CN116034275A - 灭活SARS-CoV-2的方法及其在抗体检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用灭活的SARS‑CoV‑2病毒检测样品中抗SARS‑CoV‑2抗体的检测方法,该方法包括将生物样品与灭活的纯化SARS‑CoV‑2全病毒颗粒在合适的条件下孵育,以获取SARS‑CoV‑2病毒/抗体复合物并检测这种复合物。
Description
技术领域
本发明涉及使用灭活的SARS-CoV-2病毒检测样品中抗体的检测方法。
背景技术
2019年底出现了一种新型人类冠状病毒,名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2,也称为COVID-19综合征)。COVID-19相关疾病已演变成全球人道主义危机,并导致2.319.066例确诊病例,其中157.970例确诊死亡(7%)[1]。COVID-19是一种新的综合症,不同于由冠状病毒引起的其他疾病,例如严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(MERS)[2]。
正如世界卫生组织(WHO)所强调的那样,检测SARS-CoV-2的诊断分析对于快速有效地发现所有COVID-19疑似病例非常重要,以便隔离和治疗确诊病例,此外,对于追踪其接触者和避免病毒传播也很重要。
确认COVID-19病例的诊断测试基于通过核酸扩增测试对病毒RNA的独特序列的检测,例如实时逆转录聚合酶链反应(rRT-PCR),必要时通过核酸测序确认[3]。
血清学筛查和检测可以帮助调查正在发生的疫情,并对疫情的发病率或程度进行回顾性评估。如果PCR阴性且与COVID-19感染有流行病学上的关联,血清学检测可以支持诊断。此外,抗体检测可用于验证疫苗的效力或检测无症状病例。事实上,抗体揭示了先前或持续感染的证据[4]。
据报道,一些血清学免疫测定法的开发可用于检测血清或血浆中的SARS-CoV-2病毒蛋白和抗体[5]。用于检测SARS-CoV-2感染的最广泛使用的生物标志物是从病毒感染的第二周开始产生的IgM和IgG抗体。IgM应答比IgG更早出现,但随后会减少并消失。另一方面,IgG在感染后可以长期存在,并可能具有保护作用。
血清学免疫测定的开发策略可以基于单个病毒抗原的使用或基于不同病毒抗原的组合使用。使用SARS-CoV-2蛋白或其重组形式作为抗原,已经开发了用于确定COVID-19样品中抗体水平的不同免疫测定法。
用作免疫分析抗原的SARS-CoV-2结构蛋白通常包括刺突蛋白(S)和核衣壳(N)蛋白。位于病毒表面的S蛋白对于附着于宿主细胞很重要,据报道它具有高度免疫原性。N蛋白参与病毒RNA的转录和复制,并干扰宿主细胞的细胞周期进程。在许多冠状病毒中,N蛋白具有很高的免疫原活性,并且在感染期间大量表达。基于重组S蛋白的ELISA进行IgM检测灵敏度高于使用N蛋白开发的ELISA[6]。IgA应答可能比IgM更早出现和发展,导致比IgM更强和更持久的应答[7]。
血清学检测的特异性很大程度上取决于所用蛋白质的类型和质量,这是因为与其他冠状病毒的交叉反应可能导致假阳性结果。事实上,例如,SARS-CoV-2的S蛋白与SARS的S蛋白具有75%的氨基酸相同性,与其他常见的引起感冒的冠状病毒具有约50-60%的氨基酸相同性[4]。
此外,研究表明,SARS-CoV-2的S蛋白中发生的构象变化是膜融合和病毒进入的基础[8,9]。因此,在构象表位的情况下,使用重组蛋白可能对抗体检测无效。
基于使用灭活的全病毒抗原SARS-CoV-2的诊断免疫分析的开发可能是一种解决方案,因此它是本发明的目的。
此外,这种策略允许开发一种诊断免疫分析法,该测定法可以很容易地与免疫荧光技术相关,这是病毒学的参考方法。
发明内容
本发明涉及大规模制备灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2及其用于生产诊断性免疫分析的用途,所述诊断性免疫分析用以检测生物样品,最好是人类样品中与COVID-19相关的IgG和/或IgM和/或IgA抗体。
在本发明中,令人惊讶地发现灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2,具体是2019-nCoV/Italy-INMI1株(GenBank:SARS-CoV-2/INMI1-Isolate/2020/Italy:MT066156),对与COVID-19相关的抗体具有高选择性和特异性。
具体地,本发明的优势在于,它表明:
i)灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2的特异性抗体存在于疾病恢复后的血清样品和疫苗接种后的患者中,但不存在于阴性患者中;
ii)使用本发明的灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2可以在血清样品中检测所有3种不同类型的抗体,即IgG、IgM和IgA;
