CN102279271A - 重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法 - Google Patents

重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法，该方法以蛔虫成虫虫体或者感染性虫卵的RNA为模板，利用RT-PCR扩增出ALAg基因，构建ALAg表达载体并转化表达菌进行诱导表达，纯化重组蛋白，以纯化蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测方法。本发明建立了稳定而特异的抗蛔虫体IgG的间接ELISA检测方法，可用于蛔虫感染的临床监测和诊断，适宜在基层和临床广泛推广。

Description

重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法
技术领域
本发明涉及一种蛔虫的防治及检测技术，特别是重组蛔虫ALAg蛋白抗原的制备及检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法，属于生物技术领域。
背景技术
蛔虫(Ascaris lumbricoides Linnaeus，1758)也称为人似蚓蛔虫，似蚓蛔虫病呈世界性分布，已经成为公共卫生问题之一。据报道，全世界约有14.72亿人感染似蚓蛔虫。我国是似蚓蛔虫感染较严重的国家之一，1990年全国人体寄生虫分布调查似蚓蛔虫感染率为44.59％，分布范围遍及全国，尤其是农村地区，对群众健康和青少年儿童的生长发育危害较大。2008年，孙凤华报道全国31个省(区、市)共检查356629人，似蚓蛔虫平均感染率12.72％。似蚓蛔虫感染者轻度、中度和重度分别占81.64％、16.64％和1.50％，感染率自东向西明显升高，东部、中部和西部地区分别为4.86％、16.47％、18.33％。蛔虫是世界上流行地域最广、感染人数最多的病原生物之一，是危害人民身体健康的重要疾病。每条雌虫平均每天可产卵24万个。感染期卵在人小肠内孵出幼虫，侵入肠粘膜和粘膜下层，钻入静脉或淋巴管，经肝、右心，到达肺，穿破肺泡毛细血管，进入肺泡，表现为机械性损伤、超敏反应、营养不良以及导致宿主肠道功能障碍。当大量幼虫在肺部移行时，引起似蚓蛔虫性支气管肺炎、支气管哮喘或嗜酸性粒细胞增多症。严重时幼虫还可侵入脑、肝、脾、肾、眼和甲状腺等器官，引起异位寄生。甚至有幼虫通过胎盘进入胎儿体内寄生的报道。成虫掠夺营养和破坏肠粘膜影响吸收，导致消化不良和营养吸收障碍，从而引起儿童发育障碍，还可出现荨麻疹、皮肤瘙痒、结膜炎以及中毒性脑病等症状；似蚓蛔虫可钻入开口于肠壁的各种管道(如胆管、胰腺管和阑尾)，甚至钻入肝脏，可引起胆道蛔虫症、蛔虫性肠梗阻、蛔虫性胰腺炎或阑尾炎以及肝蛔虫病，也可上窜阻塞气管支气管，造成窒息，引起尿道和生殖器官蛔虫病及其他器官组织的蛔虫卵肉芽肿。
蛔虫病的诊断往往根据临床症状，对粪便采用饱和硫酸镁漂浮集卵法发现蛔虫卵然后作出可确诊，但粪便检出时间晚而且检出率低，当通过粪便检查检出虫卵时，犬弓首蛔虫幼虫已经在犬体内移行造成肝脏、肺脏等器官或者组织损伤。相对其它虫种来说，蛔虫病的免疫诊断技术研究较少，因此发展也较缓慢。因此早期快速诊断蛔虫病具有重要的意义。近年来，由于宿主感染蛔虫后能够引起免疫反应，因此蛔虫感染的早期诊断，流行病学调查和血清学方法检测蛔虫抗体已经成为可能。但在蛔虫幼虫时期的排泄物和分泌物构成了一个糖蛋白家族，在这个家族中至少有六种蛋白具有明显的抗原性。分泌的糖蛋白在虫体表面形成一层保护膜，该膜在宿主体内定期脱落，这种定期蜕皮的行为是寄生虫试图混淆宿主免疫系统的表现，所以宿主要建立起完全保护性免疫要很长的时间。蛔虫特异性引物，通过PCR方法对组织内弓首蛔虫幼虫ITS-2片断进行扩增可以鉴定是否有幼虫感染。但是PCR需要一定仪器设备，不适宜在基层和临床推广。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法，用于蛔虫感染的临床监测，从而克服现有技术(粪检虫卵法)导致漏检或者检出率低的不足。
为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：一种重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法。该方法按照下列步骤进行：
