CN107312786B - 一种重组斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶的制备方法及应用 - Google Patents

一种重组斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶的制备方法及应用，通过斯氏副柔线虫转录组测序，预测出的编码基因与已公布的线虫数据库比对分析，找出斯氏副柔线虫特有基因，用RT‑PCR方法从斯氏副柔线虫中扩增出特有基因Pj_CPR，克隆测序后，构建到原核表达载体pET30a中，转化至E.coli BL21，进行诱导表达，用Western‑bloting法验证重组蛋白rCPR的免疫原性。斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因重组蛋白经纯化后，建立了家畜斯氏副柔线虫iELISA检测方法。

Description

一种重组斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种重组斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶的制备方法及应用。
背景技术
斯氏副柔线虫病由斯氏副柔线虫(Parabronema skrjabini)寄生于骆驼、羊、牛等反刍动物真胃引起,尤以骆驼感染较为严重。大量虫体寄生可导致患畜真胃发生炎症、出血、溃疡,严重者造成骆驼死亡,对养驼业危害极大，是危害我国养驼业的一种主要寄生虫病，长期以来,给农牧民带来了巨大的经济损失。因此，今后对斯氏副柔线虫病的监测和防制是骆驼寄生虫病防治中的重点。
由于骆驼多分布在第三世界国家的落后地区，所以时至今日，国内外关于斯氏副柔线虫病的研究报道较少。严重危害我国骆驼养殖业的斯氏副柔线虫病的相关研究滞后，在骆驼斯氏副柔线虫病的防治上，目前存在的主要问题是缺少针对该病的基础理论研究、缺乏有效的生前诊断方法和防治的新方法。适用于许多寄生性线虫的粪便虫卵检查法用于该病的诊断，检出率非常低，很难用于临床实践。该病的诊断主要依靠死后剖检(在真胃查找虫体)，此类诊断方法不能为早期治疗提供参考。在实际的生产中，往往是在没有诊断依据的情况下盲目地给药驱虫，造成经济损失的同时也带来了诸如毒副作用、出现耐药虫株和畜产品兽药残留超标等诸多弊端。
当前，在生产实践中亟待研究斯氏副柔线虫病的生前诊断方法，为该病的防治提供科学依据，使该病的防治更有针对性，提高防治效果，避免不必要的经济投入，同时为该病的监测提供科学的监测手段。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种重组斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶的制备方法及应用。该方法通过斯氏副柔线虫转录组测序预测出的编码基因与已公布的线虫数据库比对分析，找出斯氏副柔线虫特有基因并进行功能注释，用RT-PCR方法从斯氏副柔线虫中扩增出特有基因Pj_CPR，克隆测序后，构建到原核表达载体pET30a中，转化至E.coli BL21(DE3)，进行诱导表达，用western-bloting法验证Pj_CPR重组蛋白的免疫原性。
其具体技术方案为：
斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
用于扩增权利要求1所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的特异性PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。
斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的克隆、原核表达方法，包括以下步骤：
步骤1、引物设计
根据Pj_CPR的基因序列，用Oligo6.0设计引物，分别在上游引物和下游引物中插入限制性内切酶EcoR I、Xho I酶切位点，引物的合成由华大基因有限公司完成。
步骤2、斯氏副柔线虫总RNA的提取
按照TaKaRa RNAiso Plus RNA提取试剂说明书提取斯氏副柔线虫总RNA，具体步骤如下：
1.样品的研磨和匀浆：将液氮中保存的斯氏副柔线虫样品迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。然后，向研钵中加入适量的RNAiso Plus，反复吹打，至均一透明；然后，将匀浆液转移至离心管中，室温(15-30℃)静置5min；12000r/min 4℃离心5min；小心吸取上清液，移入新的离心管中。
2.总RNA的提取：向上述匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；室温静置5min；12000r/min4℃离心15min；从离心机中小心取出离心管(此时匀浆液分为三层，即：无色含RNA的上清液、中间白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。)吸取上清液转移至另一新的离心管中；向上清中加入0.5-1倍RNAisoPlus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min；12000r/min4℃离心10min。
3.RNA沉淀的清洗：小心弃去上清液。加入与RNAiso Plus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g 4℃离心5min后小心弃去上清液。
