CN110261607A - 用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110261607A
CN110261607A CN201910452217.9A CN201910452217A CN110261607A CN 110261607 A CN110261607 A CN 110261607A CN 201910452217 A CN201910452217 A CN 201910452217A CN 110261607 A CN110261607 A CN 110261607A
Authority
CN
China
Prior art keywords
avian leukosis
sample
solution
kit
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910452217.9A
Other languages
English (en)
Inventor
冯小宇
杨春江
梅力
赵荣茂
韦海涛
宋彦军
莫勋
魏单平
高晓龙
陈会玲
吴佳兴
罗伏兵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing One Hundred Biological Technology Co Ltd
BEIJING MUNICIPAL CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Original Assignee
Beijing One Hundred Biological Technology Co Ltd
BEIJING MUNICIPAL CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing One Hundred Biological Technology Co Ltd, BEIJING MUNICIPAL CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION filed Critical Beijing One Hundred Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201910452217.9A priority Critical patent/CN110261607A/zh
Publication of CN110261607A publication Critical patent/CN110261607A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种禽白血病的荧光偏振免疫分析检测试剂盒，其包括禽白血病阳性对照、禽白血病阴性对照、荧光素标记的禽白血病重组P27蛋白溶液、样本稀释液、反应微孔板组成。利用该试剂盒，该试剂盒可在15分钟内检测出鸡是否感染禽白血病病毒。本发明提供的检测试剂盒与传统技术相比较，优势明显，技术改进明显，特别是针对禽白血病净化形式复杂、需求旺盛，具有非常广阔的市场前景，可在基层检测和政府监管中发挥重大作用。

Description

用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物检测技术制备领域，具体涉及一种用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法。
背景技术
禽白血病(Avian Leukosis Disease)是由禽白血病病毒(Avian LeukosisVirus，ALV)引起的病毒性传染病，是由禽C型反转录病毒群的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，主要是淋巴细胞性白血病，其次是成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病。此外，还可引起骨髓细胞瘤、结缔组织瘤、上皮肿瘤、内皮肿瘤等。大多数肿瘤侵害造血系统，少数侵害其他组织。
禽白血病病毒ALV属于反转录病毒科α反转录病毒属。根据其囊膜蛋白的抗原性，迄今为止已将ALV分为A-J十个亚群。ALV主要引起鸡群感染、发病，既可引起免疫抑制、生产性能下降等亚临床致病作用，还能诱发各种急性或慢性的不同细胞类型的肿瘤。随流行毒株变异及鸡群遗传背景的不同而表现出诸如纤维肉瘤、淋巴肉瘤、成红细胞瘤、髓细胞样肿瘤、组织细胞瘤、骨硬化症等不同肿瘤。