(1)重组蛔虫ALAg蛋白抗原的制备
①蛔虫成虫总RNA的提取和RT
从-70℃冰箱取出蛔虫成虫虫体或感染性虫卵，置于研钵中磨成粉末，然后按RNA提取试剂盒说明提取总RNA；以抽提的总RNA为模板，反转录为cDNA；
②ALAg基因的扩增和克隆
以cDNA为模板，根据Genbank中公布的猪蛔虫抗原基因的序列，利用PrimerPrimer 5.0软件设计引物进行扩增蛔虫的ALAg基因，所述引物中，上游引物为：5’-CGCGGATCC GCCAGTTTAAGCGAGATGC-3′(含BamHI酶切位点)；下游引物为：5’-CCGGAATTCGAGAAGCTTATGCCTCGCTT-3′(含EcoR I酶切位点)；扩增产物用DNA胶回收试剂盒回收ALAg目的片段；将ALAg与pMD18-T载体连接，然后转化感受态细胞DH5α，涂于含有氨苄青霉素(AMP)的LB培养基上进行培养，挑取菌落进行经菌落PCR鉴定后，抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒pMD18-T-ALAg送往大连宝生物进行测序；
③Pet28a(+)-ALAg重组质粒构建及酶切鉴定
将测序正确的阳性菌，提取质粒pMD18-T-ALAg，分别采用BamH I和EcoR I进行酶切pMD18-T-ALAg质粒和Pet28a(+)表达载体，纯化目的片段进行连接成Pet28a(+)-ALAg，并转入DH5α中，涂于含有氨苄青霉素(AMP)的LB培养基上进行培养，挑取菌落进行经过菌落PCR和酶切鉴定后，抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒Pet28a(+)-ALAg送往大连宝生物公司进行测序；
④重组Pet28a(+)-ALAg质粒在大肠杆菌中的诱导表达
将测序正确的阳性质粒Pet28a(+)-ALAg转化BL21(DE3)感受态细胞，加入IPTG进行诱导表达；
⑤重组ALAg蛋白的纯化
按1∶100比例将培养过夜的含有Pet28a(+)-ALAg的BL21(DE3)接种到新的LB液体培养基中，37℃快速振荡培养至细菌生长对数中期，A550＝1.0；在IPTG诱导下，进行重组ALAg蛋白的大量表达，收集诱导表达菌；离心后将细菌沉淀经反复冻融和超声裂解后，依次用含0、2、4mol/L尿素的1×结合蛋白缓冲液洗涤沉淀；随后用含8mol/L尿素的1×结合蛋白缓冲液重悬沉淀，冰上放置1h，使包涵体蛋白完全溶解；16,000×g离心30min去除不可溶物，以孔径0.45mm的NC膜过滤收集上清液；经His结合树脂纯化，以缓冲液洗去杂蛋白，以洗脱液洗脱重组ALAg蛋白；将纯化的重组蛋白于4℃分别在含4mol/L、2mol/L尿素的PBS及PBS溶液中依次进行透析，将溶液进行冷冻干燥后于4℃保存；
(2)以纯化后的重组蛔虫ALAg蛋白做包被抗原建立间接ELISA检测方法的建立
①最佳抗原包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定
将重组ALAg蛋白用pH为9.6的0.05M的碳酸盐稀释成为25、10、5、1、0.5、0.1μg/mL6个浓度包被酶联板100μL/孔，每个浓度包被1列，于37℃温浴1h后放置于4℃过夜，取出用含0.05％Tween-20的PBS-T洗涤3次，每次3min，然后每孔再加1％牛血清白蛋白(BSA)100μL封闭液，37℃封闭30min；然后将已知蛔虫阳性血清和蛔虫阴性血清在酶标板上从1∶20、1∶40、1∶80、1∶160和1∶320倍比稀释，分别加入酶标板中，100μL/孔，37℃反应1h后，洗涤3次，用封闭液作1∶8000稀释辣根过氧化物酶标鼠抗人IgG加入酶联板，100μL/孔，37℃反应1h，经洗涤后加入TMB底物溶液100μL/孔，反应15min，最后加入100μL2mol/L硫酸终止反应，用酶标仪在490nm波长下测定OD值，同时用健康人血清作方阵滴定；选择已知蛔虫阳性血清与蛔虫阴性血清OD490的P/N比值最大所对应的抗原、抗体稀释度作为判定标准。
②鼠抗人IgG-HRP的最佳工作浓度的确定
将鼠抗人IgG-HRP作1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000倍比稀释，通过检测已知阳性和阴性血清，来确定鼠抗人IgG-HRP的最佳工作浓度。