4.RNA的溶解：打开离心管盖，室温干燥沉淀数分钟；沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。
步骤3、Pj_CPR基因RT-PCR扩增
以提取的斯氏副柔线虫总RNA为模板反转录为cDNA，然后以cDNA为模板，用上述设计的特异性引物PCR扩增Pj_CPR基因并对其特有性进行验证。PCR扩增反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30sec，退火57℃1min，延伸72℃1.5min，35个循环；再延伸72℃10min。PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
步骤4、PCR产物回收
按照Axygen PCR产物回收试剂盒说明书操作，回收Pj_CPR基因PCR产物。
步骤5、PCR回收产物与pMD19-T Simple载体的连接
取200μL离心管加1μL pMD19-T Simple Vector、4μL PCR回收产物和5μLSolutionⅠ，离心混匀，16℃过夜连接。
步骤6、重组质粒的转化
按照北京全式金生物技术有限公司Trans1-T1感受态细胞使用说明书操作，将连接产物转化于Trans1-T1感受态细胞中，涂布于含抗生素(Amp)的固体LB培养基上，37℃培养过夜。
步骤7、重组克隆菌PCR鉴定
挑取单菌落，接种到含抗生素的液体LB培养基中培养过夜，以培养物做PCR鉴定。
步骤8、重组克隆质粒的双酶切鉴定
提取重组克隆质粒，用限制性内切酶Xho I和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切和电泳检测。
步骤9、重组克隆菌测序
经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组克隆菌，送北京华大基因公司进行双向测序。
步骤10、目的基因与表达载体pET30a的连接
将测序正确的克隆菌株和含有pET30a质粒的菌株分别接种于LB培养基中培养过夜，分别提取质粒，用限制性内切酶Xho I和EcoRⅠ对重组克隆质粒和pET30a质粒进行双酶切和电泳检测，胶回收目的基因片段和pET30a片段。
取200μL离心管加入6μL回收的目的片段、2μL pET30a表达载体片段、1μL T4DNA连接酶和1μL buffer，16℃连接过夜；构建重组表达质粒(pET30a-Pj_CPR，以下简称为pETCPR)如SEQ ID NO:2所示。
步骤11、重组表达质粒转化感受态细胞
按照北京全式金(TransGen Biotech)生物技术有限公司E.coli BL21(DE3)感受态细胞使用说明书操作，将连接产物转化于E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含卡那霉素的固体LB培养基上37℃培养过夜。
步骤12、重组表达菌的鉴定
对构建的重组表达菌E.coli BL21(pETCPR)，以下简称BL21(pETCPR)进行PCR鉴定和双酶切鉴定，经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组表达菌，送北京华大基因公司进行双向测序，具体步骤如步骤7、步骤8和步骤9所述。
步骤13、重组表达菌诱导表达条件的优化
分别对重组表达菌诱导表达时间、诱导剂IPTG浓度以及培养温度进行优化，确定最佳诱导表达条件。
步骤14、重组蛋白表达形式的检测
确定重组蛋白最佳诱导条件后，诱导表达500mL重组菌，离心收集菌体，将菌体沉淀用PBS洗3遍后，用PBS重悬沉淀，加入溶菌酶，常温放置1h，-20℃反复冻融，冰浴超声破碎15min，12000r/min离心10min，收集沉淀和上清，加入蛋白上样缓冲液煮沸10min，12％SDS-PAGE电泳检测蛋白表达形式。
步骤15、重组蛋白包涵体溶解及重组蛋白纯化
按最佳诱导条件诱导重组表达菌1L，12000r/min离心10min收集菌体，按上述方法裂解重组表达菌，离心收集裂解物沉淀，将沉淀用8M尿素溶解，12000r/min低温离心10min，收集上清液，用0.45μm孔径滤器过滤后按照上海生工Ni+柱蛋白纯化试剂盒操作步骤纯化重组蛋白。
步骤16、重组蛋白western blotting检测
将纯化出的重组Pj_CPR蛋白(以下简称rCPR)进行SDS-PAGE电泳，从制胶板上将蛋白质胶取出，在夹子上放置滤纸、PVDF膜、蛋白胶、滤纸，按顺序放好夹住，100V 40min转膜；转膜后取出PVDF膜TBST洗涤4min，重复3～4遍，用现配的5％脱脂乳封闭液常温微摇封闭2h；取出PVDF膜TBST洗涤4min，重复3～4遍，将PVDF膜在1：1000稀释的感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中4℃孵育过夜；取出PVDF膜TBST洗4min，重复3～4遍，将PVDF膜在辣根过氧化物酶标记的兔抗骆驼多克隆抗体中常温微摇孵育1h；取出PVDF膜TBST洗涤4min，重复3～4遍，用ECL显色后照相。
本发明所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因在检测和防治家畜斯氏副柔线虫感染过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的优势所在：
