PL189808B1 - Sposób ochrony roślin lub części tych roślin przed atakiem jednego lub wiekszej ilości owadów lub nicieni, roślina transgeniczna i jej płciowe potomstwo odporne na atak jednego lub większej ilości owadów lub nicieni, nośnik ekspresji, transgeniczna komórka gospodarza transformowana funkcjonalnym biologicznie nośnikiem ekspresji oraz peptyd inhibitora z powtórzoną domeną tyreoglobulinową typu I - Google Patents

Abstract

1. Sposób ochrony roslin lub czesci tych roslin przed atakiem jednego lub wiekszej ilosci owadów lub nicieni posiadajacych trawienne proteazy cysteinowe, znamienny tym, ze podaje sie w miejscu, gdzie wymieniony(e) owad(y) lub nicien(ie) maja byc zwalczane, hamujaca ilosc inhibitora proteazy cysternowej posiadajacego sekwencje aminokwasów przedstawiona na fig. 1. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób ochrony roślin lub części tych roślin przed atakiem jednego lub większej ilości owadów lub nicieni, roślina transgeniczna i jej płciowe potomstwo odporne na atak jednego lub większej ilości owadów lub nicieni, nośnik ekspresji, trans«-» -fi i r» Izn ΐ ΛΜ o 1 z-\1 m τη i <=» n i I/ί

I 1£Ł Μ/11ΐυΐΛ.α ^VOpV^XCŁŁZXł. UOllOtUllllU WU11U A WJ.JJWJ WAltAAllj AAA UiVlV^lVĆ4lilv presji oraz peptyd inhibitora z powtórzoną domeną tyreoglobulinową typu I.

Wiele warzyw, upraw ogrodniczych i rolniczych jest atakowanych przez szkodniki owadzie. Większość roślin wykazuje pewną odporność na określone owady lub nicienie, przy czym odporność może być fizyczna lub chemiczna. Na przykład, włoski na liściach wielu roślin mogą powstrzymać małe owady od zbliżania się do powierzchni liści w celu ich przeżucia. W innych przypadkach rośliny wykorzystują szereg złożonych związków, aby sprawić że ich tkanki stają się nieatrakcyjne lub toksyczne. Zwalczanie takich roślinożernych owadów

189 808 i nicieni jest częściowo rozwiązane dzięki sposobom upraw i hodowli. Skutecznym sposobem zmniejszenia strat jest stosowanie odmian uprawnych posiadających geny odporności na szkodniki (patrz ^Painter, 1951, Insect Resistance in Crop Plants, Macmillan: New York). Hodowcy roślin próbują zredukować straty powodowane przez owady i nicienie poprzez inkorporację genów odporności różnych odmian przez konwencjonalne programy hodowlane.

Klasyczne podejścia do problemu odporności roślin, chociaż zakończone w pewnych przypadkach znaczącymi sukcesami, są raczej empiryczne. Gdy pewne „cechy” odporności zostaną odkryte, to przenoszone są one metodami selekcji do grupy roślin akceptowanych w rolnictwie. Ograniczeniem klasycznego podejścia jest to, że przenoszenie genów odporności z jednej rośliny na innąjest ograniczone do gatunków, które mogą być krzyżowane.

Dodatkowo, te rodzaje odporności mogą być pod kontrolą wielu genów i przez to trudne do wykorzystania przez hodowców roślin. Często odmiany odporne wykazują spadek plonów i przez to nie są opłacalne. Co więcej, jeśli nie można zidentyfikować żadnej odporności wewnątrz gatunku lub gatunków spokrewnionych, nie jest możliwe polepszenie odporności na szkodniki owadzie poprzez klasyczne krzyżowanie.

Do zwalczania owadów i nicieni stosowane są intensywnie pestycydy chemiczne. Środki te stosowane są zwykle albo poprzez umieszczanie w glebie, albo na liściach roślin lub w pułapkach. Pomimo dostępności szerokiej gamy pestycydów chemicznych, roślinożerne owady i roślinne nicienie pasożytnicze wciąż są poważnym problemem. Wadą wielu pestycydów chemicznych jest wymóg wielokrotnego stosowania. Dużym problemem stosowania wielu pestycydów jest możliwość uodpornienia się owadów na stosowane środki. Zjawisko to jest wynikiem selekcji najbardziej odpornych osobników populacji owadów podczas wielokrotnego stosowania danego środka. W dodatku chemikalia te przynoszą szkodę środowisku i zanieczyszczają zasoby wody. Istnieje więc potrzeba nowych środków zwalczania owadów, szczególnie środków, których sposób działania różni się od sposobu działania konwencjonalnych insektycydów i środków nicieniobójczych.

Jajko alternatywę dla związków syntetycznych, izolowano pewne naturalnie występujące środki i wykorzystano je jako pestycydy. Są to roślinne i drobnoustrojowe wtórne metabolity i białka, oraz naturalni dr^j^i^:żcy czy patogeny owadów lub nicieni (w tym inne owady, grzyby, bakterie i wirusy). Ponadto w wyniku rozwoju technologii rekombinacji DNA, geny z organizmu dawcy mogą być przenoszone do organizmu biorcy, dzięki czemu otrzymuje się nowy fenotyp biorcy. W przypadku roślin transgenicznych, fenotyp taki może być odporny na uszkodzenie przez owady lub zakażenie przez nicienie, jeśli wprowadzone geny kodują polipeptydy, których aktywność wywiera szkodliwe działanie na szkodniki. W konsekwencji istnieje ogromna potrzeba znalezienia polipeptydów, które wywierają takie działanie. Geny takich polipeptydów mogą być używane do modyfikowania organizmów, szczególnie roślin i mikroorganizmów, aby one oddziaływały niekorzystnie na wzrost i rozwój szkodliwych owadów. Szereg takich polipeptydów został opisany dla Bacillus thuringiensis, różnych białkowych inhibitorów proteaz i amylaz, oraz różnych lektyn roślinnych.

Fizjologicznym systemem owadów i nicieni, podatnym na uszkodzenie przez specyficzne inhibitory jest działanie proteaz trawiennych. Proteazy trawienne hydrolizują spożyte białka i polipeptydy poprzez rozszczepianie wiązań peptydowych. Termin „proteazy” odnosi się zwłaszcza do endopeptydaz i egzopeptydaz z czterech klas katalitycznych: proteaz serynowych, proteaz cysternowych, proteaz asparaginianowych i metaloproteaz (patrz Laskowski i inni, 1983, Ann. Rev. Biochem., 49: 593-626). Klasa, do której należy specyficzna proteaza może być określona na podstawie zakresu pH, w którym jest aktywna, jej zdolności hydrolizowania specyficznych białek, jej podobieństwa do innych dobrze scharakteryzowanych protan? t 101 ηττοΎ IVUX* A J VJ ------no rA7nA ϋνίΉΐίϋΤλΖ ................................. '* J ·

Różne rodzaje enzymów trawiennych owadów i nicieni uwalniają peptydy i aminokwasy z białek w pokarmie. Jedną klasą enzymów trawiennych są proteazy cysteinowe. Termin „proteazy cysteinowe” służy do opisania proteaz posiadających wysoce reaktywną grupę tiolową reszty cysteinowej, jako miejsce katalityczne enzymu. Istnieje dowód, że wiele roślinożernych owadów i roślinnych pasożytniczych nicieni bazuje, co najmniej częściowo, na jelitowych proteazach cysternowych do trawienia białek. Należą tu, choć nie są ograniczone tylko do nich, Hemiptera (pluskwiaki), szczególnie squash bug (Anasa tristis); green stink bug

189 808 (Acrosternum hilare); Riptortus clavatus; i prawie wszystkie chrząszcze zbadane do tej pory, szczególnie stonka ziemniaczana, Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata); threelined potato beetle (Lema trilineata); poskrzypka szparagowa, asparagus beetle (Crioceris asparagi); Mexican bean beetle (Epilachna varivestis); red flour beetle (Tribolium castaneum); trojszyk ulec, confused flour beetle (Tribolium confusum); pchełki, the flea beetles (Chaetocnema spp, Haltica spp. oraz Epitrix spp.); com rootworm (Diabrotica spp.); cowpea weevil (Callosobruchus maculatus); kwieciak bawełnowiec, boll weevil (Anthonomus grandis); wołek ryżowy, rice weevil (Sitophilus oryza), maize weevil (Sitophilus zeamais); wołek zbożowy, granary weevil (Sitophilus granarius); ziołomirek zmienny, Egyptian alfalfa weevil (Hypera postica); strąkowiec fasolowy, bean weevil (Acanthoscelides obtectus); lesser grain borer (Rhyzopertha dominica); mącznik młynarek, yellow meal worm (Tenebrio molitor); Thysanoptera, szczególnie wciornastek, western flower thrips (Frankliniella occidentalis); dwuskrzydłe, szczególnie miniarka koniczynówka, leafminer spp. (Liriomyza trifolii); roślinne pasożytnicze nicienie, szczególnie ziemniaczane nicienie cystowe, potato cyst nematodes (Globodera spp.); burakowy nicień cystowy, the beet cyst nematode (Heterodera schachtii) i nicienie z grupy guzaków, root knot nematodes (Meloidogyne spp.).

Inną klasą enzymów trawiennych są proteazy asparaginianowe. Termin „proteaza asparaginianowa” odnosi się do proteaz, które posiadają dwie wysoce reaktywne reszty kwasu asparaginianowego w miejscu katalitycznym enzymu i charakteryzują się specyficzną inhibicją przez pepstatynę, inhibitor o niskiej masie cząsteczkowej, działający na prawie wszystkie znane proteazy asparaginianowe. Istnieje dowód, że wiele roślinożernych owadów bazuje częściowo na jelitowych proteazach asparaginianowych do trawienia białek najczęściej w połączeniu z proteazami cysternowymi. Występują one, choć nie tylko, u pluskwiaków (Hemiptera), szczególnie Rhodnius prolixus i bedbug (Cimex spp.) i członków rodzin Phymatidae, tarczówkowatych (Pentatomidae), zwińcowatych (Lygaeidae) i Belostomatidae; u chrząszczy, u rodzin majkowatych (Meloidae), stonkowatych (Chrysomelidae), biedronkowatych (Coccinelidae) i strąkowcowatych (Bruchidae), wszystkie należące do grup Cucujiformia, szczególnie stonka ziemniaczana, Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata), three-lined potato beetle (Lema trilineata); południowe i zachodnie com rootworm (Diabrotica undecimpunctata i D. virgifera), kwieciak bawełnowiec, boll weevil (Anthonomus grandis); squash bug (Anasa tristis); flea beetle (Phyllotreta crucifera); bruchid beetle (Callosobruchus maculatus), Mexican bean beetle (Epilachna varivestis); soybean leafiminer (Odontota horni); margined blister beetle (Epicauta pestifera) i red flour beetle (Tribolium castaneum); muchówki (Diptera), szczególnie mucha domowa, housefly (Musca domestica) (Terra i Ferreira, 1994, Comp. Biochem. Physiol. 109B: 1-62; Wolfson i Murdock, 1990, J. Chem. Ecol. 16: 1089-1102).

Składniki tworzące kompleksy z proteazami i hamujące ich aktywność proteolityczną są rozpowszechnione w naturze. Znane są rozmaite inhibitory proteaz, o niskim ciężarze cząsteczkowym, w większości syntetyczne. Pewną liczbę naturalnie pojawiających się inhibitorów o niskim ciężarze cząsteczkowym izolowano z bakterii i grzybów i scharakteryzowano; grupa ta zawiera inhibitory takie jak E64 (N-(L-3-trans karb<^l^!^;yo^sy^^-;^i^-(carb<^mylo)-L-leucylo-amido-4-kwanidobutan), leupeptyny (leupeptins), antypainy (antipains) i pepstatyny (pepstatins).

Wiele inhibitorów proteaz białkowych izolowano z roślin i należą one do obronnych substancji tkanek roślinnych, które są regulowane zarówno rozwojowo jak i zaangażowane w odpowiedzi na ataki owadów i patogenów. Inhibitory proteaz serynowych, cysternowych, asparaginianowych i metaloproteaz znalezione zostały w roślinach, a szczególnie w ich organach maniiTtmincpwh ί hn1wv czy naęinna

Najbardziej powszechną i szeroko badaną grupą, roślinnych inhibitorów proteaz są te, które hamują zwierzęce proteazy serynowe, wśród nich trypsynę i chymotrypsynę (patrz Ryan, 1990, Annu. Rev. Phytopathol. 28: 425-449).

Białkowe inhibitory proteaz cysteinowych zmniejszają lub eliminują katalityczną aktywność proteaz cysternowych. Optymalne pH proteaz cysternowych mieści się zazwyczaj w zakresie 3,5-7, który jest zakresem pH w świetle jelita owadów, które wykorzystują proteazy cysternowe. Inhibitory proteaz cysteinowych to przede wszystkim rodzina cystatyn, która

189 808 dzieli się na kilka podrodzin ze względu na ciężar cząsteczkowy, liczbę wiązań dwusiarczkowych, lokalizację subkomórkową i strukturę pierwszorzędową. System klasyfikacji opiera się głównie na danych dotyczących cystatyn kręgowców i roślin, Cystatyny skierowane przeciwko owadom i nicieniom były testowane zarówno in vitro jak i in vivo.

Do dnia dzisiejszego znane są nieliczne inne przykłady białkowych inhibitorów proteaz cysternowych. Znana jest rodzina inhibitorów proteaz cysternowych pochodząca z ziemniaka i należąca do rodziny roślinnych inhibitorów Kunitza, do której należą również inhibitory proteaz asparaginianowych (Strukelj, 1992, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 373: 477-482; Krizaj i inni, 1993, FEBS Letters 333: 15-20). Inhibitor ten, Kunitz PCPI8.3, jest ścisłym inhibitorem Katepsyny L (Ki = 0,07 nM) i dobrym inhibitorem papainy (Ki=3,3 nM). Z Diabrotica virgifera izolowano całkowicie nowy typ inhibitora proteazy tiolowej (patent według publikacji WO 95/24479). Inhibitor ten nie jest związany strukturalnie z innymi znanymi inhibitorami proteaz cysternowych.

Ostatnio pojawiła się nowa klasa inhibitorów proteaz cysternowych. Białka te mają wspólną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I (Malthiery i Lissitzky, 1987, Eur. J. Biochem. 165: 491-498). Izolowano fragment białkowy pochodzący ze stałego łańcucha p41 związanego z ludzkimi białkami MHC klasy II. (Ogrinc i inni, 1993, FEBS Letters 336: 555-559; Bevec i inni, 1996, J. Exp. Med. 183: 1331-138). Jest on ścisłym inhibitorem Katepsyny L (Ki=0,0017 nM) i dobrym inhibitorem papainy (Ki=1,4 nM). Podobny inhibitor proteazy cysternowej, zawierający powtórzoną domenę tyreoglobulinową izolowano z jaj Oncorhynchus keta, chum salmon (Yamashita i Konagaya, 1996, J. Biol. Chem. 271: 1282-1284). Na koniec, izolowano inhibitor proteazy cysteinowej nazwany ekwistatyną, zawierający trzy powtórzone domeny tyreoglobulinowe typu I (Lenarcie i inni, 1997, J. Biol. Chem. 272: 13899; Lenarcie i inni, 1998, J. Biol. Chem. 273: 12682).

Oprócz stałego łańcucha ludzkiego, ECI (inhibitor proteazy cysteinowej jaja) i ekwistatyny, części innych białek również posiadają domeny homologiczne z powtórzonymi domenami tyreoglobulinowymi typu I, w tym białka takie jak szczurzy stały łańcuch (McKnight i inni, 1989, Nucleic Acids Res. 17: 3983-3984), saksifilina (Morabito i Moczydłowski, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2478-2482), nidogen (Mann i inni, 1989, EMBO J. 8: 65-72), glikoproteina nabłonkowa (Simon i inni, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2755-2759), proteina-3 wiążąca IGF (Brewer i inni, 1988, Biochem. Biophys. Res. Comun. 152: 12871289), testican (Alliel i inni, 1993, Eur. J. Biochem. 214: 347-350), i entaktyna (Durkin i inni, 1988, J. Celi. Biol. 107: 2749-2756) (fig. 3). Opublikowano dane stwierdzające, że entaktyna i tyreoglobulina nie hamują proteaz cysternowych (Yamashita i Konagaya, 1996, J. Biol. Chem. 271: 1282-1284). Białka te zawierają konserwatywne sekwencje i przyczyna braku inhibicji jest niejasna.

Białkowe inhibitory proteazy asparaginianowej zmniejszają lub eliminują katalityczną aktywność proteazy asparaginianowej. Optymalna wartość pH dla proteaz asparaginianowych mieści się w zakresie 2-5, co stanowi zakres pH w tej części jelita, gdzie proteazy są aktywne. Znane są nieliczne białkowe inhibitory proteaz asparaginianowych. Jedną dobrze scharakteryzowaną rodzinę białkowych inhibitorów ka-tepsyny D znaleziono w ziemniakach i spokrewnionych psiankowatych (Solanaceae) (Strukelj i inni, 1992, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 373:477-482). Nie opublikowano enzymatycznych testów in vitro czy biotestów in vivo na zastosowanie inhibitorów proteaz asparaginianowych ziemniaka przeciw owadom lub nicieniom.

Australijskie zgłoszenie patentowe nr 36568/89 podaje, że zwierzęca cystatyna (taka jak cystatyna białka jaja kurzego i jak kininogeny) i nie-białkowe inhibitory proteaz cysternowych, o niskim ciężarze cząsteczkowym, (takie jak E-64, antypaina i leupeptyna) mogą być skuteczne w zwalczaniu wielu chrząszczy, które wykorzystują proteazy cysteinowe do trawienia.

Publikacja WO 92/21753 podaje, że multicystatyna, fitocystatyna z 8 domenami z ziemniaka jest bardziej skuteczna niż inne cystatyny w zwalczaniu różnego rodzaju owadów wykorzystujących proteazy cysteinowe do trawienia białek w jelicie cienkim, ponieważ jest ona bardziej odporna na proteolizę przez karboksypeptydazę.

189 808

Publikacja WO 96/16173 podaje, że modyfikowane cystatyny mogą chronić rośliny przed nicieniami.