③间接ELISA方法建立
建立间接ELISA检测方法将重组ALAg蛋白以最佳包被浓度包被酶标板100μL/孔，于37℃过夜，洗涤3次，每次3min，晾干；加入100μL/孔封闭液，37℃温浴1h，然后将待检血清按步骤(2)的步骤①中试验结果得出的最佳稀释倍数稀释后加入酶标板100μL/孔，37℃温浴1h，洗涤3次，晾干，加入步骤(2)的步骤②试验结果得出的最佳工作浓度的鼠抗人IgG-HRP 100μL/孔，37℃温浴1h，洗涤3次，每次3min，晾干，加入TMB底物100μL/孔，37℃反应15min，最后加入100μL12mol/L硫酸终止反应，用酶标仪测OD490值。
上述的重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法，步骤(1)的步骤③中所述酶切鉴定的方法具体为：分别选用BamH I和EcoR I两种限制性内切酶对提取Pet28a(+)-ALAg质粒进行双酶切鉴定，酶切产物于0.8％琼脂糖凝胶中电泳后紫外检测结果；将双酶切鉴定正确的菌液进行测序并分析。
前述的重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法，步骤(1)的步骤④中，将重组Pet28a(+)-ALAg质粒在大肠杆菌中进行诱导表达，然后进行SDS-PAGE分析，所述SDS-PAGE分析方法为：取诱导和未诱导的细菌培养物离心后，分别取沉淀和上清液进行SDS-PAGE分析，确定重组蛋白是包涵体表达还是可溶性表达。
本发明的有益效果：与现有技术的粪检虫卵法相比，本发明以从-70℃冰箱取出蛔虫成虫虫体或感染性虫卵的RNA为模板，利用RT-PCR扩增出ALAg基因，构建ALAg表达载体并转化表达菌进行诱导表达并进行纯化，以纯化蛋白为包被抗原，将包被抗原用稀释液稀释成为一系列的浓度包被酶联板孔，低温放置过夜，取出用洗涤液洗涤，然后每孔加入封闭液室温下封闭，然后将已知的抗蛔虫阳性血清和蛔虫阴性血清在酶标板上作倍比稀释，分别加入酶标板中孵育一定时间，用封闭液稀释鼠抗人IgG-HRP加入酶联板中进行反应，经洗涤后加入底物溶液反应，最后加终止液终止反应，用酶标仪测定OD值，同时用正常人血清作方阵滴定，选择已知的抗蛔虫阳性血清和蛔虫阴性血清OD值的比值(P/N)最大所对应的抗原、抗体稀释度作为判定标准，从而建立了ELISA方法用于蛔虫病的诊断。本发明经试验表明建立了稳定而特异的抗蛔虫体IgG的间接ELISA检测方法，可用于蛔虫感染的临床监测。而且用本发明的重组蛋白建立ELISA方法检测人的血清样本与传统的粪检虫卵法相比，其敏感性要高5倍。
附图说明
图1是本发明的ALAg基因RT-PCR扩增产物电泳分析图，图中M为100bpDNA标准分子量，1为RT-PCR扩增产物；
图2是本发明的ALAg基因菌落PCR鉴定电泳分析图，图中M为100bp DNA标准分子量，1-6为菌落PCR产物；
图3是本发明的ALAg基因序列；
图4是本发明的AlAg蛋白与其他氨基酸同系物同源性比较图；
图5是本发明的ALAg基因碱基编码的氨基酸序列；
图6是本发明的重组Pet28a(+)-ALAg质粒酶切鉴定图，图中M为标准分子量(DL 10000Marker)，1为Pet28a(+)-ALAg双酶切产物；
图7是本发明的重组质粒表达蛋白Western-blotting，图中M为标准蛋白质，1为采用IPTG诱导表达含Pet28a(+)-ALAg的BL21(DE3)3h的产物；2为采用IPTG诱导表达含Pet28a(+)的BL21(DE3)3h的产物；3为采用IPTG诱导表达含Pet28a(+)-ALAg的BL21(DE3)3h的纯化产物的免疫印迹分析；4为采用IPTG诱导表达含Pet28a(+)的BL21(DE3)3h的纯化产物的免疫印迹分析。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例1。按照以下步骤进行：
1、感染的感染性虫卵的制备
将患有蛔虫病的新鲜的小孩粪便(通过粪检虫卵法确诊)，采用反复沉淀法收集虫卵，置于事先备好的、用2％福尔马林浸泡过的滤纸上。然后将滤纸放在用湿棉花垫底的培养皿内，加盖，置25～28℃温箱内培养，3～4周就能获得大量的感染性虫卵(培养过程中，为防止福尔马林的挥发，应时常补加一定量的2％福尔马林溶液和生理盐水)。