本发明通过斯氏副柔线虫转录组测序，预测出的编码基因与已公布的线虫数据库比对分析，找出斯氏副柔线虫特有基因，用RT-PCR方法从斯氏副柔线虫中扩增出特有基因Pj_CPR，克隆测序后，构建到原核表达载体pET30a中，转化至E.coli BL21(DE3)，进行诱导表达，用western-bloting法验证Pj_CPR重组蛋白的免疫原性。本发明所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因及其编码产物在检测家畜斯氏副柔线虫感染过程中的应用，能诊断斯氏副柔线虫的感染，且该方法具有较高的特异性、敏感性和较好的重复性。
附图说明
图1是本发明实施例1中斯氏副柔线虫特有基因Pj_CPR的PCR检测结果；其中，M为DNA Marker DL2000；1为捻转血矛线虫；2为斯氏副柔线虫；3为秀丽隐杆线虫；4为盘尾丝虫。
图2为本发明实施例1中基因Pj_CPR的PCR扩增电泳图；其中，M为DNA MarkerDL2000；1-2为基因Pj_CPR；3为空白对照。
图3为本发明实施例1中重组克隆质粒双酶切鉴定结果；其中，M为DNA MarkerDL2000；1-3为Pj_CPR基因克隆质粒。
图4为本发明实施例1中重组表达质粒pETCPR双酶切鉴定结果；其中，M为DNAMarker DL2000；1-3为重组表达质粒pETCPR。
图5为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETCPR)最佳诱导表达SDS-PAGE电泳结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21(DE3)空菌；2为BL21(pET30)诱导前；3为BL21(pET30)诱导后；4为为BL21(pETCPR)在25℃；5为BL21(pETCPR)在30℃；6为BL21(pETCPR)在37℃，0.1mMIPTG浓度，诱导4h后，诱导表达菌。
图6为本发明实施例1中重组蛋白表达形式的SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21(pETCPR)菌体裂解物上清；2为BL21(pETCPR)菌体裂解物沉淀。
图7为本发明实施例1中重组蛋白纯化的SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M1为蛋白质marker(14.9kDa-97.2kDa)；M2为蛋白质marker(10kDa-170kDa)；；1-2为纯化的重组蛋白rCPR。
图8为本发明实施例1中重组蛋白His标签Western-bloting检测结果；其中，M为蛋白质marker；1-2为纯化重组蛋白rCPR。
图9为本发明实施例1中纯化重组蛋白rCPR与感染斯氏副柔线虫的骆驼阳性血清反应；其中，M为蛋白质marker；1-2为rCPR与感染斯氏副柔线虫的骆驼阳性血清反应；3为rCPR与未感染斯氏副柔线虫的骆驼阴性血清反应。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
通过斯氏副柔线虫转录组测序，预测出的编码基因与已公布的线虫数据库比对分析，找出斯氏副柔线虫特有基因，用RT-PCR方法从斯氏副柔线虫中扩增出特有基因Pj_CPR，克隆测序后，构建到原核表达载体pET30a中，转化至E.coli BL21(DE3)，进行诱导表达，用western-bloting法验证Pj_CPR重组蛋白的免疫原性。
1.1实验方法：
1.1.1引物设计
根据Pj_CPR的基因序列，用Oligo6.0设计引物，分别在上游引物和下游引物中插入限制性内切酶EcoR I、Xho I酶切位点，引物的合成由华大基因有限公司完成，引物序列见表1。
表1 Pj_CPR基因引物序列
1.1.2斯氏副柔线虫总RNA的提取
按照TaKaRa RNAiso Plus RNA提取试剂说明书操作，具体操作同上述总RNA提取方法。
1.1.3Pj_CPR基因RT-PCR扩增
以提取的斯氏副柔线虫总RNA为模板反转录为cDNA，然后以cDNA为模板，用上述设计的特异性引物PCR扩增Pj_CPR基因并对其特有性进行验证。PCR扩增反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30sec，退火57℃1min，延伸72℃1.5min，35个循环；再延伸72℃10min。PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.1.4 PCR产物回收
按照Axygen PCR产物回收试剂盒说明书操作，回收Pj_CPR基因PCR产物。
1.1.5 PCR回收产物与pMD19-T Simple载体的连接
取200μL离心管加1μL pMD19-T Simple Vector、4μL PCR回收产物和5μLSolutionⅠ，离心混匀，16℃过夜连接。
1.1.6重组质粒的转化
按照北京全式金生物技术有限公司Trans1-T1感受态细胞使用说明书操作，将连接产物转化于Trans1-T1感受态细胞中，涂布于含抗生素(Amp)的固体LB培养基上，37℃培养过夜。
1.1.7重组克隆菌PCR鉴定
挑取单菌落，接种到含抗生素(Amp)的液体LB培养基中培养过夜，以培养物做PCR扩增鉴定。
1.1.8重组克隆质粒的双酶切鉴定
按照Axygen质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒，用限制性内切酶Xho I和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切电泳检测。
1.1.9重组克隆菌测序
经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组克隆菌，送北京华大基因公司进行双向测序。
1.1.10目的基因重组表达载体的构建
