papain-sepharose szuszpenziót kevertünk össze 15 ml 0,02 N NaOH-oldattal 10 percre. Ezt követően a szuszpenziót zsugorított üveg szűrővel ellátott 15 ml térfogatú oszlopba töltöttük. Az oszlopot háromszor mostuk 30 ml 100 mM Trisz-pufferrel (pH=7,0) és végül 10 ml 50 mM MES-pufferrel (pH=6,5) (amelyhez ciszteint adtunk 0,6 mg/ml végső koncentrációig). A fentiek szerint (3. példa) előállított, 1 I baktériumtenyészetből kapott felülúszót cseppenként visszük fel az oszlopra. A papain-sepharose-t ezt követően 20 ml 50 mM MES-pufferrel (pH=6,5) mossuk (cisztein nélkül) és 50 ml 20 mM Trisz-pufferrel (pH=7,5) mossuk. A minta visszanyeréséhez az oszlopot 20 ml 20 mM Trisz-pufferrel (pH=10,3, nem állítjuk be a pH-t HCI segítségével), 20% DMSO-koncentrációval eluáljuk. A tisztított equistatint vízzel szemben dializáljuk és Sartricon minikoncentrátorok alkalmazásával koncentráljuk annak érdekében, hogy 350 μΜ végső koncentrációt érjünk el.

B) Rekombináns equistatin sztöchiometria és inhibíciós konstansok

Mikrotiterlapban 20 μΙ papainoldatot [1 mg/ml koncentrációjú (Sigma) frissen készült oldat MES-pufferben, Ε-64-gyel titrálva az aktív frakció meghatározására, általában 17%] keverünk össze 0-80 μΙ ismert fehérjekoncentrációjú oldattal. A minta térfogatát MES-puffer (50 mM MES, pH 6,5; 0,6 mg/ml L-cisztein; 1 mg/ml BSA frakció-V) hozzáadásával 150 μΙ végső térfogatra kiegészítjük. A keveréket szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk, és ezt követően 50 μΙ szubsztrátoldatot (60 μΙ 15 mg/ml Z-Phe-Arg-pNA metanolban oldva, és felhasználás előtt 940 μΙ MES-pufferrel hígítva) adunk hozzá. A lapot rögtön behelyezzük a mikrotiterlap-leolvasóba és 405 nm-en mérjük. Fel egészen 0,3 O.D-600 értékig a leolvasások lineárisak. A változás sebességét használjuk fel az aktivitás meghatározásához, növekvő mennyiségű inhibitor mellett. Az eredményeket grafikusan ábrázoljuk, és sztöchiometrikus koncentrációknál megmérjük a disszociált komplex mennyiségét a látszólagos egyensúlyi disszociációs konstans (K,) meghatározására. Ezek az eredmények igazolták, hogy az equistatin egy molekulája körülbelül 1 molekula papaint gátol. A látszólagos egyensúlyi disszociációs konstans a papain esetében becslésünk szerint 0,6 nM volt, a tisztított fehérje esetében leközölt adatokkal összhangban [Lenarcic és munkatársai: J. Bioi. Chem. 272 13899 (1997)].

HU 225 427 Β1

5. példa

Kolorádóbogár tápcsatornája középrészén található proteázaktivitás in vitro gátlása Végső állapotban lévő, metil-jasmonat-indukált növényeken felnevelt kolorádóbogár-lárvák tápcsatornáját izoláltuk és extraháltuk, lényegében a Bolter és Jongsma által leközölt módon [Bolter és Jongsma: J. Insect Physiol. 41 1071], Ezekben a tápcsatoma-extraktumokban a burgonya proteázinhibitoraira érzékeny proteázok már komplexben kötött formában találhatók. A visszamaradó proteázaktivitást burgonya proteázinhibitorokra nem érzékeny proteázok adják, amelyek a metil-jasmonat indukálta burgonya inhibitorok jelenlétére adott válaszként indukálódtak. Ezek a proteázok olyan proteázok, amelyek a bogárlárvákat érzéketlenné teszik a burgonyanövény proteázinhibitor védelmével szemben. Különböző ciszteinproteáz-inhibitorok széles skáláját vizsgáltuk meg ezen indukált burgonya proteázinhibitor-érzéketlen ciszteinproteázokkal szemben mutatott specifikus aktivitásukra. Csaknem az összes ilyen inhibitort Szlovéniában, a Jozef Stefan Intézetben tisztították. Kolorádóbogarakkal szemben mutatott potenciáljuk vizsgálatát mind általános fehérjeszubsztrátok (azokazein, 2. táblázat) és hasonlóképpen specifikus szintetikus szubsztrátok (L-Arg-pNA, 3. táblázat; pGlu-Phe-LeupNA, 4. táblázat; Z-Phe-Arg-pNA, 5. táblázat; Z-Arg-Arg-pNA, 6. táblázat) alkalmazásával megvizsgáltuk. Specifikus esetekben az inhibitorokat két koncentrá5 ció - ekvimoláris és a proteázhoz képest feleslegben mellett is megvizsgáltuk annak érdekében, hogy jelzést kapjunk a komplex kötés erősségéről. A legtöbb vizsgált inhibitor vagy inaktív volt, vagy csak gyenge inhibitornak bizonyult. Csak a vizsgált, I. típusú ismétlődő tiroglobu10 lindomént tartalmazó ciszteinproteáz-inhibitorok (tisztított p41 invariáns lánc fragmens és tisztított equistatin) mutattak állandó magas aktivitást a vizsgált kolorádóbogár-lárvák endo- és exoproteolitikus aktivitásával szemben (2-6. táblázatok; 4. ábra). Fontos megjegyezni, hogy az inhibitorok ezen osztálya képes gátolni csaknem az összes általános ciszteinproteáz-aktivitást. Az equistatinpeptid-molekula és annak funkcionális származéka nem volt nagyon aktív az aminopeptidázszerű ciszteinproteáz-aktivitással szemben. A rekombináns humán stefin-A nagymértékben aktív volt ezen típusú aktivitással szemben. A kolorádóbogárral szemben teljes toxicitást mutató inhibitorok legjobb kombinációja ezért az equistatin vagy p41 invariáns lánc fragmens és stefinszerű inhibitorok kombinációja lehet.