2、蛔虫成虫总RNA的提取和RT
从-70℃冰箱取出感染性虫卵，按RNA提取试剂盒说明提取的成虫的总RNA；以抽提的总RNA为模板，以Oligo dT(18)为反转录引物，按照逆转录试剂盒手册进行，其反应体系如下：42℃60min，95℃10min，4℃保存。
3、ALAg基因的扩增和克隆
以cDNA为模板进行PCR扩增。根据Genbank中公布的猪蛔虫抗原基因(GenBank accession no：AB078971)的序列，利用Primer Primer 5.0软件设计引物为：上游引物为：5’-CGCGGATCC GCCAGTTTAAGCGAGATGC-3′(含BamH I酶切位点)；下游引物为：5’-CCGGAATTCGAGAAGCTTATGCCTCGCTT-3′(含EcoR I酶切位点)。PCR反应体系为：2×TaqPCR Master Mix：25μL；cDNA产物：3μL；无菌水：19μL，上下游引物各1.5μL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环扩增30次，最后72℃延伸10min。扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离。ALAg目的片段与pMD18-T载体连接，然后转化感受态细胞，涂于含有氨苄青霉素(AMP)的LB培养基上进行培养，挑取菌落进行经过菌落PCR和酶切鉴定后，抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒，利用该质粒的氨苄抗性筛选得到转化子pMD18-T-ALAg。将菌落PCR鉴定为阳性的克隆菌株送往大连宝生物公司测序。
4、ALAg基因序列分析
通过BLAST搜索与其同源性高的基因序列，通过ORF Finder软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)预测ALAg基因开放阅读框，并用BLAST验证。并通过BLAST搜索与ALAg基因阅读框编码的氨基酸序列(ALAg蛋白)同源性高的其他同系物，并作比较。
5、Pet28a(+)-ALAg重组质粒构建
经BamH I和EcoR I酶切的pMD18-T-ALAg和Pet28a(+)质粒的纯化回收产物，进行16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，并将其涂于含有氨苄青霉素(AMP)的LB培养基平板中，在37℃培养过夜，小量制备PCR检测为阳性的质粒DNA。
6、Pet28a(+)-ALAg重组质粒的酶切鉴定
分别选用BamH I和EcoR I两种限制性内切酶对提取质粒进行双酶切鉴定，酶切产物于0.8％琼脂糖凝胶中电泳后紫外检测结果。将双酶切鉴定正确的菌液送往大连宝生物公司测序。
7、重组Pet28a(+)-ALAg质粒在大肠杆菌中的诱导表达
将测序正确的克隆菌株抽提Pet28a(+)-ALAg质粒，转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取含有Pet28a(+)-ALAg质粒的BL21(DE3)菌落接入含有AMP的LB培养液中，于37℃培养过夜；将1mL过夜培养物接种到20mL含AMP的LB培养液中，于37℃下培养直至A550值为1.0。分别取出5mL培养物放在一个离心管中，作为未经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的对照；在剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，然后同对照培养物一起在37℃继续培养；从培养3h的培养物(包括对照培养物)中取出1mL转移到离心管中，于室温以12,000×g离心1min，弃去上清液。
8、SDS-PAGE分析
取诱导和未诱导的细菌培养物离心后，分别取沉淀和上清液(确定是包涵体表达还是可溶性表达)按1∶1的比例加入2x上样缓冲液，混匀后，100℃沸水浴5min，以10,000×g离心1s。用微量加样器在样品孔内分别加入待检样品(10μl/孔)，同时设标准蛋白Marker进行电泳，电泳完毕取出凝胶后，采用考马斯亮蓝R-250染色液进行染色。取出凝胶用脱色液进行脱色，直至蛋白条带清晰为止。
9、重组蛋白的纯化