将测序正确的克隆菌株和含有pET30a质粒的菌接分别接种于LB培养基中培养过夜，分别提取质粒，用限制性内切酶XhoI和EcoRⅠ对重组克隆质粒进行双酶切和电泳检测，胶回收目的基因片段和pET30a片段。
取200μL离心管加入6μL回收的目的片段、2μL pET30a表达载体片段、1μL T4DNA连接酶和1μL buffer，16℃连接过夜；构建重组表达质粒(pET30a-Pj_CPR，以下简称为pETCPR)。
1.1.11重组表达质粒转化感受态细胞
按照北京全式金(TransGen Biotech)生物技术有限公司E.coli BL21(DE3)感受态细胞使用说明书操作，将连接产物转化于E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含抗生素的固体LB培养基上37℃培养过夜。
1.1.12重组表达菌鉴定
对构建的重组表达菌E.coli BL21(pETCPR)，以下简称BL21(pETCPR)进行PCR鉴定和双酶切鉴定，经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组表达菌，送北京华大基因公司进行双向测序，具体步骤如1.1.7、1.1.8和1.1.9所述。
1.1.13重组表达菌诱导表达条件的优化
将重组表达菌BL21(pETCPR)涂布于含卡那霉素(Kan)的固体LB培养基上培养过夜，挑取单菌落接种在6mL含Kan液体培养基里，37℃培养过夜。第2天以1:100接种于20mL含Kan的LB培养基中，37℃180r/min培养，当OD600达到0.6～1.0时加入IPTG诱导剂至终浓度1.0mM，分别在25℃、30℃、37℃180r/min条件下培养4h后，各取2mL菌液，1mL测吸光值OD600，另1mL离心收集菌体，菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸变性10min，12％SDS-PAGE电泳检测。
将重组表达菌BL21(pETCPR)涂布于含Kan的固体LB培养基上培养过夜，挑取单菌落接种在6mL含Kan液体培养基中，37℃培养过夜。第2天以1:100的比例接种于20mL含KanLB培养基中，37℃180r/min培养，当OD600达到0.6～1.0时取1mL菌液作为0h对照，其余的培养物里加入IPTG诱导剂至终浓度1.0mM，37℃180r/min诱导培养。分别在0h、1h、2h、3h、4h、6h每个时间点各取2mL菌液，1mL测吸光值OD600，另1mL离心收集菌体，菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸变性10min，12％SDS-PAGE电泳检测。
将重组表达菌BL21(pETCPR)涂布于含Kan固体LB培养基上培养过夜，挑取单菌落接种在6mL含Kan的液体培养基里，37℃培养过夜。第2天以1:100的比例接种于20mL含Kan的LB培养基中，37℃180r/min培养，当OD600达到0.6～1.0时，加入诱导剂IPTG至终浓度0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM。37℃180r/min继续培养4h，各取2mL菌液，1mL测吸光值OD600，另1mL离心收集菌体，菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸变性10min，12％SDS-PAGE电泳检测。
1.1.14重组蛋白表达形式的检测
确定重组蛋白最佳诱导条件后，诱导表达500mL重组菌，离心收集菌体，将菌体沉淀用PBS洗涤3遍后，用PBS重悬沉淀，加入溶菌酶，常温放置1h，-20℃反复冻融，冰浴超声破碎15min，12000r/min离心10min，收集沉淀和上清，加入蛋白上样缓冲液煮沸10min，12％SDS-PAGE电泳检测蛋白表达形式。
1.1.15重组蛋白包涵体溶解及纯化
按最佳诱导条件诱导重组表达菌1L，12000r/min离心10min收集菌体，按上述方法裂解重组表达菌，离心收集裂解物沉淀，将沉淀用8M尿素溶解，12000r/min低温离心10min，收集上清液，0.45μm孔径滤器过滤后按照上海生工Ni+柱蛋白纯化试剂盒操作步骤纯化重组蛋白。
1.1.16重组蛋白western blotting检测
将纯化出的重组蛋白(rCPR)进行SDS-PAGE电泳，从制胶板上将蛋白质胶取出，在夹子上放置滤纸、PVDF膜、蛋白胶、滤纸，按顺序放好夹住，100V 40min转膜。转膜后取出PVDF膜TBST洗4min，重复3～4遍，用现配的5％脱脂乳封闭液常温微摇封闭2h。取出PVDF膜TBST洗涤4min，重复3～4遍，将PVDF膜在1：1000稀释的感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中4℃孵育过夜。取出PVDF膜TBST洗涤4min，重复3～4遍，将PVDF膜在辣根过氧化物酶标记的兔抗骆驼多克隆抗体中常温微摇孵育1h。取出PVDF膜TBST洗4min，重复3～4遍，用ECL显色后照相。
1.2实验结果
1.2.1 Pj_CPR基因特异性PCR检测
斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因序列与NCBI公布的线虫序列进行BLAST比对，比对结果显示该序列为斯氏副柔线虫特有序列。Pj_CPR基因PCR扩增后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。结果表明：Pj_CPR基因只在斯氏副柔线虫RNA中扩增出约291bp条带，而在捻转血矛线虫、秀丽隐杆线虫和盘尾丝虫中均未扩增出Pj_CPR基因条带。
