CN111579793A - 一种用于牛支原体抗体检测的elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于牛支原体抗体检测的elisa试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒及其应用，该试剂盒包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、酶标二抗、PBST、封闭液、底物液和终止液。本发明通过构建表达载体获得免疫原性较强的重组牛支原体假定膜蛋白，以此作为包被抗原，建立了特异性强、灵敏度高的牛支原体抗体ELISA检测试剂盒。将该试剂盒用于牛血清临床样品监测，将有助于基层工作人员及时了解疫情动态，为疫情防控制定有效措施，而且本发明的检测试剂盒不需要昂贵且精密的仪器设备，具有很大的应用前景。

Description

一种用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及牛支原体抗体检测技术领域，尤其涉及快速检测牛支原体抗体的ELISA试剂盒。
背景技术
牛支原体（Mycoplasma bovis）是一种能引起牛呼吸综合征、乳房炎、母牛流产、关节炎、角膜结膜炎等疾病，基因组大小约为1 080 kb，环状双股DNA、介于病毒与细菌之间且能通过滤膜为0.22 μm的孔径的原核生物。自20世纪60年代美国分离到第一株牛支原体以来，相继有多国报道该病原的发现，已引起全世界范围内的广泛关注。随着牛贸易以及交通压力等因素可导致牛支原体呈广泛流行趋势，给养牛业带来巨大的经济损失，英国每年死于肺炎的犊牛约有15.7万头，其中约有2.5亿~3.3亿英镑的经济损失是由牛支原体引起的；美国每年由于感染该病而造成的经济损失高达3 200万美元。我国于2008年报道牛支原体肺炎疫情，随后，广西、湖北、甘肃、重庆、内蒙古、贵州、宁夏、新疆等地均有该病的报道。该病的发病率为50%~100%，病死率为20%~50%，给我国养牛业造成了严重的危害。因此，快速准确检出牛支原体感染情况，对养牛业健康发展具有非常重要的意义。
目前国内外对牛支原体的诊断方法主要有病原的分离鉴定、PCR检测技术和血清学诊断等方法。由于牛支原体的特殊结构，牛支原体培养的条件要求非常苛刻，而且牛支原体的生化特性与无乳支原体的生化特性基本一致，因此，给牛支原体的鉴别诊断带了困难。PCR技术具有快速、特异、敏感等优点，是目前牛支原体检测的主要方法，适用于感染或潜伏期排毒的牛群，主要用以检测肺脏组织、鼻拭子、纯化产物等病料。检测牛支原体的血清学方法主要有间接血凝试验、补体结合试验、生长抑制试验、琼扩试验、被动颗粒凝集试验以及酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，其中ELISA是最主要的牛支原体血清学检测方法。本研究利用分子生物信息学方法从牛支原体分离株BS2上选择假定膜蛋白进行原核表达，筛选出具有较好地免疫厡性蛋白，并以此作为包被抗原，建立牛支原体间接ELISA检测方法，该方法为大批量检测样品提供技术支持，为今后牛支原体的临床诊断和综合防控提供重要依据。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于牛支原体抗体检测试剂盒，有助于牛支原体抗体监测和免疫评估。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、酶标二抗、PBST、封闭液、底物液和终止液；
所述的包被酶标板是用包被液将包被抗原稀释获得；
所述包被抗原是通过应用生物信息学的方法筛选目的基因，再通过构建表达载体获得免疫原性较强的重组牛支原体假定膜蛋白，该蛋白序列如SEQ.ID.No.1所示。
优选地，所述包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液，由Na2CO3和NaHCO3组成。
优选地，所述的封闭液为5%脱脂奶粉。
优选地，所述阴性标准血清是牛支原体抗体阴性的牛血清；所述阳性标准血清是牛支原体抗体阳性的牛血清。
优选地，所述酶标二抗是HRP标记兔抗牛-IgG。
优选地，所述PBST由NaCl，KH2PO4， KCl，Na2HPO4·12H2O，Tween-20 组成。
优选地，所述底物液是TMB 显色液，所述终止液由浓硫酸和蒸馏水组成。
本发明还提供一种用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒的应用，按照以下步骤进行：
（1）抗原获得：通过构建表达载体获得免疫原性较强的重组牛支原体假定膜蛋白，以此作为包被抗原；
（2）包被孵育：将重组蛋白按1:80倍稀释按200 μL/孔包被到酶标板孔，孵育一定时间后移除上清液；
（3）封闭：按200 μL/孔加入封闭液，一定时间后移除孔内液体，按200 μL/孔添加
PBST，静止后移除孔内液体，重复洗涤数次后拍干；
（4）加样：对封闭后的板依次血清和二抗，之后加底物显色液；
（5）终止反应：按50 μL/孔加入终止液，在酶标仪上测定OD450值，并记录结果；
