CN108101974A - 肝片吸虫多表位融合诊断抗原及其应用和制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肝片吸虫多表位融合诊断抗原分子Fh‑meAg2的制备方法及其应用，属生物技术领域。本发明通过对Fh重要基因SAP2、Cathepsin L1D和Cathepsin B4和进行克隆，利用生物信息学软件对Fh重要基因编码蛋白的氨基酸序列进行分析，筛选优势抗原表位，并将采用柔性氨基酸将筛选得到的优势抗原表位按照一定的排列组合进行串联，构建并合成多表位融合抗原(Fh‑meAg)基因。将Fh‑meAg基因克隆入表达载体中，在大肠杆菌中进行表达，制备重组蛋白Fh‑meAg，通过血清学试验筛选获得了强反应原性的重组蛋白Fh‑meAg2。即210(3)。与现的技术相比，本发明的肝片吸虫重组多表位融合抗原Fh‑meAg2的具有高特异性和敏感性，是一种有应用价值的Fh感染诊断抗原分子。

Description

肝片吸虫多表位融合诊断抗原及其应用和制备方法
技术领域
本发明涉及一种肝片吸虫多表位融合诊断抗原分子Fh-meAg2的制备方法及其应用，属生物技术领域。
背景技术
肝片吸虫病(Fascioliasis)是由肝片吸虫(F.hepatica，Fh)所引起的一种草食动物常发寄生虫疾病。成年动物感染多呈慢性发病，难以早期诊治，而幼年动物发病临床症状明显，严重可致死亡。
该寄生虫能对肝脏和肠道造成机械性损伤，引起器官组织创伤、出血，寄生于胆管中的虫卵和幼虫堵塞胆汁通道，引发肝炎、胆管炎、腹膜炎；肝片吸虫生长以红细胞为养料，可致红细胞减少和血管渗透性增强，导致机体贫血，严重影响了反刍动物养殖业的发展。同时，Fh还可以引起人感染，是一种对牧民危害较大的人兽共患寄生虫病。
肝片吸虫(F.hepatica，Fh)又称肝蛭或柳叶虫，属扁形动物门(Platyhelminthes)、吸虫纲腹殖目(Digenea)、片形科(Fasciolidae)片形属(Fasciola)，可导致草食动物发生慢性高危性寄生虫病。肝片吸虫的终末宿主是牛、羊、骆驼等动物，中间宿主是椎实螺。成虫在胆管内聚集，排出大量虫卵，虫卵随胆汁进入消化道，随粪便排出体外。虫卵在适当的温度、水分及光线的环境中形成毛蚴。毛蚴钻入椎实螺，在螺体内经过胞蚴、雷蚴，最后形成尾蚴，排出螺体，在水面植物叶子上结囊形成囊蚴。囊蚴在草食动物吃草时被吞食，进入动物十二指肠内脱囊成为幼虫。幼虫穿过肠壁进入腹腔，再经肝包膜进入肝脏移行到胆管，在胆管内发育成成虫。幼虫在机体内穿过十二指肠，给肠壁造成机械性损伤；进入腹腔后，穿透肝包膜，在肝脏中穿行，造成肝脏组织创伤。虫体代谢产物的毒性作用、机械性损伤，可导致动物发病甚至死亡。
肝片吸虫病的诊断对于及时治疗病畜、减少死亡和经济损失具有重要的意义。
近年来，国内外学者对肝片吸虫病的诊断进行了研究，特别是一些新的免疫学、分子生物学检测技术的应用，使该病的诊断方面有了较大的进展。
目前，肝片吸虫病的诊断主要包括粪便中虫卵检查、抗原检测和特异性抗体检测。
粪便中虫卵检查是Fh感染检测的常用方法，但是虫体一般都在感染后2-3个月才能成熟排卵，因此，粪便中虫卵检测不适合早期感染的诊断。
粪抗原检测是基于MM3单克隆抗体建立的检测粪便中Fh抗原的ELISA诊断方法，该方法可检测到Fh感染后5周粪便中的抗原，相对于虫卵检测而言，能够更早的检测Fh。
Fh抗体检测方法主要包括变态反应、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)、亲和素-生物素酶联免疫吸附试验(BA-ELISA)等。
Mezo等(2007)和Muino等(2011)制备了抗Fh L1和L2组织蛋白酶的单克隆抗体MM3，利用组织蛋白酶L建立了检测肝片吸虫感染的捕获ELISA，用于动物奶或血清样品的检测。Gottstein等建立了基于鞘脂激活蛋白样蛋白-2的检测肝片吸虫感染的ELISA方法。
然而，尽管ELISA法在检测Fh感染方面具有敏感性高的优点，但普遍存在特异性较低的缺点。同时，已经建立的检测Fh感染的ELISA方法不能有效区分F.hepatica和F.gigantica两个种。
筛选和鉴定特异性高和敏感性强的Fh抗原是研发Fh血清学诊断试剂的关键。
研究发现，Fh在发育过程中会产生排泄分泌产物(Excretory-secretaryproducts，ESP)，这些ESP不仅是Fh入侵宿主组织的关键分子，而且在与宿主的相互作用(逃避、破坏、抵抗免疫系统)中也发挥着重要的作用。
