KR101873204B1 - 구제역 바이러스 입자 판별 방법 - Google Patents

구제역 바이러스 입자 판별 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101873204B1
KR101873204B1 KR1020160168915A KR20160168915A KR101873204B1 KR 101873204 B1 KR101873204 B1 KR 101873204B1 KR 1020160168915 A KR1020160168915 A KR 1020160168915A KR 20160168915 A KR20160168915 A KR 20160168915A KR 101873204 B1 KR101873204 B1 KR 101873204B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
foot
mouth disease
particles
disease virus
monoclonal antibody
Prior art date
Application number
KR1020160168915A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180067319A (ko
Inventor
탁동섭
이향심
고영준
박선영
김충수
이명헌
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020160168915A priority Critical patent/KR101873204B1/ko
Publication of KR20180067319A publication Critical patent/KR20180067319A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101873204B1 publication Critical patent/KR101873204B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
    • G01N2333/09—Foot-and-mouth disease virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 구제역 바이러스 입자 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 구제역 바이러스 입자 판별 방법은 종래의 완전 입자(146S)만을 판별할 수 있는 수크로즈 밀도구배 방식과 비교하여, 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)를 모두 판별할 수 있고, 상대적 분포를 비교할 수 있어, 구제역 백신 생산 공정 단계에서 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)를 정확하게 판별할 수 있어, 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

구제역 바이러스 입자 판별 방법{Method for diagnosising particle of Foot-and-Mouth Disease virus}
본 발명은 구제역 바이러스 입자 판별 방법에 관한 것이다.
구제역(foot-and-mouth disease)은 우제류의 동물에서 바이러스 감염으로 고열, 수포 등의 증상을 나타내며 어린 가축에서는 폐사를 일으키는 국내 제 1종 법정 가축전염병이다. 국내에서는 2000년 이후로 8회 발생하였으며 2010-2011년 발생 시에는 무려 약 3조원의 직접적인 경제적 피해를 초래하기도 하였다.
구제역바이러스(foot-and-mouth disease virus)는 총 4개의 단백질(VP1, VP2, VP3, VP4)로 구성되어 있다. 바이러스가 세포에서 증식할 때 생성되는 상기 4개의 단백질들이 1개씩 모여서 단일체(protomer)를 형성했다가 단일체 5개가 모여서 펜타머(pentamer)를 형성한다. 그 후, 펜타머 12개가 모여서 완전한 형태의 구제역바이러스 입자를 형성하고, 원심 분리의 밀도 및 침강 계수가 146S이므로, 완전 입자 형태를 상기 146S로 부르기도 한다. 또한, 상기 완전한 형태의 구제역바이러스가 고열이나 낮은 pH 등에 의해서 펜타머로 분해가 되고, 이를 분해 입자라고도 하며, 원심 분리의 밀도가 12S이므로, 분해 입자 형태를 상기 12S로 부르기도 한다. 구제역 바이러스의 분해산물인 상기 펜타머의 경우에는 완전한 형태에 비해서 면역원성이 훨씬 낮아진다는 것이 보고된 바 있어, 구제역 백신을 제조하는 단계 혹은 완제품 단계에서 구제역바이러스의 입자 형태에 대한 분석기법 확립이 필요한 상황이다.
현재 여러 백신제조사에서는 구제역바이러스 완전 입자(146S)의 측정을 위해 슈크로즈 밀도 구배를 이용한 초고속원심분리법을 사용하고 있으나 이를 위해서는 구제역 바이러스액을 농축해야 하기 때문에 많은 시간이 소요되고 고가의 초고속원심분리기가 필요하다. 또한, 핵산의 함량 측정을 통해서 구제역바이러스 회수율을 평가하기 때문에 핵산이 없는 분해 입자에 대한 유무를 파악하기는 어려움이 따른다. 따라서 구제역 백신 생산 공정 단계별로 적은 용량으로도 용이하게 구제역바이러스의 완전 입자와 분해 입자를 측정할 수 있는 기법의 개발이 절실한 상황이다.
이에 본 발명자들은 구제역 바이러스의 입자를 판별하기 위한 방법을 연구하던 중, 구제역 바이러스의 완전 입자 또는 분해 입자와 반응하는 각 항체를 선발하고, DAS ELISA를 수행하여 구제역 바이러스 입자를 판별할 수 있는 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 구제역 바이러스 입자 판별 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 구제역 바이러스 완전 입자 간접 측정 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 수탁번호 KCTC 11337BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체; 또는 KCTC 11319BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체;를 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus)에 반응시키는 단계;를 포함하는 구제역 바이러스 입자 판별 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) KCTC 11319BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체를 열처리군 및 비열처리군의 구제역 바이러스에 반응시키는 단계; 및 (2) 상기 열처리군 및 비열처리군의 흡광도를 비교하는 단계;를 포함하는, 구제역 바이러스 완전 입자 간접 측정 방법을 제공한다.