1.2.2目的基因的扩增
Pj_CPR基因RT-PCR扩增后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。结果显示：Pj_CPR基因出现约291bp的条带，与预期的目的基因大小相符。
1.2.3重组克隆菌PCR鉴定
目的片段与pMD19-T simple载体连接后转入感受态细胞，在固体培养基上培养12～16h，挑取3个单菌落接种到LB液体培养基，培养12～16h，再以菌液为模板PCR扩增，并进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。Pj_CPR基因克隆菌扩增出了约291bp条带，均获得了预期大小的目的条带。
1.2.4重组克隆质粒的双酶切鉴定
经菌液PCR鉴定呈阳性的菌株提取质粒，用限制性内切酶(EcoR I、Xho I)进行双酶切，酶切产物电泳检测，结果见图3。结果出现了两个条带，分别为Pj_CPR基因(0.291kb)和pMD19-Tsimple(2.7kb)，表明目的基因成功插入pMD19-Tsimple载体序列中。
1.2.5重组表达菌PCR鉴定
目的片段插入到pET30a载体后转化感受态菌体细胞，涂布在固体培养基上培养12～16h，挑取3个单菌落接种到液体LB培养基中培养12～16h，以菌液为模板PCR扩增，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出约291bp的条带，与预期的目的基因大小相符。
1.2.6重组表达质粒的双酶切鉴定
经PCR鉴定呈阳性的菌株提取质粒用限制性内切酶(EcoR I、Xho I)进行双酶切，酶切产物电泳检测，结果见图4。结果出现两个条带，分别为Pj_CPR基因(0.291kb和表达载体pET30a(5.4kb)，结果表明目的基因成功插入表达载体pET30a中。
1.2.7测序结果及分析
经PCR鉴定和双酶切鉴定呈阳性的克隆菌和表达菌进行双向测序，测序得到的Pj_CPR基因序列与转录组测序得到的Pj_CPR基因核苷酸序列比对同源性均为100％，说明Pj_CPR基因成功克隆至载体pET30a中，并成功构建重组表达载体。
1.2.8重组表达菌诱导表达条件的优化
培养的重组表达菌BL21(pETCPR)增殖培养至OD600达到0.6～1.0后，分别对其进行诱导温度(25℃、30℃、37℃)，诱导剂IPTG浓度(0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.6Mm、1.0mM、2.0mM)和诱导时间(0h、1h、2h、3h、4h、6h)进行优化。结果表明，重组表达菌BL21(pETCPR)与空菌BL21(DE3)、未诱导BL21(pET30)和诱导后重组菌BL21(pET30)比较，多出了一个条带，与预期的目的表达产物大小一致。重组表达菌BL21(pETCPR)在诱导温度为37℃，诱导时间为4h，诱导剂IPTG诱导浓度为0.1mM时，确定为BL21(pETCPR)最佳诱导条件，结果见图5。
1.2.9重组蛋白表达形式的检测
确定重组蛋白最佳诱导条件后，诱导表达重组菌，离心收集菌体沉淀，裂解菌体，离心收集沉淀和上清液，进行12％SDS-PAGE电泳，发现重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀，结果见图6。
1.2.10重组蛋白的纯化
Pj_CPR基因重组表达菌诱导培养后，离心收集菌体，裂解，离心收集的沉淀用8M尿素溶解，再离心收集上清液，以0.45μm孔径滤器过滤后按照上海生工Ni+柱蛋白纯化步骤过柱子纯化蛋白，得到了较纯的重组蛋白，结果见图7。
1.2.11重组蛋白Western-bloting检测
以Rabbit Anti-His.tag IgG为抗体做Western-Blotting检测，重组菌BL21(pETCPR)在17.6kDa处出现了特异性条带，证明重组蛋白融合表达了pET30a表达载体上的His标签，结果见图8。
以确定感染斯氏副柔线虫的骆驼血清作为抗体检测重组蛋白rCPR，在17.6kDa处出现了特异性条带，表明重组蛋白能够与感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中的抗体发生特异性反应，具有较好的免疫原性，而重组蛋白rCPR与未感染斯氏副柔线虫的骆驼血清不反应，结果见图9。
实施例2
2.1iELISA实验方法
将斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因重组蛋白(rCPR)用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液稀释成一定的浓度，每孔100μL加入酶标板，于4℃包被过夜。第2天取出酶标板在室温下将其孔内液体弃掉，用PBST洗涤液洗涤酶标板3次，每次静止5min，洗涤结束后在滤纸上拍干酶标板内的液体。每孔加100μL封闭液，在37℃放置2h后，用洗涤液洗3次，每次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。用稀释液将血清稀释到一定的倍数后加入到酶标板孔内，每孔加入100μL于37℃孵育1h。弃掉孔内液体，用洗涤液洗3次，每次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。加入按适当比例稀释的HRP标记兔抗骆驼IgG，每孔加入100μL于37℃孵育45min，之后用洗涤液洗3次，每次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板。每孔加100μL TMB显色液，37℃显色10min。显色结束后，每孔加100μL终止液终止反应，并在酶标仪上测定OD450值。
