CN117630376A - 非洲猪瘟病毒p30蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒P30蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒及其制备方法。试剂盒包括抗体检测芯片和酶标试剂，其中，抗体检测芯片设有点样点，该点样点包括包被有P30蛋白的检测点；酶标试剂含有酶标记的非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12。该试剂盒结果准确可靠，重复性好，检测耗时仅需约55分钟，为非洲猪瘟筛查、监测提供更为方便、快捷的工具。

Description

非洲猪瘟病毒P30蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒及其制 备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒P30 蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种对家猪和欧亚野猪具有极高致死性和传染性的病毒性疫病，给世界生猪养殖业造成了巨大经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)列入须通报动物疫病名录。非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，SAFV)是引起ASF 的病原体。ASFV是一种二十面体的大型包膜病毒，双链DNA基因组长度为170～190kb，基因组含有160～175个开放阅读框(ORF)，编码150～200种蛋白质。这些编码蛋白中的主要结构蛋白包括：A238L 蛋白、CD2v蛋白、多基因家族蛋白、P54蛋白、P72蛋白和P32蛋白。其中，P32蛋白由CP204L基因编码，也被称为P30蛋白。该蛋白在病毒进入宿主细胞过程中起重要作用，有良好的抗原性，可在感染早期表达盒分泌，常被用于感染后免疫反应的早期检测，是一种理想的血清学诊断和免疫学检测抗原。

P30蛋白包含优势抗原决定簇，具有良好的抗原性，可以诱导机体产生较强的体液免疫效应。由此可见，基于P30蛋白的研究意义重大。然而，作为ASFV主要结构蛋白和重要抗原蛋白，P30分子结构仍未被解析。

因此，其单克隆抗体的制备，可为ASFV检测及其P30蛋白的结构解析提供重要工具。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒P30蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒。

本发明的第二目的在于提供上述试剂盒的制备方法。

为了实现上述目的，本发明特采用如下方案：

一种非洲猪瘟病毒P30蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括抗体检测芯片和酶标试剂，其中，所述抗体检测芯片设有点样点，该点样点包括包被有P30蛋白的检测点；所述酶标试剂含有酶标记的非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12。

本发明的非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12含有重链可变区和轻链可变区，重链可变区为SEQ.ID No.1所示的氨基酸序列；轻链可变区为SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列。

单克隆抗体4C12重链可变区氨基酸序列为:

EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFTNYAMSWV RQTPEKRLEWVATIGSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQ MSSLRSEDTAMFFCARPHYQFYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ.ID No.1)。

单克隆抗体4C12轻链可变区氨基酸序列为:

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHW NQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEED AATYYCQHIREPYTFGGGTKLEIK(SEQ.ID No.2)。

上述试剂盒以非洲猪瘟病毒P30蛋白作为抗原，利用待测样本中抗体与酶标记的非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12竞争结合抗原，通过竞争法检测抗体。非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体 4C12识别的抗原表位位于非洲猪瘟病毒P30蛋白，对非洲猪瘟病毒P30的抗体阻断率90％以上，与非洲猪瘟病毒反应呈阳性，可高效价地用于多个组织的免疫组化检测，表明其与非洲猪瘟病毒具有良好的反应特性。

进一步地，本发明中抗体检测芯片的点样点还包括包被有羊抗鼠IgG的质控点。

传统ELISA试剂盒均设有阴性对照、阳性对照或标准品作为试剂盒内的质控品，与之相比，本发明提供的试剂盒，在反应载体上设有质控点，该质控点包被有商品化羊抗鼠IgG，不需要再在试剂盒中设有阴性对照、阳性对照，也就是说不仅不需要提前筛选动物进行免疫或攻毒、采集血清等，还降低了人力、动物试验场地的成本，同时大大提升试剂盒操作便捷性及准确性。而羊抗鼠IgG可以商业上购买或通过常规方法制备，操作简便。

在优选的实施方式中，羊抗鼠IgG的包被量为5ng/点。当质控点的羊抗鼠IgG的包被量为5ng/点时，阴性血清的质控点灰度值与检测点灰度值较为接近，检测结果更准确。优选地，质控点数量为 3个。

在优选的实施方式中，P30蛋白的包被量为1～32ng/点，优选为4～16ng/点，进一步优选为8ng/点。实验证明，当P30蛋白的包被量为1～32ng/点时N/P值为11.50～13.60均可满足检测，但当包被量为4～16ng/点时N/P值略优(为13.11～13.60)，包被量为8ng/点时N/P 值为较优(为13.60)，其中，N/P为阴性猪血清(N)与阳性血清(P)的比值。