본 발명의 구제역 바이러스 입자 판별 방법은 종래의 완전 입자(146S)만을 판별할 수 있는 수크로즈 밀도구배 방식과 비교하여, 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)를 모두 판별할 수 있고, 상대적 분포를 비교할 수 있어, 구제역 백신 생산 공정 단계에서 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)를 정확하게 판별할 수 있어, 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1의 가는 종래의 수크로즈 밀도 구배 초고속원심분리방법을 이용하여 구제역 바이러스 완전 입자(146S) 반응 시의 흡광도를 나타내고, 나는 본 발명의 단클론항체인 76.5E(KCTC 11319BP)를 이용한 DAS ELISA 수행에 따른 구제역 바이러스 완전 입자(146S) 반응 시의 흡광도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 단클론항체인 76.5E(KCTC 11319BP)를 이용한 DAS ELISA를 수행에 따른 구제역 바이러스 완전 입자(146S)를 전자 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 단클론항체 또는 다클론항체(토끼 혈청)을 이용한 구제역 바이러스 완전 입자(146S)의 검출 효과를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 4의 가는 DAS ELISA를 수행하여 단클론항체인 76.5E(KCTC 11319BP)를 이용하여 검출된 구제역 바이러스의 완전 입자(146S)를, 나는 70-17(KCTC 11337BP) 항체를 이용하여 검출된 구제역 바이러스 분해 입자(12S)에 대한 입자를 전자 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5의 가는 단클론항체인 76.5E(KCTC 11319BP)를 이용하여 구제역 바이러스의 완전 입자(146S)를, 나는 분해 입자(12S)를 반응시킨 결과를 나타낸 도이다. 다는 단클론항체인 70-17(KCTC 11337BP)를 이용하여 구제역 바이러스의 완전 입자(146S)를, 라는 분해 입자(12S)를 반응시킨 결과를 나타낸 도이다.
도 6의 가는 수크로즈 밀도구배 초고속원심분리를 이용하여 구제역 바이러스 A형 (IRQ A22) 완전 입자(146S) 수득 시의 흡광도를 나타내고, 나는 70-17(KCTC 11337BP) 항체를 이용한 열처리전의 구제역 바이러스(완전 입자(146S))의 반응 결과를 나타내고, 다는 70-17(KCTC 11337BP) 항체를 이용한 열처리 후 구제역 바이러스(분해 입자(12S))의 반응 결과를 나타내며, 라는 상기 다에서 나의 흡광도를 뺀 값을 나타낸 도이다.
본 발명은 수탁번호 KCTC 11337BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체; 또는 KCTC 11319BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체;를 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus)에 반응시키는 단계;를 포함하는 구제역 바이러스 입자 판별 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 "구제역 바이러스 입자"는 완전 입자 또는 분해 입자로 나눌 수 있고, 원심 분리의 밀도 및 침강 계수에 따라 각 146S 또는 12S로 명명한다. 상기 "완전 입자"는 구제역 바이러스의 총 4개의 단백질(VP1, VP2, VP3, VP4)이 1개씩 모여 단일체(protomer)를 형성하고, 단일체 5개가 모여서 펜타머(pentamer)를 형성한 후, 펜타머 12개가 모인 것을 의미한다. 상기 "분해 입자"는 상기 펜타머를 의미한다.
본 발명에서 "입자 판별"이란, 시료 내 바이러스가 완전 입자 형태로 존재하는지, 분해 입자 형태로 존재하는지 여부를 판별하는 것을 의미한다.
상기 단클론항체는 종래 한국등록번호 10-1102841에 기재된 항체를 이용하였고, 수탁번호 KCTC 11337BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체는 본 발명에서 "70-17 항체"로 명명하였고, KCTC 11319BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체는 "76.5E 항체"로 명명하였다.
상기 수탁번호 KCTC 11337BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체와 반응하는 구제역 바이러스는 분해 입자(particle)이고, 상기 수탁번호 KCTC 11319BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체와 반응하는 구제역 바이러스는 완전 입자이며, 각 단클론항체에 대한 완전 입자 및 분해 입자의 특이적 반응에 기반하여 구제역 바이러스 입자 판별이 가능하다.
