CN103364569A - 牛隐孢子虫elisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液，包被酶标板以卵囊壁蛋白COWP和热休克蛋白HSP70的串联体COWP-HSP70作为包被抗原。发明人通过两种蛋白串联表达，来探讨两种蛋白融合互作，由于更近似虫体自身情况，因而在获得了免疫原性更强的包被抗原，这在国际上尚属首次。应用本发明及其建立的ELISA方法，将有助于深入开展牛隐孢子虫病的免疫预防和免疫诊断价值研究，为快捷的检测诊断牛隐孢子虫病提供了必要的技术手段。

Description

牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及牛隐孢子虫检测技术领域，尤其涉及一种牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒。 

背景技术

联合表达在细菌病毒中的研究主要是将毒力基因串联起来表达，这可以提高目的蛋白的免疫原性，将其制备成疫苗可以获得更高的保护率；或者将两段不同来源的目的基因联合一起，就可同时获得两个不同来源的蛋白，将目的蛋白制成疫苗免疫，即可让动物产生两个不同病源的抗体，从而有效防御两个病原的入侵。如，有报道将猪繁殖与呼吸综合征病毒高度保守的N基因和流感病毒HA基因进行联合表达，利用流感的血凝素HA基因可以跟HA单抗特异性反应，建立了检测PRRSV抗体的乳胶凝集试验，检测结果显示与IDEXX公司ELISA试剂盒符合率达93.8%。上述思路对于开发各种试剂盒有很大的指导意义，联合表达有良好的应用前景。 

在寄生虫研究方面，联合表达的报道比较少，杨兴等人串联融合表达牛瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)双拷贝p33表面蛋白，其融合蛋白可被T.sergenti阳性血清识别，具有较好的反应原性，但是其并没有跟单拷贝的P33表面蛋白的效果进行比较，因而未能体现出联合表达的优势。江莉等人为了提高细粒棘球蚴AgB抗原在诊断中的敏感性和特异性，将AgB1和AgB2两个亚单位基因在同一载体中进行联合表达，并通过血清抗体检测跟单基因表达的AgB1和AgB2相比较，结果发现联合表达的AgB在血清学诊断意义上远优于单基因抗原AgB1或AgB2。 

虽然有些抗寄生虫药、抗病毒药和抗生素都被用来研究抗隐孢子虫的效果，然而效果都不稳定，无法根除隐孢子虫，因此预防措施显得尤为重要。除了保持良好的日常生活生活习惯之外，药物预防和疫苗的预防均是可行方法。自从预防伪狂犬病取得成功后，基因工程疫苗就受到广大学者的高度关注，其跟常规疫苗相比，具有许多优势，深受欢迎。以串联不同基因蛋白表达为基础制造的基因工程多价苗比单价苗具有更为广泛的疫病防治范围，能提高疫苗的免疫保护率。因此，蛋白串联表达具有十分重要的应用意义和广阔的前景。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，以利于牛隐孢子虫病的免疫预防和免疫诊断。 

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液，包被酶标板以卵囊壁蛋白COWP和热休克蛋白HSP70的串联体COWP-HSP70作为包被抗原。 

卵囊壁蛋白COWP和热休克蛋白HSP70分别由序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的基因编码；串联体COWP-HSP70由序列表SEQ.ID.No.3的基因编码。 

包被酶标板是用包被液将包被抗原稀释至0.05275μg/mL，加入96孔酶标板，100μL/孔，置于湿盒37℃作用2h后，4℃过夜；用PBST洗板3次，拍干，用封闭液封闭酶标板，置于湿盒37℃作用1h，用PBST洗板3次，拍干制得；封闭液为1%脱脂奶；包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液。 