禽白血病呈世界性分布，并且可垂直传播，严重制约着养禽业的发展。目前该病尚无切实可行的治疗方法，也无有效的疫苗，唯一有效的控制方法是净化。ALV传播方式有垂直传播和水平传播，传染源是病鸡和带毒鸡。有病毒血症的母鸡，其整个生殖系统都有病毒繁殖，以输卵管的病毒浓度最高，特别是蛋白分泌部，因此其产出的鸡蛋常带毒，孵出的雏鸡也带毒。这种先天性感染的雏鸡常有免疫耐受现象，它不产生抗肿瘤病毒抗体，长期带毒排毒，成为重要传染源。
为了从根源上控制禽白血病，不同的种鸡场和原种鸡场都根据自身特点制定了切实可行的净化方案。这些净化方案的核心关键就是要多次检测、剔除阳性鸡，确保种群的干净和纯粹。而目前检测携带有禽白血病病毒的主要方法有酶联免疫法(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)等，其中ELISA方法主要以ALV保守基因p27表达的P27蛋白为检测目标，通过检测P27蛋白判断鸡是否感染ALV。因使用方便，可批量检测，ALV的ELISA方法在实际检测中有大量应用，国内外也有商品化产品，如美国IDEXX、荷兰BioChek以及美国Affinitech等。
此外，国内也有一些禽白血病抗原ELISA检测相关专利，如申请号为201310161174.1的发明专利“一种用于检测禽白血病P27的酶联免疫反应载体及试剂盒”公布的禽白血病ELISA检测方法，采用多克隆抗体包板，酶标单抗检测，孵育时间为1小时45分钟，最后通过酶标仪检测；申请号为201210113675.8的发明专利“检测禽白血病群检测禽白血病特异性抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒”公开的是间接双抗体夹心ELISA，其采用单抗包板，多抗夹心，二抗检测，整体耗时为2小时20分钟；陈晨等2005年在《禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立和标化》(中国预防兽医学报,2005,27(6):535-539)公开的ELISA方法则与美国IDEXX公司的产品类似，整体反应时间也超过1小时。
通过以上对比可知，现有ELISA技术的主要缺陷在于检测时间长，操作较为复杂，且需要酶标仪，只能在化验室或者中心实验室具有酶标仪才能开展检测，无法在基层养殖场大规模推广应用。PCR方法与ELISA方法相比较，其缺陷更为明显，操作繁琐复杂，精密度还要求高，PCR仪器动辄数万元，RT-PCR更是达数十万元，且操作人员需要专业水平，否则易出现假阳性或假阴性结果，基层企业难以承担。因此，亟需开发出便捷、操作简单、灵敏度高的检测方法和产品
发明内容
为了解决上述技术操作复杂繁琐、耗时长的缺陷问题，本发明提供一种用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法，采用试剂盒可在15分钟内检测出鸡是否感染禽白血病病毒。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒，其包括荧光素标记的禽白血病毒重组P27蛋白溶液、样本处理液、阳性对照、阴性对照和反应微孔板，其中，所述阳性对照为灭活的禽白血病病毒JS09株，所述阴性对照为未接病毒的细胞培养上清，所述样本处理液是含禽白血病病毒特异性单克隆抗体的PBST溶液。
如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光素为异硫氰酸荧光素、戊二胺罗丹明、4’-氨甲基荧光素等。
进一步地，荧光素的浓度为0.01～1mg/mL，标记的禽白血病毒重组P27蛋白溶液为0.1～5mg/mL所用的稀释液是pH值为7.4、浓度为0.01mol/L的PBS。
所述反应微孔板为不透明的塑料96孔板。
如上所述的试剂盒，优选地，所述禽白血病病毒特异性单克隆抗体的浓度为0.5～5μg/ml，PBST溶液为含体积比为0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液。进一步地，所述禽白血病病毒特异性单克隆抗体的浓度为1～2.5μg/mL。
如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光素标记优选为异硫氰酸荧光素(FITC)，浓度为0.5～1.0mg/mL。