目前，在Fh中已经发现的ESP包括参与氧化应激相关蛋白、能量代谢相关蛋白和蛋白水解酶等，其中组织蛋白酶L(CathepsinL)和组织蛋白酶B(CathepsinB)是Fh成虫阶段表达量最大的ESP之一，并且具有较强的免疫原性和反应原性，可作为研发Fh诊断抗原和亚疫苗的主要靶标蛋白。然而，已有研究表明，天然的Fh ESP蛋白虽然具有较高的敏感性，但特异性较差，与其他吸虫病的血清发生交叉反应；重组的Fh单一蛋白抗原虽具有较高的特异性，但其敏感性较低。
因此，一种特异性高、敏感性强的Fh诊断抗原及其制备方法和用途就应运而生。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性高、敏感性强的针对Fh感染的诊断抗原及其制备方法和用途。
本发明通过对Fh重要基因SAP2、Cathepsin L1D和Cathepsin B4和进行克隆，利用生物信息学软件对Fh重要基因编码蛋白的氨基酸序列进行分析，筛选优势抗原表位，并将采用柔性氨基酸将筛选得到的优势抗原表位按照一定的排列组合进行串 联，构建并合成多表位融合抗原(Fh-meAg)基因。将Fh-meAg基因克隆入表达载体中，在大肠杆菌中进行表达，制备重组蛋白Fh-meAg，通过血清学试验筛选获得了强反应原性的重组蛋白Fh-meAg2。即210(3)。
将表达的重组蛋白Fh-meAg2纯化后作为包被抗原，建立间接ELISA方法，经对126份绵羊血清样品进行检查，并与屠宰后检测虫体结果进行对比验证，证实所制备的肝片吸虫重组多表位融合抗原Fh-meAg2的具有高特异性和敏感性，是一种有应用价值的Fh感染诊断抗原蛋白分子。
本发明的肝片吸虫重组多表位融合抗原Fh-meAg2主要通过以下过程制备：
1.Fh重要抗原基因的克隆。
2.Fh重要抗原蛋白优势抗原表位的预测分析。
3.Fh-meAg多表位融合抗原基因的构建。
4.Fh-meAg基因在大肠杆菌中的表达。
5.Fh-meAg2抗原蛋白的纯化。
6.基于Fh-meAg2抗原蛋白建立间接ELISA方法及条件的优化。
7.基于Fh-meAg2的间接ELISA方法的临床应用。
具体如下：
1.Fh重要抗原蛋白基因的克隆。
根据Fh重要抗原基因SAP2和Cathepsin B4基因cDNA序列分别设计特异性引物，以绵羊Fh成虫总RNA模板，分别进行RT-PCR扩增。将PCR产物克隆到pMD19-T载体，测序后对上述基因序列进行生物信息学分析。
2.Fh重要抗原蛋白优势抗原表位的预测分析。
对Fh重要基因编码蛋白的氨基酸序列进行优势抗原表位分析，综合不同的分析方法结果，寻找出存在共同优势线性抗原表位的序列。
3.Fh多表位融合抗原(Fh-meAg)基因的构建。
通过编码柔性氨基酸(GPG)的核苷酸序列(GGCCCGGGC)将编码优势抗原表位的基因片段按照一定的排列组合方式串联在一起，构建出含有多表位融合抗原基因(Fh-meAg)。经过稀有密码子在线软件对融合基因Fh-meAg中的大肠杆菌稀有密码子进行预测分析，并用编码相同氨基酸的大肠杆菌偏爱密码子替换大肠杆菌的稀有密码子，构建并合成的多表位融合基因中不含有大肠杆菌稀有密码子，易于重组蛋白在大肠杆菌中表达。
4：Fh多表位融合抗原(Fh-meAg)基因在大肠杆菌中的表达。
通过分子克隆技术构建pT-Fh-meAg重组质粒。采用EcoR I和XhoI分别对pT-Fh-meAg质粒和pET-32a(+)质粒进行双酶切，分别回收目的片段和载体片段，采用T4DNA连接酶分别构建pET-Fh-meAg重组表达质粒。
将重组表达质粒分别转入感受态细胞E.coli DH5α中，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，培养，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，将阳性菌落送至华大基因生物公司测序，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证。
将鉴定正确的重组表达质粒分别转化至表达工程菌E.coli BL21中，培养，挑取菌落并用PCR进行筛选，将筛选出的阳性菌转接到含有卡那霉素的液体LB培养基中，培养至OD600nm为0.6～0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，诱导8h后收集菌液，即可。
同时设置空载体对照和未加IPTG诱导的重组菌作为对照，进行SDS-PAGE电泳分析；同时用绵羊Fh阳性血清作为一抗，HRP标记的兔抗绵羊IgG酶标抗体为二抗，进行Western blot分析。SDS-PAGE电泳分析结果表明，在大肠杆菌中Fh-meAg1、Fh-meAg2、Fh-meAg3和Fh-meAg4四个目的蛋白均成功(图9)，分子量约为31.5-35.0kDa，与预期大小一致。
Western blot分析结果表明，Fh-meAg2的反应原性最强，要高于Fh-meAg1、Fh-meAg3和Fh-meAg4。