阴性标准血清是未免疫安氏隐孢子虫卵囊的健康BALB/c小鼠血清； 

阳性标准血清是免疫安氏隐孢子虫卵囊的健康BALB/c小鼠血清； 

酶标二抗是羊抗鼠-IgG； 

洗涤液由NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL而得； 

稀释液由脱脂奶粉1.0g，加洗涤液定容至100mL而得； 

底物液是TMB显色液； 

终止液由浓硫酸22.2mL，加蒸馏水177.8mL而得； 

包被液由Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加双蒸水定容至1 000mL而得。 

阳性标准血清采用皮下注射免疫方法，将安氏隐孢子虫卵囊经过超声破碎后，12000rpm离心10min，经过0.22μM滤膜过滤后，测定蛋白浓度；免疫18-20g的BALB/c小鼠，按体积比1:1与弗氏佐剂混合均匀，用超声破碎仪破碎震荡20min充分乳化；免疫剂量为100μg/只，共免疫3次，间隔2周；同时用PBS免疫2只BALB/c小鼠，作为对照组；其中第1次免疫用弗氏完全佐剂FCA，加强免疫用福氏不完全佐剂FIA；三免后一周摘眼球采血，从而分离到的血清。 

针对目前牛隐孢子虫缺乏简便有效的检测诊断手段的问题，发明人将卵囊壁蛋白COWP和热休克蛋白HSP70的串联体COWP-HSP70作为包被抗原，构建了牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，进而建立了诊断隐孢子虫病的间接ELISA方法。发明人通过两种蛋白串联表达，来探讨两种蛋白融合互作，由于更近似虫体自身情况，因而在获得了免疫原性更强的包被抗原，这在国际上尚属首次。应用本发明及其建立的ELISA方法，将有助于深入开展牛隐 孢子虫病的免疫预防和免疫诊断价值研究。 

附图说明

图1是临床样本的检测实验中不同包被抗原检测样品的OD值分布图，图中：1COWP-HSP70包被抗原，2HSP70包被抗原，3COWP包被抗原。 

图2是His一抗的Western blot检测结果，图中：M：蛋白质标准Marker；1：空载体对照；2：COWP-HSP70融合蛋白。 

图3是鼠血清的Western blot检测结果，图中：M：蛋白质标准Marker；1：空载体对照；2：COWP-HSP70融合蛋白。 

图4是不同质粒pET-32a-COWP-HSP70-BL21转化菌株的诱导表达SDS-PAGE电泳结果，图中：M：蛋白质标准Marker；1：空载体对照；2-8：不同重组菌株的诱导产物。 

具体实施方式

以下将详细说明本发明中卵囊壁蛋白和热休克蛋白串联表达、免疫原性鉴定及ELISA检测方法建立的研究过程。其中，脱脂奶粉Difco^TM Skim milk购自Solarbio；酶标二抗：羊抗鼠-Ig G购自中杉金桥公司；其他试剂均为国产分析纯产品。 

1．包被抗原的制备 

选取测序结果正确、分别含有卵囊壁蛋白基因和热休克蛋白基因的重组菌株pET-32a-COWP和pET-32a-HSP70进行大量培养，抽提质粒，抽提产物进行双酶切，37℃酶切8h或过夜；用胶回收试剂盒回收后进行凝胶电泳，以确定载体跟目的基因的量，载体DNA与插入外源基因DNA摩尔比为1:3-1:10进行连接；将连接过夜产物转化到DH5α中并筛选、鉴定；将经过双酶切鉴定和测序鉴定正确后的阳性克隆，转化到表达菌BL21中，构建重组质粒pET-32a-COWP-HSP70分别进行限制性内切酶酶切鉴定及测序，阳性克隆菌用细菌冻存液-20℃和-80℃保存。 

重组蛋白的表达与鉴定：通过SDS-PAGE电泳凝胶来鉴定重组蛋白是否表达；挑取pET-32a-COWP-HSP70-BL21的7株不同菌落，经IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳分析（如图4），在约50kDa大小均出现目的蛋白带，其中，5号的表达量相对较高，以下优化过程均取5号菌株。 

2.重组联合蛋白（串联体COWP-HSP70）免疫原性检测（Western blot） 

使用His和免疫的小鼠血清为一抗检测，均有目的条带出现（如图2和3），即均能识别此重组联合蛋白，表明pET-32a-COWP-HSP70蛋白具有免疫原性。 

3.ELISA试剂盒的研制 

3.0抗原的最佳浓度和血清最佳稀释倍数的确定 

用棋盘法可以得出COWP抗原最佳工作浓度和血清稀释度，结果见表1，从结果可以看出，当COWP抗原稀释10 000倍（0.078μg/mL）时，阳性对照的OD值在1.0左右，且阴性血清的OD值较低，本底也较低。因此，确定COWP抗原最佳工作浓度为1:10 000倍（0.078μg/mL），血清最佳稀释倍数为1:800。 