Publikacja WO 92/24479 ujawnia, że nowy inhibitor proteazy tiolowej z Diabroticca spp. (com rootworm), nazwany virgiferin, może chronić rośliny przed owadami i nicieniami, które wykorzystują proteazy tiolowe jako enzymy trawienne.

Dowody na to były opublikowane w piśmiennictwie naukowym poświęconym różnym chrząszczom i pluskwiakom, jak i nicieniom (Chen i inni, 1992, Protein Express Purification 3: 41-49; Edmonds i inni, 1996, Entomol. Exp. Appl. 78: 83-94; Elden, 1995, J. Econ. Entomol. 88: 1586-1590; Orr i inni, 1994, J. Insect Physiol. 40: 893-900; Kuroda i inni, 1996, Biosci. Biotech. Biochem. 60: 209-212; Lepie i inni, 1995, Molecular Breeding 1: 319-328; Urwin i inni, 1995, Plant J. 8: 121-131). W wysokich stężeniach cystatyny powodują śmiertelność lub zmniejszoną płodność i rozwój pewnych owadów i nicieni (tabela 1). Jednak, stężenia inhibitora proteazy cysteinowej w sztucznej diecie (200-2000 μΜ, patrz tabela 1), wymagane dla uzyskania rolniczo interesujących wyników ochrony roślin, w większości przypadków są znacznie wyższe niż można oczekiwać u roślin transgenicznych (10-40 μΜ, patrz tabela 1), jak również znacznie wyższe niż aktualne stężenia proteaz, które mają hamować (10-30 μΜ). Wysokie stężenia są prawdopodobnie wymagane, ponieważ nie wiążą dostatecznie ściśle wszystkich molekularnych form proteaz cysternowych występujących w jelicie. Słabe inhibitory mogą nadal hamować proteazy, będąc w dużym nadmiarze w stosunku do proteaz. Szacuje się, że 10 do 30 różnych enzymów proteolitycznych jest aktywnych w jelicie i transkrypcja proteaz, które nie są hamowane może być aktywnie indukowana przez owady celem kompensacji inhibicji innych proteaz (Jongsma i inni, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8041-8045; Bolter i Jongsma, 1995, J. Insect Physiol. 41: 1071-1078). Drugim powodem braku toksyczności może być fakt, że są one niestabilne w środowisku jelita i że są rozkładane przez proteazy, które nie są hamowane.

To, że inhibitor proteazy jest inhibitorem proteaz cysteinowych czy asparaginianowych, nie znaczy, że będzie skuteczny in vitro przeciwko owadom wykorzystującym te proteazy w procesie trawienia (patrz również publikacja WO 92/21753). Ogólnie można stwierdzić, że rzadko zdarza się, aby pojedynczy inhibitor hamował całkowicie cały zakres aktywności proteazy cysteinowej czy asparaginianowej w jelicie owada czy nicienia w normalnych stężeniach, które można uzyskać u roślin (10-40 μΜ). Inhibitory, które równocześnie hamują zarówno proteazy cysteinowe jak i asparaginianowe u pewnych owadów, nie zostały do tej pory opisane, chociaż ich użyteczność jest oczywista jako, że wiele owadów bazuje na kombinacji tych dwóch klas trawiennych enzymów proteolitycznych. Wiele z owadów wymienionych w tabeli 1 bazuje na obu typach proteaz i to, że inhibitory często nie są wysoce toksyczne w stosunku do owadów jest prawdopodobnie spowodowane tym, że proteazy asparaginianowe trawią białka pokarmowe i inhibitory proteaz cysternowych.

Tabela 1. Inhibitory proteazy cysteinowej, które oddziałują na parametry kondycji owadów, gdy podawane są w diecie lub podlegają ekspresji w transgenicznych roślinach żywicielskich

Gatunek owadów	Poziom PI w diecie/roślinę (μΜ)	Skutek	Publikacje
1	2	3	4
Sztuczna dieta uzupełniona cystatynami
Tribolium castaneum (Col.)	10000	35% WR	Chen i inni, 1992
Hepera postica (Col.)	200	RF	Eiden 1995
Diabrotica undecimpunctata (Col.)	100-200	40 - 70% M	Edmonds i inni, 1996
Diabrotica undecimpunctata (Col.)	125 pg/cm2	50% WR	Orr i inni, 1994
Diabrotica virgifera (Col.)	125 pg/cm2	50% WR	On i inni, 1994
Callosobruchus chinensis (Col.)	100-2000	10- 100% M	Kuroda i inni, 1996

189 808

c.d. tabeli 1

1	2	3	4
Riptortus clavatus (Hem.)	100-2000	0- 100% M	Kuroda i inni, 1996
Rośliny transgeniczne wykazujące ekspresję cystatyn
Globodera pallida (Nemat.)	10 (pomidor)	puste cysty	Urwin i inni, 1995
Chrysomela tremulae (Col.)	40 (topola)	40% M	Leplć i inni, 1995

WR = redukcja wagi; RF = redukcja płodności; M = śmiertelność

Wcześniej w piśmiennictwie wykazano, że pewne owady, jak stonka ziemniaczana (Colorado potato beetle) są szczególnie niewrażliwe na inhibitory proteaz, nawet gdy są one izolowane z całkowicie niespokrewnionych źródeł, takich jak ryż czy człowiek (Michaud i inni, 1995, Insect Biochem. Molec. Biol. 25: 1041-1048; Michaud i inni, 1996, Archives of Insects Biochemistry and Physiology 31: 451 -464; Michaud i inni, 1993, FEBS Letters 331: 173-176). Pewne takie inhibitory proteaz, gdy były testowane przeciw innym owadom, okazały się całkiem skuteczne (Lepić i inni, 1995, Molecular Breeding 1: 319-328). U stonki ziemniaczanej (Colorado potato beetle) wykazano, jednak, że inhibitory te są albo zbyt specyficzne dla jednego tylko typy aktywności proteazy, albo są rozkładane przez proteazy asparaginianowe.

Całkowicie nieznane są wymagania strukturalne dla inhibitorów proteazy cysteinowej lub asparaginianowej, leżące u podłoża bardziej skutecznej inhibicji proteaz jelitowych owadów czy nicieni. Rośliny, szczególnie gdy są spokrewnione z roślinami żywicielskimi, są ubogim źródłem skutecznych inhibitorów, ponieważ owady wytworzyły proteazy niewrażliwe na inhibitory proteaz skierowane przeciwko nim.

Jest możliwe przetestowanie inhibitorów proteazy cysteinowej z innych roślin, ale do tej pory nie opisano białkowych inhibitorów proteaz asparaginianowych inych niż pochodzących z psiankowatych (Solanaceae). Najbardziej pożądane typy inhibitora proteaz do zwalczania owadów, wykorzystujących proteazy cysternowe i/lub asparaginianowe do trawienia, jednocześnie hamowałyby więcej niż 90% obu aktywności u owadów, które są hodowane na ich roślinach żywicielskich, aby zwłaszcza uczynić inhibitory proteaz roślin żywicielskich niewrażliwymi na zestaw proteaz. Takie inhibitory nie są znane w rozwiązaniach ze stanu techniki.

Stwierdzono obecnie, że inhibitory proteazy cysteinowej, wyselekcjonowane z grupy białek zawierających co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreogiobulinową typu I są skuteczne in vivo przeciw owadom lub nicieniom, wykorzystującym proteazy cysteinowe, co więcej, stwierdzono z zaskoczeniem, że wymienione inhibitory są szczególnie aktywne przeciwko owadzim proteazom cysternowym, które są niewrażliwe na inhibitory proteaz cysternowych pochodzące z roślin żywicielskich. Taka właściwość jest bez precedensu wśród innych typów inhibitorów proteaz cysternowych, obejmując inhibitory nie pochodzące z roślin. Skutkiem tego, wymienione inhibitory są wysoce toksyczne, na przykład, w stosunku do larw stonki ziemniaczanej (Colorado potato beetle).

Zgodnie z wynalazkiem, sposób ochrony roślin lub części tych roślin przed atakiem jednego lub większej ilości owadów lub nicieni posiadających trawienne proteazy cysteinowe, charakteryzuje się tym, że podaje się w miejscu, gdzie wymieniony owad(y) lub nicień(ie) mają być zwalczane, hamującą ilość inhibitora proteazy cysteinowej posiadającego sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1.

Korzystnie, owady posiadają proteazy cysteinowe, które są niewrażliwe na inhibitory __ro ______~e~o ^zUc vyaic utuwcj puciiuiuĄw luhiui wivxviaitivii.

Korzystnie, owady to jedna lub większa ilość stonek ziemniaczanych, Diabrotica spp, wciórnastków i miniarek.

Korzystnie, nicieniami są nicienie cystowe i guzaki.

Korzystnie w sposobie tym, do genomu rośliny wprowadza się sekwencję kodującą inhibitor proteazy cysteinowej posiadający sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1 powiązaną funkcjonalnie z sekwencją promotora aktywną w roślinie, powodującą ekspresję

189 808 tego inhibitora na poziomach, które zapewniają zwalczającą owady lub nicienie ilość tego inhibitora.

Korzystnie, sposób ten ponadto obejmuje etapy:

(a) hodowania komórek lub tkanek z roślin, (b) wprowadzania do komórek lub tkanek co najmniej jednej kopii sekwencji kodującej inhibitor proteazy cysteinowej, (c) regeneracji całych odpornych roślin z hodowoli komórek lub tkanek.

Korzystnie, sposób taki może ponadto obejmować etap płciowego lub przez klonowanie rozmnażania całych roślin w taki sposób, że co najmniej jedna kopia sekwencji kodującej inhibitor proteazy cysteinowej powiązanej funkcjonalnie z sekwencją promotora aktywną w roślinie występuje w komórkach potomstwa tego rozmnażania.

Sposób według wynalazku korzystnie obejmuje ponadto etapy:

(a) selekcjonowania płodnych, odpornych na owady lub nicienie roślin wytworzonych wyżej podanym sposobem, (b) krzyżowania płciowego roślin odpornych na owady lub nicienie z roślinami podatnymi na owady lub nicienie z odmian podatnych, (c) odzyskiwania materiału reprodukcyjnego z potomstwa krzyżówek, oraz (d) hodowania roślin odpornych z materiału reprodukcyjnego.

Korzystnie w sposobie tym, dla nadania odporności na owady lub nicienie na zasadniczo homozygotyczną populację roślin odmiany podatnej, przeprowadza się ponadto powtarzane etapy, którymi są:

(a) krzyżowanie wsteczne potomstwa odpornego na owady lub nicienie z zasadniczo homozygotycznymi, podatnymi na owady lub nicienie roślinami z odmiany podatnej, oraz (b) selekcjonowanie na ekspresję, zarówno odporności na owady lub nicienie jak i innych cech odmiany podatnej wśród potomstwa krzyżówki wstecznej, aż pożądana zawartość procentowa cech odmiany podatnej wystąpi u potomstwa wraz z odpornością na owady lub nicienie.

Zgodnie z wynalazkiem roślina transgeniczna i jej płciowe potomstwo odporne na atak jednego lub większej ilości owadów lub nicieni posiadających trawienne proteazy cysteinowe, charakteryzuje się tym, że roślina transgeniczna wykazuje ekspresję zwalczającej owady lub nicienie ilości inhibitora proteazy cysteinowej posiadającego sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1.

Zgodnie z wynalazkiem, nośnik ekspresji, funkcjonalny biologicznie, charakteryzuje się tym, że zawiera promotor zdolny do wzbudzania ekspresji leżącej za nim sekwencji kodującej w komórkach roślinnych, rejon kodujący DNA kodujący w komórkach roślinnych ekspresję inhibitora proteazy cysteinowej posiadającego sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1 oraz sekwencję terminatorową zdolną do terminacji transkrypcji lub translacji tego inhibitora w komórkach roślinnych, przy czym nośnik ekspresji jest zdolny do ekspresji w komórkach rośliny zwalczającej owady ilości tego inhibitora.

Korzystnie, nośnikiem ekspresji jest pCABl.

Zgodnie z wynalazkiem, transgeniczna komórka gospodarza, charakteryzuje się tym, że jest transformowana biologicznie funkcjonalnym nośnikiem ekspresji opisanym powyżej.

Korzystnie, w takiej transgenicznej komórce gospodarza, rejon kodujący DNA kontrolowany jest przez promotor zdolny do wzbudzania ekspresji leżącej za nim sekwencji kodującej w komórce rośliny, rejon kodujący DNA kodujący w komórkach roślinnych ekspresję inhibitora proteazy cysteinowej posiadającego sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1 oraz sekwencję terminatorową zdolną do terminacji transkrypcji lub translacji tego inhibitora w^_ komorkach roślinnych, przy czym nośnik ekspresji jest zdolny' do ekspresji, w komórkach rośliny, zwalczającej owady ilości tego inhibitora dla zwalczania jednego lub wielu owadów posiadających trawienne proteazy cysteinowe.

Zgodnie z wynalazkiem, peptyd inhibitora z powtórzoną domeną tyreoglobulinową typu I o aktywności skierowanej przeciwko proteazom asparaginianowym, charakteryzuje się tym, że peptyd ten posiada sekwencję aminokwasów rozciągającą się od pozycji aminokwasów 68199 ekwistatyny z fig. 1 lub zmodyfikowanego peptydu inhibitora proteazy asparaginianowej o powtórzonej tyreoglobulinie typu I, przy czym ten zmodyfikowany peptyd zawiera peptyd,

189 808 mający zasadniczo identyczne aminokwasy jak pozycja aminokwasów 68-199 ekwistatyny;

skrócenia pozycji aminokwasów 68-199 ekwistatyny; lub skrócenia peptydu mającego zasadniczo identyczne aminokwasy jak pozycja aminokwasów 68-199 ekwistatyny, gdzie zmodyfikowany peptyd jest funkcjonalnym odpowiednikiem pozycji aminokwasów 68-199 ekwistatyny z aktywnością inhibitora proteaz asparaginianowych.

Zgodnie z wynalazkiem, sposób ochrony roślin lub części tych roślin przed atakiem jednego lub większej ilości owadów lub nicieni posiadających trawienne proteazy asparaginianowe, charakteryzuje się tym, że podaje się w miejscu, gdzie wymieniony(e) owad(y) lub nicienie) mają być zwalczane, hamującą ilość inhibitora proteazy asparaginianowej jak określono powyżej.

Zgodnie z wynalazkiem, sposób ochrony roślin lub części tych roślin przed atakiem jednego lub większej ilości owadów lub nicieni posiadających trawienne proteazy cysteinowe i asparaginianowe, charakteryzuje się tym, że podaje się w miejscu, gdzie wymieniony(e) owad(y) lub nicień(ie) mają być zwalczane, hamującą ilość inhibitora proteazy asparaginianowej jak określono powyżej i inhibitora proteazy cysteinow-ej posiadającego sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1.

Szereg podanych cech wynalazku zostało zilustrowanych na załączonym rysunku, na którym fig. 1 pokazuje sekwencję nukleotydów i wywnioskowaną sekwencję aminokwasów genu ekwistatyny z Actinia equina L, fig. 2 - porównanie wszystkich trzech domen cDNA kodującego sekwencję aminokwasów ekwistatyny i oczyszczonego białka ekwistatyny z Actinia equina L. z sekwencją aminokwasów innych białek z powtórzoną domeną tyreoglobulinowa typu I ze znaną i nieznaną aktywnością inhibitora proteazy, fig. 3 - efekt in vitro szerokiej gamy różnych inhibitorów-' proteazy cysteinowej larwy stonki ziemniaczanej (Leptinotarsa decemlineata), które są niewrażliwe na endogenne inhibitory proteaz cysternowych rośliny żywńcielskiej ziemniaka, fig. 4 - wpływ ekwistatyny na rozwój i śmiertelność larw' stonki ziemniaczanej, fig. 5 - wpływ ekwistatyny w stosunku do innych inhibitorów proteaz cysternowych na aktywność proteolityczną in vitro wciornastka, western flower thrips (Frankiniella occidentalis), fig. 6 - wpływ ekwistatyny na płodność samic wciornastka dwa dni po umieszczeniu ich na diecie, zawierającej ten inhibitor, fig. 7 - mapę plazmidu pB3-ekwistatyny, fig. 8 - konstrukcje plazmidu pCAB 1-ekwistatyny, fig. 9 - analizę HPLC ekwistatyny. Chromatogtamy pokazują profile elucyjne HPLC ekwistatyny po inkubacji z różnymi enzymami. W panelu A ekwistatyna była inkubowana z katepsyną D w końcowym stężeniu molarnym 2:1, a w panelu B ekwistatyna została pofragmentowana przy użyciu 1% (wagowych) β-trypsyny. Identyfikacja szczytów opierała się na sekwencjach N-terminalnych, fig. 10 - analizę elektroforetyczną ekwistatyny. A, SDS-PAGE pociętej ekwistatyny. Linie: 1, standardy ciężaru cząsteczkowego; 2, pierwsza domena ekwistatyny (eq d-1); 3, połączone druga i trzecia domena ekwistatyny (eq d-2,3). B, Natywny PAGE formacji kompleksu ekwistatyny i katepsyny D. Linie: 1, katepsyną D, ekwistatyna i katepsyna D zmieszane razem 30 min. przed elektroforezą; 3, ekwistatyna. Żele były barwione błękitem Coomassie, fig. 11 - schemat funkcji zastosowanych fragmentówekwistatyny. Miejsca proteolitycznych rozszczepień są wskazane przerwami i pokazane jako numery aminokwasów. Miejsca rozszczepień uzyskane przez działanie β-trypsyny są wskazane strzałkami. Sparowanie reszt cysteinowych w wiązaniu dwusiarczkowym wskazane jest przez poziome linie łączące reszty cysternowe, fig. 12 - miejsce aktywnego wytrącania ekwistatyny z katepsyną D. Inhibicja 77nM katepsyny D przez wzrastające stężenia natywnej ekwistatyny. Resztkowa aktywność wyrażona jest jako procent aktywności kontrolnej w próbkach nie zawierających inhibitora, a fig. 13 przedstawia wykres zależności aktywności resztkowej w funkcji ekwistatyny/katepsyny D.

darnina i/*HvniA ndnipcipmp utttnw · τ j xxxw ν «χχχχ wx νχχχ ~

-tirA^łum¹ rwrffmromtrtli tri rTWMAVl£2 v j v v » » tui j ttł w ozjj οιχνιν i do stanu techniki.