상기 구제역 바이러스는 O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혈청형이고, 바람직하게는, 상기 수탁번호 KCTC 11337BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체는 구제역 바이러스의 O, A 및 Asia-1형 분해 입자에 적용 가능하고, 수탁번호 KCTC 11319BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체는 구제역 바이러스 O형의 완전 입자에 적용 가능하다. 또한, 본 발명은 바람직하게는 국내 분리 구제역 바이러스에 적용 가능하며, 예컨대 진천주일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "구제역 바이러스의 혈청형"은 7개의 혈청형이 존재하며, 구제역 바이러스는 항원 변이성이 높아, 복제 과정에서 3D 폴리머라제가 유전자 교정(3D pol gene proofreading) 및 복제 후 수리 활성이 결여되어 있기 때문에 상기 혈청형이 존재한다.
상기 판별 방법은 DAS-ELISA(Double Antibody Sandwich- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), 경쟁적 ELISA(Competitive ELISA), 샌드위치 ELISA(Sandwich ELISA), 간접적 ELISA(Indirect ELISA) 및 직접적 ELISA(direct ELISA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 바람직하게는 DAS-ELISA이나, 구제역 바이러스의 입자를 판별하기 위한 목적을 달성하기 위해서라면 제한되지 않는다.
상기 열처리군은 50 내지 60도에서 30분 내지 2시간 조건으로 열을 가한 것이고, 바람직하게는 52도 내지 58도에서 50 분 내지 1시간 30분 동안 열을 가한 것이나, 구제역 바이러스를 사멸시키지 않고, 완전 입자에서 분해 입자로 분리하기 위한 목적을 달성하기 위한 조건이라면, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 본 발명은 DAS-ELISA를 사용할 수 있으며, (1) 수탁번호 KCTC 11337BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체; 또는 KCTC 11319BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체;를 구제역 바이러스와 반응시키는 단계; (2) 표지자가 표지된 수탁번호 KCTC 11337BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체; 또는 KCTC 11319BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체;를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (3) 상기 표지자를 측정하여 완전 입자 또는 분해 입자를 검출하는 단계;를 포함하는 구제역 바이러스 입자 판별 방법으로 완전 입자 및 분해 입자를 판별할 수 있다.
상기 표지자는 호스레디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase), 알칼리성 인산가수 분해효소(Alkaline phosphatase), 소이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민이소티오시아네이트(rhodanun B isothiocyanate, RITC) 및 피코에리트린(phycoerythrin, PE)이 공여된 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 바람직하게는 호스레디쉬 페록시다제이고 구제역 바이러스의 완전 입자 및 분해 입자와 반응할 수 있는 것이라면, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 (1) KCTC 11319BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체를 열처리군 및 비열처리군의 구제역 바이러스에 반응시키는 단계; 및 (2) 상기 열처리군 및 비열처리군의 흡광도를 비교하는 단계;를 포함하는, 구제역 바이러스 완전 입자 간접 측정 방법을 제공한다.
상기 (1)의 열처리군은 50 내지 60도에서 30분 내지 2시간 조건으로 열을 가한 것이고, 바람직하게는 52도 내지 58도에서 50분 내지 1시간 30분 동안 열을 가한 것이나, 구제역 바이러스를 사멸시키지 않고, 완전 입자에서 분해 입자로 분리하기 위한 목적을 달성하기 위한 조건이라면, 이에 제한되지 않는다.
상기 (1)의 구제역 바이러스는 O, A, C 및 Asia-1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혈청형이고, 바람직하게는 A 형이다.
본 발명의 목적 상, 구제역 바이러스 A형(IRQ A22) 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)를 포함하는 시료에 분해 입자(12S)와 반응하는 단클론항체 70-17(KCTC 11337BP)를 이용하여 먼저 분해 입자를 측정하고, 이후 열처리하여 완전 입자(146S)에서 분해된 분해 입자를 측정하면, 간접적으로 시료 내 완전 입자를 측정할 수 있다. 또한, 상기 열처리 전 후의 흡광도를 비교함에 따라, 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)의 상대적 분포를 비교할 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 수크로즈 밀도 구배 초고속원심분리 또는 DAS (Double Antibody Sandwich) ELISA를 이용한 구제역바이러스 완전 입자(146S) 수득 및 확인
구제역바이러스 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)를 수득하기 위하여 종래의 수크로즈 밀도 구배 초고속원심분리방법과 비교하여, 본 발명의 단클론항체 및 DAS ELISA 이용에 따른 완전 입자 수득을 확인하였다.
