CN110596402A - 一种快速检测绵羊肺炎支原体抗体的elisa试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测绵羊肺炎支原体抗体的ELISA试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液。通过构建表达载体获得免疫原性较强的重组绵羊肺炎支原体外膜蛋白MOL，以此作为包被抗原，建立了特异性强、灵敏度高的绵羊肺炎支原体抗体ELISA检测方法和试剂盒，将该试剂盒用于羊血清临床样品检测，将有助于深入开展绵羊肺炎支原体病的免疫预防和免疫价值研究，为快捷检测绵羊肺炎支原体抗体提供必要的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及绵羊肺炎支原体抗体检测技术领域，尤其涉及快速检测绵羊肺炎支原体抗体的ELISA试剂盒。
背景技术
重组表达在细菌病毒中的研究主要是将毒力基因重组表达，这可以提高目的蛋白的免疫原性；将其制成疫苗免疫，即可让动物产生更高保护率的抗体，从而有效防御病原的入侵。
羊支原体肺炎又称羊传染性胸膜肺炎，主要由绵羊肺炎支原体(MO)、丝状支原体山羊亚种(MMC)、山羊支原体山羊肺炎亚种(MCC)和山羊支原体山羊亚种(MCSC)等多种支原体引发的绵羊或山羊的一种传染病。我国多个省区均有支原体肺炎的报道，给养羊业造成了巨大的经济损失。目前对绵羊肺炎支原体抗体检测与防治工作力度薄弱，远远落后于实际需要，亟待找到一种适宜在羊场等基层推广应用的检测技术。
据调查研究显示：广西羊支原体流行株主要为MO、MMC。羊支原体肺炎的病原分离培养工作繁琐、困难，耗时久，间接血凝检测方法交叉反应严重，重复性差，PCR等分子生物学诊断方法成本高，不宜推广到基层，但是ELISA方法操作简便、交叉反应少、重复性好，各地大多已配备相关设备。羊群未免疫相关疫苗情况下，若感染支原体产生抗体，即可通过ELISA方法检出，因此建立特异性强、灵敏度高的ELISA方法无疑是目前最适合基层技术人员使用的快速诊断绵羊肺炎支原体的方法。发明旨在建立一种能适合羊场等基层使用的，快速检测羊肺炎支原体抗体的间接ELISA方法，推广先进的羊肺炎支原体抗体检测技术，保障绿色养羊产业发展和食品安全等方面具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种绵羊肺炎支原体抗体检测试剂盒，有助于绵羊肺炎支原体抗体监测和免疫评估。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种快速检测绵羊肺炎支原体抗体的ELISA检测试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液，所述包被酶标板以绵羊肺炎支原体外膜蛋白MOL作为包被抗原。
所述重组绵羊肺炎支原体外膜蛋白MOL由序列表SEQ.ID.No.1的基因编码。
所述包被酶标板是用pH 9.6的CBS缓冲液作为包被液，将包被抗原稀释至0.05275μg/mL，加入96孔酶标板，200μL/孔，置于湿盒37℃作用2h后，4℃过夜；用PBST洗板3次，拍干，用封闭液封闭酶标板，置于湿盒37℃作用1h，用PBST洗板3次，拍干制得；封闭液为1％脱脂奶；包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液。
所述阴性标准血清是绵羊肺炎支原体抗体阴性的山羊血清(稀释倍数1:800)；
所述阳性标准血清是绵羊肺炎支原体抗体阳性的山羊血清(稀释倍数1:800)；
所述酶标二抗是羊抗鼠-IgG(稀释倍数1:5000)；
所述包被液由Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加双蒸水定容至1000mL而得；
所述稀释液由脱脂奶粉1.0g，加洗涤液定容至100mL而得；
所述洗涤液由NaCl 8.0g，KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1 000mL而得；
所述底物液是TMB显色液；
所述终止液由浓硫酸22.2mL，加蒸馏水177.8mL而得。
所述包被抗原以pET-32a作为表达载体，酶切产物经胶回收后进行T4酶连接。
所述包被抗原连接反应体系为：MOL基因片段3uL，pET-32a载体1uL，T4连接酶1uL，水5uL；连接物放置4℃连接过夜。
本发明的有益效果为：