如上所述的试剂盒，优选地，所述阳性对照为多个，是具有梯度滴度的禽白血病病毒。此时，可以根据检测结果绘制校准曲线，对样本中的禽白血病病毒定量检测。
如上所述的试剂盒，优选地，所述阳性对照为106TCID50、105TCID50、104TCID50、103TCID50或102TCID50的禽白血病病毒JS09株。
一种用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析方法，其采用如上所述的试剂盒进行检测，其包括如下步骤：
S1、采集泄殖腔拭子或胎粪或蛋清样本；
S2、泄殖腔拭子或胎粪样品或蛋清样本加入到样本稀释液中，振荡作为样本溶液；
S3、用移液器吸取处理好的样本溶液加入反应微孔中，然后继续加入荧光素标记的禽白血病重组P27蛋白溶液、样本处理液，室温孵育10min；同时做阳性对照和阴性对照，也就是阳性对照和阴性对照直接加入反应微孔中进行检测；所述阴性对照为采用未接种病毒的DF1细胞上清进行检测；所述阳性对照为含禽白血病病毒JS09株的溶液进行检测；
S4、利用荧光偏振免疫分析仪读取荧光偏振信号，根据阴性对照与样本检测的荧光偏振值之差即ΔFP值确定样本检测结果，样本中病毒含量与荧光偏振值呈负相关关系。
如上所述的分析方法，优选地，在步骤S3中，所述样本溶液加入量为100μL，所述荧光素标记的禽白血病重组P27蛋白溶液为50μL，所述样本处理液50μL。
如上所述的分析方法，优选地，在步骤S4中，ΔFP值大于或等于20mP时判为阳性，ΔFP值小于20mP时判定为阴性。
如上所述的方法，优选地，在步骤S2中，泄殖腔拭子或胎粪样品检测时无需稀释，蛋清样品在96孔血清稀释板中按1:1的比例用样本稀释液进行稀释。
需要注意的是，样品若不立即使用或进行检测，可在短时间内(1～4小时)应置于4℃保存，长时间(≥4小时)需置于-20℃保存。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析检测试剂盒操作简便、无需特殊培训即可进行检测操作，检测灵敏度高，非常适合禽白血病大规模、快速检测。
与传统的病原学分析方法和常规ELISA方法相比，本发明具有以下优点：
1)检测耗时短，效率高。该试剂盒可在15分钟内检测出鸡是否感染禽白血病病毒，利用96孔微孔板可同时检测至少46份样本(以双孔重复对照计算)，检测效率高。
2)检测灵敏度高，成本低。本方法利用荧光偏振免疫检测技术优势，具有极高的检测灵敏度，且单次检测成本不超过10元。
3)检测结果可定性、定量。利用梯度稀释的阳性对照做校准曲线，可以进一步测定检测样本中的禽白血病病毒滴度，作定量及半定量测定。
本发明提供的用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒与传统技术相比较，优势明显，技术改进明显，操作简单方便，特别是针对禽白血病净化形式复杂、需求旺盛，具有非常广阔的市场前景，可在基层检测和政府监管中发挥重大作用。
附图说明
图1为禽白血病毒的荧光偏振免疫分析检测试剂盒校准曲线，其中阳性对照品TCID50值为106、105、104、103、102。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用试剂、实验材料，如没有特殊说明，均来源于商品化产品。
实施例1重组P27蛋白的制备
(1)根据GenBank序列号JF911742.1的序列设计引物并扩增，将扩增片段(扩增的基因序列和氨基酸序列分别SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)插入载体pET-28a(+)，转入大肠杆菌BL21(DE3)构建重组工程菌pET-28a(+)-P27-BL21(DE3)，构建成功的重组工程菌保存于北京纳百生物科技有限公司。将表达禽白血病病毒P27蛋白的工程菌接种于LB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)中，37℃过夜活化。
(2)以1～5％(v/v)接种活化培养物于5ml的LB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)中，37℃培养至吸光度600nm(OD600)达0.6～0.8时，加入IPTG，终浓度为0.2mmol/L诱导表达。
(3)在37℃，以200～250r/min诱导4h后，取经诱导的菌液收集后移入离心管配平，15000rpm，30min，4℃离心。收集上清液过0.22μm滤器进行过滤除杂，经镍柱纯化，收集产物经SDS-PAGE鉴定，为25KD大小的目的条带，测定蛋白浓度后作为重组P27抗原分装备用。