（6）判定结果：样品OD450值大于或等于临界值为阳性。
优选地，所述判定结果是样品OD450值大于或等于临界值0.389为阳性，小于临界值0.389为阴性。
本发明的有益效果为：
针对目前牛支原体缺乏简便有效检测手段的问题，通过构建表达载体获得免疫原性较强的牛支原体假定膜蛋白重组蛋白，以此作为包被抗原，建立了特异性强、灵敏度高的牛支原体抗体ELISA检测方法，将该试剂盒用于牛血清检测，将有助于基层工作人员及时了解牛支原体免疫或感染动态，为牛支原体防控制定有效措施。
附图说明
图 1是牛支原体假定膜蛋白基因扩增结果。图中：M：DNA marker；1：目的基因；2：阴性对照。
图2是不同质粒pET-32a-BS2转化菌株的诱导表达SDS-PAGE电泳结果，图中：M：蛋白质标准Marker；1：空白对照； 2-5：重组菌株的诱导产物。
图3是Western blot 检测结果，图中：M：蛋白质标准Marker；1：空载体对照；2：牛支原体假定膜蛋白。
具体实施方式
以下将详细说明本发明中牛支原体假定膜蛋白表达、免疫原性鉴定及ELISA检测方法建立的研究过程。其中，牛支原体分离株BS2、牛支原体阳性、牛支原体阴性血清由本专利申请者制备保存；酶标二抗是HRP标记兔抗牛-IgG购自Sigma公司；脱脂奶粉Difco TM Skim milk购自Solarbio；其他试剂均为国产分析纯产品。
1．包被抗原的制备
利用限制性内切酶分别酶切假定膜蛋白基因（PCR扩增结果如图1）片段以及pET-32a表达载体，酶切产物经胶回收后进行T4酶连接。连接反应体系为：假定膜蛋白基因片段3 μL，pET-32a载体1 μL，T4连接酶1 μL，T4连接Buffer 5 μL；连接物放置4 ℃连接过夜。将连接产物转化BL21感受态细胞,转化细胞涂布至含有青霉素平板，过夜培养，挑取阳性克隆斑进行PCR鉴定。将PCR扩增阳性的菌斑扩大培养，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，质粒DNA分别进行限制性内切酶酶切鉴定及测序验证，成功构建了表达质粒pET-32a-BS2，阳性克隆菌用细菌冻存液-20 ℃和-80 ℃保存。
重组蛋白的表达与鉴定：阳性克隆菌与LB培养基按1:100的比例，在37℃条件下，用1 mmol/L的IPTG诱导6 h，通过SDS-PAGE电泳凝胶来鉴定重组蛋白是否表达；挑取pET-32a-BS2的4株不同菌落，经IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳分析（如图2），在约47.3 kDa大小均出现目的蛋白带，选取表达量高的3号菌株进行后续试验。
2. 重组蛋白免疫原性检测（Western blot）
使用免疫的小鼠血清为一抗检测，有目的条带出现（如图3），说明能识别此重组蛋白，表明pET-32a-BS2蛋白具有免疫原性。
3. 间接ELISA试剂盒的研制
3.1 抗原的最佳浓度和血清最佳稀释倍数的确定
用棋盘法可以得出抗原最佳工作浓度和血清稀释度，结果见表1，从结果可以看出，当抗原稀释倍数为1:80时，阳性血清（P）的OD值约1.0，阴性血清（N）的OD值约0.1，阳性血清与阴性血清比值（P/N）最大。因此，确定抗原最佳工作稀释浓度为1:80，血清最佳稀释倍数为1:200。
表1 抗原最适稀释浓度的确定
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
3.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定
抗原及血清均按最佳稀释倍数进行，分别以1:1 000、1:2 000、1:3 000、1:4 000、1:5000稀释HRP标记兔抗牛-IgG，加入显色液，37 ℃作用15 min，加入终止液，酶标仪测OD450nm吸光度。当酶标二抗HRP标记兔抗牛-IgG按1: 3 000稀释，P的OD值约1.0，N的OD值约0.1，本底较低，P/N值最大，结果见表2。因此，确定其酶标二抗的最佳工作浓度为1:3 000。
表2 二抗最佳稀释倍数的确定
Figure 121990DEST_PATH_IMAGE004
3.3 血清作用时间的确定
根据以上试验确定的抗原最佳包被浓度，37 ℃ 2 h，4 ℃包被过夜；封闭2.5 h后，按确定的血清稀释倍数稀释阴阳血清，37 ℃分别作用0.5，1.0，1.5，2.0 h，加入最佳酶标二抗工作浓度，37 ℃ 1 h，加入TMB，37℃显色15 min，加入2 M H2SO4终止反应，比较阴阳性血清OD450 nm值，确定血清作用时间。当血清作用1.0 h时，P的OD值约1.0，N的OD值约0.1，P/N值最大，故确定血清作用时间为1 h。
表3 阴阳性血清反应时间的确定
时间/h 血清 空白值 OD450 nm P/N值
0.5 P 0.067 0.836 5.77
0.5 N 0.145
1.0 P 0.056 0.950 7.92
1.0 N 0.120
1.5 P 0.058 0.860 7.23
1.5 N 0.119
2.0 P 0.056 0.856 6.48
2.0 N 0.132
3.4 酶标二抗作用时间的确定