表1  COWP抗原最适稀释浓度的确定 

用棋盘法可以得出HSP70抗原最佳工作浓度和血清稀释度，结果见表2，从结果可以看出，当HSP70抗原稀释8 000倍（0.08125μg/mL）时，阳性对照的OD值在1.0左右，且阴性血清的OD值较低，本底也较低。因此，确定HSP70抗原最佳工作浓度为1:8000倍（0.08125μg/mL），血清最佳稀释倍数为1:800。 

表2  HSP70抗原最适稀释浓度的确定 

棋盘法筛选得出COWP-HSP70抗原最佳工作浓度和血清稀释度，结果见表3，从结果可以看出，当COWP-HSP70抗原稀释20000倍（0.05275μg/mL）时，阳性对照的OD值在1.0左右，且阴性血清的OD值较低，本底也较低。因此，确定COWP-HSP70抗原最佳工作浓度为1:20000倍（0.05275μg/mL），血清最佳稀释倍数为1:800。 

表3  COWP-HSP70抗原最适稀释浓度的确定 

3.1酶标二抗最佳工作浓度的确定 

抗原及血清均按最佳稀释倍数进行，分别以1:4000，1:5000，1:8000，1:10000稀释HRP-羊抗鼠-IgG，加入显色液，37℃作用15min，加入终止液，酶标仪测OD_450nm吸光度。根据结果，选择阳性血清的OD_450nm值在1.0左右、阴性血清OD_450nm值较低且本底较低的作为酶标二抗的最佳稀释度。 

COWP蛋白作为包被抗原时，酶标二抗HRP-羊抗鼠-IgG按1:5000稀释，阳性对照的OD值为0.872±0.011，阴性血清的OD值较低，本底也较低，P/N值最大，结果见表4。因此，确定其酶标二抗的最佳工作浓度为1:5000。 

表4  COWP蛋白二抗最佳稀释倍数的确定 

HSP70蛋白作为包被抗原时，酶标二抗HRP-羊抗鼠-IgG按1:5000稀释，阳性对照的OD值为0.996±0.017，阴性血清的OD值较低，本底也较低，P/N值最大，结果见表5。因此，确定其酶标二抗的最佳工作浓度为1:5000。 

表5  HSP70蛋白二抗最佳稀释倍数的确定 

COWP-HSP70联合蛋白作为包被抗原时，酶标二抗HRP-羊抗鼠-IgG按1:4000稀释，阳 性对照的OD值为0.941±0.027，阴性血清的OD值较低，本底也较低，P/N值较大，结果见表6。因此，确定酶标二抗的最佳工作浓度为1：4 000。 

表6  COWP-HSP70联合蛋白二抗最佳稀释倍数的确定 

3.2血清作用时间的确定 

根据以上试验确定的抗原最佳包被浓度，37℃2h，4℃包被过夜；封闭1h后，按确定的血清稀释倍数稀释阴阳血清，37℃分别作用0.5，1.0，1.5，2.0h，加入最佳酶标二抗工作浓度，37℃1h，加入TMB，37℃显色15min，加入2M H₂SO₄终止反应，比较阴阳性血清OD_450nm值，确定血清作用时间。 

COWP蛋白作为包被抗原，阴阳血清作用时间见表7，当血清作用2.0h时，阳性对照OD值最大为0.986±0.003，阴性OD值较低，本底也较低，且P/N值最大，故确定血清作用时间为2.0h。 

表7  阴阳性血清反应时间的确定 

HSP70蛋白作为包被抗原，阴阳血清作用时间见表8，当血清作用1.0h时，阳性对照OD值最大为1.004±0.026，阴性OD值较低，本底也较低，且P/N值较大，故确定血清作用时间为1.0h。 

表8  阴阳性血清反应时间的确定 

COWP-HSP70蛋白作为包被抗原，阴阳血清作用时间见表9，当血清作用2.0h时，阳性对照OD值最大为0.987±0.039，阴性OD值较低，本底也较低，且P/N值最大，故确定血清作用时间为2.0h。 