BHK21 세포를 배양하고 플라스크에 단층 형성이 확인되면, 구제역바이러스 (진천주)를 0.01 MOI(Muliplicity of Infection) 농도로 세포에 접종하였다. 이 후, 세포변성효과(Cytopathic effect; CPE)가 90% 이상 관찰되었을 때 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상기 바이러스 상층액에 불활화제로서 3% 바이너리에틸렌이민(Binaryethyleneimine)을 첨가하여 37에서 24시간동안 불활화하고 중화제(Sodium thiosulfate)로 BEI를 이용하여 중화하였다. 폴리에틸렌글리콜 6000을 7.5% 처리한 후에 고속원심분리(10000g x 30분)하여 펠렛을 수확하였고 이를 완충용액으로 현탁하여 수크로즈 밀도구배 초고속원심분리(110000g x 4시간)를 실시하였고 원심분리 튜브의 아랫부분부터 1 ml씩 분획을 회수하여 254nm에서의 흡광도를 확인하여 146S 형태의 존재를 확인하였다.
또한, 구제역바이러스 완전 입자에 결합하는 단클론항체인 76.5E(KCTC 11319BP)를 이용하여 DAS ELISA를 수행하여 완전 입자(146S) 수득을 확인하였다. 구체적으로, 96웰 마이크로플레이트(Maxisorp)에 구제역 바이러스 2㎍의단클론항체 76.5E(KCTC 11319BP)을 탄산완충용액(Carbonate buffer, pH 9.6)으로 1,000배 희석하였다. 그 후, 50㎕/웰 분주하여 4도에서 16시간 정치하였다. 그 후, 코팅한 마이크로플레이트를 세척액[0.05% 트윈 20(Tween 20)이 함유된 10 mM 인산완충용액(phosphate buffered buffer)]으로 3회 세척하여 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하고 나서 구제역바이러스 입자를 블로킹 용액(10mM 인산완충용액에 0.05% 트윈 20 및 5% 탈지유 첨가한 용액)으로 2진 희석하여 50㎕/웰 분주한 다음 37도에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 3회 세척하여 부착되지 않은 항원을 세척하여 제거한 후, 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 본 발명의 단클론항체 76.5E(KCTC 11319BP)를 블로킹용액으로 0.2㎍/ml 농도로 희석하여 50㎕/well씩 분주한 다음 37도에서 1시간동안 반응시켰다. 세척액으로 5회 세척하고 난 후, 발색제로서 티엠비(TMB) 용액을 50㎕/웰 첨가하여 15분 내외로 반응시켰다. 이후에 1.25N 황산용액을 50㎕/웰 첨가하여 발색반응을 정지시킨 다음, 254nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 종래의 수크로즈 밀도 구배 초고속원심분리방법으로 완전 입자(146S) 수득시의 흡광도와(가), 본 발명의 단클론항체인 76.5E(KCTC 11319BP)를 이용한 DAS ELISA를 수행한 결과를 비교한 결과, 254nm에서의 흡광도에 대하여 동일한 결과가 나타났으며, 4번째 분획 구역에서 구제역 바이러스 완전 입자를 수득함을 확인하였다(나).
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단클론항체 76.5E(KCTC 11319BP)를 이용한 DAS ELISA를 수행하여 수득한 구제역 바이러스의 완전 입자를 전자 현미경으로 살펴본 결과, 25 - 30nm 크기의 완전 입자가 나타남을 확인하였다.
실시예 2. 구제역 바이러스 분해 입자(12S)의 포집 항체로서의 단클론항체와 다클론항체 간의 반응성 비교
구제역 바이러스 분해 입자(12S)의 포집 항체로서 본 발명의 단클론항체70-17(KCTC 11337BP)와 종래 다클론항체 간의 반응성을 DAS ELISA을 수행하여 비교하였다.