实施例2禽白血病病毒特异性单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
1.抗体制备、纯化
将实施例1制备好的重组P27抗原按照50μg的量，与等量弗氏佐剂乳化后，皮下多点注射免疫若干只Balb/C小鼠。首次免疫时佐剂为弗氏完全佐剂，后续免疫佐剂为弗氏不完全佐剂佐剂。免疫间隔为2周，3次免疫后以直接ELISA测定血清效价。筛选血清效价高、交叉反应较小的小鼠按常规方法细胞融合，筛选分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
筛选抗原为灭活的减蛋综合症病毒EDS、禽流感病毒、新城疫病毒、禽白血病病毒及实施例1制备的重组P27蛋白抗原，并用阴性血清作为参考对照，通过筛选排除对所用的交叉反应物质有反应的单抗细胞株，保留只与禽白血病病毒及重组P27蛋白抗原反应的细胞株。扩大培养后以体内法诱生腹水，收集后经过饱和硫酸铵沉淀后，以Protein G柱纯化，获得单克隆抗体，测定蛋白浓度后冻存。
2.抗体亚型鉴定
利用商品化IgG亚型鉴定试剂盒对所制备的单克隆抗体进行鉴定，结果为IgG2b亚型，具体操作如下：
(1)将制备的纯化单抗用1×PBS溶液作1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、1:35000和1:40000稀释。
(2)取实例1制备的P27蛋白包被板(0.1μg/mL)，以1×洗涤液300μL/孔洗板1次，弃去洗涤液。加入相应步骤(1)稀释好的单克隆抗体，每孔50μL，每个单抗作5个重复孔，振荡混匀1分钟。37℃孵育30分钟后，取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μL 1×洗涤液，洗涤3次后，甩干。
(3)将商品化试剂盒中的IgG1、IgG2b和IgG3用PBS溶液作1:1000稀释，将商品化试剂盒中的IgG2a和IgM用PBS溶液作1:5000稀释。步骤(2)后的每个单抗依次加入已稀释的IgG1、IgG2b、IgG3、IgG2a和IgM抗体，每孔加入100μL，4℃孵育过夜，或37℃孵育2小时。
(4)将HRP标记的山羊抗兔IgG抗体用PBS作1:5000稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育30分钟后，按上一步中的方法洗涤3次，甩干。
(5)将底物溶液立即加入到ELISA反应板中，100μL/孔，室温避光显色10分钟后，每孔加50μL终止液终止反应。
(6)反应终止后，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值。
(7)比较每个单抗加入IgG1、IgG2b、IgG3、IgG2a和IgM抗体孔的OD450nm值，OD450nm最高者对应的亚类为该单抗的亚类。
单克隆抗体鉴定结果为IgG2b亚型3.抗体效价测定
以间接ELISA鉴定ALV单克隆抗体的效价，具体操作如下：
(1)将本实施例步骤1中制备的纯化单抗用1×PBS溶液作1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、1:35000和1:40000稀释。
(2)取实施例1制备的P27蛋白包被板(0.1μg/mL)，以1×洗涤液300μL/孔洗板1次，弃去洗涤液。将稀释好的免疫小鼠阳性血清(阳性对照)和空白小鼠血清(阴性对照)分别加入到ELISA板中，50μL/孔，其中阳性及阴性对照各做2个重复。加入已稀释好的单克隆抗体，每孔100μL，振荡混匀1分钟。37℃孵育30分钟后，取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μL1×洗涤液，洗涤3次后，甩干。
(3)将HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体用相应的稀释液作1:100稀释后，每孔加入100μl，37℃孵育30分钟后，按上一步中的方法洗涤3次，甩干。
(4)将底物溶液立即加入到ELISA反应板中，100μL/孔，室温避光显色10分钟后，每孔加50μL终止液终止反应。
(5)反应终止后，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值。