进一步地，本发明抗体检测芯片的点样点还包括包被有点样液的空白对照点。

优选地，所述点样液为体积比10∶15∶0.1∶50∶100的5％甘油溶液、5％山梨醇溶液、0.05％曲拉通溶液、DMSO溶液、PBS(pH6.8) 溶液。

进一步地，作为标记酶的种类包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-D-半乳糖苷酶。

在优选的实施方式中，酶标试剂的缓冲液为含有体积比 20％胎牛血清的PBS溶液。

在优选的实施方式中，酶标记的非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12的浓度为50ng/ml。

进一步地，本发明试剂盒还包括洗涤液、样品稀释液和底物液。

在优选的实施方式中，洗涤液为含1％V/V吐温20的PBS 溶液。

在优选的实施方式中，样品稀释液为含10％V/V胎牛血清、 0.05％～0.2％V/VTriton-100、0.1％V/V Proclin300的PBS溶液。

在优选的实施方式中，底物液为TMB溶液。

进一步地，本发明的抗体检测芯片设置于底端和上格栅之间，共同组成检测芯片亚单元，上格栅设有检测孔，待测样品通过检测孔与点样点接触。

在优选的实施方式中，所述试剂盒包括至少一个所述检测芯片亚单元。

进一步地，点样点(例如检测点、质控点和空白对照点) 之间的边缘距离至少为700μm，点样点到检测芯片亚单元上边缘或下边缘的距离至少为8mm，点样点到检测芯片亚单元左边缘或右边缘的距离至少为5mm。

在优选的实施方式中，点样点具体设置如图1的A-E所示，质控点(1)、质控点(2)、质控点(3)的羊抗鼠IgG包被量均为5ng/ 点、空白对照点(4)为点样液，非洲猪瘟病毒P30蛋白点样于检测点 (5)；质控点(1)、质控点(2)、质控点(3)、空白对照点(4) 这四种点样点分别位于检测芯片的左上角、左下角、右下角、右上角，检测点(5)可以位于所述抗体检测芯片其他位置。

本发明还提供试剂盒的制备方法，将P30蛋白点样于膜上，制备抗体检测芯片，酶标记非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12 得到酶标试剂，得到所述试剂盒。

进一步地，所述制备方法包括如下步骤：

步骤(1)非洲猪瘟病毒P30蛋白用点样液稀释，点样于膜上作为检测点，羊抗鼠IgG用点样液稀释，点样于膜上作为质控点，点样液点样于膜上作为空白对照点，以制备非洲猪瘟病毒P30蛋白的抗体检测芯片；

步骤(2)将步骤(1)中的抗体检测芯片设置于底端、上格栅之间，由所述底端、上格栅夹紧构成检测芯片亚单元，当所述试剂盒包括多个非洲猪瘟病毒的抗体检测芯片亚单元时，相互独立的检测芯片亚单元集成为微阵列芯片；

步骤(3)用酶标记非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12，按终浓度50ng/ml用酶标稀释液稀释后混匀，作为酶标试剂，所述酶标稀释液为含终体积20％V/V胎牛血清的PBS溶液；

步骤(4)配制样品稀释液、洗涤液、底物液；

步骤(5)将所述步骤(2)制备的非洲猪瘟病毒的检测芯片亚单元或微阵列芯片、步骤(3)制备的所述酶标试剂及步骤(4) 制备的所述样品稀释液、所述洗涤液、所述底物液组装成所述抗体检测试剂盒。

与现有技术相比，本发明的技术效果为：

本发明提供的试剂盒，包被抗原蛋白为非洲猪瘟病毒P30蛋白，P30蛋白是优良的早期检测靶标，检测抗体为非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12，其识别的抗原表位位于非洲猪瘟病毒P30蛋白，对非洲猪瘟病毒P30的抗体阻断率90％以上，与非洲猪瘟病毒反应呈阳性，可高效价地用于多个组织的免疫组化检测，本发明制备的试剂盒结果准确可靠，重复性好，检测耗时仅需约55分钟，为非洲猪瘟筛查、监测提供更为方便、快捷的工具。