구체적으로, 96웰 마이크로플레이트(Maxisorp)에 단클론항체 70-17(KCTC 11337BP) 혹은 다클론항체(토끼항혈청; 영국 퍼브라이트연구소에서 입수한 LPB ELISA 키트내 항혈청)를 탄산완충용액(Carbonate buffer, pH 9.6)으로 1,000배 희석하였다. 그 후, 2㎕의 농도로 50㎕/웰 분주하여 4도에서 16시간 정치하였다. 그 후, 코팅한 마이크로플레이트를 세척액[0.05% 트윈 20(Tween 20)이 함유된 10 mM 인산완충용액(phosphate buffered buffer)]으로 3회 세척하여 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하고 나서 구제역바이러스 입자를 블로킹 용액(10mM 인산완충용액에 0.05% 트윈 20 및 5% 탈지유 첨가한 용액)으로 2진 희석하여 50㎕/웰 분주한 다음 37도에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 3회 세척하여 부착되지 않은 항원을 세척하여 제거한 후, 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 본 발명의 단클론항체 70-17(KCTC 11337BP)를 블로킹용액으로 0.2㎍/ml 농도로 희석하여 50㎕/well씩 분주한 다음 37도에서 1시간동안 반응시켰다. 세척액으로 5회 세척하고 난 후, 발색제로서 티엠비(TMB) 용액을 50㎕/웰 첨가하여 15분 내외로 반응시켰다. 이후에 1.25N 황산용액을 50㎕/웰 첨가하여 발색반응을 정지시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단클론항체와 비교하여 다클론항체인 토끼 혈청으로 DAS ELISA를 수행한 결과, 본 발명의 단클론항체를 이용한 DAS ELISA를 수행 시 다클론항체 이용군과 비교하여 구제역 바이러스 완전 입자(146S)에 대한 반응성이 낮으므로, 상기와 같은 결과를 통해 항원 포집과 검출이 동시에 가능한 DAS-ELISA에 단클론 항체를 이용하는 경우 높은 특이도로 반응할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 구제역바이러스 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)의 확인 및 항체에 대한 반응성 비교
상기 실시예 1에서 사용된 구제역 국내 분리주인 진천주의 혈청형이 O형이므로, 구제역바이러스 O형의 완전 입자(146S) 또는 분해 입자(12S)의 바이러스 입자를 확인하고, 상기 각 입자에 대한 항체 반응성을 확인하기 위하여, 76.5E(KCTC 11319BP) 항체 또는 70-17(KCTC 11337BP) 항체를 각각 이용하여 DAS ELISA를 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 획득한 구제역바이러스 O형의 완전 입자(146S)를 56도에서 1시간 동안 열처리하여 분해 입자(12S)를 확보하였고 구제역바이러스 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)를 전자현미경으로 확인하였다.
또한, DAS ELISA를 수행하기 위하여, 96웰 마이크로플레이트(Maxisorp)에 구제역바이러스 단클론항체 76.5E(KCTC 11319BP) 또는 70-17(KCTC 11337BP)를 탄산완충용액(Carbonate buffer, pH 9.6)에 각 2㎍ 농도로 50㎕/웰 분주하여 4도에서 16시간 정치하였다. 이튿날, 코팅한 마이크로플레이트를 세척액[0.05% 트윈 20(Tween 20)이 함유된 10 mM 인산완충용액(phosphate buffered buffer)]으로 3회 세척하여 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하였다. 그 후, 구제역바이러스 완전 입자 혹은 분해 입자 시료를 블로킹 용액(10mM 인산완충용액에 0.05% 트윈 20 및 5% 탈지유를 첨가한 용액)으로 단계 희석하여 50㎕/웰 분주한 다음 37도에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 3회 세척하여 부착되지 않은 항원을 세척하여 제거한 후, 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 76.5E(KCTC 11319BP) 또는 70-17(KCTC 11337BP) 단클론항체를 블로킹용액으로 0.2㎍/ml 농도로 희석하여 50㎕/well씩 분주한 다음 37도에서 1시간동안 반응시켰다. 세척액으로 5회 세척하고 나서, 발색제로서 티엠비(TMB) 용액을 50㎕/웰 첨가하여 15분 내외로 반응시켰다. 이후에 1.25N 황산용액을 50㎕/웰 첨가하여 발색반응을 정지시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 25 - 30nm 크기의 완전 입자(146S)를 확인하였다(가). 또한, 상기 완전 입자에 열처리하여 분해된 약 10nm 정도 크기의 분해 입자(12S)(나) 또한 제대로 형성됨을 확인하였다.
또한, 도 5의 가 및 다에 나타낸 바와 같이, 구제역바이러스 O형의 완전 입자(146S)에 76.5E(KCTC 11319BP) 항체를 이용할 경우, 상기 완전 입자(146S)의 320배 희석배수에서도 흡광도가 2 이상인 높은 반응성이 나타남을 확인하였다. 반면, 완전 입자(146S)에 70-17(KCTC 11337BP) 항체를 이용할 경우, 320배 희석 배수에서 0.2 이하의 베이스라인 흡광도가 나타남을 확인하였다.