3. táblázat

Különböző ciszteinproteáz-inhibitorok hatása kolorádóbogár-lárvák tápcsatorna-kivonatának általános proteolitikus aktivitására, azokazein segítségével meghatározva

Ciszteinproteáz-inhibitor családja	Elnevezése	Visszamaradó aktivitás az inhibitor feleslege esetében
I. típusú cisztatinok	humán stefin-A	90%
patkány stefin-A	90%
sertés stefin-B	100%
sertés stefin-D1	105%
sertés stefin-D2	105%
II. típusú cisztatinok	csirke cisztatin	105%
humán cisztatin-C	105%
III. típusú cisztatinok	marha kininogén	110%
humán LMW kininogén	65%
humán kininogén 3. dómén	20%
Fitocisztatinok	Chelidonium május cisztatin	100%
tehénborsó cisztatin	75%
lencse cisztatin	60%
szója cisztatin	65%
burgonya multicisztatin	90%
bromelain inhibitor	110%
Tiroglobulin I. típusú doménje	p41 invariáns lánc fragmens	10%
equistatin	10%
Növényi Kunitz CPI	PCPI 6.6	120%

HU 225 427 Β1

4. táblázat

Különböző ciszteinproteáz-inhibitorok hatása az aminopeptidázaktivitásra, ahogyan ezt L-Arg-pNA segítségével meghatároztuk

	Visszamaradó aktivitás, százalékban
inhibitorfelesleg	ekvimoláris
Equistatin és p41 invariáns lánc fragmens	75%	85%
Humán stefin-A	10%	60%
Kininogének	75%	n.d.
Fitocisztatinok Fabaceae-ből	75%	n.d.

5. táblázat

Különböző ciszteinproteáz-inhibitorok hatása specifikus tripeptidil-peptidáz- és endoproteázaktivitásra, ahogyan ezt pGlu-Phe-Leu-pNA segítségével meghatároztuk

	Visszamaradó aktivitás, százalékban
inhibitorfelesleg	ekvimoláris
Equistatin és p41 invariáns lánc fragmens	-5%	10%
Humán stefin-A	90%	95%
Kininogének	20%	n.d.
Fitocisztatinok Fabaceae-bő]	70%	n.d.

6. táblázat

Különböző ciszteinproteáz-inhibitorok hatása széles spektrummal rendelkező endoproteázaktivitásra, ahogyan ezt Z-Phe-Arg-pNA segítségével meghatároztuk

	Visszamaradó aktivitás, százalékban
inhibitorfelesleg	ekvimoláris
Equistatin és p41 invariáns lánc fragmens	20%	30%
Humán stefin-A	80%	95%
Kininogének	-20%	n.d.
Fitocisztatinok Fabaceae-bői	50%	65%

7. táblázat

Különböző ciszteinproteáz-inhibitorok hatása keskeny spektrummal rendelkező endoproteázaktivitásra, ahogyan ezt Z-Arg-Arg-pNA segítségével meghatároztuk

	Visszamaradó aktivitás, százalékban
inhibitorfelesleg	ekvimoláris
Equistatin és p41 invariáns lánc fragmens	-5%	20%
Humán stefin-A	90%	n.d.
Kininogének	10%	n.d.

HU 225 427 Β1

6. példa

Proteázaktivitás in vitro gátlása kifejlett nyugati virágtrípszeken, levélfúró legyeken, végső lárvaállapotban levő kolorádóbogár-lárvákon és nyugati kukorica-gyökérférgen, ahogyan ezt FITC-jelölt hemoglobin segítségével meghatároztuk Kifejlett nyugati virágtripszeket (Frankliniella occidentalis) és levélfúró legyek (Liriomyza trifolii) kifejlett egyedeit gyűjtöttük be krizantémnövényeken fenntartott tenyészetből, majd a tripszeket és a legyeket teljes egészben elhomogenizáltuk extrakciós pufferben (200 mM β-alanin-HCI, pH 3,5) a rovarok súlyának ötszörösével megegyező térfogatban. A puffer pH-értéke a hemoglobinnal szemben mutatott proteázaktivitás korábban meghatározott optimális értéke volt. Végső fázisban levő, az 5. példában leírtak szerint burgonyanövényeken fenntartott kolorádóbogár-lárvákat ellenőriztünk a tápcsatornában található aszparaginsavproteáz-aktivitásra oly módon, hogy teljes tápcsatorna-kivonatot készítettünk pH 3 pufferben, amely optimális a kolorádóbogár aszparaginsavproteázokra (200 mM glicin, pH 3). A tápcsatornákat egyedenként 100 μΙ pufferben homogenizáltuk. Kukoricanövény gyökerén fenntartott harmadik fázisú nyugati kukorica-gyökérféreglárvákat használtunk fel a tápcsatornák biztosítására. Tíz tápcsatornát homogenizáltunk 100 μΙ vízben és kétszer lecentrifugáltuk az oldhatatlan anyagok eltávolítására. Kétféle puffért alkalmaztunk az enzimes vizsgálat során. Az egyik pH-értéke a ciszteinproteázok számára feltételezhetően előnyös érték volt (50 mM MES, pH 6,5, 0,6 mg/ml L-cisztein), és a másik az aszparaginsavproteázok kimutatására szolgált (200 mM glicin, pH 3). A felülúszókat -20 °C-on tároltuk.

