CN117330750A - 一种筛选新冠病毒早期毒种的方法和制造疫苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种筛选新冠病毒早期毒种的方法和制造疫苗的方法。所述方法包括：(1)提供新冠病毒毒株的候选毒种；(2)测定各毒种的总蛋白含量；(3)保持总蛋白上样量一致，比较各毒种的S蛋白含量，选择S蛋白含量高的毒种。该方法的筛选速度明显快于传统的噬斑及有限稀释法，因此可以作为一种辅助方法用于前期毒种的筛选。

Description

一种筛选新冠病毒早期毒种的方法和制造疫苗的方法
技术领域
本发明涉及一种筛选新冠病毒早期毒种的方法和制造疫苗的方法。更具体而言，本发明涉及一种新型的快速筛选方法，可辅助用于毒种的筛选。
背景技术
随着新型冠状病毒突变位点不断增加，变异株的免疫逃逸能力也提高。Omicron株内部的亚系不断突变，目前已进化的BA.5、BA.7以及刚刚崛起的XBB.1.5。
疫苗是有效的新冠病毒预防方式，现有技术主要为灭活类新冠疫苗、重组类新冠疫苗、mRNA类新冠疫苗、载体类如腺病毒类新冠疫苗。其中灭活疫苗占全球提供的新冠疫苗剂量的一半，其在大幅减少住院、重症和死亡率方面发挥着重要作用（https://www.nature.com/articles/d41586-021-02796-w）。在灭活疫苗的制备过程中，毒种的筛选是最为关键的一步。选择一个高毒力、高效力的优势毒种对于疫苗的质量至关重要。
目前大部分毒种的筛选方法为蚀斑克隆法以及有限稀释法。例如中国专利申请公开CN104109654A公开了一种筛选病毒毒种的方法，其利用蚀斑克隆及有限稀释2种方法通过3次筛选获得了高滴度、高免疫原性的病毒。然而这两种方法耗时较长，采取微量病变法判别一个代次滴度的时间至少需要3-4天。其次，在早期毒种阶段，筛选出的单斑的滴度差异不大，不利于快速判别，需要传代更多次数以便区分。毒种的筛选速度影响整体疫苗的开发速度。
因此目前需要开发一种快速的方法用来(辅助)筛选毒种。
发明内容
本发明提供了一种新型的毒种筛选方法，可用于对新冠病毒，特别是奥密克戎(Omicron)早期毒种进行快速筛选。本发明可以以快速的方法对毒种进行筛选，特别适合于对毒种进行初筛。与传统的方法的每轮3-4天相比，本发明每轮筛选所用时间小于24h。
另外，该方法筛选完的毒种的关键抗原（刺突蛋白Spike）的相对浓度占比提高、结合特异性抗体的抗原的效价增强以及中和抗体提高。同时后期的滴度也表明筛选出的毒种较好。因此可作为一种新型的方法，辅助用于毒种的筛选。
在一个方面，本发明提供一种筛选新冠病毒早期毒种的方法，所述方法包括：(1)提供新冠病毒毒株的候选毒种；(2) 测定各毒种的总蛋白含量；和(3) 保持总蛋白上样量一致，比较各毒种的S蛋白含量，选择S蛋白含量高的毒种。
在一个实施方式中，步骤(1)还包括对候选毒种进行滴度测定以进行初筛。
在一个实施方式中，步骤(2)采用Lowry法进行。
在一个实施方式中，步骤(3)采用蛋白质印迹Western blot进行。
在一个实施方式中，所述方法在步骤(3)后还包括步骤(4)：采用ELISA筛选有效抗原含量高的毒种。
在一个实施方式中，所述步骤(4)包括先采用多抗法进行初筛，然后采用单抗法对初筛结果进行复验证。
在一个实施方式中，所述方法在步骤(3)后还包括步骤(5)：采用表面等离子共振法(surface plasmon resonance, SPR)测定所选择毒种的亲和力。
在一个实施方式中，所述方法在步骤(3)后还包括步骤(6)：测定所选择毒种的免疫原性。
在一个实施方式中，所述新冠病毒是阿尔法毒株、贝塔毒株、伽马毒株、德尔塔毒株或奥密克戎毒株，优选是奥密克戎毒株。
在另一方面，本发明提供一种制造疫苗的方法，将通过上述方法筛选出的新冠病毒早期毒种进一步利用蚀斑克隆及有限稀释法进行筛选，获得所需滴度和/或免疫原性的病毒毒种。
有益效果
本发明与现有技术的蚀斑克隆法以及有限稀释法相比，将病毒毒种的筛选速度提高了3-4倍，特别适合于变异快的RNA病毒(例如单链RNA病毒)、尤其是新冠病毒的毒种的筛选。通过本发明的方法筛选出的毒种无论抗原浓度、免疫原性均显示出优势，且与滴度的结果一致性良好。鉴于该方法的筛选速度明显快于传统的噬斑 及有限稀释法，因此可以作为一种辅助方法用于前期毒种的筛选。