按1∶100比例将培养过夜的Pet28a(+)-ALAg/BL21(DE3)接种到新的LB液体培养基中，37℃快速振荡培养至细菌生长对数中期(A550＝1.0)。在IPTG诱导下进行重组ALAg蛋白的大量表达，收集诱导表达菌。离心后将细菌沉淀经反复冻融和超声裂解后，依次用含0、2、4mol/L尿素的1×结合蛋白缓冲液洗涤沉淀；随后用含8mol/L尿素的1×结合蛋白缓冲液重悬沉淀，冰上放置1h，使包涵体蛋白完全溶解；16,000×g离心30min去除不可溶物，以孔径0.45mm的NC膜过滤收集上清液。经His结合树脂纯化，以缓冲液洗去杂蛋白，以洗脱液洗脱目的蛋白。将纯化的重组蛋白于4℃分别在含4mol/L、2mol/L尿素的PBS及PBS溶液中依次进行透析，将溶液进行冷冻干燥后于4℃保存。
10、最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定
将重组ALAg蛋白用0.05M碳酸盐(pH 9.6)稀释成为25、10、5、1、0.5、0.1μg/mL 6个浓度包被酶联板100μL/孔，每个浓度包被1列。于37℃温浴1h后放置于4℃过夜，取出用0.05％Tween-20(PBS-T)洗涤3次，每次3min，然后每孔再加1％牛血清白蛋白(BSA)100μL封闭液，37℃封闭30min。然后将已知蛔虫阳性血清和蛔虫阴性血清在酶标板上从1∶20、1∶40、1∶80、1∶160和1∶320倍比稀释，分别加入酶标板中，100μL/孔，37℃反应1h后，洗涤3次。用封闭液作1∶8000稀释辣根过氧化物酶标鼠抗人IgG(按说明书使用)加入酶联板，100μL/孔，37℃反应1h，经洗涤后加入底物溶液(TMB)100μL/孔，反应15min，最后加入100μL2mol/L硫酸终止反应，用酶标仪在490nm波长下测定OD值。同时用健康人血清作方阵滴定。选择蛔虫阳性血清与蛔虫阴性血清OD490的比值(P/N)最大所对应的抗原、抗体稀释度作为判定标准。
11、鼠抗人IgG-HRP的最佳工作浓度的确定
将鼠抗人IgG-HRP作1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000倍比稀释，通过检测已知阳性和阴性血清，来确定鼠抗人IgG-HRP的最佳工作浓度。
12、间接ELISA方法建立
将重组ALAg以步骤9试验结果的最佳包被浓度包被酶标板，100μL/孔于37℃过夜，洗涤3次，每次3min，晾干；加入100μL/孔封闭液，37℃温浴1h，然后将待检血清按以步骤10试验结果的最佳稀释倍数稀释后加入酶标板，100μL/孔，37℃温浴1h，洗涤3次，晾干，加入以步骤11试验结果的最佳工作浓度的鼠抗人IgG-HRP 100μL/孔，37℃温浴1h，洗涤3次，每次3min，晾干，加入TMB底物100μL/孔，37℃反应15min，最后加入100μL 2mol/L硫酸终止反应，用酶标仪测OD490值。
为验证本发明的效果，发明人进行了系列的试验，其试验结果如下：
一、RT-PCR
从感染性虫卵提取总RNA后，应用RT-PCR方法扩增得到约为900～1000bp左右的目的条带(见图1)。
二、基因克隆菌落PCR鉴定
回收纯化的目的产物与载体连接，转化感受态细菌DH5α，取1μL培养的重组克隆菌液为模板做菌落PCR鉴定，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，表明菌落PCR扩增得到在900～1000bp左右的目的条带(如图2)。
三、蛔虫ALAg基因的序列分析
将经过菌落PCR鉴定为阳性的克隆菌株提取质粒，送上海英俊生物有限公司进行测序。将测序结果进行分析，经BLAST搜索发现与猪蛔虫AS37抗原基因(AB078971)同源性为95％，与西式贝蛔虫Ag3抗原基因(EU927450)的同源性为92％。
通过ORF.Finder软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)预测ALAg基因开放阅读框，并用BLAST验证，蛔虫ALAg基因的开放阅读框含有963个核苷酸，能编码321个氨基酸，分子量35.91kDa，pI为6.19。通过NCBI搜索ALAg基因阅读框编码的氨基的同系物结果发现，ALAg基因阅读框编码的氨基酸与猪蛔虫的AS37(GenBank accession no：BAC06575)的同源性达91.59％；与西式贝蛔虫抗原基因Ag3(GenBank accession no：ACL31520)同源性达91.28％；与链尾唇棘线虫的肌蛋白-1(GenBank accession no：XP_003137600)同源性达89.1％；与马来丝虫的肌蛋白-1(GenBank accession no：XP_001899521)同源性达88.79％(见图4)。