iii)鉴于IgG、IgM和IgA针对的是不同的病毒蛋白,使用灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2代替单一或选定的重组病毒蛋白可提供更灵敏的诊断免疫分析;
iv)IgG在还原和非还原条件下的不同反应性表明,病毒蛋白二硫键的还原可能会改变它们的抗原性。
本发明提供了检测生物样品中一种或多种抗SARS-CoV-2病毒特异性抗体的方法,该方法包括:
a)将生物样品与灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒在合适的条件下孵育,以得到SARS-CoV-2病毒/抗体复合物;
b)可选地洗涤以去除未结合的材料;
c)检测所述SARS-CoV-2病毒/抗体复合物。
该方法允许在样品中检测针对SARS-CoV-2病毒的抗体,所述SARS-CoV-2病毒包括其变体,例如英国、南非和巴西变体。
优选地,检测到的抗SARS-CoV-2病毒抗体是IgG和/或IgM和/或IgA抗体。
优选地,所述灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒被预先固定在固体支持物上。
优选地,固体支持物是芯片、柱基质材料、培养板、管、皿、瓶、微量滴定板、珠子、微球、反应器容器、孔、聚苯乙烯、顺磁性颗粒(PMP)或乳胶磁颗粒(LMP)或其组合,优选地,固体支持物是微量滴定板。
优选地,检测步骤通过标记的二抗,优选单克隆抗体来进行。
优选地,二抗用放射性同位素或酶标记,优选地,酶是过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。
优选地,检测步骤包括测量来自标记物的信号并将该信号与来自已知对SARS-CoV-2病毒抗体呈阴性的对照生物样品的对照信号进行比较。
优选地,所述灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒包含以下SARS-CoV-2蛋白中的至少一种,最好是全部:病毒刺突糖蛋白、核衣壳蛋白、膜蛋白、包膜蛋白或其免疫原性片段。
优选地,生物样品是来自对象的血液、血清、血浆、体液、唾液和其他来自对象的分泌物或组织或细胞提取物。
优选地,从对象获取的生物样品在SARS-CoV-2病毒感染症状出现后或暴露于SARS-CoV-2病毒风险后,或在所述对象从SARS-CoV 2病毒感染中恢复后至少3天获取用于IgM和IgA,至少10天获取用于IgG。在一个实施方式中,对象已接受针对SARS-CoV-2病毒的疫苗,并且在施用疫苗剂量后获取生物样品。所述疫苗可以是针对SARS-CoV-2病毒的任何疫苗。
优选地,该方法进一步包括定量生物样品中特异性SARS-CoV-2病毒抗体的量。
优选地,生物样品中SARS-CoV-2病毒抗体的量与检测到的复合物的量成比例。
对于“SARS-CoV-2”,此处指的是严重急性呼吸综合征冠状病毒2。该术语包括所有SARS-CoV-2毒株和变体。SARS-CoV-2病毒及其抗原性蛋白的序列在本领域是已知并且可获得的。SARS-CoV-2病毒变体的序列,如英国、南非和巴西变体,在本领域是已知的。本领域技术人员了解SARS-CoV-2变体之用,尤其是英国、南非和巴西变体。
“抗SARS-CoV-2病毒特异性抗体”是指以特异性方式结合和识别SARS-CoV-2病毒的抗体。
灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒可以以任何已知方式获取,例如它们可以通过灭活操作从来自感染对象分离的生物样品中获取。
本文公开了一种从分离的生物样品中获取灭活的SARS-CoV-2全病毒颗粒以用于本发明的检测方法的方法,包括以下步骤:
a)通过向所述样品中至少两次添加灭活试剂来灭活SARS-CoV-2全病毒颗粒,和,可选择地
b)纯化灭活的SARS-CoV-2全病毒颗粒。
优选地,这种灭活试剂是β-丙内酯,优选为0.1%(v/v)。优选地,附加的0.1%(v/v)的β-丙内酯在15℃至37℃的温度下进行至少1小时,优选3小时。
灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒可以是任何SARS-CoV-2毒株或变体。优选地,SARS-CoV-2全病毒颗粒属于2019-nCoV/Italy-INMI1毒株(GenBank:SARS-CoV-2/INMI1-Isolate/2020/Italy:MT066156),或其天然或重组衍生物。
本发明进一步提供了一种用于实施上述方法的试剂盒,包括:
a)被覆有灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒的固体支持物,
b)能够与人IgG或IgM或IgA结合的至少一种标记二抗或抗SARS-CoV-2抗原的标记抗体,
c)阴性对照;
d)阳性对照;
e)截止值对照或校准物;