(6)阳性对照血清的平均值≥2倍阴性对照血清的平均值的最高稀释度确定为抗体的效价。
实施例3：荧光素标记禽白血病病毒重组P27蛋白的制备
将荧光素FITC(异硫氰酸荧光素)与禽白血病病毒重组P27蛋白标记，操作如下：
(1)取按实施例1制备的禽白血病病毒重组P27蛋白用0.01mol/L PBS，pH7.2稀释至2mg/mL备用；
(2)取FITC用二甲基亚砜溶解成1mg/mL的FITC溶液备用；
(3)取100μL准备的FITC溶液加入到1mL准备好的禽白血病病毒重组P27蛋白溶液中(FITC与P27蛋白质量比例为1:20)；
(4)继续用PBS补液至2mL，然后室温避光搅拌反应2h；
(5)将上述反应液用SephadexG-25柱过柱除去游离的FITC，用PBS洗脱。流速控制在1mL/min，收集第一个荧光蛋白结合峰流出液，测定F/P值，
F/P＝(2.87×A495)/(A280-0.35×A495)，确保F/P值在2.5左右。A495表示在495nm的吸光度值，A280表示在280nm的吸光度值。
(6)纯化好的FITC标记的重组P27蛋白经进一步用PBS溶液透析后备用。
实施例4禽白血病的荧光偏振免疫分析检测试剂盒的组装
(1)阳性对照：灭活禽白血病病毒JS09株(由中国动物疫病预防控制中心制备并提供)，病毒滴度为104TCID50，2mL
(2)阴性对照：DF1未接毒的细胞培养上清，2mL
(3)异硫氰酸荧光素标记的禽白血病病毒重组P27蛋白(实施例3中制备)6mL
(4)样本处理液：50mL含禽白血病病毒特异性单克隆抗体和0.1％BSA的PBST溶液；其中抗体浓度为1μg/mL，PBST溶液为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液。
(5)反应微孔板：商品化不透明的塑料96孔板
(6)试剂盒组装：将上述各组分贴好标签，放置于刻有孔位的泡沫托上，与试剂盒说明书一起放入试剂盒外包装盒，贴上标签，塑封后保存于2～8℃备用。
其中，采用试剂盒的检测方法包括如下步骤:
第一步，采集泄殖腔拭子或胎粪或蛋清样本。
第二步，泄殖腔拭子或胎粪样品加入到配套的样本稀释液中，并且在检测之前充分振荡。泄殖腔拭子或胎粪样品检测时无需稀释。蛋清样品按1:1的比例用样本稀释液进行稀释，振荡器充分混匀备用，并确保回复室温。若不立即使用，短时间内(1～4小时)应置于4℃保存，长时间(≥4小时)需置于-20℃保存。
第三步，用移液器吸取100μL处理好的样本溶液加入反应微孔板中，然后继续加入实施例3中制备的荧光素标记的禽白血病重组P27蛋白溶液50μL、样本稀释液50μL，室温孵育10min；
第四步，利用荧光偏振免疫分析仪读取荧光偏振信号，根据阴性对照与样本检测的荧光偏振值之差(ΔFP值)确定样本检测结果，样本中病毒含量与荧光偏振值呈负相关关系。当阴性对照的FP值大于180mP，阳性对照的ΔFP值大于或等于40mP，试验成立。ΔFP值大于或等于20mP时判为阳性，ΔFP值小于20mP时判定为阴性。
实施例5禽白血病的荧光偏振免疫分析检测试剂盒检测系列滴度的禽白血病病毒
将灭活的禽白血病病毒(TCID50为106)用PBS稀释分别稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，用本发明实施例4中建立的荧光偏振免疫分析法做检测，利用不同含量禽白血病病毒的FP值建立标准曲线(图1)，曲线回归判断本试剂盒对禽白血病病毒的最低检测限。下表1描述的是禽白血病病毒与荧光素标记的重组P27蛋白结合前后检测的FP值变化。
表1反应物 FP(mP)
荧光素标记的重组P27蛋白 210
荧光素标记的重组P27蛋白加入阳性对照 123
荧光素标记的重组P27蛋白加入阴性对照 207
以灭活的禽白血病病毒滴度TCID50为横坐标，对应检测获得的FP值为纵坐标，建立禽白血病病毒检测的标准曲线，如图1所示，其中各个标准点的禽白血病病毒滴度分别为106、105、104、103和102TCID50，通过计算机软件分析可知曲线的IC20为658.46TCID50，即本试剂盒对禽白血病病毒的最低检测灵敏度可达到658.46TCID50。
实施例6禽白血病的荧光偏振免疫分析检测试剂盒重复性实验
按实施例4方法制备3个批次的禽白血病的荧光偏振免疫分析检测试剂盒，检测同样的血清样本，每个样本重复检测2次，并且用不同批次试剂盒重复测定，根据检测结果判定试剂盒的批内、批间检测稳定性。
表2
由表2可知，本发明研制试剂盒批内批间变异系数均小于10％，稳定性良好。