附图说明
图1显示五个毒种灭活液western blot 结果。
图2显示ELISA多抗实验中五个毒种的OD值和IC50结果。
图3显示使用单克隆抗体的双抗夹心ELISA实验中三个毒种的OD值和IC50的结果。
图4显示在SPR实验中两个毒种亲和力的结果，左边#4样本，右边#3样本。纯化液的浓度从6.25nM到400nM,抗体为Omicron株特异性单抗。
图5显示#4以及#3毒种制备的成品的免疫原性分析. ** p<0.01。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本发明将Omicron株P3代毒种进一步扩增、筛选成5个毒种：分别为P4#1, P4#3,P4#4, P4#5, P4#11。部分测滴度，其余将其利用beta-丙内酯灭活，利用Lowry法测蛋白浓度。保持总蛋白上样量一致，利用Western blot筛选S蛋白含量较高的毒株。结果显示该方法筛选的毒株有效抗原含量高（利用Elisa以及SPR），中和抗体强。同时结果也表明滴度与新的筛选方法的结果一致性良好，鉴于新的筛选方法速度更快，因此可以作为一种辅助方法帮助毒种的筛选。
以下通过各实施例描述本发明的一种具体实施方式。
实施例1. 滴度测定
1.试验样品：新型冠状病毒Omicron株P4代毒种（北京公司）
2.试验液体：含10%牛血清的199营养液（天信和 批号：211011）
3.试验耗材：96孔板（Thermo 批号：165432）
4.试验用细胞：Vero细胞悬液（北京公司）
5.对五株Omicron株毒种采用病毒滴度（微量病变法）进行初筛，步骤如下：
1）样品稀释：使用含10%牛血清的199营养液稀释病毒，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的病毒稀释液。
2）将稀释样品的10-5，10-4，10-3，10-24个稀释度，接种于96孔板中，每个稀释度接种8孔，每孔0.1 mL。同时96孔板中滴8孔，每孔0.1mL 10%牛血清的199营养液作为细胞对照孔。
3）细胞接种：每孔加入Vero细胞悬液0.1mL。
4）培养：将96孔板置于二氧化碳培养箱（Thermo 4111）， 37℃培养4天后判定结果。
5）结果计算：观察细胞病变情况，用Kärber法计算病毒滴度，细胞发生圆缩拉网样为病变。
样品的滴度用滴定终点稀释度倒数表示。
计算公式为：滴定终点稀释度的对数（LgCCID50）= -（X0-d/2+d×Σ ri/ni）
X0＝样品在96孔板上全部显示阳性反应的最低稀释度倒数的对数值；
d = 梯度系列稀释系数的对数值；
ni = 每个稀释度所用细胞孔数；
ri = 每个稀释度显示阳性反应的数目
6．结果分析
结果如以下表1所示
表1
表一结果表明，五种毒种滴度相比较，4号毒种病毒感染力优于其他毒种，与抗原浓度、免疫原性结果一致。
实施例2. 蛋白测定
本发明选取5株Omicron毒种进行了比较，5株毒株蛋白含量结果如下：
1. 方法：Lowry法
2. 试剂：氢氧化钠(厂家：国药集团化学试剂有限公司、批号：20190909)、碳酸钠（厂家：国药集团化学试剂有限公司、批号20191212）、酒石酸钾（厂家：国药集团化学试剂有限公司、批号：20190604）、硫酸铜（厂家：国药集团化学试剂有限公司、批号：20191202）
3. 毒种编号：nCOVOMP4#1、#3、#4、#5、#11
4.步骤：
1）溶液配制：福林酚试液：量取福林试液中的贮备液(2mol/L酸浓度)，加纯化水进行16倍稀释，摇匀即得，现用现稀释。
甲液：取氢氧化钠10g,碳酸钠50g,加水400mL使溶解,作为甲液。
乙液：取酒石酸钾0.5g,加水50mL使溶解,另取硫酸铜0.25g,加水30mL使溶解,将两液混合作为乙液。
碱性铜溶液（用时现配）：临用前,合并甲、乙液,并加水至500mL，混匀。
2) 精密量取标准蛋白质溶液 0、20、40、80、120、160、200μg/ml,置试管内，各两份，加纯化水至1.0mL；
3）精密量取样品稀释适合浓度，各两份，加纯化水至同样体积；
4）每管内加碱性铜溶液1.0mL，混匀，从第一管加入碱性铜溶液开始计时，室温放置10分钟；