本发明制备的试剂盒检测快速，操作简便，一键式智能化数据处理，免除了常规方法检测后繁琐的数据处理及大量数据分析，更轻松地把控猪群健康状况，便于养殖业进行集约化管理。

此外，试剂盒中抗体检测芯片的设计，质控点采用商品化羊抗鼠IgG，不需要再在试剂盒中设有阴性对照、阳性对照，也就是说不仅不需要提前筛选动物进行免疫或攻毒、采集血清等，省略了繁琐的制备步骤，降低了人力、动物试验场地成本，还大大提升试剂盒操作便捷性及准确性。

附图说明

下面参照附图来进一步说明本申请的各个技术特征和它们之间的关系。附图为示例性的，一些技术特征并不以实际比例示出，并且一些附图中可能省略了本申请所属技术领域中惯用的且对于理解和实现本申请并非必不可少的技术特征，或是额外示出了对于理解和实现本申请并非必不可少的技术特征，也就是说，附图所示的各个技术特征的组合并不用于限制本申请。另外，在本申请全文中，相同的附图标记所指代的内容也是相同的。具体的附图说明如下：

图1是为非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体检测芯片上每个芯片孔的点样模式示意图，A、B、C、D、E分别表示了不同的点样模式，其中，1为质控点1、2为质控点2、3为质控点3、4为空白对照点、 5为非洲猪瘟病毒P30蛋白检测点；

图2为三种具有不同数量的非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体检测芯片亚单元的试剂盒，其局部放大图显示了一个非洲猪瘟病毒P30 蛋白抗体检测芯片亚单元的检测芯片，O、P、Q分别为具有一个、三个、多个抗体检测芯片亚单元的试剂盒。

具体实施方式

定义

术语“非洲猪瘟病毒”(African swine fever virus,ASFV) 是一种核质双链DNA大病毒，呈二十面体结构，外有囊膜包被，不同毒株基因组大小存在些许差异，长度介于170～190kb之间，包含1 个中间保守区和2个分布在两端的可变区，基因组含有160～175个开放阅读框(ORF)，编码150～200种蛋白质，其中存在许多与病毒复制、免疫逃逸、病毒传播等相关的蛋白。

术语“非洲猪瘟病毒P30蛋白”简称“ASFV P30”，又称 P32。P30是非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白和强免疫原性蛋白之一，由CP204L基因编码，蛋白分子量约为36KDa。P30有强的免疫原决定簇，能够诱导机体产生中和抗体，通常被用作诊断抗原，为病毒的早期蛋白，在感染后4h胞浆内即可检测到，常被用于感染后免疫反应的早期检测。

术语“抗体”是机体免疫细胞被抗原激活后，B细胞分化成熟为浆细胞后所合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。

术语“Ig”，免疫球蛋白(Immunologlobulin)，指具有抗体(Ab)活性或化学结构，与抗体分子相似的球蛋白。免疫球蛋白是由两条相同的轻链和两条相同的重链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。

术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、犬、猫、水貂源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、犬源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG， IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023 中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187、 GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用 PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。

术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125 个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与猫泛白细胞减少症病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。

术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体的氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽的非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。

术语“酶”包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶。其中，辣根过氧化物酶所使用的底物为邻苯二胺 (OPD)、四甲基联苯胺(TMB)，优选为四甲基联苯胺(TMB)；碱性磷酸酶所使用的底物为对-硝基苯磷酸酯(p-NPP)；β-D-半乳糖苷酶所使用的底物为4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷(4MUG)。

术语“羊抗鼠IgG”为羊抗鼠多克隆抗体，又称羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。

术语“微阵列芯片”是指以阵列方式设定在基片上能够并行处理和分析样本中生物或化学信息的微型器件，点阵排布点径在500μπι以内，相邻两点中心间距最小距离以不产生信号交叉为准 (参见GB/T 27990-2011《生物芯片基本术语》)。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲液除有另外的说明，均为pH值7.4的PBS，其1L体积配方为：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、 Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄0.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。羊抗鼠IgG可以商业上获得，也可以通过常规方法制备。

本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

实施例1抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

1.1非洲猪瘟病毒P30蛋白的制备及含量的测定

参考郝丽影(郝丽影.非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体的制备与应用，河南农业科学，2020，49(10)：124-129)文献的方法制备非洲猪瘟病毒P30蛋白；按照BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)说明书测定P30蛋白的浓度，为1.5mg/ml。