实施例7禽白血病的荧光偏振免疫分析检测试剂盒敏感性实验
利用本发明实施例4的禽白血病的荧光偏振免疫分析检测试剂盒检测ALV病毒：禽白血病A亚型病毒VR-335(为ATCC产品)、禽白血病B亚型病毒VR-658(为ATCC产品)、禽白血病J亚型病毒CADC2010(顾小雪等，血管瘤型J亚型禽白血病病毒的分离与鉴定，中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集)。病毒效价为106.0TCID50/mL，结果均为阳性。说明本试剂盒可对不同亚型的禽白血病毒病毒进行检测。
实施例8禽白血病的荧光偏振免疫分析检测试剂盒特异性实验
将常见的禽病病毒AIV为禽流感病毒A/turkey/Wisconsin/66(H9N2)()；REV为禽网状内皮组织增生症病毒CVCC AV107，为中国兽医药品监察所产品；MDV为马立克氏病病毒VR-987，为ATCC产品；EDS为产蛋下降综合征病毒CVCC AV71为中国兽医药品监察所产品；IBDV为传染性法氏囊病毒VR-478，为ATCC产品，按照禽白血病毒的荧光偏振免疫分析检测试剂盒操作说明分别检测AIV、REV、MDV、EDS和IBDV，结果AIV、REV、MDV、EDS和IBDV均呈阴性，说明本发明提供的禽白血病毒的荧光偏振免疫分析检测试剂盒特异性强，不会发生交叉反应。
实施例9本发明的禽白血病毒的荧光偏振免疫分析检测试剂盒与现有的禽白血病毒的酶联免疫试剂盒的比较
将本发明的禽白血病的荧光偏振免疫分析检测试剂盒与美国IDEXX的禽白血病P27抗原酶联免疫试剂盒做比较结果如下表3，结果说明本发明试剂盒大缩短了高通量检测的时间，无需繁琐的洗板拍板过程，孵育时间短，方便快捷。对372份样本进行检测，本发明的禽白血病的荧光偏振免疫分析检测试剂盒与美国IDEXX的禽白血病P27抗原酶联免疫试剂盒比较，总符合率在95.7％。
表3
技术指标 本发明试剂盒 美国试剂盒
检测时间 20min 150min以上
孵育温度 室温 室温
孵育次数 1 3
孵育时间 10min 135min
有效期 12个月 12个月
序列表
<110> 北京市动物疫病预防控制中心、北京纳百生物科技有限公司
<120> 用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcctgtag tgattaagac agagggaccc gcctggaccc ctctggagcc aaaattgatc 60
acaagactgg ctgatacggt caggaccaag ggcttacgat ccccgatcac tatggcagaa 120
gtggaagcgc ttatgtcctc cccgctgctg ccgcatgacg tcacgaatct aatgagagtt 180
atcttaggac ctgccccata tgccttatgg atggacgctt ggggagtcca actacagacg 240
gttatagcgg cagccactcg cgacccccga cacccagcga acggtcaagg gcggggggaa 300
cggactaact tggatcgttt aaagggtttg gcggatggaa tggccggcaa tccagagggt 360
caggctgcat tattaagacc gggggaactg gttgctatta cggcgtcggc tctccaggcg 420
tttagagagg tcgctcggtt ggcggaaccc acagacccgt gggcggaaat tacgcaggga 480
ccatctgagt cctttgtgga ttttgccaat cgtcttataa aggcggttga agggtcagat 540
ctcccacctt ccgcgcgggc tccggtgatc attgactgct ttaggcagaa gtcacagcca 600
gatatccagc agcttatacg ggcagcaccc tccacgctga ccaccccagg agagataatc 660
aaatatgtgc tagacaggca gaagactgcc cctcttacgg atcgaggcat agccgcggcc 720
atgtcgtctg ctatccagcc ctaa 744
<210> 2
<211> 247
<212> PRT
<213> P27氨基酸序列(P27)
<400> 2