Obecnie stwierdzono, że wśród powtórzonych domen tyreoglobulinowych typu I istnieją, domeny, wykazujące aktywność w stosunku do proteaz asparaginianowych pochodzących od człowieka i owadów. W połączeniu z białkami (stały fragment łańcucha P41 i domena I ekwistatyny) o domenach, które są aktywne w stosunku do proteaz cysternowych, mają one potencjalną aktywność hamującą skierowaną przeciw trawiennym proteazom cysternowym i asparaginianowym „niewrażliwym na inhibitory proteaz”, szerokiego zakresu gatunków owadów

189 808 należących do różnych rzędów, wliczając w to stonkę ziemniaczaną wciornastki, miniarki i Diabroticca spp. Były one larwobójcze, gdy podawano je dojelitowo larwom owadów, takich jak stonka ziemniaczana, posiadającym trawienne proteazy cysteinowe i asparaginianowe, i silnie hamowały płodność wciornastków, które głównie zależą od proteaz cysternowych do trawienia białek. Wykazano, że ta właściwość powtórzonych domen tyreoglobulinowych typu I jest unikalna pośród szerokiego zestawu inhibitorów proteaz cysternowych i asparaginianowych pochodzących od prawie wszystkich znanych typów inhibitorów proteaz cysternowych i asparaginianowych. Wykazano zatem, że nie jest wystarczające, jak sugerowano wcześniej, wykorzystywanie inhibitorów, które charakteryzują się dużym dystansem ewolucyjnym w stosunku do roślin jako, że były one nieaktywne jako inhibitory pochodzenia roślinnego. Natomiast, wyłącznie inhibitory proteaz cysternowych i/lub asparaginianowych, zawierające konserwatywne cechy powtórzonej domeny tyreoglobulinowej typu I mają zdolność do pełnej in-aktywacji „niewrażliwych na PI” proteaz cysteinowych i asparaginianowych różnych gatunków owadów. Tak więc, wynalazek ten zapewnia sposób uśmiercania owadów i nicieni, posiadających trawienne proteazy cysteinowe i/lub asparaginianowe „niewrażliwe na inhibitory proteaz”, w tym larwę stonki ziemniaczanej, obejmujący dojełitowe podanie larwom lub nicieniom larwobójczych i nicieniobójczych ilości białka zawierającego jedną lub więcej powtórzonych domen tyreoglobulinowych typu I, co zależy od tego, czy owady wykorzystują jedną lub więcej klas proteaz do trawienia.

wyklucza, że może być hamowana przez inhibitory proteaz izolowane ze źródeł innych niż roślina żywicielska. Terminy owad i larwa, chociaż nie są równoważne przy określonym użyciu, obejmują zarówno formy dorosłe jak i larwalne gatunku, gdy używane są ogólnie. Zatem, termin odporność owadów obejmuje odporność form larwalnych, tak samo jak i dorosłych, a materiały larwobójcze oznaczają materiały owadobójcze, szczególnie, że uśmiercają larwy, czego konsekwencją jest brak osobników dorosłych.

W korzystnym przykładzie wykonanią niniejszy wynalazek skierowany jest na inhibitory proteaz cysteinowych/asparaginianowych z polipa morskiego (Actinia eąuina), określanych tu także jako ekwistatyną. Dla celów niniejszego wynalazku, „ekwistatyną” oznacza białka, kodowane przez geny, posiadające zestaw sekwencji pokazany na fig. 1, lub ich funkcjonalne pochodne. Peptyd ekwistatyny, oczyszczony z polipa morskiego (Actinia eąuina) charakteryzuje się obecnością trzech powtórzonych domen tyreoglobulinowych typu I (Lenarcie i inni, 1997, J. Biol. Chem. 272: 13899, Lenarcie i inni, 1998, J. Biol. Chem. 273: 12682). Rezultatem przejrzenia biblioteki cDNA z Actinia eąuina za pomocą znakowanej izotopem sondy, uzyskanej dzięki PCR przy użyciu dwóch zdegenerowanych primerów na totalnym cDNA, było uzyskanie klonu z sekwencją kodującą zawierającą sygnalizacyjny peptyd dla sekrecji i część dojrzałego białka o trzech domenach, o sekwencji prawie identycznej z sekwencją białka oczyszczonego.

Primery do amplifikacji cDNA ekwistatyny:

EI-degl: CT(A,C,GT) AC (A,C,G,T)AA(A,G)TG(T,C)CA(A,G)CA(A,G)

EI-deg2:ATT(A,G)AC(A,G,C,T)TG(A,C,G,T)GG(A,C,G,T)CG(T,C)TT(A,G)AA

Jak widać na fig. 1 i 2 dojrzała komponenta białkowa ekwistatyny składa się z 3 domen, które wydają się być skutkiem duplikacji materiału genetycznego. Na podstawie wstępnej analizy sekwencji DNA, można otrzymać z Actinia equina wiele strukturalnych izoform ekwistatyny. Trzy domeny obejmują 22 kD polipeptyd. Każda domena zawiera około 65-68 aminokwasów, z przypuszczalnie trzema wiązaniami dwusiarczkowymi. Opierając się na sekwencji domen jest widoczne, że białko to należy do konserwatywnych powtórzonych domen tyreoglobulinowych typu I, zawierających powtórzone domeny typu I. Sekwencja domeny wykazuje specyficzne zachowanie sekwencji aminokwasów: Cys-(Xxx)i8-29-Pr°-X^xx*Cys-(Xxx)3Gly-(Xxx)5-Gln-Cys-(Xxx)6-Cys-Thr-Cys-Val-(Xxx)3-Gly-(Xxx)io-i5-Cys. Te trzy domeny inhibitorowe, oczyszczone z Actinia eąuina były proteolitycznie rozszczepione na dwa duże pepty12

189 808 dy i odseparowane przez HPLC o odwróconej fazie. Wyznaczenie N-końców obu fragmentów pozwoliło na ich lokalizację w sekwencji. Jeden peptyd oznaczony eqd-l zawiera pierwszą domenę zawierającą reszty 1-67, podczas gdy drugi peptyd oznaczony eqd-2,3 zawiera domeny 2 i 3 reszty 68-199. Nienaruszona cząstka ekwistatyny mogłaby być hamowana tylko przez 1 cząstkę papainy i 1 cząstkę katepsyny D. Testy inhibicji z Eqd-1 i Eqd-2,3 wykazały, że Eqd-1 mogłaby być hamowana przez papainę, a Eqd-2,3 przez katepsynę D. Stałe inhibicji odseparowanych domen były podobne jak dla nienaruszonej cząstki ekwistatyny. Pokazało to, że mimo, iż domeny wydają się być strukturalnie konserwatywne, to specyficzność w stosunku do proteaz odnosiła się do całkowicie różnych klas proteaz. Nie jest możliwe przy obecnych dowodach ustalić, które reszty decydują o różnicy specyficzności.

Należy zrozumieć, że na podstawie obecnej wiedzy, można syntetyzować lub izolować chemicznie czyste funkcjonalne pochodne naturalnie występujących cząstek ekwistatyny. „Funkcjonalna pochodna” ekwistatyny jest związkiem, posiadającym biologiczną aktywność, która jest istotnie podobna do biologicznej aktywności cząstki ekwistatyny. Termin „pochodna funkcjonalna” obejmuje „fragmenty” lub „efektywne odmiany homologiczne”.

Określenie „fragment” cząstki odnosi się do każdego inhibitorowego podzbioru polipeptydowego cząstki ekwistatyny.

Określenie „efektywna odmiana homologiczna” cząsteczki takiej jak cząsteczka ekwistatyny odnosi się do cząsteczki zasadniczo podobnej poprzez sekwencję i funkcję albo do całej cząsteczki, albo do jej fragmentu. Dla celów mniejszego wynalazku, cząsteczki te są identyfikowane, gdy zawierają powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I. Ogólnie rzecz biorąc, efektywna homologiczna sekwencja powinna zachować silną konserwatywność w naturalnie pojawiających się pozycjach konserwatywnej sekwencji Cys-(Xxx)i8-29-Pro-Xxx-Cys(Xxx)3-Gly-(Xxx)5-Gln-Cys-(Xxx)6-Cys-Thr-Cys-Val-(Xxx)3-Gly-'(Xxx)io-i5-Cys. Dwie cysteiny na każdym końcu konserwatywnej sekwencji są konserwatywne, ale nie mają utrzymanych pozycji. Wydaje się, że formują one strukturalnie ważne mostki dwusiarczkowe z każdą inną cysteiną. Dla celów tego wynalazku, struktura sekwencji aminokwasów jest efektywnie homologiczna w stosunku do drugiej sekwencji, jeśli co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 80%, i najkorzystniej co najmniej 90% aktywnych porcji sekwencji aminokwasów jest identyczna lub równoważna. Ogólne kategorie potencjalnie równoważnych zestawów aminokwasów są zestawione poniżej, gdzie aminokwasy w obrębie grupy mogą być zastąpione przez inne aminokwasy z tej grupy: (1) kwas glutaminowy i asparaginianowy; (2) lizyna, arginina i histydyna; (3) alanina, wałina, leucyna i izoleucyna; (4) asparagina i glutamina; (5) treonina i seryna; (6) fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan; i (7) glicyna i alanina. Istotne i krytyczne jest dla definicji to, że funkcja drugiej sekwencji aminokwasów jest efektywnie homologiczna do innej sekwencji aminokwasów, jeśli drugi aminokwas przystosuje się do struktury trzeciorzędowej, mającej zdolność zmniejszania lub eliminacji katalitycznej aktywności proteazy trawiennej cysteinowej i/lub asparaginianowej.

Jak stosowano tutaj, termin „zasadniczo czysty” służy do opisania białek zawierających co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I, która jest jednorodna na podstawie charakterystyki czystości lub jednorodności. Na przykład, zasadniczo czyste cząstki peptydu ekwistatyny wykazują stałą i powtarzalną charakterystykę w standardowych doświadczalnych odchyleniach parametrów takich jak ciężar cząsteczkowy, zachowanie w chromatografii i tym podobne. Termin ten, jednak, nie służy do wykluczenia sztucznych czy syntetycznych mieszanin cząstek peptydu ekwistatyny z innymi substancjami. Termin ten również nie służy do wykluczenia obecności drobnych zanieczyszczeń, które nie interferują z biologiczną aktywnością cząstki peptydu ekwistatyny i mogą występować, na przykład, wskutek niecał1_____________ ____________________

Kuwncgv az^z-ciua.

A I / J¹ Ki LILIA) W IWlUllIYi AiUyilVlUJtą νχχχ

-------chromatografia cieczowa z filtracją żelową chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa, wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa, chromatografia w fazie odwróconej lub stosowanie reagentów immunologicznych z użyciem przeciwciał skierowanych przeciw ekwistatynie.

189 808

Izolowanie genu

Możliwe jest zsyntetyzowgzie in vitro peptydu ekwistatyny ze składowych aminokwasów. (patrz Merrifield, 1963, J. Amer. Chem. Soc., 85: 2149-2154; i Solid Phase Peptide Syzthesis, 1969, (wyd. Stewart i Yokzg). Tak uzyskane peptydy mogą być izolowane i oczyszczone przez dobrze znane w tej dziedzinie procedury (patrz Current Protocols in Molecular Biology, 1989, (wyd.). Ausubel i ϊζζϊ oraz Sambrook i inni, 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual).

Chociaż możliwe jest wyznaczenie i zsyntetyzowgzie całej sekwencji aminokwasów peptydu ekwistatyny, korzystne jest izolowanie całej sekwencji genu ekwistatyriy. DNA kodujące peptyd ekwistatyny może być otrzymany z chromosamalzego DNA, cDNA lub DNA pochodzenia syntetycznego przy zastosowaniu dobrze znanych technik.

Genomowe DNA kodujące peptyd ekwistgtyzy może być izolowane za pomocą standardowych technik (Sambrook i inni, 1989, supra). Zwłaszcza rozważane jako część zCnieiszego wynalazku są sekwencje genomowego DNA, kodujące formy allelowe genu ekwistatyny, tak samo jak ich rejony flankujące 5' i 3'.

Możliwe jest stosowanie primerów oraz wykładnicza amelifikacja DNA in vitro przy wykorzystaniu oligonukleotydów o specyficznych sekwencjach w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) (patrz Mullis i ϊζζϊ, 1987, Meth. Enz. 155: 335-350; Horton i inni, 1989, Gene, 77:61; i PCR Techzology: Principles azd Apelications for DNA Amplificgtion, (wyd.)

Erlich 1989).

Przygotowane cDNA jest ligowaze ze zrekombinowgzym wektorem w celu stworzenia biblioteki gezów. Alternatywsie, cDNA mogą ulegać ekspresji w wektorze takim jak lambda gt11 i można przeglądać bibliotekę przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko cząstkom peptydu ekwistatyzy.

Można stosować odpowiedzi oliganukleotyd, zestaw oligozukleotydów lub fragmenty DNA pochodzące z PCR przy użyciu znanych technik w celu przeglądania gezomowych bibliotek DNA lub cDNA. Aby ułatwić wykrycie pożądanej sekwencji, sozda DNA może być znakowana przy pomocy każdej substancji o wykrywalnych własnościach fizycznych czy chemicznych. Gezeralze procedury izolowania, oczyszczania i sekwencjozowαzig pożądanej sekwencji są dobrze znane (patrz Current Protocols iz Molecular Biology, 1989, supra oraz Sambrook i izzi, 1989, supra).

Alternatywnym sposobem uzyskania genetycznych sekwencji, które mają zdolność kodowania białek zawierających co najmniej jedzą powtórzoną domenę tyreoglobulinowątypu I, jest uzyskanie ich dzięki syntezie oligozukleotydów, gdy wyznaczy się sekwencję interesującego genu (patrz Caruthers, 1983, W: Methodology of DNA and RNA, (wyd.) Weissman); Beaucage i inni, 1981, Tetrahedroz Letters, 22: 1859-1962). Serie oligozu.kleatydów mogą być zsyntetyzowane w celu dostarczenia serii pasujących fragmentów, które gdy zostaną zligowaze, wytworzą obie nici gezu. Fragmenty te są następnie ligowane razem przy zastosowaniu dobrze znanych technik (patrz Sambrook i izzi, 1982, supra). Alternatywnie, gezy mogą być wytwarzane przez zsyztetyzowanie primera posiadającego tak zwany „waggizg tail” (kiwający ogon), który nie hybrydyzuje z docelowym DNA, następnie sekwencje genomowe są amplifikowane i składane razem przy nadmiarze sekwencji (patrz Horton i izzi, 1989, Geze, 77: 61-68). Otrzymany fragment DNA o przewidzianej wielkości jest izolowany przez elektroforezę i ligowazy z odpowiednim wektorem do klonowania w celu ampliflkapii i dalszych manipulacji (patrz Mullis i izzi, 1987, supra; oraz PCR Techzology: Principles and Applications for DNA Amelification, supra).

Oczywiście, można izgarporować modyfikacje do wyizolowanych fragmentów, takie

ΟιιΌ nZr gnzeerw'WaI;zp uOssHCzsmi» b frr^nipsnnpi τΛ'ΖηνίΉ zillrlp..... . . . . . ...........----_{τ τ} w nm włjwjawj Λ·»»* j .. — — - —

Zabłyp

V1V1WJ ju bil rma J Uł\. ^r otydów lub konserwatywne substytucje wielu zu^eotydów, przy zachowanej odpowiedniej ramce odczytu. Sygnały zatrzymania i rozpoczęcia translacji są dodawane w odpowiednich miejscach, jak również na końcach dodawane są sekwencje dla stworzenia dogodnych miejsc klonowania. Przykładowe techniki do modyfikowania sekwencji nukleotydów' zawierają stosowanie umiejscowionych, mediowazych przez eolinugleotrdy mutagenez (patrz Zoller i izm, 1984, DNA, 3: 479-488; Higuchi i izzi, 1988, Nuci. Acids Res, 16: 7351-7367; Ho

189 808 i inni, 1989; i PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (wyd.)

Erlich, 1989).

Ekspresja genu

W celu dalszego scharakteryzowania takich genetycznych sekwencji pożądane jest wprowadzenie sekwencji do odpowiedniego gospodarza w celu ekspresji białka, kodowanego przez tę sekwencję i potwierdzenie, że posiadają one cechę cząsteczki peptydu ekwistatyny. Techniki takich manipulacji są dobrze znane w tej dziedzinie i ujawnione przez Sambrook i inni (1989), supra.

Wektory są dostępne lub mogą być łatwo wytworzone w celu transformacji wirusów, komórek prokariotycznych lub eukariotycznych. Ogólnie, wektory plazmidowe lub wirusowe powinny zawierać wszystkie kontrolne sekwencje DNA, niezbędne zarówno do zachowania jak i ekspresji heterologicznych sekwencji DNA w danym organizmie gospodarza. Taka kontrolna sekwencja generalnie zawiera sekwencję promotorową, sekwencję do startu transkrypcji, sekwencję DNA kodującą startowy kodon translacji, kodon terminacyjny translacji, i sekwencję DNA kodującą nie podlegający translacji rejon 3', zawierający sygnał terminacyjny syntezy RNA i/lub modyfikacji mRNA. Ostatecznie wektory powinny korzystnie posiadać gen markerowy, zdolny do wytworzenia cech fenotypowych, co pozwala na identyfikację komórki gospodarza zawierającej wektor i w przypadku transformacji ,jednoliściennych”, intron znajdujący się w 5' rejonie nie ulegającym translacji, na przykład, intron 1 z genu dehydrogenazy alkoholowej kukurydzy, który podnosi ustalone poziomy mRNA.

Przykładowa komórka gospodarza zawarta jest w organizmach prokariotycznych i eukariotycznych. Odpowiednia procedura transformacji wybranej komórki gospodarza może być wybrana zależnie od rodzaju używanej komórki gospodarza. Opierając się na dotychczasowym doświadczeniu, wydaje się, że istnieją małe różnice w ekspresji genów wprowadzonych do komórek, związane ze sposobem ich transformowania.