f)样品稀释剂;
g)底物溶液;
h)洗涤溶液
i)可选地,终止溶液。
本发明还提供了灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒用于检测SARS-CoV-2抗体的用途,其中所述灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒优选通过如上定义的灭活方法获得,其中所述SARS-CoV-2病毒是毒株2019-nCoV/Italy-INMI1(GenBank:SARS-CoV-2/INMI1-Isolate/2020/Italy:MT066156)或其天然或重组衍生物。
灭活纯化全病毒SARS-CoV-2的生产方法可包括:病毒在细胞培养中扩增、灭活、以及纯化。具体地,SARS-CoV-2全病毒可以在细胞中扩增,例如在上皮细胞(例如VERO细胞系和亚克隆)中,然后进行灭活和纯化,具体地是通过沉降灭活的SARS-CoV-2全病毒颗粒以回收含有蛋白质的全病毒颗粒。
在本发明中,能够在SARS-CoV-2病毒感染症状出现后至少3、4、5或6天从对象获得用于IgM和IgA的生物样品,至少10、11、12、13、14、15、16、17或18天从对象获得用于IgG的生物样品。
本发明的免疫酶法包括以下步骤:
1)将灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2被覆到固体支持物(例如芯片、微球、聚苯乙烯、反应器容器或孔、微量滴定板)上;
2)将待测人样品添加至被覆的固体支持物并在适合形成抗原/抗体免疫结合复合物的条件下孵育;
3)可选地洗涤以去除未结合的材料;
4)添加偶联的二抗,其中所述偶联的二抗针对人抗体或针对SARS-CoV-2抗原;在适合形成抗原/抗体免疫复合物的条件下孵育;
5)可选地洗涤以去除未结合的材料;
6)检测抗原/抗体免疫结合复合物的存在。
通过参考下图非限制性实施例阐述本发明。
图1.凝胶电泳在非还原条件下进行,分离度为10%。银染检测。在分子量大小标志物的右侧,报告了四个不同生产批次的灭活纯化全病毒SARS-CoV-2(即泳道A、B、C和D)。主要条带是来自细胞培养基的白蛋白。
图2.在还原(大小标志物左侧)和非还原(大小标志物右侧)条件下进行凝胶电泳。银染检测。凝胶在不同浓度的纯化灭活病毒抗原SARS-CoV-2(2和5μl)下进行。
图3.Western印迹在还原条件下进行,并用五个COVID-19阳性血清样品(泳道1-5)和六个COVID-19阴性阳性血清样品(泳道6-11)检测。使用抗人IgG进行检测。
图4.Western印迹在非还原条件下进行,并使用来自康复患者的一份COVID-19阳性血清样品进行检测。使用抗人IgG、IgA和IgM进行检测。
具体实施方式
方法
病毒扩增
VERO E6细胞(ATCC,CRL-1586)(培养和收集)通过常规技术培养扩增[10]。细胞底物感染SARS-CoV-2病毒(毒株2019-nCoV/Italy-INMI1,完整序列已提交给GenBank(SARS-CoV-2/INMI1-Isolate/2020/Italy:MT066156),并且可在GISAID网站获得(BetaCoV/Italy/INMI1-isl/2020:EPI_ISL_410545),具体的感染复数MOI值为0.05,并于滚瓶(每个850cm2)中37℃下孵育46-50小时。孵育后,通过显微镜观察VERO E6细胞单层细胞变圆、脱离和变性,评估SARS-CoV-2特有的细胞病变效应(cpe)[11]。通过使用Reed-Muench方法并计算TCID50/ml来量化病毒滴度[12]。48小时后,cpe完成,收集病毒并冷冻于-80℃。取样以评估病毒的感染效价。
病毒灭活
解冻后,用β-丙内酯(Natalex,CAS 57-57-8)灭活病毒。为确保灭活,至少两次连续添加0.1%[v/v]的β-丙内酯到固定体积的病毒悬浮液中。β-丙内酯处理的每个循环在室温下孵育3小时。然后,将病毒悬浮液在37℃下孵育2小时。通过在灭活材料的亚培养物上进行cpe验证活病毒的消失来检查灭活对照。此对照使用具有104-105TCID50/ml的活病毒作为参考进行。通过显微镜观察存在/不存在的cpe并计算TCID50/ml滴度。如果VERO E6细胞单层未显示SARS-CoV-2cpe且TCID50/ml<1*101,5,则病毒被灭活。在不完全灭活的情况下,重复用0.1%的β-丙内酯处理并检查。灭活病毒在-80℃冷冻。
纯化
灭活病毒的纯化首先以10.000g离心去除细胞碎片以进行澄清化。收集上清液并通过100.000g超速离心浓缩。灭活病毒存在于沉淀中,收集上清液,对沉淀进行超声处理并重悬于PBS(pH 7,2-7,8)中。灭活的纯化病毒分装在小瓶中并冷冻于-80℃。
免疫酶法
本发明的免疫酶法用于诊断对象中的COVID-19,包括检测人类样品中SARS-CoV-2特异性抗体的步骤,即在适当条件下使所述人类样品与灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2反应,产生免疫复合物,然后用偶联的二抗检测。