1.2抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体的制备

1.2.1杂交瘤细胞株的建立

将非洲猪瘟病毒P30蛋白按照200μl/只(含50μg P30蛋白)的量免疫小鼠，按照郝丽影(郝丽影.非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体的制备与应用，河南农业科学，2020，49(10)：124-129)文献的操作方法制备获得19株小鼠杂交瘤细胞。

1.2.2杂交瘤细胞株的鉴定

1.2.2.1阳性血清阻断实验

取杂交瘤细胞上清进行检测，操作步骤：加样100μl检测，设置加样品稀释液的孔为阴性对照，置37℃温育60分钟，洗板；加入1： 800倍稀释的ASF阳性血清，100μl/孔，置37℃温育60分钟，洗板；加入稀释好的HRP标记的抗猪IgG，100μl/孔，置37℃温育30分钟，洗板；依次加入显色剂A、B液，50μl/孔，振荡混匀，37℃避光温育15 分钟后，加终止液，50μl/孔；设定酶标仪波长于450nm处，检测各孔 OD值；样品阻断率＝(阴性对照孔OD值-样品孔OD值)/阴性对照孔 OD值。优选阻断率最高的1株杂交瘤细胞4C12进行腹水制备，并将腹水100倍稀释后，用阳性血清阻断试验评价腹水的阻断率，结果单克隆抗体4C12阻断率为96％，结果较为理想，用于后续评价。

1.2.3单克隆抗体亚类的鉴定

用小鼠单抗Ig类/亚类/亚型鉴定用ELISA试剂盒按说明书检测，结果单克隆抗体4C12的重链亚类为IgG1，轻链亚类为kappa。

1.2.4单克隆抗体特异性的鉴定

采用间接免疫荧光方法，分别取单克隆抗体对猪瘟病毒 (CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪2型圆环病毒(PCV2)进行检测，以判断其特异性，结果单克隆抗体 4C12检测这些病毒均为阴性，说明单克隆抗体特异性良好。

1.3单克隆抗体可变区序列的测定

根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：

4C12重链可变区序列：

F：5’-ACTAGTCGACATGAACTTYGGG-3’(SEQ ID No.5)；

R：5’-CCAGGGRCCARKGGATARACN-3’(SEQ ID No.6)；

设计轻链可变区引物序列：

4C12轻链可变区序列：

F：5’-ACTAGTCGACATGGAGWCAGACA-3’(SEQ ID No.7)；

R:5’-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGG-3’(SEQ ID No.8)；

收集杂交瘤细胞，提取RNA后反转录作为模板，用上述引物对其可变区序列进行扩增，将扩增产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果：测得单克隆抗体4C12重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，基因序列分别如 SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示。

单克隆抗体4C12重链可变区核苷酸序列

GAAGTGATGCTGGTAGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAA GCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAC TTTCACTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAA GAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTGGTAGTGGTGGTAGTTACAC CTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGA CAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTC TGAGGACACGGCCATGTTTTTTTGTGCAAGACCACATTACCAATT CTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACCGTCTCCTC A(SEQ IDNo.3)。

单克隆抗体4C12轻链可变区核苷酸序列

GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTA TCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAG TGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAA ACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCT AGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGAC AGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGC AACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCCTTACACGTTCGGAGG GGGGACCAAGCTGGAAATAAAA(SEQ ID No.4)。

实施例2ASFV P30蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒的建立

2.1点样液的配制

5％甘油溶液的配制：精密称定5.00g甘油置100ml容量瓶中，加少量纯化水轻轻旋转使其溶解充分，避免产生过多气泡，再加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用。

5％山梨醇溶液的配制：精密称定5.00g山梨醇置250ml烧杯中，加适量纯化水并搅拌使其完全溶解，再完全转移至100ml容量瓶中，加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用。

0.05％曲拉通溶液的配制：用移液枪量取50μl曲拉通置100ml 容量瓶中，加适量纯化水使其完全溶解，再加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用。

DMSO溶液：直接采用DMSO试剂即可。

PBS(pH6.8)溶液配制：先配置0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，再将两者按照49.5:51的体积比进行混合，得到pH值为6.8的磷酸盐缓冲液。

将上述溶液按照10∶15∶0.1∶50∶100的体积比混合均匀，作为点样液。

2.2酶标抗体的制备

2.2.1制备

采用改良过碘酸钠法对非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体 4C12进行辣根过氧化物酶(HRP)的标记。