또한, 도 5의 나 및 라에 나타낸 바와 같이, 구제역바이러스 O형의 분해 입자(12S)에 76.5E(KCTC 11319BP) 항체를 이용할 경우, 0.2이하의 베이스라인 흡광도가 나타남을 확인하였다. 반면, 분해 입자(12S)에 70-17(KCTC 11337BP) 항체를 이용할 경우, 상기 분해 입자(12S)의 320배 희석배수에서도 흡광도가 2 이상인 높은 반응성이 나타남을 확인하였다.
따라서, 구제역바이러스 O형의 완전 입자(146S) 판별 시에는 76.5E(KCTC 11319BP) 항체를, 분해 입자(12S) 판별 시에는 70-17(KCTC 11337BP) 항체를 이용하는 것이 가장 효과적임을 확인하였다.
실시예 4. 구제역바이러스 A형 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)의 판별 방법 확인
단클론항체 70-17(KCTC 11337BP)는 구제역 바이러스 O, A 및 Asia-1와 결합 가능하므로, O형 외에 A형에도 입자 형태를 판별할 수 있는 여부를 확인하였다. 특히, 분해 입자(12S)에 특이적인 단클론항체 70-17(KCTC 11337BP)를 이용하여 완전 입자(146S)에 대한 간접적인 판별 방법을 수립하였다.
구체적으로, 검출하고자 하는 시료에는 구제역 바이러스 A형 (IRQ A22) 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)가 혼합되어 있을 가능성이 존재하므로, 이를 이용하여 구제역 바이러스 A형 (IRQ A22) 완전 입자(146S)를 간접적으로 측정하였다. 먼저, 완전 입자(146S)를 수득하기 위하여, 구제역 바이러스 A형(IRQ A22)에 종래의 수크로즈 밀도구배 초고속원심분리를 수행하여 아래부터 1 내지 11의 분획을 수득하고 완전 입자(146S)에 대한 흡광도(254nm)를 확인하고, 이를 완전입자 확인 대조군으로 이용하였다. 이 후, 본 발명의 상기 구제역 바이러스 A형 (IRQ A22) 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)를 포함하는 상기 시료에 대하여, 단클론항체 70-17(KCTC 11337BP)를 이용하여 DAS ELISA를 수행하고, 분해 입자(12S)에 대한 흡광도를 확인하였다(450nm)(도 6의 나). 이 후, 시료에 37도에서 1시간 열처리하고 단클론항체 70-17(KCTC 11337BP)를 이용하여 DAS ELISA를 수행하고 분해 입자(12S)에 대한 흡광도를 확인하였다(450nm)(도 6의 다). 이 후, 열처리 후의 분해 입자(12S)에 대한 흡광도에서(도 6의 다), 열처리 전의 분해 입자(12S)에 대한 흡광도(도 6의 나)를 뺀 것으로, 간접적으로 완전 입자(146S)의 존재를 확인하고, 이에 따라 분해 입자(12S)의 존재를 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6의 가에 나타난 바와 같이, 분획 4 및 5에서 수크로즈 밀도구배 초고속 원심 분리하여 수득한 구제역 바이러스 A형(IRQ A22) 완전 입자(146S)의 흡광도(254nm)를 확인하였다.
또한, 나에 나타낸 바와 같이, 열처리 전의 구제역 바이러스 A형(IRQ A22) 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)를 포함하는 상기 시료에 단클론항체 70-17(KCTC 11337BP)를 이용하여 흡광도를 측정한 결과, 분획 10에서 분해 입자(12S)의 흡광도(450nm)를 확인하였다.
또한, 다에 나타낸 바와 같이, 완전 입자(146S)를 분해 입자(12S)로 분해하기 위한 열처리 후, 단클론항체 70-17(KCTC 11337BP)를 이용하여 흡광도를 측정한 결과, 분획 4, 5 및 10에서 분해 입자(12S)의 흡광도(450nm)를 확인하였다.
따라서, 단클론항체 70-17(KCTC 11337BP)를 이용한 완전 입자(146S)의 간접적인 측정을 위하여, 상기 다의 흡광도 측정 결과에서 나의 흡광도 측정 결과를 뺀 결과, 열처리 후 분획 4 및 5에서 450nm의 흡광도가 나타남을 확인함에 따라, 상기 분획 4 및 5는 완전 입자(146S)에서 열처리 되어 분해된 분해 입자(12S)임을 확인하였다. 또한, 상기 가에 나타낸 대조군으로서 수크로즈 밀도구배 초고속원심 분리를 이용하여 완전 입자(146S)를 측정한 결과에서도, 완전 입자(146S)의 흡광도를 분획 4 및 5에서 나타남을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 완전 입자(146S)를 간접적으로 측정이 가능함을 확인하였다.