5.作为优化的技术方案，所述的Fh-meAg2多表位融合抗原最好进行进一步纯化。
按照Ni-NTA Purification System(Invitrogen,USA)说明书对表达的重组Fh-meAg2进行蛋白的纯化。
经纯化蛋白浓度测定，Ni柱纯化的重组蛋白Fh-meAg2浓度为30mg/mL。
6.基于Fh-meAg2抗原蛋白间接ELISA方法建立及条件的优化。
(1)最佳工作条件的确定：用0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液对纯化的蛋白进行稀释，重组蛋白Fh-meAg2按64、32、16、8、4和2ug/mL依次作倍比稀释，包被96孔ELISA板，每孔包被100μL。包被条件：ELISA板包被好后，4℃过夜，取出，PBST洗涤3次，每次3min；选用1％明胶、5％脱脂奶粉和5％BSA为封闭液，200μL/孔，37℃分别封闭0.5h、1h、1.5h、2h和4h，洗涤3次；Fh阳性血清分别做1:50、1:100和1:200倍比稀释，100μL/孔，血清作用时间设定为1h，同一样品作3个重复孔，同时作一空白对照孔，洗涤3次；酶标抗体先进行1:2000、 1:4000和1:8000稀释，100μL/孔，分别于37℃反应0.5h、1h和1.5h，洗涤3次；加入可溶性单组分TMB底物溶液，100μL/孔，37℃避光反应，反应时间设定为30min，最后加入2M的H2SO4终止反应，100μL/孔，在酶标仪上测定D450nm值。采用方阵滴定法确定最适包被浓度和条件、封闭液的成分和封闭时间、血清和酶标二抗的稀释度和作用时间，底物显色时间等。结果判定以阳性血清OD450nm＝1，且P/N值最大组合所对应的条件作为间接ELISA最佳工作条件。P/N＝(被检血清OD450nm值－空白对照OD450nm值)/(阴性血清OD450nm值－空白对照OD450nm值)。
试验结果表明，当封闭液为5％BSA时，阳性血清OD450nm值更接近1.0，P/N值最大，因此选用5％BSA为最佳封闭液。当封闭时间为2h时，阳性血清稀释度为1:100时，OD450nm值更接近1.0，P/N值最大，故最佳封闭时间为2h。当酶标抗体的稀释度为1:4000时，阳性血清OD450nm值更接近1.0，且P/N值最大，因此酶标抗体的最适工作浓度为1:4000。当酶标抗体工作时间为1h时，阳性血清OD450nm值更接近1.0，P/N值为最大，故酶标抗体的最佳工作时间为1h。
(2)间接ELISA判定标准的确定：以30份绵羊Fh阴性血清为样本，按照1:100的血清稀释度进行稀释，采用建立的间接ELISA进行检测，测定OD450nm值，运用SPSS13.0软件对数据进行统计分析。计算平均值(X)和标准差(S)，按公式：X+3S作为阴阳性判定标准(cut-off值)。结果30份Fh阴性血清的OD450nm值在0.12-0.18之间。经统计学软件Excel和SPSS 13.0软件对数据进行分析，阴性血清样本的平均值(X)为0.156，标准差(S)为0.039，其置信区间上限cut-off值＝X+3S＝0.273。样品OD450nm值大于0.273可判为阳性，小于或等于0.273可判为阴性。
7.基于Fh-meAg2抗原蛋白的间接ELISA方法特异性和敏感性分析。
(1)特异性试验：用建立的Fh meAg2-ELISA法对10份绵羊细颈囊尾蚴病阳性血清、10份绵羊细粒棘球蚴病阳性血清、10份绵羊Fh阳性血清进行检测，结果显示10份绵羊Fh阳性血清检测结果均为阳性，其余血清检测结果均为阴性，表明重组蛋白Fh meAg2与其他寄生虫病血清无交叉反应，具有很高的特异性。
(2)敏感性试验：选择20份Fh阳性血清，以1:10、1:50、1:100、1:200、1:400进行倍比稀释，用建立的Fh meAg2-ELISA法进行检测。当血清稀释度为1:200时，结果仍为阳性，表明该方法具有良好的敏感性。
8.Fh-meAg2-ELISA方法对临床样品的检测及评估。
采用Fh-meAg2-ELISA法对126份放牧地区屠宰绵羊血清样品进行Fh抗体检测， 并与绵羊屠宰后虫体检测结果进行比对验证，分析Fh-meAg2-ELISA方法的特异性和敏感性。Fh meAg2-ELISA法和绵羊屠宰后虫体检测结果见表3。
经统计学分析，Fh-meAg2-ELISA方法的敏感性和特异性分别为93.02％和95.18％，与屠宰后虫体检测方法的符合率为94.44％，证实Fh-meAg2是一种具有高特异性和敏感性的Fh诊断抗原分子。
进一步地，本发明的肝片吸虫重组多表位融合抗原Fh-meAg2可以应用于对草食动物由肝片吸虫(F.hepatica，Fh)所引起的动物寄生虫疾病的诊断及其制剂中。