四、重组Pet28a(+)ALAg质粒的酶切鉴定
从双酶切后的PCR产物中回收纯化的ALAg基因片段，然后与同样双酶切Pet28a(+)表达载体连接，构建Pet28a(+)-ALAg重组表达质粒，转化大肠杆菌后DH5α，挑取单个菌落，提取质粒，用BamH I和EcoR I进行双酶切鉴定，可得到pET32a(+)载体骨架片段和900～1000bp的目的片段，目的片段与预期大小相符(见图6)，鉴定结果表明，ALAg基因片段已正确连接到Pet28a(+)载体中。
五、SDS-PAGE和Western-blot分析
将构建Pet28a(+)-ALAg重组表达质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序，抽提测序结果正确的克隆菌的质粒转化到E.coli BL21中进行表达，收集菌液离心，分别取上清和沉淀经超声波破碎后离心，经SDS-PAGE分析表明表达蛋白主要以包涵体形式存在。当A550＝1，1Mm IPTG时，取诱导表达3h的菌液进行SDS-PAGE。表达产物大小约为36kDa，而含空载体的细菌经诱导后无大小为36KDa表达条带，将纯化后的表达产物进行Western-blot分析，结果发现含空载体菌表达产物不能和已知蛔虫阳性血清发生反应，而含重组载体菌表达产物则可与已知蛔虫阳性血清发生反应，出现显色带。表达产物大小约36KDa，结果见图7。
六、包被抗原和抗体最佳工作浓度测定
用已知蛔虫阳性血清和蛔虫阴性血清进行了方阵滴定(3次重复)，测得的平均OD490值分别见表1和表2。可见当包被抗原(Ag)浓度为1μg/mL、抗蛔虫抗体(Ab)为1∶80时，蛔虫阳性血清OD490值达0.366，而阴性血清OD490值为0.025，阳性孔显色明显，阴性孔几乎无色。所以，确定抗原包被浓度为1μg/mL、抗体1∶80倍稀释为ELISA的最佳工作浓度。
表1已知蛔虫阳性血清ELISA方阵滴定结果的平均OD值
  Ab\Ag   25   10   5   1   0.5   0.1
  1∶20   1.473   1.263   1.123   0.863   0.534   0.075
  1∶40   1.350   1.054   0.853   0.535   0.243   0.053
  1∶80   0.832   0.626   0.250   0.366   0.217   0.035
  1∶160   0.356   0.312   0.252   0.190   0.065   0.029
  1∶320   0.090   0.073   0.062   0.025   0.007   0.000
表2已知蛔虫阴性血清ELISA方阵滴定结果的平均OD值
  Ab\Ag   25   10   5   1   0.5   0.1
  1∶20   0.321   0.272   0.230   0.162   0.086   0.019
  1∶40   0.156   0.156   0.134   0.120   0.066   0.015
  1∶80   0.136   0.125   0.110   0.025   0.027   0.008
  1∶160   0.047   0.038   0.030   0.023   0.007   0.001
  1∶320   0.029   0.014   0.010   0.009   0.001   0.000
七、鼠抗人IgG-HRP最佳工作浓度的确定结果
鼠抗人IgG-HRP作1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000倍比稀释，通过检测已知阳性和阴性血清，来确定鼠抗人IgG-HRP的最佳工作浓度。选取阳性对照OD490大于1.0，在阴、阳性对照差异最大时，鼠抗人IgG-HRP的稀释度即为最佳工作浓度，此时鼠抗人IgG-HRP1∶8000的稀释浓度为最佳工作，结果见表3。