Konwencjonalne technologie wprowadzania materiału biologicznego do komórek zawierają elektroporację (patrz Shigekawa i Dower, 1988, Biotechniąues, 6: 742; Miller i inni, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 856-860; oraz Powell i inni, 1988, Appl. Environ. Microbiol., 54: 655-660); mechanizm bezpośredniego wychwytu DNA (patrz Mandel i Higa, 1972, Biochimica et Biophysica Acta, 281: 319-323; Wigier i inni, 1979, Cell, 16:77; oraz Uchimiya i inni, 1982, w: Proc. 5^ft Intl. Conq. Plant Tissue and Cell Culture, A. Fujiwara (wyd.), Jap. Assoc. for Plant Tissue Culture, Tokyo, strony 507-508); mechanizmy fuzji (patrz Uchidax i inni, 1980, w: Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells, C. Baserga, G. Crose, i G Rovera (wyd.) Wistar Symposium Series, Vol. 1, A. R. Liss Inc., NY, strony 169-185); czynniki infekcyjne (patrz Fraley i inni, 1986, CRC Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1-46; i Andersen, 1984, Science, 226: 401-409); mechanizmy mikroiniekcji (patrz Crossway i inni, 1986, Mol. Gen. Genet, 202: 179-185) i mechanizmy armatki jonowej (patrz EPO 0 405 696).

Transformanty są izolowane zgodnie z konwencjonalnymi metodami, zazwyczaj przy zastosowaniu technik selekcji, które pozwalają na selekcję pożądanych organizmów spośród organizmów niezmodyfikowanych. Ogólnie, po transformacji komórki gospodarza rozwijają się przez 48 godzin, aby doszło do ekspresji genów markerowych. Komórki są następnie umieszczane w środowisku selekcyjnym lub umożliwiającym ich ocenę, gdzie komórki, które nie uległy transformacji są odróżniane od komórek transformowanych, albo na podstawie śmierci albo własności biochemicznych. Wyselekcjonowane komórki mogą być badane pod kątem ekspresji cząstki peptydu ekwistatyny lub funkcjonalnych pochodnych na podstawie technik testowych takich jak analiza typu immunoblot, test aktywności inhibicyjnej, test immunoenzymatyczny FLISA, radioimmunoassay, łub aktywowane fiuorescencją sortowanie komórek, immunohistochemia i temu podobne. Transformowane tkanki są następnie testowane na aktywność zwalczającą owady.

Transformowana komórka gospodarza może stanowić źródło, z którego można izolować znaczące ilości wektora, zawierającego interesujący gen, w celu wprowadzenia go do pożądanej komórki gospodarza, lub w którym można otrzymać ekspresję znaczącej ilości białka i możliwość jego wyizolowania. Przykładowa zrekombinowana komórka gospodarza obejmuje jednokomórkowe prokariotyczne i eukariotyczne szczepy. Prokariotyczne mikroorganizmy,

189 808 które mogą być wykorzystywane jako gospodarze to Escherichia coli i inne Enterobacteriaceae, Bacilli i różne Pseudomonas. Powszechne eukariotyczne mikroorganizmy to Sacchromyces cerevisiae i Pichia pastoris. Powszechne wyższe eukariotyczne komórki gospodarza to

Sp2/0 lub komórki CHO. Inni korzystni gospodarze to komórki owadów, na przykład, larwy Drosophila, u których wektor zawiera promotor dehydrogenazy alkoholowej Drosophila.

Alternatywnie, wektory bakulowirusa, na przykład, Autographa californica, wirusa jądrowej polihedrozy (patrz Miller i inni, 1983, Science, 219: 715-721) mogą być skonstruowane w celu ekspresji dużych ilości cząstid peptydu ekwistatyny łub funkcjonalnych pochodnych w hodowanych komórkach owadzich (patrz Andrews i inni, 1988, Biochem. J., 252: 199-206.

Stężenie białek zawierających co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreogiobulinową typu I będzie różne, zależnie od szczególnych przepisów, zwłaszcza gdy używa się koncentratu lub stosuje bezpośrednio. Białko zawierające co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I występować będzie w ilości co najmniej 1% wagowych i może osiągnąć 100% wagowych.

Niniejszy wynalazek ponadto uwzględnia stosowanie zrekombinowanych gospodarzy (na przykład, żywicielskie mikroorganizmy i wirusy owadów) transformowanych genami kodującymi białko, zawierające co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreogiobulinową typu I i podawane na wyselekcjonowane rośliny lub w ich pobliżu, lub na części roślin podatne na atak owadów. Wyselekcjonowani są gospodarze, zdolni do kolonizowania tkanek roślinnych, podatnych na zakażenie owadami lub będą stosowane jako martwe lub nie żywotne komórki zawierające białko, zawierające co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreogiobulinową typu I. Gospodarze mikrobowi w szczególnych sytuacjach będą prokariotami i niższymi eukariotami jak, na przykład, grzyby.

Charakterystyki gospodarzy mikroorganizmów do okapsułowania białek zawierających co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreogiobulinową typu I zawierają zabezpieczenie białka, takie jak gruba ściana komórkowa, pigmentacja, wewnątrzkomórkowe upakowanie lub formowanie ciał inkluzyjnych, powinowactwo do liścia, brak toksyczności w stosunku do ssaków, atrakcyjność dla szkodników przyjmujących pokarm, łatwość uśmiercania i utrwalania bez uszkodzenia białek zawierających co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I; i możliwość przedłużenia aktywności białka zawierającego co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreogiobulinową typu I. Charakterystyka gospodarzy mikroorganizmów do kolonizacji roślin zawiera brak fitotoksyczności; łatwość wprowadzenia sekwencji genetycznej kodującej białko, zawierające co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I, dostępność systemów ekspresji, wydajność ekspresji i stabilność insektycydu w gospodarzu.

Przykładowe prokariota, zarówno gram-ujemne i -dodatnie, zawierają Enterobacteriaceae, takie jak Escherichia; Bacillaceae; Rhizoboceae, takie jak Rhizobium i Rhizobacter; Spirilaceae (takie jak fotobakteria), Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Yibrio, Desułfovibrio, Spirillum, Lactobacillaceae; Pseudomonaceae (takie jak Pseudomonas i Acetobacter), Azotobacteriaceae i Nitrobacteriaceae. Pośród eukariotów są grzyby (takie jak Phycomycetes i Ascomycetes), zawierające drożdże (takie jak Saccharomyces i Schizosaccharomyces); i drożdże Basidiomycetes (takie jak Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces) i podobne.

Niniejszy wynalazek przewiduje również stosowanie bakulowirusów, zawierających gen kodujący białko, zawierające co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreogiobulinową typu I. Bakulowirusy, które infekują Heliotis virescens (cotton bollworm), Orgyla pseudotsugata (Douglas firtussock moth), Lymantria dispar (gypsy moth, brudnica nieparka), Autographica californica (Alfalfa looper), Neodiprion serfiter (European pine tly) i Laspeyresia pomonel.............................

LU l^UUUllllg 1I1Ullij ZjCU Vjt<OLIWVCU.lV

ÓlUÓUWUllL JCUVV pVOLjvjLAj p-uwłiw TT

US 4,745,051 i EP 175 852).

Zrekombinowany gospodarz może być stosowany na różne sposoby. Może być stosowany w formie zwilżalnego proszku, granulek lub pyłów, lub przez zmieszanie z różnymi obojętnymi materiałami, takimi jak nieorganiczne minerały (filito-krzemiany, węglany, siarczany, fosforany, i tym podobne) lub materiały botaniczne (sproszkowane kaczany kukurydzy, łuski ryżowe, skorupy orzecha włoskiego, i temu podobne). Skład może zawierać powlekane-lepkie adjuwanty, środki stabilizujące, inne owadobójcze addytywne surfaktanty, odżywki bakteryjne

189 808 lub inne środki do polepszenia wzrostu lub stabilizujące komórki bakteryjne. Płynny skład może opierać się na roztworach wodnych lub nie i stosować piany, żele, zawiesiny, koncentraty emulgujące, lub temu podobne. Składniki mogą zawierać środki reologiczne, surfaktanty, emulgatory, dyspergatory lub polimery.

Rośliny transgeniczne

Alternatywnie, białko zawierające co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I może być inkorporowane do tkanek podatnych roślin, a w wyniku zakażenia rośliny, owad spożyje zwalczającą owady ilość wyselekcjonowanego białka, zawierającego co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I. Metoda ta oferuje szczególne korzyści, pozwalając na osiąganie tkanek roślinnych trawionych przez owady lub nicienie, które normalnie są trudno osiągalne przy konwencjonalnym stosowaniu pestycydów. Dodatkowo, istnieją ważne ekonomiczne i środowiskowe korzyści uzyskane, gdy zredukowana zostanie potrzeba stosowania pestycydów.

Sposób zapewnia również korzyści, gdy rozważamy problem odporności owadów Intensywne stosowanie materiałów owadobójczych na polu, lub na obszarze geograficznym w formie pyłu lub rozpylonej cieczy lub poprzez wprowadzenie do gleby wywiera ogromną presję selekcyjną, jako że owady nieodporne nie przetrwają. Jednak, wiele owadzich szkodników upraw roślinnych atakuje również gatunki nieuprawne. Ograniczenie materiałów owadobójczych do upraw roślinnych w danym rejonie, poprzez stosowanie ich tylko w obrębie tych roślin, umożliwia przeżycie owadom nieodpornym na sąsiednich chwastach, co nie tylko tworzy rejony pozbawione toksycznego środka, ale i dostarcza owadom żywność. Zmniejsza to znacząco presję selekcyjną, co zwalnia rozwój i rozprzestrzenianie się owadów uodpornionych.

Sposób ten zapewnia również korzyści z punktu widzenia kontaminacji gleby i wód podziemnych, gdyż nie jest wymagane stosowanie żadnego nośnika. Owadobójcze składniki są pochodzenia naturalnego i zostają naturalnie niszczone, gdy roślina jest trawiona lub ulega rozkładowi. Metoda oferuje dalsze korzyści z punktu widzenia kosztów, gdyż nie pociąga za sobą dodatkowych kosztów, a koszty materiałów owadobójczych są wliczone do ceny ziarna lub innych materiałów reprodukcyjnych zakupionych przez hodowcę.

Sposobem osiągnięcia tego jest inkorporacja białka zawierającego co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I do nie fitotoksycznego nośnika, zaadaptowanego do ogólnoustrojowego podawania roślinom. Jednak ponieważ geny kodujące białka, zawierające co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I, mogą być izolowane, wynalazek uwzględnia, w korzystnym przykładzie wykonania, rośliny transgeniczne, zdolne do biologicznej syntezy białek zawierających co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I, w celu dostarczenia roślinom nowego lub dodatkowego mechanizmu ochrony przed atakiem owadów lub nicieni.

Wynalazek zapewnia sposoby przekazywania odporności na atak przez owady posiadające trawienne proteazy cysteinowe i/lub asparaginianowe roślinom podatnej jednostki taksonomicznej, które obejmują: (a) hodowanie komórek lub tkanek co najmniej z jednej rośliny taksonu; (b) wprowadzanie do hodowanej komórki lub tkanki co najmniej jednej kopii sekwencji kodującej inhibitor proteazy cysteinowej, i (c) regenerację z jednej komórki lub hodowli tkankowej całych rośliny odpornych na owady.

Ekspresja dużych ilości białek zawierających co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I może być szkodliwa dla samej rośliny. Zastosowanie sygnałowej sekwencji dla sekrecji lub odizolowanie w wybranej organielli umożliwi białku usytuowanie w miejscu chemicznie obojętnym, aż do momentu uwolnienia w środowisku jelita patogennego owada.

Sekwencja dna będzie tą, z Której pochodzić uędzie ciałko, luu będzie uuw sekwencję homologiczną do białka zawierającego co najmniej jedną domenę tyreoglobulinową typu I, pochodzącą z organizmu innego niż organizm docelowy.

Optymalna ekspresja w roślinach

W celu zoptymalizowania wydajności transkrypcyjnej i translacyjnej takiego systemu, możliwe jest sprawdzenie częstości użycia kodonów i stwierdzenia, które kodony są istotnie preferowane w systemach transfaypcyjnych i translacyjnych normalnie obecnych w danej ro189 808 ślinie. Wykorzystując takie preferowane używanie kodonów, możliwe jest skonstruowanie sekwencji kodującej białko, która może znacząco zwiększyć poziom wydajności transkrypcyjnej i translacyjnej genu ekwistatyny lub funkcjonalnych pochodnych tego genu w porównaniu z tym, którego można oczekiwać po bezpośrednim zastosowaniu sekwencji organizmu dawcy w formie niezmodyfikowanej. Dodatkowo, sekwencja kodująca może być później optymalizowana poprzez usuwanie potencjalnych sygnałów poliadenylacji, ukrytych miejsc składania genów i niestabilności mRNA, jak to wykazano w genach toksyny Bacillus thuringiensis.

Ogólnie, wbudowywanie heterologicznych genów wydaje się być przypadkowe przy zastosowaniu technik transformacji; jednak, istnieje obecnie technologia otrzymywania roślin ze specyficzną względem miejsca rekombinacją DNA do komórki roślinnej (patrz publikacja WO/9109957). Aktywność obcego genu, wprowadzonego do komórki rośliny zależy od cech ekspresji poszczególnie wprowadzonych genów, związanej z rejonami kontroli (promotorami, rejonami poliadenylacji, enhancerami, itp.) i od wpływu endogennego, roślinnego DNA przyległego do chimerycznej insercji i od liczby kopii.

Wybrany promotor powinien być zdolny do znaczącej ekspresji, której skutkiem jest wytwarzanie zwalczającej owady ilości białka. Odpowiednie promotory mogą stanowić promotory pochodzące od genu, który ulega naturalnej ekspresji w roślinie jak i syntetyczne sekwencje promotorowi, które mogą zawierać nadmiarowe lub heterologiczne sekwencje enhancera. Promotory, które są aktywne w komórkach roślinnych zawierają promotory syntazy nopaliny, syntazy oktopiny i syntazy mannopiny z plazmidów Agrobacterium tumefaciens powodujących guzy. Niniejszy wynalazek rozważa promotory konstytutywne związane ze zwiększeniem tolerancji na owadzie szkodniki przez transformowane rośliny. Przykładami konstytutywnych promotorów są promotory CaMv 19S i 35S (JP 63287485), promotory ubikwityny, promotor aktyny ryżu (WO/9109948).

U gatunków, które wytwarzają natywne białka zawierające co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I, które nie są wytwarzane lub rozprowadzane w tkankach, normalnie zakażanych przez owady, można zastosować specyficzny tkankowy promotor w celu otrzymania zlokalizowanej ekspresji lub nadprodukcji białka z co najmniej jedną powtórzoną domeną tyreoglobulinową typu I. Przykładem tkankowego specyficznego promotora są specyficzne promotory korzenia takie jak metalotioneina kukurydzy (EP 452269), specyficzny promotor korzenia (WO/9113992), promotor ciał magazynujących nasion roślin (WO/9113993) i promotor dehydrogenazy alkoholowej 1. Promotory znane jako zdolne do indukcji przez światło obejmują promotor genu kodującego małąpodjednostkę (ss) karboksylazy bisfosforanu-l,5,-rybuloz.y z soi i promotor genu kodującego białko wiążące chlorofil ażb w zieleniejących liściach (Coruzzi i inni, 1983, J. Biol. Chem., 258: 1399; i Dunsmuir i inni, 1983, J. Molecular and App. Gen., 2: 285; Nap i inni, 1993, Plant Molec. Biol., 23: 605-612).

Ostatecznie, promotor indukowalny przez zranienie lub patogen, może być zastosowany do ekspresji białek z co najmniej jedną powtórzoną domeną tyreoglobulinową typu I, gdy tkanka atakowana jest przez szkodniki roślin. Przykładami promotorów indukowalnych przez zranienie lub patogen są promotory inhibitora II proteinazy.

Wektory roślinne

Odpowiednie wektory do transformowania tkanek roślinnych opisano w piśmiennictwie i są tu zestawione (patrz deFrammond i inni, 1983, Biotechnology, 1: 262; An i inni, 1985, EMBO J., 4: 277; Potrykus i inni, 1985, Mol. Gen. Genet, 199: 183; Rothstein i inni, 1987, Gene, 53: 153; Wo 90/08829 i WO 84/02913; i w korzystnym przykładzie wykonania, pCABl, jak opisano w przykładach). Nie jest konieczne w praktyce, aby wektor posiadający możliwy do wyselekcjonowania gen markerowy zawierał również interesujący nas gen. Raczej można zastosować kotransformację takich wektorów do transformacji komórek roślinnych.

Procedura transformacji

Odpowiednia procedura wytworzenia dojrzałych transgenicznych roślin może być wybrana zgodnie ze stosowanym gatunkiem roślin. Regeneracja jest różna zależnie od gatunku rośliny. Skuteczna regeneracja zależeć będzie od środowiska, genotypu i historii kultury hodowlanej. Po uzyskaniu całych roślin, można je będzie reprodukować na drodze płciowej lub

189 808 przez klonowanie w ten sposób, że co najmniej jedna kopia sekwencji występować będzie w komórce rośliny potomnej. Taka procedura może być wybrana zależnie od stosowanego gatunku rośliny.

Hodowanie roślin transgenicznych

Dojrzałe rośliny, które rozwinęły się z transformowanych komórek roślinnych, mogą być krzyżowane same ze sobą aby wytworzyć osobniki wsobne. U roślin diploidalnych, typowo jeden rodzic ulega transformacji, a drugi pozostaje typu dzikiego. Rodzice będą skrzyżowani, aby uzyskać pierwsze pokolenie hybryd (Fi), które są krzyżowane same ze sobą, aby wytworzyć drugie pokolenie hybryd (F2). Hybrydy F2 z genetyczną strukturą białka zawierającego co najmniej jedną domenę tyreoglobulinową typu I są wybierane i krzyżowane same ze sobą, aby wytworzyć rośliny wsobne.