2.2斯氏副柔线虫iELISA检测方法的建立
2.2.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
按照棋盘滴定法，将纯化好的重组蛋白(rCPR)用包被液进行定量稀释，使纯化抗原每孔(100μL/孔)上样量分别为每孔1μg，2μg，4μg，8μg，16μg，4℃包被过夜，次日将已知标准阳性(81份阳性血清等体积混合的血清作为标准阳性血清)、阴性血清(9份阴性血清等体积混合的血清作为标准阴性血清)按1:25、1：50、1：100、1：200、1：400的5个梯度进行稀释，兔抗骆驼IgG-HRP按1：5000稀释，根据上述iELISA程序测定OD450值。根据OD450值计算每组的P/N值，P/N＝实验组/对照组＝OD阳性血清/OD阴性血清，P/N值最大时所对应的抗原稀释度和血清稀释度为最佳稀释度。
2.2.2酶标二抗最佳稀释度的确定
确定了抗原最佳稀释浓度和血清稀释倍数后，兔抗骆驼IgG-HRP按1:2500、1：5000、1：7500、1：100004个梯度稀释，每孔加100μL，进行iELISA试验。根据OD450值计算每个二抗稀释度的P/N值，P/N值最大时所对应的二抗稀释度即为最佳二抗稀释度。
2.2.3重复性实验
选取2份阳性血清和2份阴性血清，并以标准阳性血清和标准阴性血清作为对照进行iELISA检测，每个样品重复3次，计算每个样品的平均值和标准差。
2.2.4判定点的确定
按照上述确定的最佳反应条件，用重组蛋白rCPR抗原检测81份斯氏副柔线虫感染的骆驼阳性血清及9份未感染斯氏副柔线虫的骆驼阴性血清，并进行统计学分析，通过计算9份阴性血清OD450值的平均值和标准差(SD)。根据以下公式确定重组抗原iELISA判定点：
当待测样品OD450值大于判定点时判为阳性，若小于判定点时判断为阴性。当待测样品OD450与临界值接近时，进行二次检测，检测结果与第一次检测结果相同时，确定为疑似斯氏副柔线虫感染。
2.2.5敏感性和特异性实验
以重组蛋白rCPR抗原检测81份斯氏副柔线虫感染的骆驼阳性血清及9份未感染斯氏副柔线虫的骆驼阴性血清，确定重组抗原iELISA敏感性。
以重组蛋白rCPR抗原对几种常见的寄生虫混合感染的24个阳性血清进行iELISA特异性检测,包括：莫尼茨绦虫、捻转血矛线虫、肺丝虫、夏伯特线虫、细颈线虫、毛尾线虫，毛圆线虫，食道口线虫，鼻蝇蛆。
2.2.6田间实验
将待检的140份骆驼血清进行iELISA检测。
2.3实验结果
2.3.1最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
将纯化的重组蛋白rCPR抗原按5个不同的浓度进行加样，已知阳性血清和阴性血清按5个梯度稀释，进行iELISA检测，根据iELISA显色后的OD450值可知阳性、阴性血清OD450值存在明显差异，结果见表2。根据P/N值计算出抗原最佳包被浓度为8μg/孔，血清最佳稀释度为1:50，结果见表3。
表2重组蛋白rCPR抗原棋盘滴定OD450值
表3重组蛋白rCPR抗原iELISA检测的P/N值
2.3.2酶标二抗最佳稀释度的确定
根据iELISA检测OD450值计算P/N值大小，确定酶标二抗最佳稀释度为1:5000，结果见表4。
表4酶标二抗最佳工作浓度的确定
2.3.3重复性实验
分别选取标准阳性、标准阴性血清和2份已知阳性、阴性血清，用重组抗原进行iELISA检测，每个样品重复检测3次。计算每个血清OD450的平均值和标准差，求出变异系数， 结果变异系数均小于10％，表明重组抗原建立的iELISA检测方法具有较好的重复性，结果如表5。
表5重组抗原重复性实验OD450值
2.3.4判定点的确定
通过对9份未感染斯氏副柔线虫的骆驼阴性血清和81份斯氏副柔线虫感染的骆驼阳性血清进行重组抗原iELISA法检测，结果见表6。根据统计学原理，将的样品，判断为阳性。根据9份阴性血清的OD450值，计算出阴性血清的平均值标准差(SD)＝0.017。因此，样品阴性、阳性的临界值＝0.184+3×0.017＝0.235。样品的判定标准为：样本OD450值＞0.235时，判定为阳性；样本OD450值＜0.235时，判定为阴性。
表6 Pj_CPR重组抗原检测结果
2.3.5特异性和敏感性分析
根据表7中rCPR抗原对81份骆驼阳性血清及9份骆驼阴性血清的测定结果和敏感性计算公式得出，在81份阳性血清中78份血清的OD450值都大于0.235，有1份阳性血清OD450值为0.235，等于临界值，判定为是疑似病例，其余2份血清OD450值均小于0.235，判定为阴性。结果表明，重组蛋白rCPR作为诊断抗原敏感性为96.3％。
用建立的iELISA方法，检测常见的9种其它寄生虫混合感染的24个血清样本。结果显示，24份血清OD450值均小于临界值0.235，均判定为阴性。只有斯氏副柔线虫感染的血清为阳性，和其它寄生虫感染的阳性血清无交反应，表明所建立的检测方法特异性良好，见表7。
表7特异性实验结果
2.3.6田间实验
根据实验确定的最佳工作条件，用重组蛋白rCPR抗原包被酶标板，对采集的140份骆驼血清进行iELISA检测，在被检的140份血清中有121份阳性血清，阳性率为86.4％。在19份判定为阴性血清中，有4份血清被检测为疑似斯氏副柔线虫感染。实验结果如表8所示。
表8田间实验结果