与现的技术相比，本发明通过对Fh重要基因SAP2、Cathepsin L1D和Cathepsin B4和进行克隆，利用生物信息学软件对Fh重要基因编码蛋白的氨基酸序列进行分析，筛选优势抗原表位，并将采用柔性氨基酸将筛选得到的优势抗原表位按照一定的排列组合进行串联，构建并合成多表位融合抗原(Fh-meAg)基因。将Fh-meAg基因克隆入表达载体中，在大肠杆菌中进行表达，制备重组蛋白Fh-meAg，通过血清学试验筛选获得了强反应原性的重组蛋白Fh-meAg2。将表达的重组蛋白Fh-meAg2纯化后作为包被抗原，建立间接ELISA方法，经对126份绵羊血清样品进行检查，并与屠宰后检测虫体结果进行对比验证，证实所制备的肝片吸虫重组多表位融合抗原Fh-meAg2的具有高特异性和敏感性，是一种有应用价值的Fh感染诊断抗原分子。
附图说明
图1为表1，为实施例中Fh重要抗原蛋白的优势线性表位序列。
表中：CB4＝Cathepsin B4；CatL1D＝Cathepsin L1D
图2为表2，为实施例中Fh多表位融合抗原蛋白的构建策略。
图3为表3，为实施例中Fh-meAg2-ELISA法对126份绵羊血清样品的检测。
图4-7为实施例中Fh-meAg1～Fh-meAg4的氨基酸序列及相对应优化前后的核苷酸序列。
图4-7中：Line1氨基酸序列；Line2原始的核苷酸序列；Line3优化后的核苷酸序列。柔性氨基酸序列(黑色字符边框)，大肠杆菌稀有密码子(波浪线)，优化后的密码子(双下划线)。
图8为实施例中重组蛋白Fh-meAg2的SDS-PAGE和Western blot分析。
图8中：M.蛋白分子质量标准；1.空白对照；3-6.pET-Fh-meAg2重组菌IPTG诱导8h、6h、4h、2h的表达产物；2.pET-32a(+)质粒诱导表达产物；7.纯化的重组蛋白的Westernblot分析结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步详述。
1、Fh重要抗原蛋白基因的克隆。
根据GenBank已经报道的Fh重要抗原基因SAP2(GenBank登录号：MG457758)、Cathepsin L1D(GenBank登录号：EU835857.1)和Cathepsin B4(GenBank登录号：KM099340.1)基因cDNA序列分别设计特异性引物，以绵羊Fh成虫总RNA模板，分别进行RT-PCR扩增。将PCR产物克隆到pMD19-T载体，测序后对上述基因序列进行生物信息学分析。
2、Fh重要抗原蛋白优势抗原表位的预测分析。
利用生物在线软件Immunomedicine Group
(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)、ABCPred
(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)、BepiPred 1.0Server
(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)、及DNAStar-Protean软件对3种Fh重要基因编码蛋白的氨基酸序列进行优势抗原表位分析，综合四种不同的分析方法结果，寻找出存在共同优势线性抗原表位的序列(表1，见图1)。
3、Fh多表位融合抗原(Fh-meAg)基因的构建。
通过编码柔性氨基酸(GPG)的核苷酸序列(GGCCCGGGC)将编码优势抗原表位的基因片段按照一定的排列组合方式串联在一起，构建出含有多表位融合抗原基因(Fh-meAg)。经过稀有密码子在线软件(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)对融合基因Fh-meAg中的大肠杆菌稀有密码子进行预测分析，并用编码相同氨基酸的大肠杆菌偏爱密码子替换大肠杆菌的稀有密码子，构建并合成的多表位融合基因中不含有大肠杆菌稀有密码子(图2和序列表)，易于重组蛋白在大肠杆菌中表达。
通过不同的排列组合方式构建了4个Fh多表位融合抗原Fh-meAg(Fh-meAg1、Fh-meAg2、Fh-meAg3和Fh-meAg4)(表2)。
4、Fh多表位融合抗原(Fh-meAg)基因在大肠杆菌中的表达。
通过分子克隆技术构建pT-Fh-meAg1、pT-Fh-meAg2、pT-Fh-meAg3和pT-Fh-meAg4重组质粒。采用EcoR I和Xho I分别对pT-Fh-meAg质粒和pET-32a(+)质粒进行双酶切，分别回收Fh-meAg1、Fh-meAg2、Fh-meAg3和Fh-meAg4四个目的片段和载体片段，采用T4DNA连接酶分别构建pET-Fh-meAg1、pET-Fh-meAg2、pET-Fh-meAg3和pET-Fh-meAg4四个重组表达质粒。