따라서, 구제역 바이러스 A형(IRQ A22) 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)를 포함하는 시료에 분해 입자(12S)와 반응하는 단클론항체 70-17(KCTC 11337BP)를 이용하여 먼저 분해 입자를 측정하고, 이후 열처리하여 완전 입자(146S)에서 분해된 분해 입자를 측정하면, 간접적으로 시료 내 완전 입자를 효과적으로 측정할 수 있다. 또한, 상기 열처리 전 후의 흡광도를 비교함에 따라, 완전 입자(146S) 및 분해 입자(12S)의 상대적 분포를 비교할 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC11319BP 20080423 한국생명공학연구원 KCTC11337BP 20080521

Claims (10)

  1. 다음 단계를 포함하는 구제역 바이러스 입자 판별 방법:
    (1) 표지자가 표지된 수탁번호 KCTC 11337BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체; 또는 표지자가 표지된 수탁번호 KCTC 11319BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체;를 항원인 구제역 바이러스와 반응시키는 단계; 및
    (2) 상기 표지자를 측정하여 완전 입자 또는 분해 입자를 검출하는 단계로서,
    상기 수탁번호 KCTC 11337BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체에 대한 반응이 검출되면, 상기 구제역 바이러스는 원심 분리의 밀도 및 침강 계수가 12S인 분해 입자(particle)로 판별하고;
    상기 수탁번호 KCTC 11319BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체에 대한 반응이 검출되면, 상기 구제역 바이러스는 원심 분리의 밀도 및 침강 계수가 146S인 완전 입자로 판별하는 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 입자 판별 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 표지자는 호스레디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase), 알칼리성 인산가수 분해효소(Alkaline phosphatase), FITC(fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine B isothiocyanate) 및 피코에리트린(phycoerythrin, PE)이 공여된 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 입자 판별 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 구제역 바이러스는 O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혈청형인 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 입자 판별 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 판별 방법은 DAS-ELISA(Double Antibody Sandwich- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), 경쟁적 ELISA(Competitive ELISA), 샌드위치 ELISA(Sandwich ELISA), 간접적 ELISA(Indirect ELISA) 및 직접적 ELISA(direct ELISA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 입자 판별 방법.
  8. (1) 수탁번호 KCTC 11319BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체를 열처리군 및 비열처리군의 구제역 바이러스에 각각 반응시키는 단계; 및
    (2) 상기 열처리군 및 비열처리군의 흡광도를 비교하는 단계;를 포함하는, 구제역 바이러스 완전 입자 간접 측정 방법으로서,
    상기 (1) 단계의 열처리군은 50 내지 60도에서 30분 내지 2시간 조건으로 열을 가함으로써 구제역 바이러스를 사멸시키지 않고, 원심 분리의 밀도 및 침강 계수가 146S인 완전 입자에서 원심 분리의 밀도 및 침강 계수가 12S인 분해 입자로 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서,
    상기 (1)의 구제역 바이러스는 O, A, C 및 Asia-1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혈청형인 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 완전 입자 간접 측정 방법.