表3鼠抗人IgG-HRP最佳工作浓度结果
  组别   1∶500   1∶1000   1∶2000   1∶4000   1∶8000   1∶16000
  阳性血清   1.406   1.243   1.124   1.098   1.002   0.854
  阴性血清   0.347   0.286   0.198   0.152   0.096   0.087
八、ELISA阴阳性临界值的确定
采10份健康人血清用ELISA法进行了检测，每个样品设一个重复，测得的OD值以OD+3SD公式计算，以(0.1266+3×0.027516)为临界值，计算出临界值0.21。
九、特异性试验
用本试验建立的ELISA方法检测人的其他寄生虫病(钩虫、鞭虫和蛲虫病)阳性血清，同时设人已知蛔虫阳性、阴性血清为对照，结果表明所有人的其他寄生虫病阳性血清和蛔虫阴性血清全为阴性，而已知蛔虫阳性血清则为阳性，说明本方法具有很好的特异性。
十、敏感性试验
重组蛔虫ALAg基因蛋白按最佳包被浓度进行包被酶标板，将已知蛔虫阳性血清做1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280和1∶2560等9个稀释浓度，其余按最佳反应条件进行ELISA试验，结果当已知蛔虫阳性血清稀释到1∶320时通过酶标仪仍能判断阴性阳性的结果(见表4)。
表4敏感性试验结果
Figure BDA0000072136880000111
十一、重复性试验
取10份人血清样本用2批次包被的酶标板各重复检测3次，3次重复检测的变异系数均在4.5％以下，表明所建立的间接ELISA方法具有较好的重复性。
十二、本发明所述ELISA法和传统粪检虫卵法的对比试验
用本发明建立的ELISA法检测200份来自农村小学生的血清样本，其阳性检出率为10.0％；在对蛔虫的调查中，血清样本对应粪便样本并当场进行粪检虫卵法确定阳性率为2.0％，结果表明本发明的间接ELISA法比传统的粪检虫卵法要敏感。
本发明中所述的健康人血清是指从未患有蛔虫病的人血清，已知蛔虫阳性血清、蛔虫阴性血清以及人的其他寄生虫病阳性血清(钩虫、鞭虫和蛲虫)，由贵阳中医学院微生物实验室保存。人血清样本，由贵阳中医学院附院提供。待检血清样本，采自贵州5个县农村小学生，共200份，在对蛔虫的调查中，血清样本对应粪便样本并当场进行粪检虫卵法确定阳性率为2.0％。

Claims (3)

1.一种重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法，其特征在于，按照下列步骤进行：
(1)重组蛔虫ALAg蛋白抗原的制备
①蛔虫成虫总RNA的提取和RT
从-70℃冰箱取出蛔虫成虫虫体或感染性虫卵，置于研钵中磨成粉末，然后按RNA提取试剂盒说明提取总RNA，以抽提的总RNA为模板，反转录为cDNA；
②ALAg基因的扩增和克隆
以cDNA为模板，根据Genbank中公布的猪蛔虫抗原基因的序列，利用PrimerPrimer 5.0软件设计引物进行扩增蛔虫的ALAg基因，所述引物中，上游引物为：5’-CGCGGATCC GCCAGTTTAAGCGAGATGC-3′(含BamHI酶切位点)；下游引物为：5’-CCGGAATTCGAGAAGCTTATGCCTCGCTT-3′(含EcoR I酶切位点)；扩增产物用DNA胶回收试剂盒回收ALAg目的片段；将ALAg与pMD18-T载体连接，然后转化感受态细胞DH5α，涂于含有氨苄青霉素的LB培养基上进行培养，挑取菌落进行经过菌落PCR鉴定后，抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒pMD18-T-ALAg进行测序；
③Pet28a(+)-ALAg重组质粒构建及酶切鉴定
将测序正确的阳性菌，提取质粒pMD18-T-ALAg，分别采用BamH I和EcoR I进行酶切pMD18-T-ALAg质粒和Pet28a(+)表达载体，纯化目的片段进行连接成Pet28a(+)-ALAg，并转入DH5α中，涂于含有氨苄青霉素的LB培养基上进行培养，挑取菌落进行经过菌落PCR和酶切鉴定后，抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒Pet28a(+)-ALAg进行测序；