在一个实施方式中,本发明的免疫酶法包括以下步骤:
1)将灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2被覆到固体支持物(例如芯片、微球、聚苯乙烯、反应器容器或孔、微量滴定板)上;
2)将待测人样品添加至被覆的固体支持物并在适合形成抗原/抗体免疫结合复合物的条件下孵育;
3)可选地洗涤以去除未结合的材料;
4)添加偶联二抗,其中所述偶联二抗针对人抗体或针对SARS-CoV-2抗原,并在适合形成抗原/抗体免疫复合物的条件下孵育;
5)可选地洗涤以去除未结合的材料;
6)检测抗原/抗体免疫结合复合物的存在,其中抗体对SARS-CoV-2具有特异性。
用于形成抗原/抗体免疫结合复合物(步骤2)的合适条件是,例如在18至37℃的温度下孵育,例如室温,时间在0.25至1小时之间。
在一个实施方式中,灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2(1:100)通过在柠檬酸盐缓冲液(pH 2,9-3,1)中室温孵育24小时被被覆在微量滴定板上。孵育后,洗涤平板,用饱和试剂处理(例如,pH为7,2-7,4的PBS缓冲溶液,含有6-7%蔗糖和0.5-1,0% BSA),然后干燥。将在1:4-1:100范围稀释的人体样品应用于微量滴定板,并在室温(例如18-37℃)下孵育0.25-1小时。孵育和可选的洗涤后,将偶联的二抗添加到微量滴定板中并在室温下孵育,例如18-37℃,0.25-1小时。孵育和洗涤后,根据使用的免疫酶技术进行检测(例如,就ELISA而言,添加底物和终止溶液,在405-450nm或620nm读数)。测试结果的计算方法是将每个样品的吸光度除以截止值的吸光度(即阴性血清的OD平均值加上两个标准偏差)。定性结果表示为指标(OD样品/OD截止值)。如果指标高于1,1,则结果为阳性。定量结果表示为结合抗体单位(BAU/ml)。
优选地,所述灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒为SARS-CoV-2毒株2019-nCoV/Italy-INMI1(GenBank:SARS-CoV-2/INMI1-Isolate/2020/Italy:MT066156)或其天然或重组衍生物的颗粒。
二抗可以是:
-抗人-IgG或/和-IgM或/和-IgA抗体;
或者
-抗SARS-CoV-2抗原抗体。
所述抗人-IgG或/和-IgM或/和-IgA抗体可以是任何市售的二抗-人-IgG或/和-IgM或/和-IgA抗体。
所述抗SARS-CoV-2抗原抗体可以是针对SARS-CoV-2的任何抗原的抗体,例如针对刺突蛋白(Spike protein)的抗体,例如S1。通常,它是人抗体。通常,它是针对灭活的SARS-CoV-2或其抗原性部分的抗体,其被覆在所述固体支持物上。
在一个实施方式中,所述抗体抗SARS-CoV-2抗原具有中和活性,尤其是针对SARS-CoV-2及其变体(例如英国变体、南非变体和巴西变体)具有中和活性;在这个实施方式中,该方法可有利地识别和量化存在于人类样品中的对SARS-CoV-2病毒或其变体具有中和活性的抗体。这种抗SARS-CoV-2抗原抗体可以是针对SARS-CoV-2抗原的市售抗体,例如Proteogenix公司针对SARS-CoV-2刺突蛋白S1的A514抗体。
不同的二抗可用于检测样品中特异性抗体的存在以及不同抗体的相对量。
用于检测SARS-CoV-2特异性抗体的诊断试剂盒可基于包括以下试剂的免疫酶分析:
-固体支持物,例如微量滴定板,被覆有灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2;
-标记的抗人抗体,例如酶偶联的抗人抗体(例如任何单克隆或多克隆的抗人或其他物种的IgG、IgM和/或IgA抗体,用2%的新生小牛血清的PBS溶液中的辣根过氧化物酶标记),或标记的抗SARS-CoV-2抗原的抗体,例如酶偶联的抗体(例如任何单克隆或多克隆抗SARS-CoV-2抗原抗体,用2%的新生小牛血清的PBS溶液中的辣根过氧化物酶标记);
-阴性对照(例如1% BSA的PBS溶液,含0.2% Tween-20);
-阳性对照(例如在含有1% BSA和0.2% Tween-20的PBS溶液中的特异性抗SARS-CoV-2单克隆/多克隆抗体);
-截止值对照或校准物(例如在含有1% BSA和0.2% Tween-20的PBS溶液中的特异性抗SARS-CoV-2单克隆/多克隆抗体);
-样品稀释剂(例如在含0.5% Brij的PBS溶液中的2%新生小牛血清);
-洗涤缓冲液(例如含有0.5% Brij的PBS溶液);
-底物(例如3,3',5,5'-四甲基联苯胺在0,05M柠檬酸盐缓冲液中的溶液);
-可选地,终止溶液(例如0.3M H2SO4).