KR1020160168915A 2016-12-12 2016-12-12 구제역 바이러스 입자 판별 방법 KR101873204B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160168915A KR101873204B1 (ko) 2016-12-12 2016-12-12 구제역 바이러스 입자 판별 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160168915A KR101873204B1 (ko) 2016-12-12 2016-12-12 구제역 바이러스 입자 판별 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180067319A KR20180067319A (ko) 2018-06-20
KR101873204B1 true KR101873204B1 (ko) 2018-07-12

Family

ID=62769954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160168915A KR101873204B1 (ko) 2016-12-12 2016-12-12 구제역 바이러스 입자 판별 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101873204B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2712769C1 (ru) * 2019-05-27 2020-01-31 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070046390A (ko) * 2005-10-31 2007-05-03 주식회사 제노바이오텍 구제역 바이러스 3ａｂ 비구조단백질과 이에 특이적으로반응하는 단일클론 항체 및 이들의 조합을 이용한 구제역바이러스의 비구조단백질 항체 검사 또는 구제역의 진단방법
KR20100001169A (ko) * 2008-06-26 2010-01-06 주식회사 제노바이오텍 하이브리도마 세포주, 이에 의해 생산된 단클론항체,구제역 진단 시약, 진단 키트 및 구제역 바이러스 중화항체검출방법
KR20120132223A (ko) * 2011-05-27 2012-12-05 차의과학대학교 산학협력단 구제역 바이러스 검출용 단일클론 항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 검출방법
KR20120132227A (ko) * 2011-05-27 2012-12-05 차의과학대학교 산학협력단 다중 타입 구제역 바이러스 검출용 단일클론 항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 검출방법
KR20150047833A (ko) * 2013-10-25 2015-05-06 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) 세포 배양에 적응된 구제역 ｏ 혈청형-동남아 지역형의 바이러스 백신주 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070046390A (ko) * 2005-10-31 2007-05-03 주식회사 제노바이오텍 구제역 바이러스 3ａｂ 비구조단백질과 이에 특이적으로반응하는 단일클론 항체 및 이들의 조합을 이용한 구제역바이러스의 비구조단백질 항체 검사 또는 구제역의 진단방법
KR20100001169A (ko) * 2008-06-26 2010-01-06 주식회사 제노바이오텍 하이브리도마 세포주, 이에 의해 생산된 단클론항체,구제역 진단 시약, 진단 키트 및 구제역 바이러스 중화항체검출방법
KR20120132223A (ko) * 2011-05-27 2012-12-05 차의과학대학교 산학협력단 구제역 바이러스 검출용 단일클론 항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 검출방법
KR20120132227A (ko) * 2011-05-27 2012-12-05 차의과학대학교 산학협력단 다중 타입 구제역 바이러스 검출용 단일클론 항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 검출방법
KR20150047833A (ko) * 2013-10-25 2015-05-06 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) 세포 배양에 적응된 구제역 ｏ 혈청형-동남아 지역형의 바이러스 백신주 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
T R Doel et al., Archives of Virology(1982), vol. 73, pp. 185-191. *
비특허문헌1 (1982) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2712769C1 (ru) * 2019-05-27 2020-01-31 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180067319A (ko) 2018-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mackay et al. A solid-phase competition ELISA for measuring antibody to foot-and-mouth disease virus
US8067560B2 (en) SRSV detection kit
Wolfaardt et al. Incidence of human calicivirus and rotavirus infection in patients with gastroenteritis in South Africa
KR101848194B1 (ko) Csfv 항체에 대한 개선된 진단 시험
Zhao et al. Development and application of an indirect ELISA for detection of antibodies against avian hepatitis E virus
CN110596402B (zh) 一种快速检测绵羊肺炎支原体抗体的elisa试剂盒
Steele et al. Circulation of the novel G9 and G8 rotavirus strains in Nigeria in 1998/1999
WO2012163263A1 (en) Reagents and methods for prrsv detection
CN108918869B (zh) fiber2蛋白及其重组蛋白在检测血清4型禽腺病毒抗体方面的应用
CN108107208B (zh) 一种基于纤突蛋白f的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒
Zhang et al. Development and evaluation of a VP3-ELISA for the detection of goose and Muscovy duck parvovirus antibodies
US20220194991A1 (en) Recombinant canine parvovirus 2a vp2 and 2b vp2 antigen protein, and use thereof
CN116034275A (zh) 灭活SARS-CoV-2的方法及其在抗体检测中的应用
Hawkes et al. Laboratory and field studies of an antigen capture ELISA for bluetongue virus
CN110016078B (zh) 一种基于pedv n蛋白特异性纳米抗体的阻断elisa的检测方法及其应用
KR101873204B1 (ko) 구제역 바이러스 입자 판별 방법
Zhao et al. Identification and characterization of nanobodies from a phage display library and their application in an immunoassay for the sensitive detection of African swine fever virus
CN108866008B (zh) 抗锦鲤疱疹病毒的单克隆抗体及其细胞株和应用
Hoet et al. Comparison of ELISA and RT-PCR versus immune electron microscopy for detection of bovine torovirus (Breda virus) in calf fecal specimens
Li et al. Isolation and genetic analysis of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China
JP6391477B2 (ja) 口蹄疫ウイルスと反応する抗体
CN111579793A (zh) 一种用于牛支原体抗体检测的elisa试剂盒及其应用
KR20170079550A (ko) 말 게타바이러스 혈청 진단방법
KR100430935B1 (ko) 대장균 발현 재조합 3ａｂｃ 비구조단백질 및단클론항체를 이용한 구제역 진단방법
Balam et al. Studies of the Antigenic relationships between Bluetongue virus serotypes 2, 9 & 15 isolated in Andhra Pradesh, India

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right