针对目前绵羊肺炎支原体缺乏简便有效检测手段的问题，通过构建表达载体获得免疫原性较强的重组绵羊肺炎支原体外膜蛋白MOL，以此作为包被抗原，建立了特异性强、灵敏度高的绵羊肺炎支原体抗体ELISA检测方法和试剂盒，将该试剂盒用于羊血清临床样品检测，将有助于深入开展绵羊肺炎支原体病的免疫预防和免疫价值研究，为快捷检测绵羊肺炎支原体抗体提供必要的技术手段。
附图说明
图1是绵羊肺炎支原体MOL基因扩增结果。图中：M：DNA marker；1：阴性对照；2：MOL基因。
图2是不同质粒pET-32a-MOL-BL21转化菌株的诱导表达SDS-PAGE电泳结果，图中：M：蛋白质标准Marker；1-4：重组菌株的诱导产物；5：空白对照。
图3是绵羊肺炎支原体外膜蛋白MOL的Western blot检测结果，图中：M：蛋白质标准Marker；1：绵羊肺炎支原体外膜蛋白MOL；2：空载体对照。
图4是鼠血清的Western blot检测结果，图中：M：蛋白质标准Marker；1：空载体对照；2：绵羊肺炎支原体外膜蛋白MOL。
具体实施方式
以下将详细说明本发明中绵羊肺炎支原体外膜蛋白表达、免疫原性鉴定及ELISA检测方法建立的研究过程。其中，绵羊肺炎支原体、阳性、阴性血清由本实验室制备保存；脱脂奶粉DifcoTM Skim milk购自Solarbio；酶标二抗：羊抗鼠-Ig G购自中杉金桥公司；其他试剂均为国产分析纯产品。
1.包被抗原的制备利用限制性内切酶分别酶切MOL基因(PCR扩增结果如图1)片段以及pET-32a表达载体，酶切产物经胶回收后进行T4酶连接。连接反应体系为：MOL基因片段3uL，pET-32a载体1uL，T4连接酶1uL，水5uL。连接物放置4℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ,转化细胞涂布至含有青霉素平板，过夜培养，挑取阳性克隆斑进行PCR鉴定。将PCR扩增阳性的菌斑扩大培养，用DNA提取试剂盒提取质粒DNA，质粒DNA分别进行限制性内切酶酶切鉴定及测序验证，成功构建了表达质粒pET-32a-MOL，阳性克隆菌用细菌冻存液-20℃和-80℃保存。
重组蛋白的表达与鉴定：阳性克隆菌与LB培养基按1:100的比例，在30℃条件下，0.5mmol/L的IPTG诱导5h，通过SDS-PAGE电泳凝胶来鉴定重组蛋白是否表达；挑取pET-32a-MOL的4株不同菌落，经IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳分析(如图4)，在约22.50kDa大小均出现目的蛋白带，选取表达量高的2号菌株进行后续试验。
2.重组蛋白(MOL)免疫原性检测(Western blot)
使用His和免疫的小鼠血清为一抗检测，均有目的条带出现(如图2和3)，即均能识别此重组蛋白，表明pET-32a-MOL蛋白具有免疫原性。
3.ELISA试剂盒的研制
3.1抗原的最佳浓度和血清最佳稀释倍数的确定用棋盘法可以得出MOL抗原最佳工作浓度和血清稀释度，结果见表1，从结果可以看出，当MOL抗原稀释10 000倍(0.087μg/mL)时，阳性对照的OD值约1.0，阴性血清的OD值约0.1。因此，确定MOL抗原最佳工作浓度为1:10000倍(0.087μg/mL)，血清最佳稀释倍数为1:800。
表1 MOL抗原最适稀释浓度的确定
3.2酶标二抗最佳工作浓度的确定抗原及血清均按最佳稀释倍数进行，分别以1:4000，1:5000，1:8000，1:10000稀释HRP-羊抗鼠-IgG，加入显色液，37℃作用15min，加入终止液，酶标仪测OD450nm吸光度。根据结果，选择阳性血清的OD450nm值在1.0左右、阴性血清OD450nm值在0.1左右的作为酶标二抗的最佳稀释度。
MOL蛋白作为包被抗原时，酶标二抗HRP-羊抗鼠-IgG按1:5000稀释，阳性对照的OD值为0.997±0.017，阴性血清的OD值0.085±0.004，本底较低，P/N值最大，结果见表2。因此，确定其酶标二抗的最佳工作浓度为1:5 000。
表2 MOL蛋白二抗最佳稀释倍数的确定
3.3血清作用时间的确定根据以上试验确定的抗原最佳包被浓度，37℃2h，4℃包被过夜；封闭1h后，按确定的血清稀释倍数稀释阴阳血清，37℃分别作用0.5，1.0，1.5，2.0h，加入最佳酶标二抗工作浓度，37℃1h，加入TMB，37℃显色15min，加入2M H2SO4终止反应，比较阴阳性血清OD450nm值，确定血清作用时间。
MOL蛋白作为包被抗原，阴阳血清作用时间见表3，当血清作用2.0h时，阳性对照OD值最大为0.986±0.003，阴性OD值为0.099±0.002，且P/N值最大，故确定血清作用时间为2.0h。