表9  阴阳性血清反应时间的确定 

3.3酶标二抗作用时间的确定 

按照ELISA程序依次包被抗原，封闭，加入阴阳血清，加入稀释好的HRP-羊抗鼠-Ig G，37℃分别作用0.5，1.0，1.5，2.0h，各设3个重复，然后加底物显色，测定OD_450nm值。选择阳性OD_450nm值在1.0左右，P/N值较大，阴性OD_450nm值较小的作为酶标二抗作用时间。 

COWP蛋白作为包被抗原，从表10中可以看出，当酶标二抗HRP-羊抗鼠-IgG作用2.0h时，阳性对照OD值为0.980±0.009，阴性血清OD值较低，本底也较低，P/N值最大，故酶标二抗的作用时间确定为2.0h。 

表10  酶标二抗作用时间的确定 

HSP70蛋白作为包被抗原，从表11中可以看出，当酶标二抗HRP-羊抗鼠-IgG作用1.0h时，阳性对照OD值为0.993±0.021，阴性血清OD值较低，本底也较低，P/N值较大，故酶标二抗的作用时间确定为1.0h。 

表11  酶标二抗作用时间的确定 

COWP-HSP70蛋白作为包被抗原，从表12中可以看出，当酶标二抗HRP-羊抗鼠-IgG作用0.5h时，阳性对照OD值为1.010±0.050，阴性血清OD值较低，本底也较低，故酶标二抗的作用时间确定为0.5h。 

表12  酶标二抗作用时间的确定 

3.4底物显色时间的确定 

按照前述确定的ELISA条件依次包被、封闭、加入血清和酶标二抗进行反应，然后加入显色液，设5，10，15，20，25，30min六个作用时间，各设3个重复，测定OD_450nm值，选取阳性OD_450nm值在1.0左右，P/N值较大，阴性OD_450nm值较小的作为底物显色时间。 

COWP蛋白作为包被抗原，底物TMB显色时间的结果见表13，当底物显色30min时，阳性OD值为0.968±0.027，阴性OD值较小，P/N值最大，因此，显色时间确定为30min。 

表13  底物显色时间的确定 

HSP70蛋白作为包被抗原，底物TMB显色时间的结果见表14，当底物显色20min时，阳性OD值为1.023±0.016，阴性OD值较小，P/N值较大，因此，显色时间确定为20min。 

表14  底物显色时间的确定 

COWP-HSP70蛋白作为包被抗原，底物TMB显色时间的结果见表15，当底物显色5min时，阳性OD值为0.997±0.018，阴性OD值较小，P/N值较大，因此，显色时间确定为5min。 

表15  底物显色时间的确定 

3.5阴阳临界值的确定 

按前述研究结果建立的间接ELISA方法，检测20份阴性血清，每份设三个重复，计算OD_450nm的平均值（X）和标准差（S），以X+3S作为阴性和阳性的临界值。 

以COWP蛋白作为包被抗原，按照建立的间接ELISA方法检测20份阴性血清（结果见表16），阴阳性临界值=阴性样本OD_450nm平均值+3×标准方差。经计算阴阳性临界值 =0.11745+3×0.0196=0.1765，因此，临界值为0.177。在阴阳对照成立的情况下，OD_450nm大于0.177就可以判定为隐孢子虫抗体阳性，否则判为阴性。 

表16  阴阳临界值的确定 

HSP70蛋白作为包被抗原，按照建立的间接ELISA方法检测20份阴性血清（结果见表17），阴阳性临界值=阴性样本OD_450nm平均值+3×标准方差。经计算阴阳性临界值=0.11995+3×0.019498=0.17844，因此，临界值为0.179。在阴阳对照成立的情况下，OD_450nm大于0.179就判定为隐孢子虫抗体阳性，否则判为阴性。 