④重组Pet28a(+)-ALAg质粒在大肠杆菌中的诱导表达
将测序正确的阳性质粒Pet28a(+)-ALAg转化BL21(DE3)感受态细胞，加入IPTG进行诱导表达；
⑤重组ALAg蛋白的纯化
按1∶100比例将培养过夜的含有Pet 28a(+)-ALAg的BL21(DE3)接种到新的LB液体培养基中，37℃快速振荡培养至细菌生长对数中期，A550＝1.0；在IPTG诱导下，进行重组ALAg蛋白的大量表达，收集诱导表达菌；离心后将细菌沉淀经反复冻融和超声裂解后，依次用含0、2、4mol/L尿素的1×结合蛋白缓冲液洗涤沉淀；随后用含8mol/L尿素的1×结合蛋白缓冲液重悬沉淀，冰上放置1h，使包涵体蛋白完全溶解；16,000×g离心30min去除不可溶物，以孔径0.45mm的NC膜过滤收集上清液；经His结合树脂纯化，以缓冲液洗去杂蛋白，以洗脱液洗脱重组ALAg蛋白；将纯化的重组蛋白于4℃分别在含4mol/L、2mol/L尿素的PBS及PBS溶液中依次进行透析，将溶液进行冷冻干燥后于4℃保存；
(2)以纯化后的重组ALAg蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法
①最佳抗原包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定
将重组ALAg蛋白用pH为9.6的0.05M的碳酸盐稀释成为25、10、5、1、0.5、0.1μg/mL 6个浓度包被酶联板100μL/孔，每个浓度包被1列，于37℃温浴1h后放置于4℃过夜，取出用含0.05％Tween-20的PBS-T洗涤3次，每次3min，然后每孔再加1％牛血清白蛋白(BSA)100μL封闭液，37℃封闭30min；然后将已知蛔虫阳性血清和蛔虫阴性血清在酶标板上从1∶20、1∶40、1∶80、1∶160和1∶320倍比稀释，分别加入酶标板中，100μL/孔，37℃反应1h后，洗涤3次，用封闭液作1∶8000稀释辣根过氧化物酶标鼠抗人IgG加入酶联板，100μL/孔，37℃反应1h，经洗涤后加入TMB底物溶液100μL/孔，反应15min，最后加入100μL2mol/L硫酸终止反应，用酶标仪在490nm波长下测定OD值，同时用健康人血清作方阵滴定；选择已知蛔虫阳性血清与蛔虫阴性血清OD490的P/N比值最大所对应的抗原、抗体稀释度作为判定标准；
②鼠抗人IgG-HRP的最佳工作浓度的确定
将鼠抗人IgG-HRP作1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000倍比稀释，通过检测已知阳性和阴性血清，来确定鼠抗人IgG-HRP的最佳工作浓度；
③间接ELISA方法建立
将重组ALAg蛋白以最佳包被浓度包被酶标板100μL/孔，于37℃过夜，洗涤3次，每次3min，晾干；加入100μL/孔封闭液，37℃温浴1h，然后将待检血清按步骤(2)的步骤①中试验结果得出的最佳稀释倍数稀释后加入酶标板100μL/孔，37℃温浴1h，洗涤3次，晾干，加入步骤(2)的步骤②试验结果得出的最佳工作浓度的鼠抗人IgG-HRP 100μL/孔，37℃温浴1h，洗涤3次，每次3min，晾干，加入TMB底物100μL/孔，37℃反应15min，最后加入100μL12mol/L硫酸终止反应，用酶标仪测OD490值。
2.根据权利要求1所述的重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法，其特征在于：步骤(1)的步骤③中，所述酶切鉴定的方法为：分别选用BamH I和EcoR I两种限制性内切酶对提取Pet28a(+)-ALAg质粒进行双酶切鉴定，酶切产物于0.8％琼脂糖凝胶中电泳后紫外检测结果；将双酶切鉴定正确的菌液进行测序并分析。
3.根据权利要求1所述的重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法，其特征在于：步骤(1)的步骤④中，将重组Pet28a(+)-ALAg质粒在大肠杆菌中进行诱导表达，然后进行SDS-PAGE分析，即：取诱导和未诱导的细菌培养物离心后，分别取沉淀和上清液进行SDS-PAGE分析，确定重组蛋白是包涵体表达还是可溶性表达。
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