表3阴阳性血清反应时间的确定
3.4酶标二抗作用时间的确定按照ELISA程序依次包被抗原，封闭，加入阴阳血清，加入稀释好的HRP-羊抗鼠-Ig G，37℃分别作用0.5，1.0，1.5，2.0h，各设3个重复，然后加底物显色，测定OD450nm值。选择阳性OD450nm值在1.0左右，P/N值较大，阴性OD450nm值较小的作为酶标二抗作用时间。
MOL蛋白作为包被抗原，从表4中可以看出，当酶标二抗HRP-羊抗鼠-IgG作用0.5h时，阳性对照OD值为1.010±0.050，阴性血清OD值较低，本底也较低，故酶标二抗的作用时间确定为0.5h。
表4酶标二抗作用时间的确定
3.5底物显色时间的确定
按照前述确定的ELISA条件依次包被、封闭、加入血清和酶标二抗进行反应，然后加入显色液，设5，10，15，20，25，30 min六个作用时间，各设3个重复，测定OD450nm值，选取阳性OD450nm值在1.0左右，P/N值较大，阴性OD450nm值较小的作为底物显色时间。
MOL蛋白作为包被抗原，底物TMB显色时间的结果见表5，当底物显色5 min时，阳性OD值为0.997±0.018，阴性OD值较小，P/N值较大，因此，显色时间确定为5 min。
表5底物显色时间的确定
| 时间(min) | 阴性值 | 阳性值 | 空白值 | P/N |
| 5 | 0.084±0.007 | 0.997±0.018 | 0.067±0.004 | 54.71 |
| 10 | 0.090±0.011 | 1.236±0.085 | 0.067±0.002 | 50.82 |
| 15 | 0.091±0.016 | 1.355±0.054 | 0.065±0.003 | 49.61 |
| 20 | 0.081±0.023 | 1.478±0.019 | 0.061±0.002 | 70.85 |
| 25 | 0.086±0.011 | 1.445±0.045 | 0.064±0.002 | 62.77 |
| 30 | 0.081±0.006 | 1.496±0.038 | 0.056±0.001 | 57.60 |
3.6阴阳临界值的确定按前述研究结果建立的间接ELISA方法，检测20份阴性血清，每份设三个重复，计算OD450nm的平均值(X)和标准差(S)，以X+3S作为阴性和阳性的临界值。
以MOL蛋白作为包被抗原，按照上面建立的间接ELISA方法检测20份阴性血清(结果见表6)，阴阳性临界值＝阴性样本OD450nm平均值+3×标准方差。经计算阴阳性临界值＝0.121492+3×0.031236＝0.2152，因此，临界值为0.215。在阴阳对照成立的情况下，OD450nm大于0.215判定为绵羊肺炎支原体抗体阳性，否则判为阴性。
表6阴阳临界值的确定
| 血清样品 | 平均值 | 血清样品 | 平均值 | 血清样品 | 平均值 |
| 1 | 0.126±0.012 | 8 | 0.085±0.006 | 15 | 0.112±0.015 |
| 2 | 0.111±0.006 | 9 | 0.168±0.028 | 16 | 0.109±0.023 |
| 3 | 0.097±0.005 | 10 | 0.160±0.029 | 17 | 0.121±0.007 |
| 4 | 0.091±0.005 | 11 | 0.156±0.015 | 18 | 0.136±0.027 |
| 5 | 0.084±0.003 | 12 | 0.143±0.019 | 19 | 0.143±0.025 |
| 6 | 0.083±0.005 | 13 | 0.140±0.032 | 20 | 0.117±0.006 |
| 7 | 0.084±0.006 | 14 | 0.121±0.019 | ||
| 空白对照 | 0.067±0.006 | 阳性对照 | 0.989±0.028 |
3.7特异性实验用ELISA方法对申请人保存的绵羊肺炎支原体(MO)、丝状支原体山羊亚种(MMC)和牛支原体阳性血清进行检测，并用阳性血清作阳性对照、PBS作阴性对照。
如表7所示，绵羊肺炎支原体抗体间接ELISA方法具有较好的特异性，均不与丝状支原体山羊亚种和牛支原体阳性血清发生交叉反应。
表7间接ELISA特异性检测
3.8临床样本的检测选30头PCR检测绵羊肺炎支原体抗体为阳性的羊，采血分离血清，编号1—30；连续检测两年绵羊肺炎支原体抗体阴性的羊场，采集10份羊血清，编号31—40。利用建立的ELISA方法检测血清中的特异性抗体，根据阴阳临界值来判断阴阳性。OD450nmnm大于阴阳临界值即判定为绵羊肺炎支原体抗体阳性，否则判为阴性。