μΙ tápcsatorna-kivonatot kevertünk össze 2 μΙ inhibitoroldattal (2 mM pepstatin metanolban, 4 mM E-64 vízben, 2 mg/ml rekombináns equistatin vízben, az egyéb fehérjeszerű inhibitorok koncentrációja nem volt pontosan ismert). Megfelelő puffereket adtunk hozzá 100 μΙ végső térfogatig. 15 perc előinkubálás után 20 μΙ szubsztrátot (5 mg/ml FITC-hemoglobin) adtunk hozzá és 30-45 percig inkubáltuk 37 °C-on. A reakciót 100 μ110% TCA (triklór-ecetsav) hozzáadásával állítottuk le. A csöveket lecentrifugáltuk és 100 μΙ 10 N NaOH-dal összekevert 100 μΙ felülúszót mértünk le fluoriméter segítségével a hemoglobinhidrolízis mértékének megállapítására. A méréseket két párhuzamosban végeztük egy (tripsz, levélfúró és nyugati kukorica-gyökérféreg) vagy három (kolorádóbogár) különböző tápcsatorna-kivonaton, és a mérések eltérése maximum ±5% volt.

A különböző cisztein- és aszparaginsavproteáz-inhibitorok hatásait a 9. táblázatban soroljuk fel. Ezek biztosítják a különböző proteázinhibitorok (Pl) hatásait krizantémnövényen kifejlett tripszekből és levélfúró legyekből, a burgonyanövényen tenyésztett kolorádóbogarakból, valamint a kukoricán tartott kukorica-gyökérféregből származó „Pl-érzéketlen proteázokkal” szemben, mert a növényi anyagban jelen levő és a rovar által elfogyasztott indukált Pl-k megjelennek a kivonatban az érzékeny proteázokkal komplexbe kötve.

A tripsz proteáz aktivitás 92%-os mértékben gátolható E-64 segítségével (cisztein Pl), és 16%-os mértékben gátolható pepstatinnal (aszparaginsav Pl) pH 3,5 értéknél, amely optimális a tripszek általános proteázaktivitására. Nyilvánvaló, hogy az aszparaginsavproteázok nem dominánsak ebben a rovarban. A p41 invariáns lánc 87%-os gátlást eredményezett, míg az equistatin a proteázaktivitás 95%-os gátlását eredményezte. Egyértelmű, hogy mind a p41 invariáns lánc (cisztein Pl), mind az equistatin (cisztein/aszparaginsav Pl) jó inhibitorai a tripsz ciszteinproteázoknak, bár az equistatin valamivel jobb lehet, az aszparaginsavproteázokkal szemben mutatott további gátlás miatt.

A levélfúró proteázok csak az E-64 (cisztein Pl) és a pepstatin (aszparaginsav Pl) kombinációjával gátolhatok teljes mértékben (97%). A burgonya cisztatin és a Kunitz PCPI8.3 mind olyan ciszteinproteáz-inhibitorok, amelyek képesek 63%-os gátlást létrehozni, összevetve az E-64 73%-os gátlásával. Equistatin hozzáadása ehhez a két inhibitorhoz 92%-os gátlást hoz létre, azt bizonyítva, hogy az equistatin kell hogy rendelkezzen levélfúró aszparaginsavproteázinhibitor-aktivitással a ciszteinproteázinhibitor-aktivitástól függetlenül. A levélfúrók számának optimális korlátozására az equistatin, a burgonya cisztatin és a Kunitz PCPI8.3 kombinált alkalmazása lehet szükséges.

A kolorádóbogár proteázok pH 3 értéknél csak az E-64 (24%) és a pepstatin (82%) kombinációjával gátolhatok teljes mértékben (97%). Az equistatin hozzáadása akár az Ε-64-hez, akár a pepstatinhoz a gátlást - sorrendben megfeleltetve - 42%-kal (24%+42%=66%) és 12%-kal (82%+12%=94%) megnöveli, azt bizonyítva, hogy az equistatin mind az aszparaginsav- és a ciszteinproteáz-aktivitást ennél a pH-értéknél több mint 50%-os mértékben gátolja. Az equistatin önmagában ennél a pH-értéknél a teljes proteázaktivitás 62%-át gátolja. Nyilvánvaló, hogy a pH 3 értéknél tapasztalt részleges gátlás a pH 6,5 értéknél bekövetkező csaknem teljes gátlással kombinálva (5. példa) elegendő ezen rovar számának a teljes mértékű szabályozására (7. példa).