表17  阴阳临界值的确定 

以COWP-HSP70蛋白作为包被抗原，按照上面建立的间接ELISA方法检测20份阴性血清（结果见表18），阴阳性临界值=阴性样本OD_450nm平均值+3×标准方差。经计算阴阳性临 界值=0.121492+3×0.031236=0.2152，因此，临界值为0.215。在阴阳对照成立的情况下，OD_450nm大于0.215就可以判定为隐孢子虫抗体阳性，否则判为阴性。 

表18  阴阳临界值的确定 

3.6特异性实验 

用ELISA方法对申请人保存的伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）、球虫（Eimeria spp）和弓形虫（Toxoplasma gondii）阳性血清进行检测，并用阳性血清作阳性对照、PBS作阴性对照。 

如表19所示，三种不同包被抗原所建立的隐孢子虫间接ELISA方法具有较好的特异性，均不与伊氏锥虫、球虫和弓形虫阳性血清发生交叉反应。 

表19  间接ELISA特异性检测 

3.7临床样本的检测 

选30头粪检为阳性的牛，采血分离血清，编号1—30；连续粪检检测两年无隐孢子虫的牛场，采集10份牛血清，编号31—40。用三种不同包被抗原建立的ELISA方法来检测血清中的特异性抗体，根据阴阳临界值来判断阴阳性。OD_450nm大于阴阳临界值就可以判定为隐孢子虫抗体阳性，否则判为阴性。比较不同蛋白抗原的检出率，筛选出最好的包被抗原。 

如表20所示，以不同蛋白作为包被抗原，分别用建立的ELISA检测30份阳性样品， COWP蛋白和HSP70蛋白作为包被抗原均有2份样品低于阴阳临界值，检出率为93.3%；联合蛋白COWP-HSP70作为包被抗原，30份样品OD_450nm均大于0.215，均判为阳性，检测率为100%；而阴性场采的10份血清，均低于临界值，判为阴性，跟粪检的检测结果一致。从图1中可以看出，联合蛋白作为包被抗原所检的样品OD值要比单独蛋白抗原的OD值高。 

表20  间接ELISA法检测不同血清样品的隐孢子虫抗体 

根据临床样品的检出率判定，三种不同包被抗原建立的ELISA方法，联合蛋白COWP-HSP70的包被抗原为最佳包被抗原。单独基因蛋白COWP或HSP70为包被抗原，ELISA检出率为93.3%；联合蛋白COWP-HSP70为包被抗原的检出率为100%，跟粪检结果符合率达100%；如图1所示，从OD值的高低来判断，也证实COWP-HSP70联合蛋白作为包被抗原效果比单独的蛋白抗原要好，阳性血清的OD值均比单独蛋白抗原的OD值要高，肉眼判断较为明显。因此，筛选出用联合蛋白COWP-HSP70为三个蛋白抗原中最佳的包被抗原，以此包被抗原检测的30份阳性血清OD值最高为0.502，最小为0.294，平均为0.387，阴性血清OD_450nm最高值为0.181，最小为0.098，平均为0.134，与阴阳临界值0.215相比，阳性血清OD_450nm值显著要高，而阴性血清OD_450nm值较低。总之，联合蛋白COWP-HSP70抗原对隐孢子虫的血清诊断价值要高于单独基因蛋白COWP或HSP70抗原。 

上述研究摸索了间接ELISA方法的反应基本条件，优化了抗原、血清、酶标二抗的工作浓度，血清、酶标二抗和底物的反应时间。包被时，37℃湿盒中作用2h，4℃包被过夜，可以将抗原固定在酶标板上，然后用1%的脱脂奶粉封闭1h能够封闭未结合的抗原空隙，减少非特异性显色。血清作用时间，随着时间的加长，OD_450nm值会增加，但实验血清作用1h仍未能达到1.0左右，因此确定血清作用时间为2h。TMB显色液具有毒性小，稳定性强，不易氧化，可在4℃长期保存，实验确定TMB的显色时间为5min。按建立的间接ELISA方法对伊氏锥虫、球虫、弓形虫阳性血清进行特异性试验，结果表明建立的间接ELISA方法与以上几种血清抗体均无交叉反应，说明该抗原具有较好的特异性。 