将重组表达质粒分别转入感受态细胞E.coli DH5α中，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12h，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，将阳性菌落送至华大基因生物公司测序，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证。
将鉴定正确的重组表达质粒分别转化至表达工程菌E.coli BL21中，37℃培养12h，挑取菌落并用PCR进行筛选，将筛选出的阳性菌转接到含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养至OD600nm为0.6～0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，诱导8h后收集菌液，同时设置空载体对照和未加IPTG诱导的重组菌作为对照，进行SDS-PAGE电泳分析；同时用绵羊Fh阳性血清作为一抗，HRP标记的兔抗绵羊IgG酶标抗体为二抗，进行Western blot分析。
SDS-PAGE电泳分析结果表明，在大肠杆菌中Fh-meAg1、Fh-meAg2、Fh-meAg3和Fh-meAg4四个目的蛋白均成功(图4-8)，分子量约为31.5-35.0kDa，与预期大小一致。
Western blot分析结果表明，Fh-meAg2的反应原性最强，要高于Fh-meAg1、Fh-meAg3和Fh-meAg4。
5、Fh-meAg2多表位融合抗原的纯化。
按照Ni-NTA Purification System(Invitrogen,USA)说明书对表达的重组Fh-meAg2进行蛋白的纯化。经纯化蛋白浓度测定，Ni柱纯化的重组蛋白Fh-meAg2浓度为30mg/mL。
6、基于Fh-meAg2抗原蛋白间接ELISA方法建立及条件的优化。
(1)最佳工作条件的确定：用0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液对纯化的蛋白进行稀释，重组蛋白Fh-meAg2按64、32、16、8、4和2ug/mL依次作倍比稀释，包被96孔ELISA板，每孔包被100μL。包被条件：ELISA板包被好后，4℃过夜，取出，PBST洗涤3次，每次3min；选用1％明胶、5％脱脂奶粉和5％BSA为封闭液，200μL/孔，37℃分别封闭0.5h、1h、1.5h、2h和4h，洗涤3次；Fh阳性血清分别做1:50、1:100和1:200倍比稀释，100μL/孔，血清作用时间设定为1h，同一样品作3个重复孔，同时作一空白对照孔，洗涤3次；酶标抗体先进行1:2000、1:4000和1:8000稀释，100μL/孔，分别于37℃反应0.5h、1h和1.5h，洗涤3次；加入可溶性单组分TMB底物溶液，100μL/孔，37℃避光反应，反应时间设定为30min，最后加入2M的H2SO4终止反应，100μL/孔，在酶标仪上测定D450nm值。
采用方阵滴定法确定最适包被浓度和条件、封闭液的成分和封闭时间、血清和酶标二抗的稀释度和作用时间，底物显色时间等。
结果判定以阳性血清OD450nm＝1，且P/N值最大组合所对应的条件作为间接ELISA最佳工作条件。P/N＝(被检血清OD450nm值－空白对照OD450nm值)/(阴性血清OD450nm值－空白对照OD450nm值)。
试验结果表明，当封闭液为5％BSA时，阳性血清OD450nm值更接近1.0，P/N值最大，因此选用5％BSA为最佳封闭液。当封闭时间为2h时，阳性血清稀释度为1:100时，OD450nm值更接近1.0，P/N值最大，故最佳封闭时间为2h。当酶标抗体的稀释度为1:4000时，阳性血清OD450nm值更接近1.0，且P/N值最大，因此酶标抗体的最适工作浓度为1:4000。当酶标抗体工作时间为1h时，阳性血清OD450nm值更接近1.0，P/N值为最大，故酶标抗体的最佳工作时间为1h。
(2)间接ELISA判定标准的确定：以30份绵羊Fh阴性血清为样本，按照1:100的血清稀释度进行稀释，采用建立的间接ELISA进行检测，测定OD450nm值，运用SPSS13.0软件对数据进行统计分析。计算平均值(X)和标准差(S)，按公式：X+3S作为阴阳性判定标准(cut-off值)。
结果30份Fh阴性血清的OD450nm值在0.12-0.18之间。经统计学软件Excel和SPSS13.0软件对数据进行分析，阴性血清样本的平均值(X)为0.156，标准差(S)为0.039，其置信区间上限cut-off值＝X+3S＝0.273。样品OD450nm值大于0.273可判为阳性，小于或等于0.273可判为阴性。
7、基于Fh-meAg2抗原蛋白的间接ELISA方法特异性和敏感性分析。