按照ELISA程序依次包被抗原，封闭，加入阴阳血清，加入稀释好的HRP标记兔抗牛-IgG，37 ℃分别作用0.5，1.0，1.5，2.0 h，各设3个重复，然后加底物显色，测定OD450 nm值。当酶标二抗HRP标记兔抗牛-IgG作用1.0 h时，P的OD值约1.0，N的OD值约0.1，P/N值最大，故确定血清作用时间为1.0 h。
表4 酶标二抗作用时间的确定
时间/h 血清 空白值 OD450 nm P/N值
0.5 P 0.061 0.822 6.09
0.5 N 0.135
1.0 P 0.058 1.101 8.34
1.0 N 0.132
1.5 P 0.056 0.826 6.40
1.5 N 0.129
2.0 P 0.055 0.815 6.57
2.0 N 0.124
3.5 底物显色时间的确定
按照前述确定的ELISA条件依次包被、封闭、加入血清和酶标二抗进行反应，然后加入显色液，设5，10，15 min三个作用时间，测定OD450 nm值。当底物显色15 min时，P的OD值约1.0，N的OD值约0.1，P/N值最大，因此，显色时间确定为15 min。
表5 底物显色时间的确定
时间/min 血清 空白值 OD450 nm P/N值
5 P 0.051 0.912 7.86
N 0.116
10 P 0.053 1.036 8.29
N 0.125
15 P 0.056 1.113 8.33
N 0.126
3.6 阴阳临界值的确定
按前述研究结果建立的间接ELISA方法，检测20份阴性血清，计算OD450 nm的平均值（X）和标准差（SD），以X+3SD作为阴性和阳性的临界值。
以重组蛋白作为包被抗原，按照上面建立的间接ELISA方法检测20份阴性血清（结果见表6），阴阳性临界值=阴性样本OD450 nm平均值+3×标准方差。经计算阴阳性临界值=0.25075+3×0.046024= 0.388822，因此，临界值为0.389。在阴阳对照成立的情况下，OD450nm大于0.215判定为牛支原体抗体阳性，否则判为阴性。
表6 阴阳临界值的确定
血清样品 OD450 nm 血清样品 OD450 nm 血清样品 OD450 nm
1 0.322 8 0.157 15 0.206
2 0.254 9 0.239 16 0.211
3 0.301 10 0.214 17 0.301
4 0.328 11 0.287 18 0.271
5 0.259 12 0.172 19 0.256
6 0.274 13 0.262 20 0.212
7 0.242 14 0.247
空白对照 0.055 阳性对照 1.039
3.7 特异性实验
用ELISA方法对申请人保存的牛传染性鼻气管炎病毒、布鲁氏菌、口蹄疫、牛支原体阳性血清进行检测，并用阳性血清作阳性对照、PBS作阴性对照。
如表7所示 ，牛支原体抗体间接ELISA方法具有较好的特异性，均不与牛传染性鼻气管炎病毒、布鲁氏菌、口蹄疫阳性血清发生交叉反应。
表7 间接ELISA特异性检测
阳性血清 OD<sub>450</sub> 阳性血清 OD<sub>450</sub>
牛传染性鼻气管炎病毒 0.235 布鲁氏菌 0.221
口蹄疫 0.138 牛支原体 0.867
空白对照 0.054
阴性对照 1.059 阳性对照 0.125
3.8 临床样本的检测
利用建立的ELISA方法检测和商品化ELISA方法分别对100份牛血清进行检测，结果用建立的ELISA方法检出23阳性和77份阴性，用商品化ELISA方法检测26份阳性和74份阴性，其中共同检测出20份阳性和71份阴性，总符合率为91%，说明该方法可行。
上述研究摸索了间接ELISA方法的反应基本条件，优化了抗原、血清、酶标二抗的工作浓度，血清、酶标二抗和底物的反应时间。包被时，37 ℃湿盒中作用2 h，4 ℃包被过夜，可以将抗原固定在酶标板上，然后用5%的脱脂奶粉封闭2.5 h能够封闭未结合的抗原空隙，减少非特异性显色。血清作用时间，随着时间的加长，OD450 nm值会增加，实验血清作用1 h达到1.0，因此确定血清作用时间为1 h。TMB显色液具有毒性小，稳定性强，不易氧化，可在4 ℃长期保存，实验确定TMB的显色时间为15 min。按建立的间接ELISA方法对牛传染性鼻气管炎病毒、布鲁氏菌、口蹄疫体阳性血清进行特异性试验，结果表明建立的间接ELISA方法与以上几种血清抗体均无交叉反应，说明该抗原具有较好的特异性。
3.9 试剂盒的装配和ELISA最佳工作条件
为便于实际检测使用，根据上述研究结果装配试剂盒，具体如下：
包被酶标板：用包被液将包被抗原（重组蛋白）稀释至80倍，加入96孔酶标板，200 μL/孔，置于湿盒37 ℃作用2 h后，4 ℃过夜；用PBST洗板3次，拍干，用封闭液封闭酶标板，置于湿盒37 ℃作用2.5 h，用PBST洗板3次，拍干制得；封闭液为5%脱脂奶粉；包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液，由Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，加双蒸水定容至1 000 mL，4 ℃保存。