该试剂盒可用于手动或自动化应用。例如,它可以是一次性装置的形式,用于在合适的仪器中自动执行免疫酶分析,例如来自DIESSE Diagnostica Senese S.p.A.公司的Chorus和Chorus Trio装置。
电泳
使用预制凝胶(Bio-Rad)进行一维SDS-PAGE,分离度为10%。所有样品均通过用等体积的Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad,1610737)稀释来制备。在还原条件下,将2-巯基乙醇添加到Laemmli缓冲液中,并将样品在95℃下加热5分钟。Precision Plus ProteinTM未染色标准品(Bio-Rad)被用作分子量标志物。凝胶在200V的电泳槽中运行,直到染料前沿到达凝胶底部。使用的运行缓冲液是Tris/甘氨酸/SDS(25mM Tris,192mM甘氨酸,0.1%[w/v]SDS)。凝胶用银染(Pierce银染色试剂盒)染色。
Western印迹
在SDS-PAGE上分离的蛋白质以湿转法(wet blotting)100V,1小时转移到硝酸纤维素(Whatman)上。将硝酸纤维素膜封闭(在tris缓冲盐水中的5%脱脂牛奶)3小时,在4℃下与在含0.05% Tween-20的封闭缓冲液中稀释的血清样品孵育过夜,用含0.05% Tween-20的tris缓冲盐水洗涤3次,在含0.05% Tween-20的封闭缓冲液中用与碱性磷酸酶偶联的抗IgG、抗IgM或抗IgA抗体孵育1小时,用含0.05% Tween-20的tris-缓冲盐水洗涤3次,孵育至用BCIP/NBT底物溶液检测,并用水终止。
灵敏度和特异度
灵敏度计算为真阳性样品数与真阳性数加假阴性数之和的百分比。特异度计算为真阴性样品数与真阴性数加假阳性数之和的百分比。
在Padoan等人,(2020)[13]的工作中,对根据本发明的方法(Diesse ENZY-WELLSARS-CoV-2IgG)的分析和临床表现进行了评估,并与四种市售化学发光分析(AbbottSARS-Cov-2 IgG、Roche Elecsys抗SARS-CoV-2、Ortho SARS-CoV-2总量与IgG)进行比较。总体而言,所有分析之间都存在良好的一致性,根据本发明的分析获取了更好的结果之一。此外,用本发明的分析法获取了与抗体水平最强的PRNT50相关性,显示了该分析法检测中和抗体的功效。另外,Nuccetelli等人(2020)[14]的工作评估了根据本发明的方法进行的检测,具体是同时抗SARS-CoV-2IgA/IgG/IgM免疫分析,通过被覆有灭活SARS-CoV-2的ELISA试剂盒("Chorus SARS-CoV-2筛查血清")在自动仪器上进行。特异度和灵敏度结果非常好,两个参数的值为100%,导致少量假阳性或假阴性个体,这对于广泛的人群筛查至关重要。作者还发现,选择使用全病毒颗粒被证明比重组特异性抗原更有效,实际上该测试能够识别出比使用重组抗原的试剂盒更多的阳性样品。鼓励使用此类病毒表位以及同时进行抗SARSCoV-2IgA/IgM/IgG检测,以帮助遏制COVID-19的传播。
实施例
实施例1
灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2的反应性
通过设置条件(例如,β-丙内酯浓度在0.05和0.5%[v/v]之间,灭活孵育时间在1到24小时之间,灭活温度在15℃和37℃之间,有/无超声处理的离心)优化灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2的生产工艺。通过检查以下项目验证了优化的工艺:
-相关蛋白(即刺突糖蛋白、核衣壳蛋白、膜蛋白和包膜蛋白)的存在,
-病毒蛋白在还原和非还原条件下的反应性,揭示了构象在抗体检测中的作用,
-病毒蛋白在检测COVID-19阳性和阴性样品中的抗体时的反应性。
首先,通过电泳评估了灭活纯化的全病毒SARS-CoV-2的生产工艺的功效和重现性(图1)。比较了四个不同批次的产物(即泳道A、B、C和D),证明了该方法的重现性,在总蛋白质浓度和蛋白质反应性方面都是可靠的。电泳表明存在四种蛋白质:刺突糖蛋白(即氨基酸质量≈140kDa)、核衣壳蛋白(即氨基酸质量≈46kDa)、膜蛋白(即氨基酸质量≈24kDa)和包膜蛋白(即氨基酸质量≈8kDa)。
通过电泳评估还原条件和非还原条件下病毒蛋白的分子量差异(图2)。非还原条件下的电泳允许检测四种病毒蛋白,相反,在还原条件下不能观察到所有四种病毒蛋白。
通过在Western印迹中分析灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2,评估了病毒蛋白在检测COVID-19阳性和阴性血清样品中的抗体的反应性(图3)。结果表明,阴性血清样品不含对SARS-CoV-2具有特异性的任何抗体。阳性样品表明,还原条件下的电泳,仅核衣壳蛋白被识别。