称取20mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于1ml超纯水中，加入1ml新鲜配制的NaIO₄溶液(30mg NaIO₄溶于1ml超纯水)，混匀，4 ℃避光作用30分钟；在上述溶液中加入40μl乙二醇，4℃避光作用30 分钟；按照1mg纯化的单克隆抗体加100μl上述混合液的比例，将两者混匀后，加入到透析袋中，混匀，用CB缓冲液透析6小时。整个操作需避光进行；将透析后的混合液转移至1.5ml EP管中，加入10μl新鲜配制的NaBH₄溶液(20mg NaBH₄溶于1ml超纯水)，室温作用2小时，每隔30分钟混匀一次；加入等体积的饱和硫酸铵，混匀后，4℃作用15分钟。12000转/分钟离心10分钟，弃上清。将沉淀用与纯化抗体等体积的PBS与甘油的混合液(V∶V＝1∶1)吹悬。

2.2.2鉴定

外观：室温下，为红棕色液体，未见絮状物沉淀。

质量评价：取酶标抗体，用PBS缓冲液(0.02mol/L，pH值 7.4)10倍稀释后用紫外分光光度计检测酶标抗体在403nm和280nm的吸光值A。按照公式计算相应的酶参数：

酶量(mg/ml)＝A403nm×0.4×稀释倍数。

IgG量(mg/ml)＝(A280nm-A403nm×0.3)×0.62×稀释倍数。

克分子比值(E/P)＝酶量×4/IgG量。

标记率＝A403nm/A280nm。

经过吸光值检测和计算，具体结果见表1。

表1酶标抗体的质量评价

2.3试剂盒的制备

用点样液将实施例1制备的P30蛋白稀释至0.4mg/ml，作为检测点点样液；用点样液将羊抗鼠IgG稀释至0.25mg/ml，作为质控点点样液，分别点样于图1中点1、2、3，设定3个浓度，以便于根据调试结果选择对应的质控点进行数据统计分析；将点样液作为空白对照点点样液点样于点4。开启点样仪，设定程序和点样参数，按照20nL/点的体积点样，将检测点点样液点样于点5、质控点点样液点样于图1中的1、2、3、空白对照点点样液点样于图1中的4。将已点样的膜取出置芯片底板中部，加上盖板压紧，两边卡上固定边条，组装成ASFVP30阻断法芯片，封装，2～8℃保存。除点1、2、3、4分别固定于检测芯片的左上角、左下角、右下角、右上角外，点5可以点样于检测芯片其他任意位置，只需与其他点的边缘相距≥700μm，而任意点与点之间的最短距离也为≥700μm。质控品点1、质控品点2、质控品点3、空白对照点样点4到检测芯片亚单元上边缘、下边缘的距离≥8mm，到检测芯片亚单元左边缘、右边缘的距离≥5mm。

抗体检测试剂盒包括一个或多个非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体检测芯片亚单元，由底端、上格栅、设置于其间由所述底端、上格栅夹紧的检测芯片组成独立的检测孔组成，所述一个检测孔对应于一个所述检测芯片亚单元，当所述抗体联检试剂盒包括多个非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体检测芯片亚单元时，各个所述独立的检测芯片亚单元集成为微阵列芯片。图2显示了具有不同数量非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体检测芯片亚单元的试剂盒，图2中O、P、Q分别为具有一个、三个、多个抗体检测芯片亚单元的试剂盒，其局部放大图显示了一个非洲猪瘟病毒P30 蛋白抗体检测芯片亚单元中检测芯片上的点样点。

酶标试剂：取PBS溶液、胎牛血清200ml混匀并补加PBS定容为1L作为酶标稀释液。将实施例2制备的酶标单克隆抗体4C12稀释后作为酶标试剂，0.22μm过滤，无菌分装。

样品稀释液：含10％V/V胎牛血清、0.1％V/V吐温20、1％W/V BSA、0.05％～0.5％W/V Casein、1％W/V Proclin300的PBS溶液，0.22 μm过滤，无菌分装。

洗涤液：含1％V/V吐温20的PBS溶液经0.22μm过滤，无菌分装。检测时用纯化水稀释20倍。

底物液：TMB(3,3',5,5'-四甲联苯胺)溶液，商品化产品，无菌分装。

将以上各组分组装成试剂盒。

2.4检测方法建立

操作步骤如下：

(1)编号，将芯片孔按样品顺序编号。

(2)浸润，加洗涤液300μL/孔，浸润3分钟后弃液、拍干。

(3)加样，加样品稀释液50μL/孔后加待检样品50μL/孔，置恒温振荡孵育器37℃、1000转/分钟温育20分钟；弃液，加洗涤液 300μL/孔，浸泡30～60秒，弃液。反复洗涤5遍，最后一次拍干。