(1)特异性试验：用建立的Fh meAg2-ELISA法对10份绵羊细颈囊尾蚴病阳性血清、10份绵羊细粒棘球蚴病阳性血清、10份绵羊Fh阳性血清进行检测，结果显示10份绵羊Fh阳性血清检测结果均为阳性，其余血清检测结果均为阴性，表明重组蛋白Fh meAg2与其他寄生虫病血清无交叉反应，具有很高的特异性。
(2)敏感性试验：选择20份Fh阳性血清，以1:10、1:50、1:100、1:200、1:400进行倍比稀释，用建立的Fh meAg2-ELISA法进行检测。当血清稀释度为1:200时，结果仍为阳性，表明该方法具有良好的敏感性。
8、Fh-meAg2-ELISA方法对临床样品的检测及评估。
采用Fh-meAg2-ELISA法对126份放牧地区屠宰绵羊血清样品进行Fh抗体检测，并与绵羊屠宰后虫体检测结果进行比对验证，分析Fh-meAg2-ELISA方法的特异性和 敏感性。Fh meAg2-ELISA法和绵羊屠宰后虫体检测结果见表3。经统计学分析，Fh-meAg2-ELISA方法的敏感性和特异性分别为93.02％和95.18％，与屠宰后虫体检测方法的符合率为94.44％，证实Fh-meAg2是一种具有高特异性和敏感性的Fh诊断抗原分子。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110> 石河子大学
<120>肝片吸虫多表位融合诊断抗原及其应用和制备方法
<141>
<160> 3
<210> 1
<211> 144
<212> 氨基酸序列
<213> 肝片吸虫（Fasciola hepatica）
<220>
<221> misc_feature
<223>Fh-meAg2蛋白氨基酸序列
<400> 1
MSFEEPTGCVPYPFPKCDHYIPSTGLKPCPKKAYPTPSCQGPGATPSLKGPGARSQDAGPGRDLVSCCGPRGDGCNIGNAPDAGPGPRGDGCNIGNAPDAWDGPGGIPYEASNRAVPDKIDWRESGYVTGVKDQGNGPGAKYLT
<210> 2
<211> 435
<212> 核苷酸序列
<213> Fh-meAg2蛋白基因（密码子未优化）
<220>
<221> misc_feature
<223> Fh-meAg2蛋白基因核苷酸序列
<400> 1
ATGTCATTTGAGGAGCCCACTGGATGCGTACCCTATCCGTTCCCCAAATGTGATCATTATATACCTTCGACAGGATTGAAACCTTGCCCGAAGAAAGCTTATCCAACACCCAGTTGTCAAGGCCCGGGCGCAACACCAAGCCTCAAAGGCCCGGGCGCTCGCTCTCAGGATGCAGGCCCGGGCAGAGATCTTGTCAGTTGTTGCGGTCCTCGTGGCGACGGATGCAACATTGGCAATGCGCCAGATGCTGGCCCGGGCCCTCGTGGCGACGGATGCAACATTGGCAATGCGCCAGATGCTTGGGATGGCCCGGGCGGTATCCCGTATGAGGCGAGCAACCGTGCCGTACCCGACAAAATTGACTGGCGTGAATCTGGTTATGTGACGGGGGTGAAAGATCAGGGAAACGGCCCGGGCGCCAAATATCTAACATAA
<210> 3
<211> 435
<212>核苷酸序列
<213> Fh-meAg2蛋白基因（密码子优化后）
<220>
<221> misc_feature
<223> Fh-meAg2蛋白基因核苷酸序列
<400> 1
ATGTCATTTGAGGAGCCGACTGGATGCGTACCCTATCCGTTCCCCAAATGTGATCATTATATCCCTTCGACAGGATTGAAACCTTGCCCGAAGAAAGCTTATCCAACACCCAGTTGTCAAGGCCCGGGCGCAACACCAAGCCTCAAAGGCCCGGGCGCTCGCTCTCAGGATGCAGGCCCGGGCCGTGATCTTGTCAGTTGTTGCGGTCCTCGTGGCGACGGATGCAACATTGGCAATGCGCCAGATGCTGGCCCGGGCCCTCGTGGCGACGGATGCAACATTGGCAATGCGCCAGATGCTTGGGATGGCCCGGGCG

Claims (6)

1.一种肝片吸虫多表位融合诊断抗原蛋白分子，其特征在于，其核苷酸序列为210(3)。
2.一种肝片吸虫多表位融合诊断抗原蛋白分子的制备方法，其特征在于，主要包含以下过程：
Fh重要抗原蛋白基因的克隆：
根据Fh重要抗原基因SAP2和Cathepsin B4基因cDNA序列分别设计特异性引物，以绵羊Fh成虫总RNA模板，分别进行RT-PCR扩增，将PCR产物克隆到pMD19-T载体，测序后对上述基因序列进行生物信息学分析；