Konwencjonalne techniki hodowli roślin mogą zostać użyte do transferu genu strukturalnego ekwistatyny lub jego funkcjonalnej pochodnej poprzez krzyżowanie i krzyżowanie wsteczne. Metody te składają się z następujących etapów (a) krzyżowanie płciowe r^oślin odpornych na owady z roślinami podatnymi na owady; (b) odzyskiwanie materiału reprodukcyjnego z potomstwa krzyżówek (c) hodowanie roślin odpornych na owady z materiału reprodukcyjnego. Gdy jest to pożądane lub niezbędne, charakterystyka agronomiczna podatnych roślin będzie znacząco zabezpieczona przez rozszerzanie tej metody o następne powtarzalne etapy (d) krzyżowanie wsteczne potomstwa odpornego na owady z roślinami podatnymi na owady; i (e) wybranie dla ekspresji odporności na owady (lub stowarzyszonego genu markerowego) potomstwa z krzyżowania wstecznego, aż pożądana zawartość procentowa cech odmiany podatnej rośliny wystąpi u potomstwa, związana z przekazywaniem genu odporności. Następnie, potomstwo wsobne, zgodnie z wynalazkiem, będzie krzyżowane z inną linią wsobną, aby wytworzyć hybrydy.

Potencjatory

Niniejszy wynalazek rozważa stosowanie z białkiem zawierającym co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I, adjuwanty, chemiczne lub biologiczne dodatki w celu rozszerzenia spektrum szkodników docelowych, wydłużenia czasu efektywności białka zawierającego co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I lub w celu wspomożenia stabilizacji w przypadku wykorzystania w kompozycji dla rolnictwa, zawierającej białko z co najmniej jedną powtórzoną domenę tyreoglobulinową typu I.

Przykładowymi potencjatorami są lektyny, amfipatyczne białka lub komplementarne inhibitory proteaz. Na przykład, obecność innych białek obronnych może odgrywać ważną rolą w obronie roślin przeciw atakowi owadów. Znane jest, że owady Hemiptera i Coleoptera rozwinęły alternatywne sposoby trawienia białek z pokarmów zawierających wysoki poziom poszczególnych inhibitorów proteaz. Może być korzystne włączanie inhibitorów z rodzin takich jak Cystatyny, (Typ I do III i fitocystatyny), inhibitory typu Kunitz, inhibitory Virgiferyny, Virgiferin, inhibitory Bowman-Birk, inhibitory Barley Trypsyny, inhibitory Ziemniaka I i II, inhibitory Squash, inhibitory bifónkcjonalne Ragi 1-2/Maize, inhibitory karboksypeptydazy A i B i inhibitory proteazy asparaginianowej (patrz Ryan, 1990, Annu. Rev. Phytopathol, 28: 425-49).

Owady i nicienie

Niniejszy wynalazek rozważa zabezpieczenie każdej rośliny taksonu, wrażliwej na atak i uszkodzenie przez owady lub nicienie, posiadające trawienne proteazy cysteinowe i/lub asparaginianowe. Do takich owadzich szkodników należą w szczególności chrząszcze (Coleoptera) z rodzin Tenebrionidae, Curculionidae, Bruchidae i Chrysomelidae, wciornastki (Thysnnnntprn) i muchówki (Dintera) Do takich nasożvtnic7vch nicieni iależa Globodera nallida.

-----_Ύ ---------- ---_v --- - _z — - --------J- ✓ r' ---- ’ C - - J. '

Heterodera schachtii i Meloidogyne incognita. Szczególnie wyróżniono owady takie jak Leptinotarsa decemlineata, Frankliniella occidentalis, Diabrotica virgifera i Liriomyza trifolii, powszechnie nazywane stonką ziemniaczaną, wciornastkiem western flower thrips, western com rootworm i miniarką. Inne specyficzne owady to southem corn rootworm, Mexican been beetle, red flour beetle, coniused flour beetle, cowpea beetle, boli weevil, rice weevil, maize weevil, granary weevil, lesser grain borer, flea beetles, Egyptian alfalfa weevil, bean weevil, yellow mealworm, asparagus beetle, squash bug. Przez termin „takson” rozumie się jednostkę, w/g bota189 808 nicznej klasyfikacji rodzaj, lub niższe jednostki. Tak więc zalicza się doń rodzaj, gatunek, odmiany i inne mniejsze grupy taksonomiczne, którym brakuje konsekwentnego nazewnictwa.

Rośliny

Przykładowe rośliny obejmują ziemniaka, kukurydzę, pomidora, sorgo, bawełnę, soję, dry bean, rzepak, lucernę, szparaga, batata i chryzantemę. Jednak, zestaw roślin, jakie owady mogą zakażać nie jest ograniczony do przedstawionego zestawu. Tak więc, sposoby przedstawione w niniejszym wynalazku można łatwo zastosować do licznych gatunków roślin, podatnych na atak owadów lub nicieni, włączając w to bez ograniczeń gatunki z rodzaju Medicago, Trifolium, Vigna, Citrus, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Capsicum, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Helianthus, Bromus, Asparagus, Panicum, Pennisetum, Cucumis, Glycine, Lolium, Triticum i Zea.

Przykłady

Niniejszy wynalazek jest zilustrowany szczegółowo następującymi przykładami. Przykłady podano jedynie w celu ilustracji, i nie należy traktować ich jako ograniczające zakres niniejszego wynalazku. Wszystkie sekwencje DNA podane są w konwencjonalnym kierunku od końca 5' do 3'. Wszystkie sekwencje aminokwasów podane są konwencjonalnie od końca aminowego w kierunku końca karboksylowego. W niniejszych przykładach manipulacje z DNA przeprowadzano zgodnie ze standardowymi procedurami, chyba że podano inaczej. Patrz Sambrook i inni, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, opublikowane przez Cold Spring Harbor Laboratory (U.S.A.).

Przykład 1

Aktywność domeny 2-3 ekwistatyny w stosunku do proteaz asparaginianowych typu katepsyny D.

Ekwistatyna została wyizolowana z polipa morskiego A. eąuina przy zastosowaniu procedury, opisanej wcześniej i wykorzystującej jej aktywność hamującą skierowaną przeciw proteinazie cysteinowej, papainie (Lenarcie i inni, 1997, J. Biol. Chem., 272: 13899). Poza proteinazami cysternowymi, ekwistatyna była oceniana ze względu na inhibicję dwóch innych klas proteinaz, proteinaz asparaginianowych (katepsyna D) i proteinaz serynowych (trypsyną). Inhibicyjny efekt ekwistatyny obserwowano tylko wówczas, gdy reagowała z katepsyną D. Uzyskana inhibicja była niespodziewana, gdyż ekwistatyna jest znana jako silny inhibitor proteinaz cysternowych typu papainy. W dodatku doniesiono, że fragment p41 nie wywiera żadnego wpływu hamującego na katepsynę D (Bevec i inni, 1996, J. Exp. Med., 183: 1331-1338). Aby upewnić się, że ekwistatyna nie stanowi substratu dla katepsyny D, obie substancje były inkubowane w różnych stężeniach molamych przez różny czas, a mieszaniny zbadano w systemie HPLC w odwróconej fazie (fig. 9A). Nie obserwowano degradacji produktów katepsyny D. Przeciwnie, stwierdzono, że ekwistatyna stanowi dobry substrat dla trypsyny i fakt ten wykorzystano do oddzielenia domen tyreoglobułiny typu I przez ograniczoną proteolizę β-trypsyną. 500 pg ekwistatyny inkubowano z 5 pg β-trypsyny w 0,5 ml 0,1 M buforu Tris/HĆl o pH 8,0, przez 40 minut w 37°C. Reakcję zatrzymano przez dodanie kwasu trójfluorooctowego. β-trypsyna, która strawiła ekwistatynę została oddzielona przez wysokociśnieniową chromatografię cieczową (Milton Roy Co.) przy zastosowaniu kolumny o odwróconej fazie Vydac CIS, zrównoważonej 5% acetonitrylem, zawierającym 0,1% (obj./obj.) kwas trójfluoroctowy. Eluację przeprowadzono przy pomocy liniowego gradientu 80% (obj./obj.) acetonitrylu, zawierającego 0,1% (obj./obj.) kwas trójfluorooctowy. Absorbancję mierzono przy 215 nm. Przy metodzie HPLC z odwróconą fazą otrzymano dwa główne szczyty (fig. 9B). Ciężary cząsteczkowe, oszacowane za pomocą SDS PAGE w nie redukujących warunkach wvnnsiłv około 7000 i 14000 ifie. 10Y Wyznaczenie N-końców obu fragmentów Dozwoliło na ich lokalizację w sekwencji cząstki ekwistatyny, co pokazano schematycznie na fig. 11. C-końce fragmentów nie zidentyfikowano bezpośrednio, lecz ich rozmiary, jak wskazano przy pomocy SDS PAGE, zgadzały się z obecnością pojedynczych i podwójnych domen. Mniejsze fragmenty zaczynały się od N-końca ekwistatyny i w związku z tym odpowiadają pierwszej domenie (eq d-1). Większy fragment ujawnił dwie sekwencje, zaczynające się od Ala68 i Vall52. Wiązanie Lys67-Ala68 zlokalizowane jest na początku drugiej domeny, podczas gdy przecięcie wiązania Argl 51-Val 152 nie było skutkiem ograniczonej proteolizy (fig. 11). Do20

189 808 niesiono, że izolowana ekwistatyna jest silnie nacinana między Argl 51 a Vall52, łańcuchy są połączone wiązaniem dwusia^^żkowym i rozchodzą się dopiero po redukcji (Lenarcie i inni, 1997, J. Biol. Chem., 272: 13899-13903). Wąski podwójny pasek, widoczny na SDS PAGE, jest prawdopodobnie rezultatem fragmentacji blisko C- końca, co znaczy, że ten fragment odpowiada kombinacji drugiej i trzeciej domeny, eq d-2,3. Zgodnie z ustaleniami sekwencji, trzy sekwencyjnie homologiczne części ekwistatyny mają trzy potencjalne miejsca wiązania proteinaz. W poprzedniej pracy wykazano, że wiązanie stechiometryczne ekwistatyny i papainy, jako przedstawiciela proteinaz cysternowych, wynosi 1:1 (Lenarcic i inni, 1997, J. Biol. Chem., 272: 13899). Gdy proteinaza asparaginianowa, katepsyna D, była miareczkowana ekwistatyną, oszacowano, że ponownie 1 mol ekwistatyny był potrzebny do wysycenia 1 mola katepsyny D (fig. 12). Wartość ta była niezależna w szerokim zakresie stężeń. W celu zbadania inhibicyjnej aktywności poszczególnych domen ekwistatyny, przeprowadzono dokładną analizę kinetyki inaktywacji papainy i katepsyny D. Cała kinetyka i stałe równowagi podane są w tabeli 2. Pierwsza domena, eq d-1, posiadała praktycznie tę samą charakterystykę inhibicyjną przeciw papainie jak nietknięta ekwistatyna, fragment p41 lub ECI. Inhibitory te o domenie tyreoglobulinowej typu I rozważane sąjako kompetytywne, odwracalne i ściśle wiążące inhibitory proteinaz cysternowych, takich jak papaina, katepsyny D i L i cruzipain. Dwudomenowy inhibitor, eq d-2,3, nie wykazał praktycznie żadnej inhibicji papainy.

Kinetyka wiązania ekwistatyny do katepsyny D została określona przy użyciu syntetycznego substratu, który zawiera chromofor, taki jak reszta nitrofenyloalaniny, w pozycji P1'. Czułość testu, przeprowadzonego przy zastosowaniu H-Pro-Thr-Glu-Phe*Nph-Arg-Leu-OH jako substratu, pozwoliła na użycie stężenia enzymu 6.4 nM, jako minimalnego stężenia w teście. Otrzymana stała równowagi dysocjacji dla interakcji między katepsyną D i ekwistatyną (Ki=0,3 nM) wskazuje, że ekwistatyna jest wyjątkowo dobrym inhibitorem proteinazy asparaginianowej, katepsyny D. Dla aktywnego fragmentu papainy, eq d-1, wyznaczono Ki=1 mM, w przybliżeniu. Wartość ta jest kilkanaście rzędów wielkości wyższa niż wartość Ki dla nienaruszonej ekwistatyny wskazując, że miejsce aktywności inhibicyjnej ekwistatyny musi znajdować się w innych domenach. Inhibitor eq d-2,3 wykazał praktycznie tę samą charakterystykę inhibicji jak cała ekwistatyna (Ki>0,6 nM). Dodatkowo, sformowanie ścisłego kompleksu przez katepsynę D i ekwistatynę zostało również uwidocznione poprzez natywnąPAGE (fig. 10B).

Ekwistatyna jest pierwszym białkowym inhibitorem katepsyny D o znanej strukturze pierwszorzędowej i o zwierzęcym pochodzeniu. Dotychczas tylko pochodne pepstatyny były znanymi inhibitorami katepsyny D, równie silnymi jak okazała się ekwistatyna.

Dane otrzymane w niniejszych badaniach jasno pokazują, że różne domeny tyreoglobulinowe typu I obecne w ekwistatynie, pomimo dużego podobieństwa sekwencji aminokwasów, działają na odmienne klasy proteinaz, albo cysternowych albo proteinazę asparaginianową katepsynę D.

Tabela 2. Stałe kinetyki interakcji ekwistatyny, eq d-1 i eq d-2,3 z papainąi katepsyną D

Enzym	Inhibitor	10- x ka M4s-1	104x kd s-1	Ki nM
papaina-	ekwistatyna	12 ± 0,6	65 ± 1,5	0,57 ± 0,04
	eq d-1	1,8 ±0,35	11 ± 0,3	0,61 ±0,01
	eq d-2,3	NDd	ND	>1000'
katepsyna Db	ekwistatyna	ND	ND	0,3 ±0,16
	eq d-1	ND	ND	>1000'
	4 2 3	ND	ND	η λ + n i s
	V<J

“ Test stałego tempa został użyty do analizy kinetyki interakcji papainy z inhibitorami. K obliczano na podstawie stosunku k,dk_a.

^b Dane wyznaczono na podstawie efektu inhibicyjnego inhibitora na stan stacjonarny, prędkość hydrolizy chromoforowego substratu katalizowanej przez katepsynę D.

^dNie wyznaczono ' Ani eq d-2,3 nie wykazało istotnego wpływu na papainę ani eq d-1 na katepsynę D nawet przy 5 mM; tak więc oszacowano, że stała inhibicji jest większa niż 1 mM.

189 808

Przykład 2

Molekularne klonowanie ekwistatyny

Z jednego osobnika polipa morskiego Actinia equina L. izolowano całkowite RNA poprzez rozerwanie tkanki w płynnym azocie. Dwa gramy zmielonej, głęboko zmrożonej tkanki przeniesiono do 20 ml roztworu tiocyjanianu guanidyny (5,5 M GtC, 0,5 M EDTA, 0,2 M β-merkapto-etanolu) i homogenizowano w elektrycznym mieszadle (16000 obEmin, 4 x 30 sek.). Następnie roztwór był wirowany w 6000 X g, 20 min., w 15°C. 10 ml klarownego supematantu przeniesiono do 10 ml roztworu cezu tFa (p = 1,5 mg/ml), uzupełniono 2,5 ml 0.5 M EDTA, o pH 8,0. Próbkę wirowano przez 24 godz. w 125000 x g, w 15°C. Supernatant usunięto i całkowite RNA (osad) rozpuszczono w 1 ml roztworu proteinazy K (0,5 mg/ml). Po inkubacji roztworu w 50°C, przez 1/2 godz., całkowite RNA strącono 1/10 objętości 3 M KOAc, pH 5,2 i 2,5 objętościami 96% etanolu, po czym mieszaninę umieszczono na całą noc w -20°C. Całkowite RNA było osadzane przy 8000 x g i osad rozpuszczono w 2 ml buforu TE. 1 ml rozpuszczonej próbki grzano w 65°C przez 5 min., chłodzono na lodzie i następnie dodano 0,2 ml buforu TE uzupełnionego 3 M NaCl. Cała próbka została umieszczona na wierzchu podłoża oligo (dT)-celulozowego w kolumnie. Celulozę przemyto trzy razy buforem ET, uzupełnionym odpowiednio 0,5 M NaCl i 0,1 M NaCl. Poli (A) + RNA było eluowane 1 ml bufora TE (podzielonym na 4 porcje 0,25 ml), podgrzanym do 65°C. Jedna trzecia próbki (ok. 1 μ g) użyto do syntezy cDNA, zgodnie z procedurą producenta (Amersham). Pierwszą nić w syntezie cDNA otrzymano stosując 11 pl roztworu mRNA, 4 pl 5 X buforu reakcyjnego, 1 p roztworu Na-pirofosforanu, 1 pl inhibitora rybonukleazy z ludzkiego łożyska (5U/pi), 2 μl zmieszanego roztworu dNTP i roztworu oligo dT primera (1 pl). Po dodaniu 2 pl (10 U/pl) odwrotnej transkryptazy, mieszaninę inkubowano w 42°C przez 40 minut. Drugą nić DNA zsyntetyzowano przez dodanie następujących składników: 37,5 pl buforu reakcyjnego drugiej nici, 7 p1 polimerazy I DNA E. coli (4U/pl) i 1 p iybenukleazy Η E. co li (lU/pl). Mieszanina reakcyjna była inkubowana kolejno w 12°C przez 60 minut i w 22°C przez 60 minut. Po denatu-racji cieplnej (5 minut w 70°C), dodano 0,5 pl polimerazy T4 DNA (2U/pl) i mieszanina reakcyjna była inkubowana w 37°C przez 10 minut. 2,5 pi (250 pmoli) EcoRIadaptorów ligowano z 1 pg cDNA, przy użyciu 2 pil Hgazy T4 DAA (4U/p 1) w 20 pl mieazaniny ligacyjnej. Po 8 godz. w 16°C, mieszaninę ligacyjną poddano w kolumnie oczyszczaniu i frakcjonowaniu według wielkości cDNA związanego z adaptorem, stosując kolumny wirowane i bufor TE. Zebrane frakcje oczyszczonego cDDA fosforylowano kinazą polinukleotydową T4 (8U/pl) i cDDA był ligowany z defoslOrylowanymi ramionami bakteriofaga Ugtl1 przy zastosowaniu ligazy T4 DDA (40U/pg DDA). Ostatecznie, cała mieszanina ligacyjna została upakowana in vitro przy użyciu ekstraktu tej samej firmy (Amersham). Porcję biblioteki cDDA Ugt11 (10⁵ piu) użyto do zainfekowania komórek Y1090 E. coli i mieszaninę umieszczono na płytkach agaru LB. Łysinki zostały naniesione na membrany nitrocelulozowa. Membrany płukano w soli buforowanej Tris z 0,01% Tween-20 (TBST) 3 razy i następnie w roztworze blokującym (20% obj./obj. surowicy płodowej w TBST). Po przemyciu membran TBST, dodano pierwsze przeciwciało (królicze anty IgG ekwistatyny) w TBST i membrany pozostawiono w roztworze przez noc w 4°C. Po tym, membrany przemyto trzy razy TBST i poddano działaniu drugiego przeciwciała (kozie anty królicze IgG-z peroksydazą chrzanową). Po ostatecznym przepłukaniu w TBST, przeprowadzono reakcję barwią z diaminobenzydyną, jako substratem. Trzy pozytywne klony izolowano z płytek agarowych i po ponownym umieszczeniu na płytkach, fagi eluowano z powierzchni płytek agarowych za pomocą buforu TE (5 ml na płytkę). Fagowe DDA izolowano przy użyciu zestawu izolacyjnego Wizard Lambda Preps DNa (Promega) zgodnie z procedurą producenta. Po analizie restrykcyjnej przy użyciu 2 pi enzymu rcr>uyegCEjncgu ncum piuu/pij f □ jo owm i iiarwjunuwainu według wielkości na 1% żelu agarozowym, wstawki DNA wycinano, oczyszczano na mleczku szklanym i subklonowano do miejsca klonowania EcoRI plazmidu pUC19. Całą mieszaninę ligacyjną (10 μl każdej próbki) przeniesiono do komórek DH5a E. coli poprzez inkubowanie 100 pl wysoce kompetentnych komórek (O.D.550-0,6) i 10 pi mieszaniny ligacyjnej w łaźni wodnej (42°C) przez 45 sekund. Po dodaniu podłoża LB (900 )1) i po lgodz. inkubacji (37°C, 250 obr/min), mieszanina bakteryjna została umieszczona na płytkach LBA, uzupełniona przez λ-gal i iPtG i po inkubacji przez noc (37°C), niewybarwione kolonie przeniesio22