5）加入福林酚（厂家：sigma-aldrich、批号BCCC2793）试液4.0mL，从第一管加入酚试剂开始计时，在室温放置20-30分钟；
6）650nm波长测定吸光度，同时以0号管作为空白，以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程，得标准曲线相关系数
5. 计算结果
结果如表2所示。
表2
实施例3. Western blot测定
为了分析各样品中S蛋白含量，根据所测得各样品蛋白浓度，按照各泳道蛋白总量一致的原则进行加样。
（1）蛋白样品缓冲液制备：将protein loading buffer（Invitrogen，2272794）和β-巯基乙醇（Sigma，M6250）按照特定体积比制备蛋白样品缓冲液。
（2）样品制备：将nCOVOMP4#1、nCOVOMP4#3、nCOVOMP4#4、nCOVOMP4#5、nCOVOMP4#11样品与蛋白样品缓冲液按照特定体积比混匀，95℃金属浴加热10min。
（3）SDS-PAGE准备：取12%的预制胶（Solarbio ，PG01210）置于电泳槽中，根据各样品蛋白浓度，分别将制备好样品按照nCOVOMP4#1（26.4 μL），nCOVOMP4#3（27.7 μL），nCOVOMP4#4（28.7 μL），nCOVOMP4#5（30 μL），nCOVOMP4#11（27.3 μL）体积向各泳道加样，保证各泳道中总蛋白含量一致，Marker来自于聚合美生物科技有限公司MF028-plus-0。
（4）SDS-PAGE:设置为恒压模式（90-120V）进行电泳，溴酚蓝至预制胶底部时结束电泳。
（5）转膜：将50 ml 20×转膜母液（novex，NP0006）加入100 ml甲醇（国药沪试，80080418）使用去离子水定容至1000 ml配制转膜液，将与预制胶相近大小的PVDF膜（Merck，IPVH00010）浸泡于甲醇之中5-15min，并且将转膜所用滤纸浸泡于转膜液中。将转膜槽板黑板向下，按照从下到上两层滤纸-预制胶-PVDF膜-两层滤纸的顺序放置，将槽板插入转膜仪中，设置恒流模式（280-320mA）进行转膜60-90min。
（6）封闭：转膜结束后，将PVDF膜浸泡于20 ml封闭液（含2.5-5%脱脂牛奶的PBST）之中，置于摇床室温摇晃1 h。
（7）一抗孵育：向封闭好的膜中按照1：1000加入20 μl SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike（Sino Biological,40591-T62）于4℃过夜孵育。
（8）洗膜：使用洗涤液PBST（含0.01%-0.05%tween20的PBS,PBS来源于中山金桥，ZLI-9063）洗膜3次，每次于摇床室温摇晃10 min。
（9）二抗孵育：将PVDF膜浸泡于PBST中，按照1：10000加入HRP标记羊抗兔二抗（GE，NA934V）于摇床室温摇晃1 h。
（10）洗膜：使用洗涤液PBST洗膜3次，每次于摇床室温摇晃10 min。
（11）曝光：使用吸水纸将膜上洗涤液吸干，将ECL发光a液与b液(Cytiva，RPN2232V1)按照1：1混匀滴加到膜上，使用Image Quant TL系统(Cytiva, AmershamImageQuant 800)曝光成像，并使用Image Quant TL进行分析。
（12）结果分析：
具体结果、灰度分析见图1及表3。
表3:五个毒种S蛋白灰度值
由于S蛋白是SARS-COV-2的抗原决定簇的主要蛋白，S蛋白的受体结合域与血管紧张素转换酶受体（ACE2）结合能力强。表一结果说明，在蛋白总量相同时，4号毒种样品的western blot结果灰度值相较于其它样品更为突出，说明其S蛋白占比更多，而S蛋白作为直接介导新冠病毒感染人体细胞的重要结构，S蛋白占比高作为疫苗毒种更容易提高疫苗诱导的免疫效果。因此五种毒种相比较，4号及11号毒种表现出作为疫苗候选毒种的潜力。
实施例4. 关键抗原含量 （ELISA）
1. 多抗法
对五株Omicron株毒种采用ELISA多抗法进行初筛，步骤如下：
（1）样品前处理：将毒种灭活液分别按照总蛋白浓度进行稀释，使用样本稀释液稀释至1000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL，作为样本；