本发明所建立的iELISA检测方法能诊断斯氏副柔线虫的感染，且该方法具有较好的特异性、敏感性和较好的重复性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换，如对斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的核苷酸序列经替换、缺失或添加若干核苷酸形成具有同等功能的核苷酸序列及其编码产物，上述核苷酸序列及其编码产物在制备家畜斯氏副柔线虫感染检测试剂及相关产品中的应用，均落入本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 内蒙古农业大学
<120> 一种重组斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶的制备方法及应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaaacgtt ccctcctcac cttctttctt attccatcaa ccttgattaa tcatgcttca 60
acgggaaata caaatgagct tgaaccgaag atcgaaatcg caatcaacca aaaattagga 120
actgagcaac tgagggaaca atatgctgct taccgattgt ataagcagca gtacagcaag 180
cctgatgctg acgcaaattt ggaatatcgt cgcttcacaa catatttgga aaatgtcgag 240
aaaatttatcagcataacgaacgctataagcgtggtgaagaaacatatgaa 291
<210> 2
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaaacgtt ccctcctcac cttctttctt attccatcaa ccttgattaa tcatgcttca 60
acgggaaata caaatgagct tgaaccgaag atcgaaatcg caatcaacca aaaattagga 120
actgagcaac tgagggaaca atatgctgct taccgattgt ataagcagca gtacagcaag 180
cctgatgctg acgcaaattt ggaatatcgt cgcttcacaa catatttgga aaatgtcgag 240
aaaatttatcagcataacgaacgctataagcgtggtgaagaaacatatgaa 291
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggaattcat gaaacgttcc ctcctc 26
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgctcgagt tcatatgttt cttcacc 27
<210> 5
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Lys Arg Ser Leu Leu Thr Phe Phe Leu Ile Pro Ser Thr Leu
1 5 10 15
Ile Asn His Ala Ser Thr Gly Asn Thr Asn Glu Leu Glu Pro Lys
20 25 30
Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Lys Leu Gly Thr Glu Gln Leu Arg
35 40 45
Glu Gln Tyr Ala Ala Tyr Arg Leu Tyr Lys Gln Gln Tyr Ser Lys
50 55 60
Pro Asp Ala Asp Ala Asn Leu Glu Tyr Arg Arg Phe Thr Thr Tyr
65 70 75
Leu Glu Asn Val Glu Lys Ile Tyr Gln His Asn Glu Arg Tyr Lys
80 85 90
Arg Gly Glu Glu Thr Tyr Glu
95

Claims (3)

1.斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：5所示；斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的特异性PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。
2.斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因克隆、重组表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、引物设计
根据Pj_CPR的基因序列，用Oligo6.0设计引物，分别在上游引物和下游引物中插入限制性内切酶EcoR I、Xho I酶切位点，引物的合成由华大基因有限公司完成；
步骤2、斯氏副柔线虫总RNA的提取
按照TaKaRa RNAiso Plus RNA提取试剂说明书提取斯氏副柔线虫总RNA，具体步骤如下：
1)样品的研磨和匀浆：将液氮中保存的斯氏副柔线虫样品迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；然后，向研钵中加入适量的RNAiso Plus，反复吹打，至均一透明；然后，将匀浆液转移至离心管中，室温15-30℃静置5min；12000r/min4℃离心5min；小心吸取上清液，移入新的离心管中；