3.8试剂盒的装配和ELISA最佳工作条件 

为便于实际检测使用，根据上述研究结果装配试剂盒，具体如下： 

包被酶标板：用包被液将包被抗原（卵囊壁蛋白COWP和热休克蛋白HSP70的串联体COWP-HSP70）稀释至0.05275μg/mL，加入96孔酶标板，100μL/孔，置于湿盒37℃作用2h后，4℃过夜；用PBST洗板3次，拍干，用封闭液封闭酶标板，置于湿盒37℃作用1h，用PBST洗板3次，拍干制得；封闭液为1%脱脂奶；包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，由Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加双蒸水定容至1 000mL而得，4℃保存。 

阴性标准血清是未免疫安氏隐孢子虫卵囊的健康BALB/c小鼠血清； 

阳性标准血清是免疫安氏隐孢子虫卵囊的健康BALB/c小鼠血清；采用皮下注射免疫方法，将安氏隐孢子虫卵囊经过超声破碎后，12000rpm离心10min，经过0.22μM滤膜过滤后，测定蛋白浓度；免疫18-20g的BALB/c小鼠，按体积比1:1与弗氏佐剂混合 均匀，用超声破碎仪破碎震荡20min充分乳化；免疫剂量为100μg/只，共免疫3次，间隔2周；同时用PBS免疫2只BALB/c小鼠，作为对照组；其中第1次免疫用弗氏完全佐剂FCA，加强免疫用福氏不完全佐剂FIA；三免后一周摘眼球采血，从而分离到的血清。 

酶标二抗是羊抗鼠-IgG； 

洗涤液由NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL而得； 

稀释液由脱脂奶粉1.0g，加洗涤液定容至100mL而得； 

底物液是TMB显色液（天根生物公司）； 

终止液由浓硫酸22.2mL，加蒸馏水177.8mL而得。 

使用时，包被酶标板以PBST洗涤后，加待检血清，37℃湿盒中作用2h；PBST洗涤后，加1:4000稀释的酶标二抗，37℃湿盒中作用30min；PBST洗涤后，加入TMB显色液，37℃湿盒中作用5min，加入50μL终止液，酶标仪测定OD_450nm。 

Claims (5)

1.一种牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液，其特征在于：所述包被酶标板以卵囊壁蛋白COWP和热休克蛋白HSP70的串联体COWP-HSP70作为包被抗原。

2.根据权利要求1所述的牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述卵囊壁蛋白COWP和热休克蛋白HSP70分别由序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的基因编码；所述串联体COWP-HSP70由序列表SEQ.ID.No.3的基因编码。

3.根据权利要求2所述的牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述包被酶标板是用包被液将包被抗原稀释至0.05275μg/mL，加入96孔酶标板，100μL/孔，置于湿盒37℃作用2h后，4℃过夜；用PBST洗板3次，拍干，用封闭液封闭酶标板，置于湿盒37℃作用1h，用PBST洗板3次，拍干制得；所述封闭液为1%脱脂奶；所述包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液。

4.根据权利要求2所述的牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，其特征在于：

所述阴性标准血清是未免疫安氏隐孢子虫卵囊的健康BALB/c小鼠血清；

所述阳性标准血清是免疫安氏隐孢子虫卵囊的健康BALB/c小鼠血清；

所述酶标二抗是羊抗鼠-IgG；

所述洗涤液由NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1 000mL而得；

所述稀释液由脱脂奶粉1.0g，加洗涤液定容至100mL而得；

所述底物液是TMB显色液；

所述终止液由浓硫酸22.2mL，加蒸馏水177.8mL而得；

所述包被液由Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加双蒸水定容至1 000mL而得。

5.根据权利要求4所述的牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述阳性标准血清采用皮下注射免疫方法，将安氏隐孢子虫卵囊经过超声破碎后，12000rpm离心10min，经过0.22μM滤膜过滤后，测定蛋白浓度；免疫18-20g的BALB/c小鼠，按体积比1:1与弗氏佐剂混合均匀，用超声破碎仪破碎震荡20min充分乳化；免疫剂量为100μg/只，共免疫3次，间隔2周；同时用PBS免疫2只BALB/c小鼠，作为对照组；其中第1次免疫用弗氏完全佐剂FCA，加强免疫用福氏不完全佐剂FIA；三免后一周摘眼球采血，从而分离到的血清。

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