阴性标准血清是牛支原体抗体阴性的牛血清；
阳性标准血清是牛支原体抗体阳性的牛血清；
酶标二抗是HRP标记兔抗牛-IgG。
PBST由NaCl 8.0 g，KH2PO4 0.2 g， KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.58 g，Tween-200.5 mL，加双蒸水定容至1 000 mL；
封闭液由脱脂奶粉5.0 g，加洗涤液定容至100 mL而得；
底物液是TMB 显色液（康为世纪生物科技有限公司）；
终止液由浓硫酸22.2 mL，加蒸馏水177.8 mL而得。
使用时，
包被酶标板以PBST洗涤3次(200 μL/孔)，每次静置2分钟后倒掉，再在干净吸水纸上拍干；
取稀释好的待检样品100 μL加入到检测板中；阴阳对照各设2孔，每孔100 μL；轻轻振匀孔中样品（勿溢出），37 ℃湿盒中作用1 h；
甩掉板孔中的溶液，用PBST洗板3次，200 μL/孔，每次静置3分钟后倒掉，再在干净吸水纸上拍干。
每孔加1: 3 000稀释的酶标二抗100 μL，37 ℃ 湿盒中作用1 h；
甩掉板孔中的溶液，用PBST洗板3次，200 μL/孔，每次静置3分钟后倒掉，再在干净吸水纸上拍干。
加入TMB显色液，37 ℃湿盒中作用15 min，
加入50 μL终止液，10分钟内测定结果（检测前在振荡器上轻轻振动一下），
酶标仪测定OD450 nm。
结果判定
试验成立的条件是阳性对照孔平均OD450 nm值大于0.389，阴性对照孔平均OD450 nm值必须小于0.389。
样品OD450 nm值大于0.389，判为阳性；样品OD450 nm值小于0.389，判为阴性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 一种用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒及其应用
<141> 2020-05-12
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1224
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 1
atgaataaaa aaataaatct actactgcca ataacaatta gcaccttgtc agtgctgatt 60
tcatcatcat gcaataatga agatgacatt ttcaatttaa aagcaaatac ggaagtaaaa 120
gccagtgaca ttttttataa aacatttttg tcgcaattaa aagcatatac attagagtct 180
ttactcaatg acttgcaaaa tggtatattg acgcttaatc ttcctaataa agttgatgaa 240
tttaagttaa gtaataataa agacgacatt atttttaagt acaaaagtaa aagttactca 300
ttaaaaaatg ttgcaaacaa aataaatggc tttgactttc atgaaatttt aagacctttt 360
acatatgaaa aagaagatgg taaatttatt gtaaaaagag caaaaaatat caatgacaag 420
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agtattcctg attcacaata tatgttgcaa agtgcttttg ttaacagtag tacacaattt 600
cctatgcaag taacatcaaa taatacaaga agcaaggcat tttttaagtc taaattccaa 660
caagaaattt tagagaaacg actttcaaat gagctaaaaa tttataattt tgcttctaat 720
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Claims (9)

1.一种用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒，其特征在于，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、酶标二抗、PBST、封闭液、底物液和终止液；
所述的包被酶标板是用包被液将包被抗原稀释获得；
所述包被抗原是通过应用生物信息学的方法筛选目的基因，再通过构建表达载体获得免疫原性较强的重组牛支原体假定膜蛋白，该蛋白序列如SEQ.ID.No.1所示。
2.根据权利要求1所述的用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液，由Na2CO3和NaHCO3组成。
3.根据权利要求1所述的用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的封闭液为5%脱脂奶粉。