Fh重要抗原蛋白优势抗原表位的预测分析：
对Fh重要基因编码蛋白的氨基酸序列进行优势抗原表位分析，综合不同的分析方法结果，寻找出存在共同优势线性抗原表位的序列；
Fh多表位融合抗原(Fh-meAg)基因的构建：
通过编码柔性氨基酸(GPG)的核苷酸序列(GGCCCGGGC)将编码优势抗原表位的基因片段按照一定的排列组合方式串联在一起，构建出含有多表位融合抗原基因Fh-meAg，经过稀有密码子在线软件对融合基因Fh-meAg中的大肠杆菌稀有密码子进行预测分析，并用编码相同氨基酸的大肠杆菌偏爱密码子替换大肠杆菌的稀有密码子，构建并合成的多表位融合基因中不含有大肠杆菌稀有密码子；
Fh多表位融合抗原Fh-meAg基因在大肠杆菌中的表达：
通过分子克隆技术构建若干个pT-Fh-meAg重组质粒，分别对pT-Fh-meAg质粒和pET-32a(+)质粒进行双酶切，分别回收目的片段和载体片段，连接酶分别构建所述的pET-Fh-meAg重组表达质粒，将重组表达质粒分别转入感受态细胞E.coli DH5α中并培养，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，将阳性菌落进行测序，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证，将鉴定正确的重组表达质粒分别转化至表达工程菌E.coli BL21中并培养，挑取菌落并用PCR进行筛选，将筛选出的阳性菌转接到含有卡那霉素的液体LB培养基中培养至OD600nm为0.6～0.8，诱导8h后收集菌液，同时设置空载体对照和未加IPTG诱导的重组菌作为对照，进行分析选取反应原性最强的目的蛋白。
3.根据权利要求2所述的肝片吸虫多表位融合诊断抗原蛋白分子的制备方法，其特征在于，Fh多表位融合抗原Fh-meAg基因在大肠杆菌中的表达为：
通过分子克隆技术构建若干个pT-Fh-meAg重组质粒，采用EcoR I和Xho I分别对pT-Fh-meAg质粒和pET-32a(+)质粒进行双酶切，分别回收目的片段和载体片段，采用T4DNA连接酶分别构建所述的重组表达质粒，将重组表达质粒分别转入感受态细胞E.coli DH5α中，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12h，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，将阳性菌落进行测序，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证，将鉴定正确的重组表达质粒分别转化至表达工程菌E.coli BL21中，37℃培养12h，挑取菌落并用PCR进行筛选，将筛选出的阳性菌转接到含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养至OD600nm为0.6～0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，诱导8h后收集菌液，同时设置空载体对照和未加IPTG诱导的重组菌作为对照，进行SDS-PAGE电泳分析；同时用动物Fh阳性血清作为一抗，HRP标记的兔抗绵羊IgG酶标抗体为二抗，进行Western blot分析，根据分析结果选取反应原性最强的目的蛋白。
4.根据权利要求2或3所述的肝片吸虫多表位融合诊断抗原蛋白分子的制备方法，其特征在于，对所述的多表位融合抗原进行进一步纯化：
按照Ni-NTA Purification System说明书对表达的重组Fh-meAg2进行蛋白的纯化，
经纯化蛋白浓度测定，Ni柱纯化的重组蛋白Fh-meAg2浓度为30mg/mL；
最佳工作条件的确定：用0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液对纯化的蛋白进行稀释，重组蛋白Fh-meAg2按64、32、16、8、4和2ug/mL依次作倍比稀释，包被96孔ELISA板，每孔包被100μL，包被条件：ELISA板包被好后，4℃过夜，取出，PBST洗涤3次，每次3min；选用1％明胶、5％脱脂奶粉和5％BSA为封闭液，200μL/孔，37℃分别封闭0.5h、1h、1.5h、2h和4h，洗涤3次；Fh阳性血清分别做1:50、1:100和1:200倍比稀释，100μL/孔，血清作用时间设定为1h，同一样品作3个重复孔，同时作一空白对照孔，洗涤3次；酶标抗体先进行1:2000、1:4000和1:8000稀释，100μL/孔，分别于37℃反应0.5h、1h和1.5h，洗涤3次；加入可溶性单组分TMB底物溶液，100μL/孔，37℃避光反应，反应时间设定为30min，最后加入2M的H2SO4终止反应，100μL/孔，在酶标仪上测定D450nm值，采用方阵滴定法确定最适包被浓度和条件、封闭液的成分和封闭时间、血清和酶标二抗的稀释度和作用时间，底物显色时间等，结果判定以阳性血清OD450nm＝1，且P/N值最大组合所对应的条件作为间接ELISA最佳工作条件，P/N＝(被检血清OD450nm值－空白对照OD450nm值)/(阴性血清OD450nm值－空白对照OD450nm值)。