(4)加酶，加入酶标试剂100μl/孔，置恒温振荡孵育器37 ℃、1000转/分钟温育20分钟；弃液，加洗涤液300μL/孔，浸泡30～ 60秒，弃液。反复洗涤5遍，最后一次拍干。

(5)显色，加入底物液100μL/孔，置恒温振荡孵育器37℃、 1000转/分钟温育15分钟。

(6)测定，垂直弃液，甩净，去芯片上盖，倒扣至无尘纸上，轻轻压干，并于10分钟内用微孔盘芯片影像仪测定结果，导出阻断率 PI(PI＝(1-样品灰度值/质控点灰度值均值)×100％)。

试验有效性判定：质控点灰度值应≥6000、空白对照灰度值应≤3000，否则试验无效，该判定通过内部数据处理分析系统自行完成。结果判定(该判定也通过内部一键式智能化数据处理分析系统自行完成，不需要技术人员再进行数据运算及统计分析)标准如下：

PI的计算：PI＝(1-样品灰度值/质控点灰度值均值)×100％质控点灰度值均值＝(质控点1灰度值+质控点2灰度值+质控点3灰度值)/3

阳性判定PI≥40％时ASFV P30抗体为阳性；

阴性判定PI≤30％时ASFV P30抗体为阴性；

可疑30％＜PI＜40％时ASFV P30抗体为可疑，需重新取样进行检测，若检测仍为可疑则判为阴性。

2.5 ASFV P30阻断蛋白芯片包被量的确定

2.5.1抗原包被量的确定

按照实施例2.3所示将实施例1P30蛋白用点样液稀释至适当浓度，点样体积为20nl/点，使得点样于膜上的P30蛋白的最终包被量分别如表2所示，其它均不变。用1份ASF标准阳性血清(P)和1份2018 年以前收集的阴性猪血清(N)按照实施例2.4的方法进行检测，结果见表2。N/P值随P30蛋白包被浓度的增加而增大，在包被量8ng/点时N/P 值最大，而后增加包被浓度N/P值开始降低，而N/P值的大小对应该方法分辨阴性、阳性能力的高低，数据越大，则检测条件越适宜。因此，当P30蛋白的包被量为1～32ng/点时N/P值为11.50～13.60均可满足检测，但当包被量为4～16ng/点时N/P值略优(为13.11～13.60)，包被量为8ng/点时N/P值为最优(为13.60)。

表2 P30蛋白包被量优化结果

2.5.2质控点包被量的确定

按照实施例2.3所示将羊抗鼠IgG用点样液稀释至适当浓度，点样体积为20nl/点，使得点样于膜上的羊抗鼠IgG的最终包被量分别如表3所示，其它均不变。用10份2018年以前收集的阴性猪血清按照实施例2.4的方法进行检测，结果见表3。在包被量为5ng/点时，10份阴性血清质控点灰度值均值为19832，与抗原点灰度值均值(18732～21438) 比较接近。因此，质控点最适包被量为5ng/点。

表3质控点包被量优化结果

2.6ASFV P30蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒的评价

2.6.1敏感性

将ASF标准阳性血清2倍梯度稀释，用实施例2.3制备的试剂盒测定，确定该试剂盒对ASF标准阳性血清的灵敏度，结果见表4。结果显示试剂盒检测标准阳性血清1:512倍稀释为阳性、1:1024倍稀释为阴性。

表4梯度稀释的ASF标准阳性血清的灵敏度试验

稀释倍数	PI(％)	结果判定
			1:8	98.3％	+
1:16	96.7％	+
			1:32	92.5％	+
1:64	84.6％	+
			1:128	72.3％	+
1:256	61.9％	+
			1:512	50.9％	+
1:1024	24.2％	-

用实施例2.3制备的试剂盒检测P30蛋白免疫猪只的阳性血清20份，结果：PI均≥40％均为阳性。

2.6.2特异性

用实施例2.3制备的试剂盒检测猪常见病毒阳性血清5份(包括猪伪狂犬病阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征阳性血清、猪瘟阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、猪流行性腹泻阳性血清)、大肠杆菌阳性血清1份、SPF猪血清10份、ASFV抗原阴性的常规免疫程序免疫猪血清 50份，结果：PI均≤30％，均为阴性，表明试剂盒特异性良好。