如表8所示，用建立的ELISA检测30份阳性样品，30份样品OD450nmnm均大于0.215，均判为阳性，检测率为100％；而检测阴性羊场的10份血清，均低于临界值，判为阴性，与间接血凝的检测结果一致。
表8间接ELISA法检测不同血清样品的绵羊肺炎支原体抗体
根据临床样品的检出率判定，建立的ELISA检测方法的检出率为100％，与间接血凝结果符合率达100％；以此包被抗原检测的30份阳性血清OD值最高为0.502，最小为0.294，平均为0.387，阴性血清OD450nm最高值为0.181，最小为0.098，平均为0.134，与阴阳临界值0.215相比，阳性血清OD450nm值显著高，而阴性血清OD450nm值较低。
上述研究摸索了间接ELISA方法的反应基本条件，优化了抗原、血清、酶标二抗的工作浓度，血清、酶标二抗和底物的反应时间。包被时，37℃湿盒中作用2h，4℃包被过夜，可以将抗原固定在酶标板上，然后用1％的脱脂奶粉封闭1h能够封闭未结合的抗原空隙，减少非特异性显色。血清作用时间，随着时间的加长，OD450nm值会增加，实验血清作用1h仍未达到1.0，因此确定血清作用时间为2h。TMB显色液具有毒性小，稳定性强，不易氧化，可在4℃长期保存，实验确定TMB的显色时间为5min。按建立的间接ELISA方法对丝状支原体山羊亚种(MMC)和牛支原体阳性血清进行特异性试验，结果表明建立的间接ELISA方法与以上几种血清抗体均无交叉反应，说明该抗原具有较好的特异性。
3.9试剂盒的装配和ELISA最佳工作条件为便于实际检测使用，根据上述研究结果装配试剂盒，具体如下：
包被酶标板：用包被液将包被抗原(重组蛋白MOL)稀释至0.05275μg/mL，加入96孔酶标板，250μL/孔，置于湿盒37℃作用2h后，4℃过夜；用PBST洗板3次，拍干，用封闭液封闭酶标板，置于湿盒37℃作用1h，用PBST洗板3次，拍干制得；封闭液为1％脱脂奶；包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液，由Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加双蒸水定容至1 000mL而得，4℃保存。
阴性标准血清是绵羊肺炎支原体抗体阴性的山羊血清；
阳性标准血清是绵羊肺炎支原体抗体阳性的山羊血清；
酶标二抗是羊抗鼠-IgG。
洗涤液由NaCl 8.0g，KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1 000mL而得；
稀释液由脱脂奶粉1.0g，加洗涤液定容至100mL而得；
底物液是TMB显色液(天根生物公司)；
终止液由浓硫酸22.2mL，加蒸馏水177.8mL而得。
使用时，
包被酶标板以PBST洗涤2次(200μl/孔)，每次静置2分钟后倒掉，再在干净吸水纸上拍干；
取稀释好的待检样品100μl加入到检测板中；阴阳对照各设2孔，每孔100μl；轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，37℃湿盒中作用2h；
甩掉板孔中的溶液，用PBST洗板3次，200μl/孔，每次静置3分钟后倒掉，再在干净吸水纸上拍干。
每孔加1:4000稀释的酶标二抗100μl，37℃湿盒中作用30min；
甩掉板孔中的溶液，用PBST洗板3次，200μl/孔，每次静置3分钟后倒掉，再在干净吸水纸上拍干。
加入TMB显色液，37℃湿盒中作用10min，
加入50μL终止液，10分钟内测定结果(检测前在振荡器上轻轻振动一下)，
酶标仪测定OD450nm。
结果判定试验成立的条件是阳性对照孔平均OD450nm值大于0.9，阴性对照孔平均OD450nm值必须小于0.2。
样品OD450nm值大于0.215，判为阳性；样品OD450nm值小于0.215，判为阴性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 一种快速检测绵羊肺炎支原体抗体的ELISA试剂盒
<141> 2019-09-12
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 596
<212> DNA
<213> Goat
<400> 1
ttcggcaact ttaaaaattc ttcaagaaaa ttttattctt gattagcgat ttttttaagt 60