A nyugati kukorica-gyökérféregről ismert, hogy mind cisztein- és aszparaginsavproteázok készletével rendelkezik [Gillikin és munkatársai: Arch. Insect Biochem. Physiol. 19 285 (1992)]. Az equistatin, E-64 és pepstatin hatásait két különböző pH-értéknél vizsgáltuk. A 9. táblázatban látható adatok azt mutatják, hogy az equistatin csaknem teljes mértékben gátolta az összes cisztein- és aszparaginsavproteáz-aktivitást (93% pH 6,5 értéknél és 98% pH 3 értéknél), és még erőteljesebb volt, mint az E-64 és a pepstatin kombinációja (79% és 89%, sorrendben megfeleltetve). Ezek az in vitro eredmények még jobbak, mint az 5. és 6. példában kapott in vitro eredmények a kolorádóbogárra, és azt jelzik, hogy az equistatin várhatóan toxikus lesz a nyugati kukorica-gyökérféreggel szemben, amikor kukoricagyökérben expresszáljuk.

HU 225 427 Β1

8. táblázat

In vitro inhibíciós vizsgálati eljárások visszamaradó proteázaktivitás mérésére különböző rovarok extraktumaiban

Inhibitorok	Tripsz	Levélfúró	Kolorádóbogár	Nyugati kukoricagyökérféreg	Nyugati kukoricagyökérféreg
pH 3,5	pH 3,5	pH 3	pH 6,5	pH 3
Kontroll	100%	100%	100%	100%	100%
E-64	8%	27%	76%	51%	35%
Ε-64/equistatin (El)	n.d.	n.d.	34%	29%	8%
Pepstatin	84%	46%	18%	58%	45%
Pepstatin/EI	n.d.	n.d.	6%	6%	0%
Ε-64/pepstatin	n.d.	3%	3%	21%	11%
El	5%	24%	38%	7%	2%
p41 invariáns lánc	13%	43%	n.d.	n.d.	n.d.
P. cisztatin	n.d.	73%	n.d.	n.d.	n.d.
PCPI8.3	n.d.	43%	n.d.	n.d.	n.d.
API	n.d.	37%	n.d.	n.d.	n.d.
P. cisztatin/PCPI8.3	n.d.	8%	n.d.	n.d.	n.d.
P. cisztatin/PCPI8.3/API	n.d.	7%	n.d.	n.d.	n.d.
P. cisztatin/PCPI8.3/EI	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
Bab cisztatin	14%	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.

- A rekombináns Kunitz PCPI8.3 inhibitort [Stiekema és munkatársai: Plánt Molec. Bioi. 11 255 (1987)] élesztőben (Pichia pastoris) állítottuk elő, 35 és a tenyészet felülúszójából kationcserélő kromatográfia segítségével tisztítottuk.

- A rekombináns burgonya cisztatin (p. cisztatin) a cv. Superior burgonya variánsból RT-PCR segítségével klónozott multicisztatin monomerjét je- 40 lenti, amelyet glutation-S-transzferázzal (Pharmacia) képezett fúziós fehérje formájában expresszáltunk és tisztítottunk.

- Az equistatint vagy tengeri rózsából tisztítottuk [Lenarcic és munkatársai: J. Bioi. Chem. 272 45 13899 (1997); Lenarcic és munkatársai: J. Bioi. Chem. 273 12682] (tripsz és levélfúró vizsgálatok) vagy rekombináns úton E. coli-bó\ állítottuk elő (kolorádóbogár és nyugati kukorica-gyökérféreg vizsgálatok). 50

- Az aszparaginsavproteáz-inhibitort (API) burgonyából tisztítottuk [Kreft és munkatársai: Phytochemistry 44 1001 (1997)].

7. példa 55

Equistatin toxicitása kolorádóbogár-lárvákkal szemben

Burgonya Surprise termesztési változatának (Solanum tuberosum) gumóit csíráztattuk. A csíráztatott gumókat 1 l-es cserepekbe ültettük és 3-4 hétig neveltük 60

22/18 °C-on, 16/8 órás nappali/éjszakai fotoperiódussal. A10-15 cm magas növényeket üvegedényekbe helyeztük egy papírcsíkkal együtt, amelyre 2 μΙ metil-jasmonátot pipettáztunk. Az üvegedényeket rögtön lezártuk parafilm segítségével és 30 °C-os klímakamrába helyeztük, folyamatos megvilágítás mellett. A kontrollnövényeket 25 °C-os kamrába helyeztük 16/8 órás nappali/éjszakai fotoperiódussal. Egy nap után a 30 °C-on tartott növényeket az üvegedényekből kivettük, és a kontrollal együtt ugyanazon kamrába helyeztük. A növényeket a harmadik napon használtuk fel. Az etetés minden következő napján frissen kezelt növényeket használtunk fel. Ez a kezelés magas endogén Pl-szinteket hozott létre a metil-jasmonáttal kezelt növényekben. A csúcsmerisztémákat a növényekről eltávolítottuk, és mindkét oldalukon rekombináns equistatin 0,3% agarban készült 175 μΜ koncentrációjú oldatával ecseteltük, amelyhez 350 μΜ equistatin-törzsoldatot kevertünk össze 1:1 arányban 0,6% vizes agarral. A kontrollokat 0,3% vizes agamai ecseteltük. Az agaroldatot 30 μΙ/cm² mennyiségben vittük fel. A levélen a végső koncentráció becslésünk szerint 70 μΜ volt, ami egyenlő 1,4 mg/g levélmennyiséggel. Az ecsetelt leveleket 0,4% agart tartalmazó csőbe helyeztük, és Petri-csészében szűrőpapír felületére helyeztük. 21-26 frissen kikelt kolorádóbogár-lárvát helyeztünk a levelekre, és a Petri-csészét 28 °C hőmérsékletre beállított inkubátorba tettük. Mindennap friss ecsetelt levelekkel helyettesítettük a régieket.