189 808 no do 5 ml podłoża LB i inkubowano przez dodatkowe 16 godzin (37°C, 250 obr/min). Plazmidy izolowano przy pomocy Wizard Plasmid Purification System (Promega) zgodnie z instrukcją producenta i analizowano za pomocą sekwencjonowania nukleotydów przy zastosowaniu polimerazy DNA T7 (zestaw sekwencj onowania T7, Pharmacia) i [³⁵S]dATPaS (Amersham). W wyniku sekwencjonowania wyselekcjonowanych klonów cDNA otrzymano pełnej długości klon cDNA przedstawiony na fig. 1.

Przykład 3

Ekspresja zrekombinowanego cDNA ekwistatyny w Escherichia coli

Zastosowano dwa primery do amplifikacji dojrzałego białka ekwistatyny i do sklonowania go jako fragmentu Ncol-Notl za peptydem sygnałowym g3 obecnym w wektorze ekspresji pB3 E. coli. Primer I to PDEI-1: CGC GCC ATG GCG AGT CTA ACC AAA TGC CAA i primer 2 to PDEI-2: GGG TGC GGC CGC GCA TGT GGG GCG TTT AAA. Prawidłowe insercje sekwencj onowano w celu sprawdzenia błędów sekwencji i wybrano jeden klon w celu uzyskania białka zrekombinowanego.

Zrekombinowaną ekwistatynę otrzymano przez hodowlę pojedynczej kolonii E. coli szczepu HB2151 z plazmidem pB3, przenoszącym cDNA ekwistatyny, przez noc w 5 ml podłoża Lb z ampicyliną (100 mg/l, stężenie ostateczne) w 37°C, 250 obr/min. Po nocy, 5 ml takiej kultury zastosowano do zaszczepienia 800 ml środowiska LB z ampicyliną (100 mg/l, stężenie ostateczne) w 2 l kolbie. Komórki rozwijały się przy wstrząsaniu (30°C przy 250 obr/min.) do O.D.600=0,5. Po tym roztwór wyjściowy IPTG dodano do uzyskania ostatecznego stężenia 1mM i wzrost komórek był kontynuowany w tych samych warunkach jak wyżej przez dodatkowe 6 godz. Komórki następnie umieszczono na lodzie przez 1 godz., osadzano w 4000 X g przez 10 min. w 4°C i ponownie zawieszano w 50 ml oziębionego na lodzie 10 mM MgSO4. Zawiesina została umieszczona w -20°C, aż płyn był całkowicie zamrożony i następnie zawartość była rozmrażana poprzez umieszczenie flaszki w łaźni wodnej (30°C). Tuż po ponownym rozmrożeniu, komórki usuwano przez wirowanie przy 6000 X g przez 10 min. w 4°C i Supernatant przechowywano w -20°C do dalszego oczyszczania na zasadzie powinowactwa na podłożu sefarozy z papainą.

Przykład 4

Oczyszczanie i charakterystyka zrekombinowanej ekwistatyny

A. Oczyszczanie na zasadzie powinowactwa przy użyciu podłoża sefarozy z papainą:

ml zawiesiny papainowo-sefarozowej mieszano z 15 ml 0,02 M. NaOH przez 10 min. Następnie, zawiesinę umieszczono na 15 ml kolumnie ze stopionym szkłem. Kolumna była przemywana 3 x 30 ml 100 mM buforu Tris, pH=7,0 i ostatecznie, 10 ml 50 mM buforu MES, pH=6,5 (z dodaniem cysteiny do ostatecznego stężenia 0,6 mg/ml). Supernatant z 1 ml kultury bakteryjnej, uzyskany jak opisano wyżej (przykład 3) nakropiono na kolumnę. Sefaroza z papainą była następnie przemywana 20 ml 50 mM buforu MES, pH=6,5 (bez cysteiny) i 50 ml 20 mM buforu Tris, pH=7,5. Próbka została odzyskana przez eluację kolumny 20 ml 20 mM buforu Tris, pH=10,3 (bez wyrównywania pH przy pomocy HCl), z 20% DMSO. Oczyszczona ekwistatyna była dializowana poprzez H2O i zagęszczana przy pomocy minikoncentratora Sartricon w celu otrzymania ostatecznego stężenia 350 pM.

B. Stechiometria i stałe inhibicji zrekombinowanej ekwistatyny

N_a płytce do mikromiar^iczkowania 20 pl roztworu papainy (świeży roztwór 1 mg/ml, Sigma, w buforze MES miareczkowany przy użyciu E-64 w celu wyznaczenia fraJkcji aktywnej, zazwyczaj 17%) pS łączono z 0-80 pl znanego stężenia b iałka. Bufor MES (50 mM MES, pH 6,5; 0,6 mg/ml L-cystemy; 1 mg/ml frakcji V BSA) dodano do ostuteczneE objętości 150 pl. Mi_eszanina była inkubowana przez 30 min. w temperaturze pokojowej i nastanie 50 pl roztwonr _sub_str_atu (60 pl z 15 mg/ml Z-Plie-Arg-pNA roapuzzezonego w metanolu zostało rozci_eń_czone _w 940 pl b_ufo_r·u MES przed użyciem). Płytkę natychmiast um^leszczono wczytniku płytek do z-inromierczfkowania i zmierzono przy 405 nm. Odczyty do OD^zOO ^o,3 były limo we. Ternpo zmian poniżyło do wyznaczenia aktywności przy wzrastających ilościach inhibitora. W^zlOini przod)tαwiono graficznie i w atechiometryczooch ztężeniach wyznaczono ilość _Zdo_Socj₀wanego kompleksu w celu określenia stałej równowagi dysycjacji (Ki). Na podstawie _ot_nzy_na^ygch wooinów stwierdzono, że jedna cząstka ekwi^oytooo może hamować w pnz^ydsiżeniu

189 808 cząstkę papainy. Stwierdzono, że stała równowagi dysocjacji dla papainy wynosi 0,6 nM, co zgadza się z danymi opublikowanymi dla oczyszczonych białek (Lenarcie i inni, 1997, J. Biol.

Chem., 272: 13899-13903).

Przykład 5

Inhibicja in vitro aktywności proteazy jelitowej stonki ziemniaczanej, Colorado potato beetle

Jelita ostatniego stadium larwalnego stonki ziemniaczanej hodowanego na roślinach indukowanych jasmonianem metylowym zostały izolowane i wyekstrahowane jak to zostało opisane (Bolter i Jongsma, J. Insect Physiol., 41: 1071-1078). W tych ekstraktach jelit proteazy, które są wrażliwe na inhibitory proteaz ziemniaka są już w kompleksach. Szczątkowa aktywność proteaz utworzona jest z aktywności proteaz niewrażliwych na inhibitory proteaz ziemniaka, które są pobudzane do odpowiedzi na inhibitory ziemniaka pobudzane jasmonianem metylu. Są to proteazy, które czynią larwy stonki niewrażliwymi na obronę upraw ziemniaka za pomocą inhibitorów proteaz. Testowano szeroki zakres różnych inhibitorów proteaz cysternowych na aktywność specyficznie skierowaną przeciw tym indukowanym proteazom cysternowym, niewrażliwym na inhibitory proteaz ziemniaka. Prawie wszystkie inhibitory zostały oczyszczone w Instytuccie Józefa Stefana na Słowenii. Przetestowano ich potencjał skierowany przeciwko stonce ziemniaczanej używając zarówno substratów białkowych (azokazeiny, tabela 2) jak i specyficznych syntetycznych substratów (L-Arg-pNA, tabela 3; pGluPhe-Leu-pNA, tabela 4; Z-Phe-Arg-pNA, tabela 5; Z-Arg-Arg-pNA, tabela 6). W specyficznych przypadkach inhibitory były testowane w dwóch stężeniach, równomolowym i z nadmiarem w stosunku do proteaz, w celu uzyskania wskazania ścisłości kompleksu. Większość testowanych inhibitorów była albo nieaktywna lub tylko o słabej aktywności inhibicyjnej. Tylko inhibitory proteaz cysteinowych z powtórzoną domeną tyreoglobulinową typu I, które były testowane (oczyszczony fragment stałego łańcucha p41 i oczyszczona ekwistatyna) były niezmiennie aktywne przeciw testowanym larwom stonki ziemniaczanej (tabele 2-6; fig. 4). Ważne, że ta klasa inhibitorów miała zdolność inhibicji prawie całej aktywności proteaz cysteinowych. Cząstka peptydu ekwistatyny i jej funkcjonalne pochodne nie były bardzo aktywne przeciw podobnej do aminopeptydazowej aktywności proteaz cysteinowych. Zrekombinowany ludzki stefin A był bardzo aktywny przeciw temu typowi aktywności. Najlepsza kombinacja inhibitorów dla uzyskania pełnej toksyczności przeciw stonce ziemniaczanej powinna być kombinacją ekwistatyny lub fragmentu stałego łańcucha p41 i inhibitorów podobnych do stefin.

Tabela 3. Wpływ różnych inhibitorów proteazy cysteinowej na ogólną aktywność proteolityczną ekstraktów jelita larw stonki ziemniaczanej mierzone dla azokazeiny

Rodzina inhibitorów proteaz cysteinowych	Nazwa	Szczątkowa aktywność w nadmiarze inhibitora
1	2	3
Typ I cystatyn	ludzka stefin a	90%
	szczurza stefin a	90%
	świńska stefin B	100%
	świńska stefin Dl	105%
	świńska stefin D2	105%
T.I TT ijrjj ai	/MłrtnHma Ιζιιΐ'Λσο/ΊΟ vjs>iuiyuu nut VŁ.ęvtu	105%
	ludzka cystatyna C	105%
Typ III cystatyn	kininogen wołu	110%
	ludzki LMW kininogen	65%
	ludzki kininogen 3-ciej domeny	20%

189 808

c.d. tabeli 3

1	2	3
Fitocystatyny	cystatyna Chelidonium majus	100%
cystatyna cowpea	75%
cystatyna lens	60%
cystatyna soji	65%
multicystatyna ziemniaka	90%
inhibitor bromelain	110%
Domena tyreoglobulinową typu I	fragment stałego łańcucha p41	10%
ekwistatyna	10%
Roślinne Kunitz CPI	PCPI 6,6	120%

Tabela 4. Wpływ różnych inhibitorów proteazy cysteinowej na aktywność amino-peptydazy mierzonej dla L-Arg-pNA

	% aktywności szczątkowej
nadmiar inhibitora	równomolamie
ekwistatyna i fragment stałego łańcucha p41	75%	85%
ludzka stefin A	10%	60%
kininogeny	75%	n.d.
fitostatyny z Fabaceae	75%	n.d.

Tabela 5. Wpływ różnych inhibitorów proteazy cysteinowej na aktywność specyficznej trój-peptydyl-peptydazy i endoproteazy mierzonej dla pGlu-Phe-Leu-pNA

	% aktywności szczątkowej
nadmiar inhibitora	równomolarnie
ekwistatyna i fragment stałego łańcucha p41	-5%	10%
ludzka stefin A	90%	95%
kininogeny	20%	n.d.
fitostatyny z Fabaceae	70%	n.d.

Tabela 6. Wpływ różnych inhibitorów proteazy cysteinowej na szerokie spektrum aktywności endoproteaz mierzonej dla Z-Phe-Arg-pNA

	% aktywności szczątkowej
nadmiar inhibitora	równomolarnie
ekwistatyna i fragment stałego łańcucha p41	20%	30%
ludzka stefin A	80%	95%
kininogeny	-20%	n.d.
fitostatyny z Fabaceae	50%	n.d.

189 80S

Tabela 7. Wpływ różnych inhibitorów proteazy cysteinowej na wąskie spektrum aktywności endoproteaz mierzonej dla Z-Arg-Arg-pNA

	% aktywności szczątkowej
nadmiar inhibitora	równomolarnie
ekwistatyna i fragment stałego łańcucha p41	-5%	20%
ludzka stefin A	90%	n.d.
kininogeny	10%	n.d.

Przykład 6 inhibicja in vitro aktywności proteaz dorosłych osobników' wciornastków western flower thrips, i miniarek leafniner flizs, i ostatnie stadium larwalne stonki ziemniaczanej (Colorado potato beetle) i western corn rootworm mierzona hemoglobiną znakowaną FITC.

Dorosłe osobniki wciornastka western flower thrips (Frankliniella occidentalis) i dorosłe osobniki miniarki leafniner flies (Liriomyza trifolii) zostały zebrane z kultur obecnych na uprawach chryzantem i całe wciornastki i muszki były homogenizowane w buforze ekstrakcyjnym (200 mM β-alaniny-HCl, pH 3,5) w objętości równej pięciokrotnej wadze owadów. Wartość pH buforu ustalono wcześniej na optymalnym poziomie dla aktywności proteazy przeciw hemoglobinie. Ostatnie stadium larwalne stonki ziemniaczanej obecne na uprawach ziemniaka, jak to opisano w przykładzie 5, zostało sprawdzone pod względem aktywności jelitowej proteazy asparaginianowej przez przygotowanie ekstraktu z całych jelit w buforze pH 3, który jest optymalny dla proteaz asparaginianowych stonki ziemniaczanej (200 mM glicyny, pH 3). Jelita były homogenizowane w 100 μΐ butesu najelito. Oobbnioomtrzccieoo stadium larw western com rootworm obecnemu na korzeniach kukurydzy usunięto jelita. Następnie jelita homogenizowano w 100 pl wody i odwirowano dwukrotnie w celu usunięcia materiału nierozpuszczalnego. W teście enzymatycznym użyto dwa typy buforów. Jeden o pH przypuszczalnie fawOryzującym proteazy cysteinowe (50 mM MES, pH 6,5; 0,6 mg/ml L-cysteiny) i drugi do wykrycia proteaz asparagmianowych (200 mM glicyny, pH 3). Supematanty przechowywano w -20°C.

μΐ eksfrakiz jelitowego f^oe^c^zoi^cł c2|^l żnhibitora (2 mM p emsUtyny’ ta metanolu, 4 mM E64 w wodzie, 2 mg/ml zrekombin.owonzj ekwislatyny w woOzic. Styżema innych iin łiibitorów biołkoioych nie były dokłado¹z znane). Odⁿon²ednie bufory dodano do ostatecznej obyętości 100 pl. Po 15 minutach yreίnkubacJi dodano ^f0 pl substratu ( 5 mg/ml hemoglobinyFITC) i inkubowano yeozb 30-45 min. w 37°C. Reakcję znteoywnbo poo-z dodanie 100 yl 10% TCA. Probdjwki były wirowane ⁱ 100 pl °up zenatantb zmieszane^oo z 100 pl W N NaOH było ο^οπζ na fluo^bsmeteze na zakres hydeo^y hemoglobiny; WWtonano podwójne pomiary na jednym (wciornastki, winiaek¹ i weltzm com. eootwoπob lub tszoch (stotóra na) ekstraktach, różnych jelit i rói/mły się onz mnksymallmz o ± 5%o.

Efekty dzialżbiśi htónych intabiiorów .rotnzs c^tainotnych i asparaginianowych podano _w tabeli 9. Przedstawia ona skutki działania z^aznych mhibhorów partane (P^fs) prz^w¹⁰ „protaawm niewrażhwym na PI” dordsłych wc^-omastZów, i miniarek lza^jminer flizs na c-hry⁰ zantemi,, stonk⁾ zierom2czbbza na ziembi2Zu i com rootworm na kukmydzy, p0ni_ew2ż i_nd_U k0w^zi^jZ Pi _obzcne w materiale rodinm/w i połkmętz przez owady budą ₀b_{ncne w} .Z^mZtach w Z_OmpleZsio z podatwyoci protzaznwi.