（2）取已包被好的酶标板，室温平衡15 min以上；
（3）加样：按实验设计进行编号，每孔加入相应毒种样本100 μL，同时设阴性对照（样本稀释液）。用封板膜封板后置37 ℃温育120 min；
（4）洗板：弃去各孔内液体，洗板5次，拍干；
（5）一抗：每孔加入检测抗体工作液100 μL，用封板膜封板后置37 ℃温育60 min；
（6）洗板：弃去各孔内液体，洗板5次，拍干。
（7）二抗：每孔加入酶标抗体工作液100 μL，用封板膜封板后置37 ℃温育60 min；
（8）洗板：弃去各孔内液体，洗板5次，最后一次洗板完成后拍干；
（9）每孔加底物显色液A 50 μL，显色液B 50 μL，轻轻振荡后置37 ℃暗处显色10min，每孔加终止液50 μL；
（10） 选择酶标仪波长450 nm，参考波长630 nm，测定各孔OD值；
（11） 以OD值为纵坐标，以样本总蛋白浓度对数为横坐标，建立标曲。利用GraphPad Prism软件对数据进行处理，通过IC50间接性反应毒种的优劣（本文中的IC50代指ELISA方法中，抗原与抗体结合到达最大OD值的一半时，所对应的毒种浓度）；
（12） 结果分析：
结果如图2所示。
本研究在同一条件下，对相同总蛋白浓度的毒种灭活液进行检测，因此，毒种灭活液中有效抗原含量越高，则与Omicron株特异性多克隆抗体结合效价越高、OD值越高，即达到抗原与抗体结合最大OD值的一半时，所需要的毒种总蛋白浓度越低。结果显示#4毒种IC50为167.9 μg/mL、#11毒种IC50为241.9 μg/mL，均小于#5、#1、#3毒种，即Omicron株多抗法检测中#4和#11毒种抗原浓度较强，且4#毒种达到抗原与抗体结合最大OD值的一半时，所需要的毒种总蛋白浓度为#3的1/3倍。
2. 单抗法
本研究对相同总蛋白中有效抗原含量较高的#4和#11毒种进行工艺放大研究，同时使用#3毒种进行对比。即将这3个毒种分别接种至10 L篮式反应器，经过收获、灭活、浓缩、纯化，最终获得纯化液。同时，为进一步提升毒种筛选方法的特异性和灵敏度，使用特异性强的单克隆抗体建立双抗夹心ELISA方法，对纯化后的同条件下有效抗原含量较多的#4和#11毒种，以及有效抗原含量最弱的#3毒种进行复验证。
实验步骤如下：
1)取纯化后的#4、#3、#11毒种按照用“BCA蛋白浓度测定试剂盒”说明书进行蛋白浓度测定，之后分别使用样本稀释液稀释至10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 μg/mL，作为样本；
2)取已包被好的酶标板，室温平衡15 min以上；
3)加样：按实验设计进行编号，每孔加入相应样本100 μL，同时设阴性对照（样本稀释液）。用封板膜封板后置37 ℃温育60 min。
4)洗板：弃去各孔内液体，洗板5次，拍干。
5)一抗：将初始浓度为1 mg/mL的检测抗体进行1:20000倍稀释，每孔加入检测抗体工作液100 μL，用封板膜封板后置37 ℃温育60 min。
6)洗板：弃去各孔内液体，洗板5次，拍干。
7)二抗：将初始浓度为1 mg/mL的酶标抗体按照1:20000倍稀释，每孔加入酶标抗体工作液100 μL，用封板膜封板后置37 ℃温育60 min。
8)洗板：弃去各孔内液体，洗板5次，最后一次洗板完成后拍干。
9)每孔加底物显色液A 50 μL，显色液B 50 μL，轻轻振荡后置37 ℃暗处显色15min，每孔加终止液50 μL。
10) 选择酶标仪波长450 nm，参考波长630 nm，测定各孔OD值。
11) 以OD值为纵坐标，以样本总蛋白浓度对数为横坐标，建立标曲。利用GraphPadPrism软件对数据进行处理，通过IC50间接性反应毒种的优劣。
结果分析：
采用BCA法测蛋白浓度，标曲线性良好（R2为0.9969），检测#4、#11和#3毒种纯化后的蛋白浓度如表4所示。
表4:三个毒种的纯化液的蛋白浓度
ELISA结果显示：在新型冠状病毒灭活疫苗（Vero 细胞）Omicron 株原液检定方法（ELISA 单抗法）的检测中，#3毒种的IC50为72.98 μg/mL，约为#4毒种（IC50为14.53μg/mL）的5倍，与多抗方法检测结果性质一致（见图3）。