2)总RNA的提取：向上述匀浆裂解液中加入氯仿，RNAiso Plus的1/5体积量，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；室温静置5min；12000r/min4℃离心15min；从离心机中小心取出离心管吸取上清液转移至另一新的离心管中；向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min；12000r/min4℃离心10min；
3)RNA沉淀的清洗：小心弃去上清液；加入与RNAiso Plus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g4℃离心5min后小心弃去上清液；
4)RNA的溶解：打开离心管盖，室温干燥沉淀数分钟；沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀；
步骤3、Pj_CPR基因RT-PCR扩增
以提取的斯氏副柔线虫总RNA为模板反转录为cDNA，然后以cDNA为模板，用上述设计的特异性引物PCR扩增Pj_CPR基因并对其特有性进行验证；PCR扩增反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30sec，退火57℃1min，延伸72℃1.5min，35个循环；再延伸72℃10min；PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测；
步骤4、PCR产物回收
按照Axygen PCR产物回收试剂盒说明书操作，回收Pj_CPR基因PCR产物；
步骤5、PCR回收产物与pMD19-T Simple载体的连接
取200μL离心管加1μL pMD19-T Simple Vector、4μL PCR回收产物和5μL Solution Ⅰ，离心混匀，16℃过夜连接；
步骤6、重组质粒的转化
按照北京全式金生物技术有限公司Trans1-T1感受态细胞使用说明书操作，将连接产物转化于Trans1-T1感受态细胞中，涂布于含抗生素Amp的固体LB培养基上，37℃培养过夜；
步骤7、重组克隆菌PCR鉴定
挑取单菌落，接种到含抗生素的液体LB培养基中培养过夜，以培养物做PCR鉴定；
步骤8、重组克隆质粒的双酶切鉴定
提取重组克隆质粒，用限制性内切酶Xho I和EcoR Ⅰ对重组质粒进行双酶切和电泳检测；
步骤9、重组克隆菌测序
经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组克隆菌，送北京华大基因公司进行双向测序；
步骤10、目的基因与表达载体pET30a的连接
将测序正确的克隆菌株和含有pET30a质粒的菌株分别接种于LB培养基中培养过夜，分别提取质粒，用限制性内切酶Xho I和EcoR Ⅰ对重组克隆质粒和pET30a质粒进行双酶切和电泳检测，胶回收目的基因片段和pET30a片段；
取200μL离心管加入6μL回收的目的片段、2μL pET30a表达载体片段、1μL T4 DNA连接酶和1μL buffer，16℃连接过夜；构建重组表达质粒pETCPR如SEQ ID NO:2所示；
步骤11、重组表达质粒转化感受态细胞
按照北京全式金生物技术有限公司E.coli BL21感受态细胞使用说明书操作，将连接产物转化于E.coli BL21感受态细胞中，涂布于含卡那霉素的固体LB培养基上37℃培养过夜；
步骤12、重组表达菌的鉴定
对构建的重组表达菌E.coli BL21进行PCR鉴定和双酶切鉴定，经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组表达菌，送北京华大基因公司进行双向测序；具体步骤如步骤7、步骤8和步骤9所述；
步骤13、重组表达菌诱导表达条件的优化
分别对重组表达菌诱导表达时间、诱导剂IPTG浓度以及培养温度进行优化，确定最佳诱导表达条件；
步骤14、重组蛋白表达形式的检测
确定重组蛋白最佳诱导条件后，诱导表达500mL重组菌，离心收集菌体，将菌体沉淀用PBS洗3遍后，用PBS重悬沉淀，加入溶菌酶，常温放置1h，-20℃反复冻融，冰浴超声破碎15min，12000r/min离心10min，收集沉淀和上清，加入蛋白上样缓冲液煮沸10min，12％SDS-PAGE电泳检测蛋白表达形式；
步骤15、重组蛋白包涵体溶解及重组蛋白纯化
按最佳诱导条件诱导重组表达菌1L，12000r/min离心10min收集菌体，按上述方法裂解重组表达菌，离心收集裂解物沉淀，将沉淀用8M尿素溶解，12000r/min低温离心10min，收集上清液，用0.45μm孔径滤器过滤后按照上海生工Ni+柱蛋白纯化试剂盒操作步骤纯化重组蛋白；
步骤16、重组蛋白western blotting检测
将纯化出的重组Pj_CPR蛋白rCPR进行SDS-PAGE电泳，从制胶板上将蛋白质胶取出，在夹子上放置滤纸、PVDF膜、蛋白胶、滤纸，按顺序放好夹住，100V 40min转膜；转膜后取出PVDF膜TBST洗涤4min，重复3～4遍，用现配的5％脱脂乳封闭液常温微摇封闭2h；取出PVDF膜TBST洗涤4min，重复3～4遍，将PVDF膜在1：1000稀释的感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中4℃孵育过夜；取出PVDF膜TBST洗4min，重复3～4遍，将PVDF膜在辣根过氧化物酶标记的兔抗骆驼多克隆抗体中常温微摇孵育1h；取出PVDF膜TBST洗涤4min，重复3～4遍，用ECL显色后照相。
3.权利要求1所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因编码蛋白在制备检测家畜斯氏副柔线虫感染过程的产品中的应用。
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