.Aktywność yrolbaz wy^tomnf^aZów wożz być w 92% zahawow_nba praż E_-64 (PI cy_st_zinnAAA/rłt.i w Ι^Λ-ο-ζοζ π^οίη^ε woazaominnowooh’^l w oEi 3.^b- co izzⁿ ootwmalne d^ja — ~ · · J _i % p-----p,!------i PI. ₂-l - ll i 3 i _p y 2 i a < , ₀gól_nej _aZtywności protznz wcioninstZów. Podobniz, proteazy ιηφη-^-ι^ηον^ _{me s}ą d_0minUjąc^e U tych 0wadów. Staze łańcuch p41 powoiZje 870ó, pndczns .dy zkMstatyr⁰ 95% ibń bicję Jsywności yeółeaz. Jasne jest, żz zarówno rtały łońcuch p41 (cystzmown Pl) jaZ i _eZ_wi st₂ty^rb2 (^tai^wy/aspjeagimjnowy PI) są dobrymi iuhibitorami protea^e cystemowech w.mmi^tZów, drocinż ekwistatyna może być teoo^0- lup szn w zwijzku z dodatkową inhiOj protznz asyaragmⁱanowych.

189 808

Proteazy miniarek mogą być w pełni hamowane tylko przez kombinację E64 (cysternowy PI) i pepstatyny (asparaginianowy PI) (97%). Cystatyna ziemniaka i Kunitz PCPI8.3 są inhibitorami proteaz cysternowych, zdolnymi do inhibicji w 63% porównywalną do 73% przez E64. Dodanie ekwistatyny do tych dwóch inhibitorów powoduje 92% inhibicję, co pokazuje, że ekwistatyna musi posiadać aktywność inhibitora proteazy asparaginianowej miniarek prócz aktywności inhibitora proteazy cysteinowej. Dla optymalnej kontroli miniarek niezbędne jest zastosowanie kombinacji ekwistatyny z cystatyną ziemniaka i Kunitz PCP18.3.

Proteazy stonki ziemniaczanej mogą być w pełni zahamowane w pH 3 (97%) tylko w kombinacji z E64 (24%) i pepstatyny (82%). Dodanie ekwistatyny do E64 lub pepstatyny zwiększa inhibicję o 42% (24% + 42% = 66%) i 12% (82% +12% = 94%), pokazując odpowiednio, że ekwistatyna hamuje więcej niż 50% aktywności proteaz asparaginianowych i cysteinowych przy tym pH, a sama ekwistatyna hamuje 62% całkowitej aktywności proteaz w tym pH. Podobnie, częściowa inhibicja przy pH 3 połączona z prawie całkowitą inhibicją przy pH 6,5 (przykład 5) jest istotna dla pełnego zwalczania tych owadów (przykład 7).

Western com rootworm jest znany z posiadania kompletu proteaz cysternowych i asparaginianowych (Gillikin i inni, 1992, Arch. Insect Biochem. Physiol., 19: 285-298). Skutki działania ekwistatyny, E64 i pepstatyny były testowane przy dwóch różnych wartościach pH. Uzyskane dane, przedstawione w tabeli 9 pokazują, że ekwistatyna prawie całkowicie hamuje całą aktywność proteaz cysternowych i asparaginianowych (93% w pH 6,5 i 98% w pH 3) i jest nawet silniejsza niż kombinacja E64 i pepstatyny (odpowiednio 79% i 89%). Te wyniki uzyskane in vitro są nawet lepsze niż wyniki in vitro dla stonki ziemniaczanej w przykładach 5 i 6 i wskazują, że ekwistatyna może być uważana za toksyczną dla western com rootworm, gdy ulega ekspresji w korzeniach kukurydzy.

Tabela 8. Test inhibicji in vitro mierzący szczątkową aktywność proteaz w ekstraktach różnych owadów.

ihibitory	wciornastki pH 3.5	miniarki pH 3.5	stonka ziemniaczana pH 3	western com rootworm pH 6.5	western com rootworm pH 3
Zwalczanie	100%	100%	100%	100%	100%
E64	8%	27%	76%	51%	35%
E64/ekwistatyna (El)	n.d.	n.d.	34%	29%	8%
Pepstatyna	84%	46%	18%	58%	45%
Pepstatyna/EI	n.d.	n.d.	6%	6%	0%
E64/Pepstatyna	n.d.	3%	3%	21%	11%
El	5%	24%	38%	7%	2%
stały łańcuch p41	13%	43%	n.d.	n.d.	n.d.
p.cystatyna	n.d.	73%	n.d.	n.d.	n.d.
PCPI8.3	n.d.	43%	n.d.	n.d.	n.d.
API	n.d.	37%	n.d.	n.d.	n.d.
p.cystatyna/PCPI8.3	n.d.	8%	n.d.	n.d.	n.d.
p.cystatyna/PCPI8.3/API	n.d.	7%	n.d.	n.d.	n.d.
p.cystatyna/PCPI8.3/EI	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
cystatyna fasoli	14%	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.

- Zrekombinowany Kunitz PCPI8.3 (Stiekema i inni, 1987, Plant Molec. Biol., 11: 255-269) został utworzony w drożdżach Pichia pastoris oczyszczony z supematantu kultury przez chromatografię jonowymienną z wymieniaczem kationowym,

- Zre-kombinowana cystatyna ziemniaka (p. cystatyna) reprezentowana jest przez monomer multistatyny sklonowany przez RT-PCR z cv ziemniaka. Uległy ekspresji i oczyszczeniu jako białko fuzyjne z transferazą S-glutationową (Pharmacia),

189 808

- Ekwistatyna została również oczyszczona z polipa morskiego (Lenarcie i inni, 1997, J. Biol. Chem., 272: 13899; Lenarcie i inni, J. Biol. Chem., 273: 12682. (testy na wciornastkach i miniarkach) lub z rekombinanta E. coli (testy na stonce ziemniaczanej i Western com rootworm),

- Inhibitor proteazy asparaginianowej (API) został oczyszczony z ziemniaka (Kreft i inni, 1997, Phytochemistry, 44: 1001-1006).

Przykład 7

Toksyczność ekwistatyny skierowana przeciw larwom stonki ziemniaczanej

Bulwy ziemniaka odmiany Surprise (Solarium tuberosum) zostały skiełkowane. Skiełkowane bulwy posadzono w 1 l donicach i wzrastały one przez 3-4 tygodnie w 22/18°C, w rytmie dnia i nocy 16/8 godz. Rośliny o wysokości 10 - 15 cm umieszczano w szklanych słojach razem z papierowym tamponem, na który nakropiono pipetą 2 p1 jasmonianu metylu. Słoiki zostały natychmiast uszczelnione parafilmem i umieszczone w komorze klimatycznej w 30°C o stałym świetle. Rośliny kontrolne umieszczono w komorze w 25°C w rytmie dnia i nocy 16-8 godz. Po jednym dniu w 30°C rośliny zostały wyjęte ze słoików i umieszczone w tej samej komorze co rośliny kontrolne. Rośliny wykorzystano 3 dnia. Świeże rośliny były używane w każdym kolejnym dniu żywienia. Skutkiem tego był wysoki poziom endogennego PI w roślinach poddanych działaniu jasmonianu metylu. Z roślin usunięto szczytowe merystemy i opędzlowano z dwóch stron 175 μΐ roztworu zrekombinowanej ekwistatyny w 0,3% agarze, uzyskanym przez zmieszanie 1:1 wyjściowego roztworu ekwistatyny z 0,6% wodnym agarem. Kontrole opędzlowano 0,3% wodnym agarem. Roztwór agaru stosowano w stężeniu 30 μΐ/cm². Ostateczne stężenie na liściach szacowano na 70 μM, co stanowi równoważnik 1,4 mg/g liścia. Opędzlowane liście zostały umieszczone w probówce zawierającej 0,4% agar i położone na wierzchu bibuły filtracyjnej, wewnątrz płytki Petriego. 21-26 świeżo wylęgłych larw stonki ziemniaczanej umieszczono na liściach i płytki Petriego włożono do inkubatora w 26°C. Każdego dnia stare liście były zastępowane świeżo pędzlowanymi.

W tabelach 9 i 10 podsumowano wpływ ekwistatyny na rozwój i śmiertelność larw stonki ziemniaczanej. Na podstawie tabel widać, że ekwistatyna podana na rośliny kontrolne o niskim poziomie endogennych inhibitorów proteaz jest zdolna do silnego zredukowania rozwoju larw i spowOdowania ich wysobkiej śmiertelności już po 4 ddiach. Podame ekwistatya ny na liście, zawierające wysoki poziom endogennych PI, dzięki wcześniejszemu poddaniu ich działaniu jasmonianu metylu, zwiększyło toksyczne działanie tych inhibitorów. Potwierdza to spodziewany synergistyczny wpływ na ten inhibitor, gdyż skierowany jest on specyficznie przeciw „proteazom wrażliwym na PI” larw stonki ziemniaczanej.

Tabela 9. Wpływ zrekombinowanej ekwistatyny na rozwój larw stonki ziemniaczanej

Sposób traktowania	dzień 1	dzień 2	dzień 3	dzień 4
Kontrola	n.d.	n.d.	9	13,8
Kontrola + ekwistatyna	n.d.	n.d.	0,5	0,7
MeJa-kontrola	n.d.	n.d.	7,5	10
MeJa-kontrola + ekwistatyna	n.d.	n.d.	n.g.	n.g.

Testowano 21 -26 larw na eksperyment

Ciężar larw podany jest w mg/larwę

n.d. - nie określony; n.g. - nie rozwijały się lub zdechły

189 808

T a b e 1a 10. Wpływ zrekombinowanej ekwistatyny na procentową śmiertelność larw stonki ziemniaczanej

Sposób traktowania	dzień 1	dzień 2	dzień 3	dzień 4
Kontrola	0	0	0	0
Kontrola + ekwistatyna	0	10	52	76
MeJa-kontrola	0	0	0	0
MeJa-kontrola + ekwistatyna	0	23	77	92

Testowano 21-26 larw na eksperyment Przykład 8

Wpływ in vivo ekwistatyny na tempo składania jaj wciornastków

Próbka 142 pM zrekompensowanej ekwistatyny, oczyszczonej jak opisano to w przykładzie 4, była testowana za aktywność skierowaną przeciwko wciornastkom. Próbka została zakwaszona HCl do pH 3 w celu stabilizacji białka egwistatyny. Kontrole zawierały zakwaszoną wodę lub 2,5 mg/ml BSA rozpuszczonego w zakwaszonej wodzie. Tempo składania jaj przez samice wciornastków testowano przy użyciu tak zwanych klatek Murai. W skrócie, 10 samic i pyłek pszczeli zostały umieszczone w probówkach z Perspexu (polimetakrylan metylu) zamkniętych z jednej strony delikatną gazą. Probówki zamknięto parafilmem i 300 pl płynu umieszczono za powierzchni parafilmu. Druga warstwa parafilmu zamykała płyt. Pyłek i próbka płynu były zmieniane każdego dnia przez dwa dni. Jaja złożone w próbce płynu liczono drugiego dnia.

Tabela 11. Tempo składania jaj przez dorosłe samice dwa dni po umieszczeniu, na różnych dietach

Dieta	Jaj przez samicę na dzień	Względny procent
BSA	1,8	100%
Woda	1,5	83%
Ekwistatyna	0,3	17%

Przykład 9

Modyfikacja genu ekwistatyny dla popra\oiazej ekspresji u roślin cDNA ekwistgtrzy zawiera w rejonie kodującym kilkanaście potencjalnych sygnałów poliadenylacyjnych rośliny, motywy niestabilności mRNA i wykorzystanie kodozu poniżej optymalnego poziomu dla ekspresji u roślin. W celu zwiększenia poziomu ekspresji gezu u roślin motywy te mogą zostać usunięte, a kodozy mogą być zoptymalizowane dzięki miejscowym specyficznym mutagezezom bez zmieniania pierwotnej sekwencji białka. Poniżej przedstawiono przykład modyfikacji wymaganych dla uzyskania zwiększonej ekspresji genu w ziemniaku. Górna zić przedstawia cześć kodującą klonu cDNA, poniżej przedstawione są sugerowane modyfikacje sekwencji cDNA, a najniżej podano sekwencję kodującą białko przy zastosowaniu jednoliterowego kodu dla reszt amizokwasowych.

189 808

ATGGCTCTTAGCCAAAACCAAGCCAAGTTTTCCAAAGGATTCGTCGTGATGATTTGG G G G

MALSQNQAKFSK GFVVM1W

GTACTATT'CATTGCTTGTGCTA'TAAC1’ICA^A^(TG'A^A^CC^T^A^C^TC^1AACCAAATCCCAACAG C G

V L F I ACAI TS TEASLTKCQQ -1 +1

CTCCAGGCCTCGGCTAACAGTGGTCTGATAGGTACTTATGTACCACAATGCAAAGAAACG GTT T

LQASANSGL 1 GTYVPQCKE T

GGAGAGTTCGAAGAAAAACAATGCTGGGGATCGACTGGTTACTGTTGGTGTGTGGATGAA TG T

GEFE EKQCWG STGYCWCVDE

GATGGAAAAGAGATTCTAGGAACCAAGATCCGTGGATCTCCGGATTGCAGCCGCAGAAAA TA ACT

DGKEILGTKIRGSPDCSRRK.

GCCGCGTTAACACTTTGCCAGATGATGCAAGCCATCATTGTTAATGTCCCTGGTTGGTGT TC G

AALTLCQMMQAI 1VNVPGWC

GGCCCTCCATCGTGTAAAGCTGACGGCAGTTTTGACGAGGTTCAGTCCTGCGCAAGTAAT A A

GPPSCKADGSFDEVQCCASN

GGAGAATGCTACTGTGTGGATAAGAAAGGAAAAGAACTTGAAGGCACAAGACAACAGGGA

GECYCVDKKGKELEGTRQQG

AGG-CCAACCTGCGAAAGACACCTAAGCGAATGCGAGGAAGCTCGAATCAAGGCGCATTCA G T A

RPTCERHLSECEEARIKAHS

AACAGTCTTCGTGTTGAGATGTTCGTGCCAGAGTGTTTAGAAGATGGATCATATAACCCA T C T

NSLRVEMFVPECLEDGSYNP

GTACAGTGCTGGCCTAGCACAGGATACTGTTGGTGCGTCGATGAAGGAGGGGTAAAGGTA

T

VQCWPS TGYCWCV DE GGKKV

CCAGGTTCCGATGTCAGATTTAAACGCCCCACATGCTAA C C T

PGSDYRFKRPTC-199

189 808

Przykład 10

Konstrukcja wektora dla roślin do ekspresji ekwistatyny

Promotor Cab ziemniaka (Nap i inni, 1993, Plant Mol. Biol., 23: 605-612) był amplifikowany z plazmidu pPPG przez PCR przy zastosowaniu primerów Pl-POTCAB i P2-POTCAB. Podobnie terminator Nos był amplifikowany z plazmidu pPPG przy zastosowaniu primerów NOS-TERM-DN i NOS-TERM-UP. Fragmenty promotorowe i terminatorowe były cięte za pomocą enzymów resktryk-cyjnych EcoRI i SacI i ligowane do wektora pUCAP trawionego EcoRI (Van Engelen i inni, 1995, Transgenic Research 4: 288-290). Prawidłowy klon został wyselekcjonowany i był sekwencjonowany. Klon ten, pUCCAB1 był trawiony przez Ncol i BglU i użyty do subklonowania rejonu kodującego ekwistatyny, który był amplifikowany techniką PCR z plazmidowego rejonu pB3 ekwistatyny przy zastosowaniu primerów EQUISTAT-DN i EQUISTAT-BGL i następnie cięty przez Ncol i Bglll. Prawidłowy klon został wyselekcjonowany i wprowadzony klon cDNA ekwistatyny był skUwencjonowany. Prawidłowy klon, pUCCAB1 ekwistatyny był trawiony przez EcoRI. Fragment EcoRI zawierający kasetę ekspresji ekwistatyny był ligowany z wektorem roślinnym pBINPLUS (Van Engelen i innu 1995, Trrmsgeenc Research, 4: 288-290), któiy był róóvnież tI^al^iij^iy prrez EcoRI. Wyselekcjonowano prawidłowy klon. Klon ten, pCABl ekwistatyny, był elektroporowany do elektrokompetentnych komórek AGL-0 Agrobacterium tumefaciens. Pozytywne klony wyselekcjonowano na podłożu LB zawierającym 100 mgl/1 kanamycyny.

Tabela 12. Primery PCR użyte do amplifikacji przy wykorzystaniu PCR

Nazwa	DNA
Pl-POTCAB	5'-GGGGGGGAATTCCTGACCTCTTACTAACTCG
P2-POTCAB	5'-GGGGGGGAGCTCAGACCTTGCCATGG'TTTTTCTTCTCTTTrTTTTTG
NOS-TERM-DN	5 '-AGATCTGAGCTCTCGTTCAAACATTTGGCA
NOS-TERM-UP	5 '-AAGCTTGAATTCGATCTAGTAACATAG
EQUISTAT-DN	5 '-GGGGCCATGGCTCTTAGCCAAAAC
EQUISTAT-BGL	5 '-GGGGGAGATCTTTAGCATGTGGGGCGTTAAAA

Przykład 11

Transformacja ziemniaka wektorami roślinnymi zawierającymi cDNA ekwistatyny Pierwszego dnia (1) komórki AGLO kultury Agrobacterium tumefaciens, zawierające binarny wektor pCABl ekwistatyny umieszczono w 50 ml podłoża LB, zawierającego 50 mg/l kanamycyny i wstrząsano przez 2 dni w 28°C. Drugiego dnia (2) międzywęźla ziemniaka odmiany Desiree linii V były cięte na 0,5-1 cm kawałki i umieszczane w podłożu R3B (30 g/l sacharozy, 4,7 g/l soli Murashige i Skoog, pH 5,8 (KOH), 8 g/l oczyszczonego agaru, 2 mg/1 NAA i 1 mg/l BAP, które zostało przykryte 2 sterylnymi bibułami fitrracyjnymii uprzednio nasączonymi 2 ml podłoża PACM (30 g/l sacharozy, 4,7 g/l soli Murashige i Skoog, 2 g/l hydrolizatu kazeiny, pH 6,5 (KOH), 1 mg/ml 2,4-D i 0,5 mg/ml kinetyny). Płytki oklejono parafilmem i inkubowano przez noc w 24°C przy 16 godz. oświetlenia. Trzeciego dnia (3) kultura A. tumefaciens została wlana do sterylnych płytek 1’etriego, zawierających eksplanty. Po 5 - 10 dniach eksplanty usunięto z kultury, położono na sterylnej bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar Agrobacteria i położono z powrotem do płytek zawierających podłoże R3B, usuwając najpierw górne przykrycie z bibuły filtracyjnej i tak zostawiając. Płytki z kkspiantami były następnie inkubowane w 24°C i w 16 godz. światła aż do dnia 5, kiedy eksplanty przeniesiono do płytek zawierających podłoże ZCVK (20 g/l sacharozy, 4,7 g/l soli Murashige i Skoog, pfl 5,,8 (KOH), 8 tyl oczyszczonego agaru, 1 mg/l zeatyny (xeattne), 200 mg/l wankomycyny, 100 mg/l kanamycyny, 200 mg/l klaforanu). Dnia 19 i następnie co 3-4 tygodnie eksplanty przenoszono do nowego podłoża ZCVK. Gdy pojawiły się pędy, zostały one przeniesione do podłoża Murashige i Skoog, zawierającego 20% sacharozę (MS20). Po ukorzenieniu rośliny przenoszono do szklarni.