在非还原条件下,通过Western印迹进一步分析了灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2中存在的病毒蛋白的反应性(图4)。结果表明,在非还原条件下,除了核衣壳蛋白外,刺突糖蛋白和膜蛋白也被存在于COVID-19阳性血清样品中的IgG识别,该样品来自一名在2次RT-PCR阴性后宣布康复的患者。IgM抗体检测核衣壳蛋白和刺突糖蛋白。IgA抗体仅检测核衣壳蛋白。
这些结果表明:
-对灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2具有特异性的抗体存在于疾病恢复后和病人的血清样品中,但在阴性样品中不存在;
-使用灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2可在血清样品中检测3种不同类型的抗体IgG、IgM和IgA;
-IgG、IgM和IgA针对不同的病毒蛋白,因此支持这样的假设:使用灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2而不是单一的重组病毒蛋白可以提供更灵敏的诊断性免疫测定。
-IgG在还原和非还原条件下的不同反应性可能表明病毒蛋白二硫键的还原可能会改变它们的抗原性。
实施例2
基于灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2的ELISA测试对IgG抗体检测的诊断性能
根据本发明的免疫酶法,开发了用于检测IgG抗体的ELISA测试。用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG单克隆抗体进行检测,在450nm或450/620nm处读取吸光度,使用特定的底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺,Sigma,860336)和H2SO4(Sigma,30743-M)0,3M作为终止溶液。
ELISA的诊断性能在一项临床研究中进行了评估,该临床研究包括495份由免疫荧光试验表征的血清样品。表1中报告了该比较研究的结果,并证明了在真阳性(即62/67)和真阴性样品(即410/428)与免疫荧光的强相关性。
表1.对用本发明的ELISA和免疫荧光试验检测抗SARS-CoV-2IgG对的总共495份血清样品进行了比较研究。
本发明的抗SARS-CoV-2IgG ELISA的诊断灵敏度和特异度报告于表2。
表2.抗SARS-CoV-2IgG ELISA的诊断灵敏度和特异度
诊断灵敏度 | 92.5% | CI95%:83.6-96.8 |
诊断特异度 | 95.8% | CI95%:93.4-97.3 |
实施例3
基于灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2的ELISA测试对IgM抗体检测的诊断性能
根据本发明的免疫酶法,开发了一种检测IgM抗体的ELISA测试。用辣根过氧化物酶标记的抗人IgM单克隆抗体进行检测,在450nm或450/620nm处读取吸光度,使用特定的底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)和H2SO4 0,3M作为终止溶液。
ELISA的诊断性能在一项临床研究中进行了评估,该临床研究包括397份由免疫荧光试验表征的血清样品。表3中报告了该比较研究的结果,并在真阳性(即57/65)和真阴性样品(即322/332)方面证明了与免疫荧光的强相关性。
表3.对用本发明的ELISA和免疫荧光试验检测抗SARS-CoV-2IgM的总共397份血清样品进行了比较研究。
本发明抗SARS-CoV-2IgM ELISA的诊断灵敏度和特异度报告于表4。。
表4.抗SARS-CoV-2IgM ELISA的诊断灵敏度和特异度
诊断灵敏度 | 87.7% | CI95%:77.5-93.6 |
诊断特异度 | 97.0% | CI95%:94.5-98.3 |
实施例4
基于灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2的ELISA测试对IgA抗体检测的诊断性能
根据本发明的免疫酶法,开发了用于检测IgA抗体的ELISA测试。用过氧化物酶标记的抗人IgA单克隆抗体进行检测,在450nm或450/620nm处读取吸光度,使用特定的底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)和H2SO4 0,3M作为终止溶液。
ELISA的诊断性能在一项临床研究中进行了评估,该临床研究包括463个通过免疫荧光测试表征的血清样品。该比较研究的结果报告于表5中,并在真阳性(即59/63)和真阴性样品(即385/400)方面证明了与免疫荧光的强相关性。
表5.对用本发明的ELISA和免疫荧光试验检测抗SARS-CoV-2IgA的总共463份血清样品进行了比较研究。
本发明抗SARS-CoV-2IgA ELISA的诊断灵敏度和特异度报告于表6。
表6.抗SARS-CoV-2IgA ELISA的诊断灵敏度和特异度
诊断灵敏度 | 93.7% | CI95%:84.7-97.5 |
诊断特异度 | 96.3% | CI95%:93.9-97.7 |
实施例5