4.根据权利要求1所述的用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒，其特征在于，所述阴性标准血清是牛支原体抗体阴性的牛血清；所述阳性标准血清是牛支原体抗体阳性的牛血清。
5.根据权利要求1所述的用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗是HRP标记兔抗牛-IgG。
6.根据权利要求1所述的用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒，其特征在于，所述PBST由NaCl，KH2PO4， KCl，Na2HPO4·12H2O，Tween-20 组成。
7.根据权利要求1所述的用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒，其特征在于，所述底物液是TMB 显色液，所述终止液由浓硫酸和蒸馏水组成。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒的应用，其特征在于，按照以下步骤进行：
（1）抗原获得：通过构建表达载体获得免疫原性较强的重组牛支原体假定膜蛋白，以此作为包被抗原；
（2）包被孵育：将重组蛋白按1:80倍稀释按200 μL/孔包被到酶标板孔，孵育一定时间后移除上清液；
（3）封闭：按200 μL/孔加入封闭液，一定时间后移除孔内液体，按200 μL/孔添加
PBST，静止后移除孔内液体，重复洗涤数次后拍干；
（4）加样：对封闭后的板依次血清和二抗，之后加底物显色液；
（5）终止反应：按50 μL/孔加入终止液，在酶标仪上测定OD450值，并记录结果；
（6）判定结果：样品OD450值大于或等于临界值为阳性。
9.根据权利要求8所述的用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒的应用，其特征在于，所述判定结果是样品OD450值大于或等于临界值0.389为阳性，小于临界值0.389为阴性。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022216162A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Pictor Limited Multiplex immunoassay for the detection of mycoplasma bovis infection

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107759674A (zh) * 2017-09-26 2018-03-06 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种牛支原体免疫相关性蛋白、含有该蛋白的检测试剂盒及其在牛支原体抗体检测中的用途
CN110483626A (zh) * 2019-08-23 2019-11-22 山东省农业科学院奶牛研究中心 牛支原体膜蛋白p59作为抗原蛋白的应用
CN110596402A (zh) * 2019-09-12 2019-12-20 广西壮族自治区兽医研究所 一种快速检测绵羊肺炎支原体抗体的elisa试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107759674A (zh) * 2017-09-26 2018-03-06 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种牛支原体免疫相关性蛋白、含有该蛋白的检测试剂盒及其在牛支原体抗体检测中的用途
CN110483626A (zh) * 2019-08-23 2019-11-22 山东省农业科学院奶牛研究中心 牛支原体膜蛋白p59作为抗原蛋白的应用
CN110596402A (zh) * 2019-09-12 2019-12-20 广西壮族自治区兽医研究所 一种快速检测绵羊肺炎支原体抗体的elisa试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "Sequence ID: CP042939.1", 《NCBI BLAST MYCOPLASMOPSIS BOVIS STRAIN NADC59 CHROMOSOME, COMPLETE GENOME》 *
吴翠兰等: "牛支原体广西分离株的致病性研究", 《黑龙江畜牧兽医》 *
韩林梅 等: "广西牛支原体主要抗原基因的变异分析", 《广西畜牧兽医》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022216162A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Pictor Limited Multiplex immunoassay for the detection of mycoplasma bovis infection

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