HU 225 427 Β1

A 9. és 10. táblázatban összegezzük a hatásokat a kolorádóbogár-lárvák növekedésére és pusztulásukra. Ezekből a táblázatokból nyilvánvaló, hogy az endogén proteázinhibitorok alacsony szintjével rendelkező kontrollnövényeken alkalmazott equistatin képes jelentős 5 mértékben csökkenteni a lárvák fejlődését, és magas pusztulási arányt okoz már négy nap után is. Azonban az equistatint olyan leveleken alkalmazva, amelyek magas indukált endogén Pl-szintekkel rendelkeznek a metil-jasmonáttal végzett korábbi kezelés eredményeképpen, tovább növeli ezen inhibitor toxikus hatásait. Ez megerősíti ezen inhibitor várt szinergiás hatását, mert specifikusan megcélozza a kolorádóbogár-lárvák „Pl-érzéketlen proteázait.

9. táblázat

Rekombináns equistatin hatása kolorádóbogár-lárvák növekedésére

Kezelés	1. nap	2. nap	3. nap	4. nap
Kontroll	n.d.	n.d.	9	13,8
Kontroll+equistatin	n.d.	n.d.	0,5	0,7
MeJa-kontroll	n.d.	n.d.	7,5	10
MeJa-kontroll+equistatin	n.d.	n.d.	n.g.	n.g.

kísérletenként 21-26 lárvát vizsgáltunk;

a lárvasúlyok mg/lárva értékben kerültek feltüntetésre; n.d. jelentése: nem került meghatározásra; n.g. jelentése: nem növekedett vagy elpusztult

10. táblázat

Rekombináns equistatin hatása kolorádóbogár-lárvák százalékos pusztulására

Kezelés	1. nap	2. nap	3. nap	4. nap
Kontroll	0	0	0	0
Kontroll+equistatin	0	10	52	76
MeJa-kontroll	0	0	0	0
MeJa-kontroll+equistatin	0	23	77	92

kísérletenként 21-26 lárvát vizsgáltunk

8. példa

Equistatin in vivő hatása trípszek peterakási rátájára

A 4. példa leírása szerint tisztított 142 μΜ rekombináns equistatin mintáját vizsgáltuk tripszekkel szemben mutatott aktivitásra. A mintát sósavval savanyítottuk meg pH 3 értékre az equistatinfehérje stabilizálására. A kontrollok savval beállított vizet vagy a savval beállított vízben oldott 2,5 mg/ml BSA-t tartalmaztak. A tripsz nőstények peterakási rátáját az úgynevezett Murai-ketrecek alkalmazásával vizsgáltuk. Röviden, egyik oldalukon finom gézszövettel lezárt perspex csöveket „oltottunk be 10 nősténnyel és méhpollennel. A csöveket parafilmmel lezártuk, és 300 μΙ folyadékot helyeztünk a parafilm tetejére. A folyadékot egy második parafilmréteg zárta le. A pollent és a mintafolyadékot mindennap kicseréltük, két napon keresztül. A folyadékmintába lerakott petéket a második napon számoltuk meg.

11. táblázat

Kifejlett nőstények peterakási rátája két nappal az eltérő étrend megkezdése után

Étrend	Peteszám nőstényenként és naponta	Relatív százalék
BSA	1,8	100%
Víz	1,5	83%
Equistatin	0,3	17%

9. példa

Az equistatingén módosítása a javított expresszió 55 érdekében növényekben

Az equistatin cDNS a kódolórégióban számos potenciális növényi poliadenilációs szignált, mRNS-instabilitási részegységet tartalmaz, és kodonhasználata szuboptimális a növényekben történő expresszió szempont60 jából. A génexpresszió szintjének a javításához növé22

HU 225 427 Β1 nyékben ezeket a részegységeket eltávolíthatjuk, és a kodonokat optimalizálhatjuk helyspecifikus mutagenezis segítségével a primer fehérjeszekvencia megváltoztatása nélkül. Az alábbiakban bemutatunk egy példát a szükséges módosításokkal, hogy javított génexpressziót 5 kapjunk burgonyában. Az ábrában a fent bemutatott szál a cDNS-klón kódolórészét reprezentálja, alatta megadjuk a cDNS-szekvencia javasolt módosításait, és ez alatt megadjuk a kódolt fehérje szekvenciáját, az aminosavak esetében az egybetűs kódokat alkalmazva.