实施例5. 亲和力分析-关键抗原含量（SPR）
为了佐证亲和力实验，我们将#4以及#3毒种的纯化液与Omicron株特异性单抗进行亲和力分析，我们使用protein A芯片捕获抗体约200 RU,纯化液的浓度从6.25nM到400nM, #4样本的ka (1/Ms)为2.39*104，kd (1/s)为
3.35*10-4，KD 为1.4*10-8M；#3样本的ka (1/Ms)为1.69*103，kd (1/s)为
9.69*10-4，KD 为5.72*10-7M，具体见图4，进一步验证#4更适合作为毒种。
实验条件：
使用的buffer为1×HEPES （10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA)，具有0.005% Tween-20, pH7.4，再生缓冲液为10 mM 甘氨酸-HCl, pH1.5，结合时间为120s，解离时间为300s，再生时间为30s，流速为30 μL/min。
因此后续将继续选择#4以及#3毒种的纯化液与佐剂氢氧化铝进行配制，对小鼠进行免疫，比较它们的毒种免疫原性。
结果如图4所示。结果显示#4样本的KD 为1.4*10-8M，#3样本的KD 为5.72*10-7M。#4样本比#3样本对Omicron株特异性单抗的亲和力强40.9倍，也证明了#4样本的有效抗原含量（Omicron株特异性S蛋白）更高。
实施例6. 免疫原性
为了进一步评价筛选的毒种的免疫原性，将#4以及#3毒种制备的纯化液801与佐剂氢氧化铝进行配制，氢氧化铝终浓度0.45 mg/mL,配制点为6 ug/剂。单次免疫BALB/c小鼠（6 μg/剂，0.5 mL），免疫后14天采血，检测针对BA.1毒株的中和抗体。结果显示，相比#3毒种，#4毒种所生产的成品产生更强的中和抗体。具体见图5。
总结
通过保持固定的总蛋白上样量，比较S蛋白的含量的方式可以筛选出优势Omicron株毒种。该方法筛选出的毒种无论抗原浓度、免疫原性均显示出优势，且与滴度的结果一致性良好。鉴于该方法的筛选速度明显快于传统的噬斑及有限稀释法，因此可以作为一种辅助方法用于前期毒种的筛选。

Claims (10)

1.一种筛选新冠病毒早期毒种的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1) 提供新冠病毒毒株的候选毒种；
(2) 测定各毒种的总蛋白含量；
(3) 保持总蛋白上样量一致，比较各毒种的S蛋白含量，选择S蛋白含量高的毒种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)还包括对候选毒种进行滴度测定以进行初筛。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)采用Lowry法进行。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)采用Western blot进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(3)后还包括步骤(4)：采用ELISA筛选有效抗原含量高的毒种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)包括先采用多抗法进行初筛，然后采用单抗法对初筛结果进行复验证。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(3)后还包括步骤(5)：采用表面等离子共振法SPR测定所选择毒种的亲和力。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(3)后还包括步骤(6)：测定所选择毒种的免疫原性。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述新冠病毒是奥密克戎毒株。
10.一种制造疫苗的方法，其特征在于，将通过权利要求1至9中任一项所述的方法筛选出的新冠病毒早期毒种进一步利用蚀斑克隆及有限稀释法进行筛选，获得所需滴度和/或免疫原性的病毒毒种。
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