5.一种肝片吸虫多表位融合诊断抗原蛋白分子，其特征在于，根据权利要求2-4任一项所述的方法制备。
6.一种权利要求1或5所述的肝片吸虫多表位融合诊断抗原蛋白分子的用途，其特征在于，将所述的多表位融合抗原应用于对由肝片吸虫所引起的动物寄生虫疾病的诊断制剂中。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111077300A (zh) * 2018-10-22 2020-04-28 吉林大学 一种肝片吸虫假定蛋白基因及胶体金免疫层析试纸
CN112538484A (zh) * 2021-01-05 2021-03-23 吉林大学 一种肝片吸虫特异抗原基因FhSAP-2及医用用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101535810A (zh) * 2006-06-27 2009-09-16 国家卫生研究院里卡多.乔治博士 使用抗原Fh8（fasciolin）的皮肤试验（皮内反应）判断肝片吸虫病
CN103203028A (zh) * 2012-12-03 2013-07-17 西南大学 一种提高抗肝片吸虫病dna疫苗免疫保护率的疫苗组合及制备方法
CN105903007A (zh) * 2016-06-15 2016-08-31 青海大学 一种新型肝片吸虫多表位疫苗的设计、制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101535810A (zh) * 2006-06-27 2009-09-16 国家卫生研究院里卡多.乔治博士 使用抗原Fh8（fasciolin）的皮肤试验（皮内反应）判断肝片吸虫病
CN103203028A (zh) * 2012-12-03 2013-07-17 西南大学 一种提高抗肝片吸虫病dna疫苗免疫保护率的疫苗组合及制备方法
CN105903007A (zh) * 2016-06-15 2016-08-31 青海大学 一种新型肝片吸虫多表位疫苗的设计、制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANA M.ESPINO等: "Fasciola hepatica:Identification of CD4+ T-helper epitopes from the 11.5 kDa saposin-like protein SAP-2 using synthetic peptides", 《EXPERIMENTAL PARASITOLOGY》 *
KOBRA MOKHTARIAN等: "Comparative assessment of recombinant and native immunogenic forms of Fasciola hepatica proteins for serodiagnosis of sheep fasciolosis", 《PARASITOLOGY RESEARCH》 *
PLOS ONE: "In Vitro and In Vivo Studies for Assessing the Immune Response and Protection-Inducing Ability Conferred by Fasciola hepatica-Derived Synthetic Peptides Containing B-and T-Cell Epitopes", 《PLOS ONE》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111077300A (zh) * 2018-10-22 2020-04-28 吉林大学 一种肝片吸虫假定蛋白基因及胶体金免疫层析试纸
CN111077300B (zh) * 2018-10-22 2021-09-07 吉林大学 一种肝片吸虫假定蛋白基因及胶体金免疫层析试纸
CN112538484A (zh) * 2021-01-05 2021-03-23 吉林大学 一种肝片吸虫特异抗原基因FhSAP-2及医用用途

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