ATGGCTCTTAGCCAAAACCAAGCCAAGTTTTCCAAAGGATTCGTCGTGATGATTTGG G G G

-32 M ALSQNQAKFSKGFVVHIW

GTACTATTCATTGCTTGTGCTATAACTTCAACTGAAGCTAGTCTAACCAAATGCCAACAG C G

-13 VLFIACAITSTEASLTKCQQ -1 +1

120 CTCCAGGCCTCGGCTAACAGTGGTCTGATAGGTACTTATGTACCACAATGCAAAGAAACG GTT T

8LQASANSGLIGTYVPQCKET

180 GGAGAGTTCGAAGAAAAACAATGCTGGGGATCGACTGGTTACTGTTGGTGTGTGGATGAA TG T

28GEFEEKQCWGSTGYCWCVDE

240 GATGGAAAAGAGATTCTAGGAACCAAGATCCGTGGATCTCCGGATTGCAGCCGCAGAAAA T A ACT

48DGKEILGTKIRGSPDCSRRK

300 GCCGCGTTAACACTTTGCCAGATGATGCAAGCCATCATTGTTAATGTCCCTGGTTGGTGT T C G

68AALTLCQMMQAI IVNVPGWC

360 GGCCCTCCATCGTGTAAAGCTGACGGCAGTTTTGACGAGGTTCAGTGCTGCGCAAGTAAT A A

88GPPSCKADGSFDEVQCCASN

420 GGAGAATGCTACTGTGTGGATAAGAAAGGAAAAGAACTTGAAGGCACAAGACAACAGGGA 108 GECYCVDKKGKELEGTRQQG

480 AGGCCAACCTGCGAAAGACACCTAAGCGAATGCGAGGAAGCTCGAATCAAGGCGCATTCA G T A

128RPTCERHLSECEEARIKAHS

540 AACAGTCTTCGTGTTGAGATGTTCGTGCCAGAGTGTTTAGAAGATGGATCATATAACCCA T C T

148NSLRVEMFVPECLEDGSYNP

600 GTACAGTGCTGGCCTAGCACAGGTACTGTTGGTGCGTCGATGAAGGAGGGGTAAAGGTA T

168 VQCWPSTGYCWCVDEGGVKV

660 CCAGGTTCCGATGTCAGATTTAAACGCCCCACATGCTAA C CT

188 PGSDVRFKRPTC--199

10. példa

Növényi vektorok szerkesztése equistatinexpresszióhoz

A burgonya Cab promotert [Nap és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 23 605 (1993)] amplifikáltuk a 60 pPPG-plazmidból PCR segítségével a P1-POTCAB és P2-POTCAB primereket alkalmazva. Hasonlóképpen a Nos-terminátort amplifikáltuk a pPPG-plazmidból a NOS-TERM-DN és a NOS-TERM-UP primereket alkalmazva. A promoter- és a terminátorfragmenst az EcoRI

HU 225 427 Β1 és a Sacl restrikciós enzimekkel hasítottuk ki, és EcoRI emésztett pUCAP-vektorba ligáltuk [Van Engelen és munkatársai: Transgenic Research 4 288 (1995)]. Megfelelő kiónt választottunk ki és szekvenáltuk. Ezt a kiónt - pUCCABI - Ncol és Bglll segítségével emész- 5 tettük, és az equistatin kódolórégió szubklónozásához használtuk, amelyet PCR segítségével amplifikáltunk a pB3-equistatin plazmidból az EQUISTAT-DN és az EQUISTAT-BGL primereket alkalmazva és Ncol, valamint BgZII alkalmazásával elhasítva. Megfelelő kiónt 10 választottunk ki, és a beillesztett equistatin cDNS-klónt megszekvenáltuk. Egy megfelelő kiónt - pUCCABI equistatin - EcoRI segítségével emésztettünk. Az equistatin expressziós kazettát tartalmazó EcoRI fragmenst a pBINPLUS növényi vektorba ligáltuk [Van Engelen és munkatársai: Transgenic Research 4 288 (1995)], amelyet úgyszintén EcoRI segítségével emésztettünk. Megfelelő kiónt választottunk ki. Ezt a kiónt - pCAB1-equistatin - elektroporáció segítségével elektrokompetens Agrobacterium tumefaciens AGL-0 sejtekbe bejuttattuk. Pozitív kiónokat szelektáltunk 100 mg/l kanamicint tartalmazó LB táptalajon.

12. táblázat

PCR-amplifikáció során alkalmazott PCR-primerek

Név	DNS
P1-POTCAB	5’-GGG-GGG-GAA-TTC-CTG-ACC-TCT-TAC-TAA-CTC-G
P2-POTCAB	5’-GGG-GGG-GAG-CTC-AGA-TCT-TGC-CAT-GGT-TTT-TCT-TCT-CTT-TTT-TTT-TG
NOS-TERM-DN	5’-AGA-TCT-GAG-CTC-TCG-TTC-AAA-CAT-TTG-GCA
NOS-TERM-UP	5’-AAG-CTT-GAA-TTC-GAT-CTA-GTA-ACA-TAG
EQUISTAT-DN	5’-GGG-GCC-ATG-GCT-CTT-AGC-CAA-AAC
EQUISTAT-BGL	5’-GGG-GGA-GAT-CTT-TAG-CAT-GTG-GGG-CGT-TTA-AA