189 808

Przykład 12

Biotesty larw stonki ziemniaczanej na transgenicznych roślinach ziemniaka wykazujących ekspresję ekwistatyny

Sekwencja cDNA ekwistatyny zoptymalizowana do ekspresji w roślinach ziemniaka była klonowana do wektora pCABl i transformowana do linii V. Osiem różnych pierwszorzędowych transformantów testowano na odporność na świeżo wylęgłe larwy stonki ziemniaczanej. Larwy usunięto z młodych roślin w szklarni, umieszczono w probówkach zawierających 0,4% oczyszczony wodny agar i umieszczono w płytkach Petriego z bibułą filtracyjną. Po sześć przypadkowo wybranych świeżo wylęgłych larw' um^^eszczano na liściu. Po dwóch dniach larwom zmieniano liście na świeże. Dnia 3 każdą larwę ważono. Tabela 13 przedstawia wyniki, pokazując, że 3 z 6 transformantów znacząco opóźniło rozwój larw. Niektórym roślinom brakowało odporności prawdopodobnie w związku z niską ekspresją, spowodowaną przez sabo^-malną pozycję insercji T-DNA w genomie rośliny. Obecność białka ekwistatyny została potwierdzona przez technikę „western blotting” i oszacowana na > 0,1 % w transgenicznych roślinach, które wykazały odporność.

Tabela 13. Wyniki biotestu na transgenicznych roślinach ziemniaka transformowanych genem ekwistatyny zoptymalizowanym dla ekspresji w roślinach.

RoślinaT	Ciężar larwb
Linia V	9,93 a
pBINPLUS	10,67 a
pCABl-EIM-1	4,03 b
pCABl-EIM-2	5,45 b
pCABl-EIM-3	8,77 a
pCABl-EIM-6	8,92 a
pCABl-EIM-7	8,55 a
pCABl-EIM-8	5,85 b
pCABl-EIM-9	9,18 a
pCABl-EIM-10	11,15 a

t Testowano rośliny Linii V, in vitro rośliny przenoszono do szklarni równocześnie z transformantami; pBINPLUS, linia V transformantów z pustym wektorem, bez kasety genu promotorowego; pCABl-10, pierwsze 8 transformantów linii V z ulepszonym genem ekwistatyny pod kontrolą promotora CAB.

^b Średni ciężar (mg) sześciu larw. Oznaczenie literowe następujące za ciężarem larwy wskazuje na istotność statystyczną wyznaczoną testem ANOVA.

Przykład 13

Izolowanie sekwencji genów homologicznych z innych organizmów w celu znalezienia lub wytworzenia ulepszonych inhibitorów.

reszt aminokwasowych Gly-Tyr-Cys-T^-Cys-Val, które są silnie konserwatywne wśród inhibitorów z powtórzoną domeną tyreoglebulinową typu I hamujących proteazy cysteinowe i asparaginianowe, z człowieka, łososia czy polipa morskiego, mogą być użwte do izolowania homologicznych sekwencji z ulepszoną specyficznością. Zdegenerowane primery PCR mogą być utworzone na podstawie tych sekwencji do amplifikacji fragmentów genomowych lub cDNA, które mogą być użyte jako sondy do izolowania całych sekwencji kodujących, na przykład, z bibliotek cDNA lub przez eksperymenty 5'RACE z oczyszczonym mRNA. Każdy organizm, łącznie z owadami i roślinami, może być wykorzystany jako nowe źródło powtórzonych domen tyreogliobulinowych typu I. Zbiory genów mogą być wykorzystane w eksperymentach tasowania genów dla wyodrębnienia nowych specyficzności.

189 808

FIG. 1

CTATGGCTCTTAGCCAAAACCAAGCCAAGmTCCAAAGGATTCGTCGTGATGATTTGG •32 malsqnqakpsxgpvvmim

GTACrATTCATTGCrrGTGCTATAACTTCAACTGAAGCTAGTCTAACCAAATGCCAACAG -13 VLFXACAITSTEASLTKCQQ

-1 +1

120 CTCCAGGCCTCGGCTAACAGTGGTCTGATAGGTACTTATGTACCACAATGCAAAGAAACG 8 LQASANSGLIGTYVPQCKET

BO GGAGAGTTCGAAGAAAAACAATGCTGGGGATCGACTGGTTACTCTTGGTGTGTGGATGAA 28 GEFEEKQCWGSTGYCWCVDE

240 GATGG AAAAGAGATTCTAGGAACCAAGATCCGTGCAT CTCCGGATTGCAGCCGCAGAAAA 48 DGKBIŁGTKTRGSPDCSRRK

300 GCCGCGTT AACACTTTGCCAGATGATGCAAGCCATCATTGTTAATGTCCCTGGTTGGTGT ¢8 AALTbCQMHQAIIVNVPGWC

360 GGCCCTCCATCGTGTAAAGCTGACGGCAGTTTTGACGAGGTTCAGTGCTGCGCAAGT A AT 38 GPPSCKADGSFDEVQCCA3if

420 GGAGAAIGCTACTGTGTGGATAAGAAAGGAAAAGAACTTG AAGGC ACAAG ACAACAGGG A 108 GECYCVDKKGKEŁEGTRQQG

83 AGGCCAACCTGCGAAAGACACCTAACCGAATGCGAGGAAGCTCGAATCAAGGCGCATTCA

123 RPTC2RHŁSSCB3ARIKAHS

4 0 AACACTCTTCGTGTTGAGATGTTCGTCCCAGAGTCTTT AGAAGATGG ATCATATAACCCA

148 HSLRVBMFVPSCLSDC5YNP

600 GTACAGTGCTGGCCTAGCACAGGATACTGTTGGTGCGTCGATGAAGGAGGGGTAAAGGTA 168 VQC«PSTGYCWCVDEGGVKV

660 CCAGCTTCCGATGTCAGATTTAAACGCCCCACATGCTAAGAAAAACACAGTGAACAĄAGT 138 ? G S D V R F K R P T C - - 199

720 ggctactttccagatcgaaaataactacaaaggattaataaaatgttaaaataatttctc

780 AATTCGGCTGTGATATATTTTTTCCAAGATAATTTAATCTGCATGTAGTT.A-ACAGAAAAC /» U rt κ ŁTr.ifi ŁiłiŁSl a IŁ Λ ęnv *· wc-w *·» ~ m -w ~ ~ .

189 808 (Ν d

w

U.

189 808

OJ σι

u	u	u	u	u	p
<	s	tt	X	<	tt
>	X	1	X	a	tt
a	tt	tt	a*	σ	tt
tt	tt	o	X	w	X
o	o	ff	b	o	Ł5
		a	w	ł	tt
a	4}	κ	<	tt	tt
a	o	>		>	H
a:	tt	tt	tt		2
w	fc	w	fc	fc	w
o	b	b	b	b	o
u	X	&	cu	tt	ω
>	h>	a	M	>	a
u	u)	w	tt	ω	tt
	X	5	σ	tt	tt
o	ff	o	o	o	o
z	ω	z	hi	w	o
	5	<>ł	g	13	tt
o	p			p	p
>	>	E>	5»	>
o	o	u		u	u
z	£	X	X	X	X
u	o	u	u	u	u
w	Cf	ω	ω	w	fc

c* tt

W _ 8 8 ω

t

c.

?

> o o !8 ΰ 2!

v> 1 έ	i tt a	έ tt	tt s w tt tt	t f g ’. w » ff £ i
U a	a ą	&	8	O C*	8
>	>	fc	X	fc	1
tt	tt	tt	X	5	1
p	tt	>	X	ff	l
tt	tt	fc	fc	fc	1
X	ff	X	tt	c	i
ff	δ	U	b	σ	o 1
tt	Q	X	X	ω
w	fal	tt	X	u	1
fc	s	Ω	o	Z	ł
u	u	4	ó	u	υ »
tt	tt	o	z	tt
tt	a	tt	tt	tt	tt
	w	>	M	H	1
tt	X	tu	55	tt	1
	2	g	>	tt	t
	tt	Λ	tt'	3	t
	fc	j	tt	P	1
	ai	fc	U)	w	1
	os	tt	3	X	1
	tt	tt		o
	tt	a	5t	X
	>	tt	3	V)	i
	O	q	tt	P	)
		3	X	X	»
	ęy	o	«J	o	t
	p	o tt	Z	w	<
	>	5	tt	ł
	tt	tt	»3	z	1
	U	ff	fc	Σ	1
	-3	p	Q	W	u
	w	w	ω	z
	tt	X	£	a
	u	ω	W	u
	a	«	tt	a
		tt	tt	p
		j	O	0 ff
		«5«	tt
		U	o	tt
		tt	X	X
		fc		o
		X

Os t· — OT O ,- Σ + <7

I f·- 4 os e- o \©

P4 O νγ Ό c/ -w- — “ « η « j ? _ _ _ o OO .5 se rs ,5 os

9 3 3

Jo Λ -O X

0^00 *bb O0 ab * ?

§».

V £ o f*> Srό g £ 8 .3 2 8 bo

O fi _ fi _ _r*% >s >> f- H ii •o

J

189 808

Figura 3

ekwistatyna fragment sutego łańcucha p41 pcpi e.s mulncysutyna ziemniaka sc cystatyna soji cystatyna „lens” cystatyna „cowpea cystatyna C.majus

3-ci ludzki kininogen Ludzki kininogen LMW kininogen wołu

Ludzka cystatyna C Cystatyna kurczęcia

Świńska stefin D2 Świńska stefin Dl Świńska stefin B Szczurzy stefin A l ,udz.ka stefin A zawartość procentowa ’00

189 808

Figura 4a

—*— kontrola J —O—koncrola ··· ekwistacyna * MeJa !

—X— Mej a ekwistatyna <

Figura4b

komroia koutrulaekwistacyna

MeJa

MeJai-ekwutatynn |

189 808

Figura 5

buforowana sól woda ekwisurtyna dieia

Fig.6

189 808

EKWISTATYNA

FIG. 7

fragment EcoRI 2713 bp \_____r

V

ligacja

EcoHl erwistatyr.a jsCABl

FIG. 8

189 808

43,000 > 30,000 ► 20,100 > 14,400 ►

2 3

Fig.10

189 808 trypsyna irypsyna

Fig.11

Fiy 12

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (17)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób ochrony roślin lub części tych roślin przed atakiem jednego lub większej ilości owadów lub nicieni posiadających trawienne proteazy cysternowe, znamienny tym, że podaje się w miejscu, gdzie wymieniony(e) owad(y) lub nicień(ie) mają być zwalczane, hamującą ilość inhibitora proteazy cysternowej posiadającego sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że owady posiadają proteazy cysteinowe, które są niewrażliwe na inhibitory proteazy cysteinowej pochodzące z roślin żywicielskich.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że owady to jedna lub większa ilość stonek ziemniaczanych, Diabrotica spp, wciornastków i miniarek.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nicieniami są nicienie cystowe lub guzaki.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że do genomu rośliny wprowadza się sekwencję kodującą inhibitor proteazy cysteinowej posiadający sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1 powiązaną funkcjonalnie z sekwencją promotora aktywną w roślinie, powodującą ekspresję tego inhibitora na poziomach, które zapewniają zwalczającą owady lub nicienie ilość tego inhibitora.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że ponadto obejmuje etapy:

   (a) hodowania komórek lub tkanek z roślin, (b) wprowadzania do komórek lub tkanek co najmniej jednej kopii sekwencji kodującej inhibitor proteazy cysteinowej, (c) regeneracji całych odpornych roślin z hodowoli komórek lub tkanek.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że ponadto obejmuje etap płciowego lub przez klonowanie rozmnażania całych roślin w taki sposób, że co najmniej jedna kopia sekwencji kodującej inhibitor proteazy cysteinowej powiązanej funkcjonalnie z sekwencją promotora aktywną w roślinie występuje w komórkach potomstwa tego rozmnażania.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że ponadto obejmuje etapy:

   (a) selekcjonowania płodnych, odpornych na owady lub nicienie roślin wytwórz nych sposobem według zastrz. 7, (b) krzyżowania płciowego roślin odpornych na owady lub nicienie z roślinami podatnymi na owady lub nicienie z odmian podatnych, (c) odzyskiwania materiału reprodukcyjnego z potomstwa krzyżówek, oraz (d) hodowania roślin odpornych z materiału reprodukcyjnego.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że dla nadania odporności na owady lub nicienie na zasadniczo homozygotycznąpopulację roślin odmiany podatnej, obejmuje ponadto powtarzane etapy, którymi są:

   (a) krzyżowanie wsteczne potomstwa odpornego na owady lub nicienie z zasadniczo homozygotycznymi, podatnymi na owady lub nicienie roślinami z odmiany podatnej, oraz (b) selekcjonowanie na ekspresję, zarówno odporności na owady lub nicienie jak i innych cech odmiany podatnej wśród potomstwa krzyżówki wstecznej, aż pożądana zawartość procentowa cech odmiany podatnej wystąpi u potomstwa wraz z odpornością na owady lub nicienie.
10. 10. Roślina transgeniczna i jtzj płciowe potomstwo odtwrne na atek jednego h& większej ilości owadów, lub nicieni posiadających trawienne proteazy cysteizowe, znamienna tym, że

    189 808 roślina transgeniczna wykazuje ekspresję zwalczającej owady lub nicienie ilości inhibitora proteazy cysteinowej posiadającego sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1.
11. 11. Nośnik ekspresji, funkcjonalny biologicznie, znamienny tym, że zawiera promotor zdolny do wzbudzania ekspresji leżącej za nim sekwencji kodującej w komórkach roślinnych, rejon kodujący DNA kodujący w komórkach roślinnych ekspresję inhibitora proteazy cysternowej posiadającego sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1 oraz sekwencję terminatorową zdolną do terminacji transkrypcji lub translacji tego inhibitora w komórkach roślinnych, przy czym nośnik ekspresji jest zdolny do ekspresji w komórkach rośliny zwalczającej owady ilości tego inhibitora.
12. 12. Nośnik według zastrz. 11, znamienny tym, że jest nim pCABl.
13. 13. Transgeniczna komórka gospodarza, znamienna tym, że jest transformowana biologicznie funkcjonalnym nośnikiem ekspresji jak określona w zastrz. 11 albo 12.
14. 14. Transgeniczna komórka według zastrz. 13, znamienna tym, że rejon kodujący DNA kontrolowany jest przez promotor zdolny do wzbudzania ekspresji leżącej za nim sekwencji kodującej w komórce rośliny, rejon kodujący DNA kodujący w komórkach roślinnych ekspresję inhibitora proteazy cysteinowej posiadającego sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1 oraz sekwencję terminatorową. zdolną do terminacji transkrypcji lub translacji tego inhibitora w komórkach roślinnych, przy czym nośnik ekspresji jest zdolny do ekspresji, w komórkach rośliny, zwalczającej owady ilości tego inhibitora dla zwalczania jednego lub wielu owadów posiadających trawienne proteazy cysteinowe.
15. 15. Peptyd inhibitora z powtórzoną domeną tyreoglobulinową typu I o aktywności skierowanej przeciwko proteazom asparaginianowym, znamienny tym, że peptyd ten posiada sekwencję aminokwasów rozciągającą się od pozycji aminokwasów 68-199 ekwistatyny z fig. 1 lub zmodyfikowanego peptydu inhibitora proteazy asparaginianowej o powtórzonej tyreoglobulinie typu I, przy czym ten zmodyfikowany peptyd zawiera peptyd, mający zasadniczo identyczne aminokwasy jak pozycja aminokwasów 68-199 ekwistatyny; skrócenia pozycji aminokwasów 68-199 ekwistatyny; lub skrócenia peptydu mającego zasadniczo identyczne aminokwasy jak pozycja aminokwasów 68-199 ekwistatyny, gdzie zmodyfikowany peptyd jest funkcjonalnym odpowiednikiem pozycji amin^^^-^^as^w 68-199 ekwistatyny z aktywnością inhibitora proteaz asparaginianowych.
16. 16. Sposób ochrony roślin lub części tych r^oślin przed atakiem jednego lub większej ilości owadów lub nicieni posiadających trawienne proteazy asparaginianowe, znamienny tym, że podaje się w miejscu, gdzie wymieniony(e) owad(y) lub nicień(ie) mają być zwalczane, hamuj ącą ilość inhibitora proteazy asparaginianowej jak określono w zastrz. 15.
17. 17. Sposób ochrony roślin lub części tych roślin przed atakiem jednego lub większej ilości owadów lub nicieni posiadających trawienne proteazy cysteinowe i asparaginianowe, znamienny tym, że podaje się w miejscu, gdzie wymieniony(e) owad(y) lub nicień(ie) mają być zwalczane, hamującą ilość inhibitora proteazy asparaginianowej jak określono w zastrz. 15 i inhibitora proteazy cysteinowej posiadającego sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1.