2.6.3重复性

使用3个不同批次的试剂盒，进行批内和批间重复性试验，测定灰度值与PI，计算变异系数。变异系数<15％，说明试剂盒重复性和稳定性好。结果表明，3个不同批次的试剂盒，批内和批间检测结果一致，变异系数均<10％，说明试剂盒重复性好。

变异系数(CV)计算公式：

CV(％)＝(标准差/平均值)×100％

2.6.4临床应用

根据上述结果，用实施例2.3制备的试剂盒进行临床应用，检测20份ASF阳性猪血清以及1000份2018年以前收集的阴性猪血清，结果：检测20份ASF阳性猪血清的PI均≥40％，均为阳性；检测1000 份2018年以前收集的阴性猪血清的PI均≤30％，均为阴性。

除非另有定义，本申请全文所使用的所有技术和科学术语与本申请所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。如有不一致，以本申请全文中所说明的含义或者根据本申请全文中记载的内容得出的含义为准。另外，本说明中所使用的术语只是为了描述本申请实施例的目的，不是旨在限制本申请。

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒P30蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗体检测芯片和酶标试剂；

所述抗体检测芯片设有点样点，所述点样点包括包被有P30蛋白的检测点；

所述酶标试剂含有酶标记的非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12；

所述非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ.ID No.1所示的氨基酸序列；所述轻链可变区为SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述点样点还包括包被有羊抗鼠IgG的质控点；

优选地，羊抗鼠IgG的包被量为5ng/点；

优选地，质控点数量为3个。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述P30蛋白的包被量为1～32ng/点，优选为4～16ng/点，进一步优选为8ng/点。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述点样点还包括包被有点样液的空白对照点；

优选地，所述点样液为体积比10∶15∶0.1∶50∶100的5％甘油溶液、5％山梨醇溶液、0.05％曲拉通溶液、DMSO溶液、PBS(pH6.8)溶液。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-D-半乳糖苷酶；

优选地，所述酶标试剂的缓冲液为含有体积比20％胎牛血清的PBS溶液；

优选地，所述酶标记的非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12的浓度为50ng/ml。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤液、样品稀释液和底物液；

优选地，洗涤液为含1％V/V吐温20的PBS溶液；

优选地，样品稀释液为含10％V/V胎牛血清、0.05％～0.2％V/V Triton-100、0.1％V/VProclin300的PBS溶液；

优选地，底物液为TMB溶液。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体检测芯片设置于底端和上格栅之间组成检测芯片亚单元，所述上格栅设有检测孔，待测样品通过检测孔与点样点接触；

优选地，所述试剂盒包括至少一个所述检测芯片亚单元。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，点样点之间的边缘距离至少为700μm，点样点到检测芯片亚单元上边缘或下边缘的距离至少为8mm，点样点到检测芯片亚单元左边缘或右边缘的距离至少为5mm。

9.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，将P30蛋白点样于膜上，制备抗体检测芯片，酶标记非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12得到酶标试剂，得到所述试剂盒。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

步骤(1)非洲猪瘟病毒P30蛋白用点样液稀释，点样于膜上作为检测点，羊抗鼠IgG用点样液稀释，点样于膜上作为质控点，点样液点样于膜上作为空白对照点，以制备非洲猪瘟病毒P30蛋白的抗体检测芯片；

步骤(2)将步骤(1)中的抗体检测芯片设置于底端、上格栅之间，由所述底端、上格栅夹紧构成检测芯片亚单元，当所述试剂盒包括多个非洲猪瘟病毒的抗体检测芯片亚单元时，相互独立的检测芯片亚单元集成为微阵列芯片；

步骤(3)用酶标记非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体4C12，按终浓度50ng/ml用酶标稀释液稀释后混匀，作为酶标试剂，所述酶标稀释液为含终体积20％V/V胎牛血清的PBS溶液；

步骤(4)配制样品稀释液、洗涤液、底物液；

步骤(5)将所述步骤(2)制备的非洲猪瘟病毒的检测芯片亚单元或微阵列芯片、步骤(3)制备的所述酶标试剂及步骤(4)制备的所述样品稀释液、所述洗涤液、所述底物液组装成所述抗体检测试剂盒。