tgtattttta caattttatt agtggataat tttagaatta cctgagttgt attgttattt 120
ttatcagttt catttttaat ttttgttggt gaatttaaaa aaattatttt tttgctgtta 180
ttattggtat tttttttagt ttcttattga ctaatgtttc caaaaattcc aaattcaaat 240
attagttttg aaagtaaggt tgtcgataaa gttagttttg gaaattttgt aaaatttgac 300
gatgataaaa tttttatccg gggtaatcaa tacgaaattg gaacactatt aaaacttagc 360
ggcaaacttg caagacctaa aaacacatca aattttgact ttatttcgta tttaaaatca 420
aaaggttcat ttttagtttt agaagatgca aaaattactt ttttagaaga aagcaatact 480
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ccgatgattt tccttggcga aactcccgtg gatgctagtg aatttcgaaa aatatt 596
Claims (7)
1.一种快速检测绵羊肺炎支原体抗体的ELISA试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液，其特征在于：所述包被酶标板以重组绵羊肺炎支原体外膜蛋白MOL作为包被抗原。
2.根据权利要求1所述的快速检测绵羊肺炎支原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：
所述重组绵羊肺炎支原体外膜蛋白MOL由序列表SEQ.ID.No.1基因编码。
3.根据权利要求2所述的快速检测绵羊肺炎支原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：
所述包被酶标板是用pH 9.6的CBS缓冲液作为包被液，将包被抗原稀释至0.05275 μg/mL，加入96孔酶标板，200μL/孔，置于湿盒37℃作用2h后，4℃过夜；用PBST洗板3次，拍干，用1%脱脂奶作为封闭液封闭酶标板，置于湿盒37℃作用1h，用PBST洗板3次，拍干制得。
4.根据权利要求3所述的快速检测绵羊肺炎支原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：
所述阴性标准血清是绵羊肺炎支原体抗体阴性山羊血清；
所述阳性标准血清是绵羊肺炎支原体抗体阳性山羊血清；
所述酶标二抗是羊抗鼠-IgG；
所述包被液由Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，加双蒸水定容至1000 mL而得；
所述稀释液由脱脂奶粉1.0 g，加洗涤液定容至100 mL而得；
所述洗涤液由NaCl 8.0 g，KH2PO4 0.2 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.58 g，Tween-20 0.5 mL，加双蒸水定容至1 000 mL而得；
所述底物液是TMB 显色液；
所述终止液由浓硫酸22.2 mL，加蒸馏水177.8mL而得。
5.根据权利要求1所述的快速检测绵羊肺炎支原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述包被抗原以pET-32a作为表达载体，酶切产物经胶回收后进行T4酶连接。
6.根据权利要求5所述的快速检测绵羊肺炎支原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述包被抗原连接反应体系为：MOL基因片段3uL，pET-32a载体1uL，T4连接酶1uL，水5uL；连接物放置4℃连接过夜。
7.根据权利要求4所述的快速检测绵羊肺炎支原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述阴性标准血清稀释倍数为 1:800；
所述阳性标准血清稀释倍数为 1:800；
所述酶标二抗稀释倍数为 1:5000。
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