11. példa

Burgonya transzformálása az equistatin cDNS-t tartalmazó növényi vektorokkal

Az első napon a pCAB1-equistatin biner vektort tartalmazó Agrobacterium tumefaciens AGL-0 sejtek tenyészetét indítottuk meg 50 mg/l kanamicint tartalmazó 50 ml LB táptalajon, és két napig rázattuk 28 °C-on. A második napon a Desiree termesztési változat V-vonalból származó burgonya in vitro tenyészetéből kapott internódiumokat 0,5-1 cm-es darabokra vágtuk és R3B táptalajra helyeztük [30 g/l répacukor, 4,7 g/l Murashige és Skoog sók, pH 5,8 (KOH-dal beállítva), 8 g/l tisztított agar, 2 mg/l NAA és 1 mg/l BAP], ezt 2 steril szűrőpapírral fedtük le, amelyeket korábban 2 ml PACM táptalajban áztattunk [30 g/l répacukor, 4,7 g/l Murashige és Skoog sók, 2 g/l kazeinhidrolizátum, pH 6,5 (KOH-dal beállítva), 1 mg/l 2,4-D és 0,5 mg/l kinetin], A Petri-csészéket parafilmmel lezártuk, és éjszakán át 24 °C-on 16 órás megvilágítással inkubáltuk. A harmadik napon az A. tumefaciens tenyészetet az explantátumokat tartalmazó steril Petri-csészébe öntöttük. 5-10 perccel később az explantátumokat a tenyészetből eltávolítottuk, az Agrobacterium-ok feleslegének eltávolítására steril szűrőpapírra tettük, és visszahelyeztük az R3B táptalajt tartalmazó csészékbe, miután először eltávolítottuk a felső szűrőpapírt (egyet meghagyva). Az explantátumokat tartalmazó Petri-csészéket 24 °C-on 16 órás megvilágítással tovább inkubáltuk az 5. napig, amikor az explantátumokat ZCVK táptalajt [20 g/l répacukor, 4,7 g/l Murashige és Skoog sók, pH 5,8 (KOH-dal beállítva), 8 g/l tisztított agar, 1 mg/l zeatin, 200 mg/l vancomicin, 100 mg/l kanamicin és 200 mg/l claforan] tartalmazó Petri-csészékbe átvittük. A 19. napon és ezt követően minden 3-4 hétben az explantátumokat új ZCVK táptalajra átvittük. Amikor a hajtások megjelentek, a hajtásokat Murashige és Skoog táptalajra vittük át, amely 20% répacukrot tartalmazott (MS20). Gyökereztetés után a növényeket üvegházba vittük át.

12. példa

Kolorádóbogár-lárvákkal végzett biológiai vizsgálati eljárások equistatint expresszáló transzgenikus burgonyanövényeken

A burgonyanövényekben történő expresszióhoz optimalizált equistatin cDNS-szekvenciát a pCAB1-vektorba klónoztuk és a V-vonalba transzformáltuk. Nyolc különböző elsődleges transzformánst vizsgáltunk meg a frissen kikelt kolorádóbogár-lárvákkal szemben mutatott ellenálló képességre. Az üvegházban leveleket távolítottunk el fiatal növényekről és 0,4% tisztított vizes agart tartalmazó csőbe helyeztük, majd szűrőpapírral ellátott Petri-csészébe tettük. Hat véletlenszerűen kiválasztott frissen kikelt lárvát helyeztünk minden egyes levélre. A leveleket két nappal később friss levelekkel cseréltük le. A harmadik napon az egyes lárvákat egyenként lemértük. Az eredményeket a 13. táblázatban mutatjuk be, jelezve, hogy a hat transzformáns közül három jelentős mértékben visszavetette a lárvák növekedését. Néhány növény esetében hiányzik az ellenálló képesség, ennek legvalószínűbb oka az alacsony szintű expresszió, amit a T-DNS-inszert nem optimális elhelyezkedése okoz a növényi genomban. A növények túl fiatalok voltak ahhoz, hogy a kísérletet - a levélanyag hiánya miatt - hosszabb ideig folytassuk, de megfigyeltük, hogy a pCAB-EIM-1 anyagon a lárvák már mind elpusztultak a 4. napra. Az equistatinfehérje jelenlétét Western-blot segítségével igazoltuk, és becslésünk szerint >0,1% volt azokban a transzge24

HU 225 427 Β1 nikus egyedekben, amelyek ellenálló képességet mutattak.

13. táblázat

Biológiai vizsgálati eljárás eredményei a növényekben történő expresszióhoz optimalizált equistatingénnel transzformált transzgenikus burgonyanövényeken

Növény³	Lárvák súlya^b
V-vonal	9,93 a
pBINPLUS	10,67 a
pCAB1-EIM-1	4,03 b
pCABI-EIM-2	5,45 b
pCAB1-EIM-3	8,77 a
pCAB1-EIM-6	8,92 a
pCAB1-EIM-7	8,55 a
pCAB1-EIM-8	5,85 b
pCAB1-EIM-9	9,18 a
pCAB1-EIM-10	11,15a

³ - A vizsgált növények a következők voltak: V-vonal, egy in vitro növény, amit a transzformáltakkal egy időben vittünk át az üvegházba; pBINPLUS, egy V-vonal transzformáns a promotergén kazetta nélküli üres vektorral; pCAB110, az első 8 V-vonal transzformáns az optimalizált equistatingénnel a CAB promoter szabályozása alatt.

^b - Hat lárva átlagolt lárvasúlya (mg). A lárvasúlyok után feltüntetett betűkódok a szignifikanciát jelzik, ahogyan azt ANOVA segítségével meghatároztuk.

13. példa

Homológ génszekvenciák izolálása további élő szervezetekből javított inhibitorok felfedezéséhez vagy előállításához