基于灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2的ELISA测试检测总Ig抗体的诊断性能
根据本发明的免疫酶法,开发了检测总Ig的ELISA测试。用过氧化物酶标记的抗SARS-CoV-2抗原的单克隆抗体进行检测,并使用具体的底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)在620nm处读取吸光度。
在一项临床研究中评估了ELISA的诊断性能,该临床研究包括378个通过PCR表征的血清样品。该比较研究的结果报告于表7中,并在真阳性(即85/86)和真阴性样品(即292/292)方面证明与PCR有强相关性。
表7.对用本发明的ELISA和PCR检测抗SARS-CoV-2Ig的总共378份血清样品进行了比较研究。
本发明的抗-Ig ELISA的诊断灵敏度和特异度报告于表8。
表8.抗SARS-CoV-2Ig ELISA的诊断灵敏度和特异度
诊断灵敏度 | 98.8% | CI95%:93.7-99.8 |
诊断特异度 | 100% | CI95%: 98.7-100.0 |
实施例6
基于灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2的ELISA测试检测抗原中和Ig抗体的诊断性能
根据本发明的免疫酶法,开发了检测抗原中和Ig的ELISA测试。用过氧化物酶标记的抗SARS-CoV-2抗原的单克隆抗体进行检测,在450nm或450/620nm处读取吸光度,使用具体的底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)和H2SO4 0,3M作为终止溶液。
ELISA的诊断性能在一项临床研究中进行了评估,该临床研究包括1.106个以PRNT(斑块减少中和试验)血清中和表征的血清样品。斑块减少中和测试允许量化病毒中和抗体的滴度。这1.106个血清样品包括:651个大流行前样品和455个大流行样品。该比较研究的结果报告于表9中,并在真阳性(即242/243)和真阴性样品(即861/863)方面证明了与PRNT血清中和的强相关性。
表9.对用本发明的ELISA和PRNT血清中和试验检测抗SARS-CoV-2抗原中和Ig的总共1.106份血清样品进行了比较研究。
本发明抗原中和Ig ELISA的诊断灵敏度和特异度报告于表10。
表10.抗原中和Ig ELISA的诊断灵敏度和特异度。
诊断灵敏度 | 99.6% | CI95%:97.7-99.9 |
诊断特异度 | 99.8% | CI95%:99.2-99.9 |
实施例7
基于灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2的ELISA测试在英国变体情况下检测抗原中和Ig抗体的诊断性能
根据本发明的免疫酶法,开发了检测抗原中和Ig的ELISA测试。用过氧化物酶标记的抗SARS-CoV-2抗原的单克隆抗体进行检测,在450nm或450/620nm处读取吸光度,使用特定的底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)和H2SO4 0,3M作为终止溶液。
ELISA的诊断性能在一项临床研究中进行了评估,该研究包括56个血清样品,通过中和试验表征抗SARS-CoV-2及其英国变体抗体的存在。表11报告了这项比较研究的结果,并证明使用SARS-CoV-2INMI毒株或SARS-CoV-2英国变体进行的血清中和试验有很强的相关性。用本发明的ELISA对象获得的结果证实了该方法也能检测到英国变体。
表11.对用本发明的ELISA和中和试验检测抗SARS-CoV-2英国变体Ig的总共56份血清样品进行了比较研究。
总之,我们在此描述了一种大规模生产灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2的方法,该方法可用于制备本发明的免疫酶分析,免疫酶分析用于检测血清样品中的IgG、IgM和IgA类抗体。
检测到的抗体IgG、IgM和IgA识别不同的病毒蛋白,从而证明了包含全病毒SARS-CoV-2的所有免疫原性蛋白的诊断免疫分析的重要性。事实上,使用灭活的纯化全病毒SARS-CoV-2提供了识别的病毒蛋白的抗原性组合。此外,通过这种灭活方法,当构象通过二硫键的存在而保持时,病毒蛋白(例如刺突糖蛋白)似乎保持其抗原性。
正如现有技术报告的那样,检测到的抗SARS-CoV-2抗体IgG、IgM和IgA是COVID-19疾病不同阶段的产物。因此,他们的检测对于无症状病例的诊断、随访和鉴定具有重要意义。本发明的免疫酶测试在大量确诊的COVID-19患者和阴性样品上进行了测试,与参考检测方法并行,证明了该方法在检测IgG、IgM和IgA这3类抗体方面的高灵敏度和特异度。
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Claims (19)
1.检测生物样品中一种或多种抗SARS-CoV-2病毒特异性抗体的方法,该方法包括:
a)将生物样品与灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒在合适的条件下孵育,以获取SARS-CoV-2病毒/抗体复合物;
b)可选地洗涤以去除未结合的材料;
c)检测所述SARS-CoV-2病毒/抗体复合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述抗SARS-CoV-2病毒抗体是IgG和/或IgM和/或IgA抗体。
3.权利要求1或2所述的方法,其中所述灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒被预先固定在固体支持物上。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述固体支持物为芯片、柱基质材料、培养板、管、皿、瓶、微量滴定板、珠子、微球、反应器容器、孔、聚苯乙烯顺磁性颗粒(PMP)或乳胶磁性颗粒(LMP)或其组合,优选地固体支持物是微量滴定板。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述检测步骤通过标记的二抗,优选单克隆抗体进行。
6.根据权利要求5所述的方法,所述二抗标记有放射性同位素或酶,优选该酶为过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。
7.根据权利要求6所述的方法,其中检测步骤包括测量来自所述标记物的信号,并将所述信号与来自已知对SARS-CoV-2病毒抗体呈阴性的对照生物样品的对照信号进行比较。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法,其中所述二抗是针对人类抗体的抗体或针对SARS-CoV-2抗原的抗体。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述针对SARS-CoV-2抗原的抗体是针对SARS-CoV-2的刺突蛋白的抗体,例如,S1,和/或所述抗体具有中和活性。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒包含以下中的至少一种SARS-CoV-2蛋白:病毒刺突糖蛋白、核衣壳蛋白、膜蛋白、包膜蛋白或其免疫原性片段。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述生物样品是来自对象的血液、血清、血浆、体液、唾液和其他分泌物或组织或细胞提取物。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述生物样品在SARS-CoV-2病毒感染症状出现后或暴露于SARS-CoV-2病毒风险后,或在所述对象从SARS-CoV-2病毒感染中恢复后至少3天获取用于IgM和IgA,至少10天获取用于IgG。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述对象已经接受了针对SARS-CoV-2病毒的疫苗,并且生物样品优选地在施用疫苗剂量之后获取。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,进一步包括对所述生物样品中特异性SARS-CoV-2病毒抗体的量进行定量。
15.根据权利要求14所述的方法,所述生物样品中SARS-CoV-2病毒抗体的量与检测到的复合物的量成正比。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其用于在样品中检测针对SARS-CoV-2病毒变体,例如英国、南非或巴西变体,的抗体。
17.用于实施根据权利要求1至16中任一项所述的方法的试剂盒,包括:
a)被覆有灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒的固体支持物,
b)至少一种标记的二抗,其能够结合至人IgG和/或IgM和/或IgA,或抗SARS-CoV-2抗原的标记抗体;
c)阴性对照;
d)阳性对照;
e)截止值对照或校准物;
f)样品稀释剂;
g)底物溶液;
h)洗涤溶液;
i)可选地,终止溶液。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法或根据权利要求17所述的试剂盒,其中所述灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒是SARS-CoV-2毒株2019-nCoV/Italy-INMI1(GenBank:SARS-CoV-2/INMI1-Isolate/2020/Italy:MT066156))或其天然或重组衍生物的颗粒。
19.灭活的纯化SARS-CoV-2全病毒颗粒用于检测SARS-CoV-2抗体的用途,其中所述SARS-CoV-2病毒是毒株2019-nCoV/Italy-INMI1(GenBank:SARS-CoV-2/INMI1-Isolate/2020/Italy:MT066156)或其天然或重组衍生物。
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