A Gly-Tyr-Cys-Trp-Cys-Val 6 aminosavból álló szekvencia, amely nagymértékben konzerválódott az I. típusú ismétlődő tiroglobulin cisztein- és aszparaginsavproteáz-inhibitorok között - akár humán, lazacvagy tengerirózsa-eredetű - alkalmazható javított specifitásokkal rendelkező homológ szekvenciák izolálására. Ezen szekvenciák alapján degenerált PCR-primerek szerkeszthetők meg olyan genomi vagy cDNS-fragmensek amplifikálására, amelyek próbaként alkalmazhatók a teljes kódolószekvencia izolálására például cDNS-klóntárakból vagy 5-RACE kísérletek segítségével, tisztított mRNS alkalmazásával. Bármely élő szervezet - beleértve rovarokat és növényeket - alkalmazható, mint az I. típusú ismétlődő tiroglobulindomének új forrása. Géngyűjtemények alkalmazhatók génkeveredési kísértetekben új specifitások izolálása során.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás növény vagy növényi rész rovar- vagy nematódafertőzés elleni védelmére egy vagy több emésztőrendszeri ciszteinproteázt tartalmazó rovar vagy nematóda ellen, azzal jellemezve, hogy ciszteinproteáz-inhibitor hatásos mennyiségét helyezzük arra a helyre, ahol a rovarok vagy nematódák számának szabályozása kívánatos, és inhibitorként bármely, legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét alkalmazunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdanövényből származó ciszteinproteáz-inhibitorokkal szemben érzéketlen ciszteinproteázzal bíró rovarral szemben védekezünk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kolorádóbogárral, kukorica-gyökérféreggel, tripsszel és/vagy levélfúróval szemben védekezünk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cisztanematódákkal vagy gyökérgümő-nematódákkal szemben védekezünk.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjeként a humán p41 invariánslánc-fragmenst vagy annak ciszteinproteázinhibitor-aktivitású homológját vagy fragmensét alkalmazzuk.
6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjeként az Actinia equina tengeri rózsából izolált, 1. ábrán bemutatott aminosavszekvenciával rendelkező fehérjét vagy annak ciszteinproteázinhibitor-aktivltású homológját vagy fragmensét alkalmazzuk.
7. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehéreként egy, a „chum” lazac ikráiból izolált fehérjét vagy annak ciszteinproteázinhibitor-aktivitású homológját vagy fragmensét alkalmazzuk.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kívánt helyen hordozót és a clszteinproteáz-inhibitor rovar- vagy nematódaszámot szabályozni képes mennyiségét tartalmazó mezőgazdasági készítményt alkalmazunk.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növény genomjába legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét kódoló szekvenciát illesztünk be a növényben aktív promoterszekvenciával együtt, és a fehérje expresszióját olyan szinten valósítjuk meg, mely a fehérje rovarok vagy nematódák számát szabályozni képes mennyiségét eredményezi.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy:

(a) a növényből sejteket vagy szöveteket tenyésztünk;

(b) a sejtekbe vagy a szövetbe a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét kódoló gén legalább egy kópiáját bejuttatjuk; és (c) a sejt- vagy szövettenyészetből rezisztens teljes növényeket regenerálunk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a teljes növényt szexuális úton vagy klónozással szaporítjuk oly módon, hogy a szaporítás során kapott leszármazottak sejtjeiben a legalább egy I. típu25

HU 225 427 Β1 sú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérjét kódoló szekvencia legalább egy kópiája megtalálható a növényben aktív promoterszekvenciával együtt.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy:

(a) a 10. igénypont szerinti eljárás alapján előállított rovar- vagy nematódarezisztens termékeny növényt választunk ki;

(b) a rovar- vagy nematódarezisztens növényt szexuális úton keresztezzük a fogékony változatból származó rovar- vagy nematódaérzékeny növénnyel;

(c) a keresztezésből származó utódokról szaporítóanyagot nyerünk; és (d) a szaporítóanyagból rezisztens növényeket nevelünk.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rovar- vagy nematódarezisztenciát viszünk át növények fogékony változatának lényegében homozigóta populációjára, amelynek során az alábbi lépéseket ismételjük:

(a) a rovar- vagy nematódarezisztens utódokat a fogékony változatból származó rovar- vagy nematódaérzékeny, lényegében homozigóta növényekkel visszakeresztezzük; és (b) a visszakeresztezésből nyert utódok közül kiválasztjuk a mind rovar-, mind nematódarezisztenciát mutató és a fogékony változat egyéb jellemzőit mutató egyedeket, míg a fogékony változat jellemzőinek kívánt aránya megjelenik az utódokban a rovar- vagy nematódarezisztenciával együtt.
14. Transzgenikus növény és annak szexuális úton nyert utódai, amelyek emésztőrendszeri ciszteinproteázokat hordozó egy vagy több rovar vagy nematóda támadása elleni rezisztenciát mutatnak, és amely transzgenikus növény és utódai legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje rovarvagy nematódaszámot szabályozni képes mennyiségét expresszálják.
15. Expressziós egység, amely az alábbiakat tartalmazza: növényi sejtekben 3’-irányban elhelyezkedő kódolószekvencia expresszióját elősegíteni képes promoter, növényi sejtben legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje expresszlóját biztosító DNS kódolórégió és a genetikai konstrukció transzkripcióját vagy transzlációját növényi sejtekben terminálni képes terminátorszekvencia, ahol a genetikai konstrukció a növény sejtjeiben a legalább egy I. típusú ismétlődő tiroglobulindomént tartalmazó fehérje rovarok számát szabályozni képes mennyiségét expresszálja.
16. A 15. igénypont szerinti expressziós egység, amelyben a DNS az 1. ábrán bemutatott aminosavszekvenciát vagy annak ciszteinproteázinhibitor-aktivitású homológját vagy fragmensét kódolja.
17. A 15. igénypont szerinti expressziós egység, amely expressziós egység a 8. ábrán bemutatott szerkezetű pCAB1-plazmid.
18. A 15-17. igénypontok bármelyike szerinti expressziós egységgel transzformált és azt tartalmazó gazdasejt.