Met Pro Val Val Ile Lys Thr Glu Gly Pro Ala Trp Thr Pro Leu Glu
1 5 10 15
Pro Lys Leu Ile Thr Arg Leu Ala Asp Thr Val Arg Thr Lys Gly Leu
20 25 30
Arg Ser Pro Ile Thr Met Ala Glu Val Glu Ala Leu Met Ser Ser Pro
35 40 45
Leu Leu Pro His Asp Val Thr Asn Leu Met Arg Val Ile Leu Gly Pro
50 55 60
Ala Pro Tyr Ala Leu Trp Met Asp Ala Trp Gly Val Gln Leu Gln Thr
65 70 75 80
Val Ile Ala Ala Ala Thr Arg Asp Pro Arg His Pro Ala Asn Gly Gln
85 90 95
Gly Arg Gly Glu Arg Thr Asn Leu Asp Arg Leu Lys Gly Leu Ala Asp
100 105 110
Gly Met Ala Gly Asn Pro Glu Gly Gln Ala Ala Leu Leu Arg Pro Gly
115 120 125
Glu Leu Val Ala Ile Thr Ala Ser Ala Leu Gln Ala Phe Arg Glu Val
130 135 140
Ala Arg Leu Ala Glu Pro Thr Asp Pro Trp Ala Glu Ile Thr Gln Gly
145 150 155 160
Pro Ser Glu Ser Phe Val Asp Phe Ala Asn Arg Leu Ile Lys Ala Val
165 170 175
Glu Gly Ser Asp Leu Pro Pro Ser Ala Arg Ala Pro Val Ile Ile Asp
180 185 190
Cys Phe Arg Gln Lys Ser Gln Pro Asp Ile Gln Gln Leu Ile Arg Ala
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Leu Thr Thr Pro Gly Glu Ile Ile Lys Tyr Val Leu
210 215 220
Asp Arg Gln Lys Thr Ala Pro Leu Thr Asp Arg Gly Ile Ala Ala Ala
225 230 235 240
Met Ser Ser Ala Ile Gln Pro
245

Claims (10)

1.一种用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒，其特征在于，其包括荧光素标记的禽白血病毒重组P27蛋白溶液、样本处理液、阳性对照、阴性对照和反应微孔板，其中，所述阳性对照为灭活的禽白血病病毒JS09株，所述阴性对照为未接病毒的细胞培养上清，所述样本处理液是含禽白血病病毒特异性单克隆抗体的PBST溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光素为异硫氰酸荧光素、戊二胺罗丹明或4’-氨甲基荧光素。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述禽白血病病毒特异性单克隆抗体的浓度为0.5～5μg/mL，PBST溶液为含体积比为0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光素标记优选为异硫氰酸荧光素，浓度为0.5～1.0mg/mL。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为多个，是具有梯度滴度的禽白血病病毒。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为104TCID50含禽白血病病毒JS09株的溶液。
7.一种用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于，其采用如权利要求1-6中任一项所述的试剂盒进行检测，其包括如下步骤：
S1、采集泄殖腔拭子或胎粪或蛋清样本；
S2、泄殖腔拭子或胎粪样品或蛋清样本加入到样本稀释液即0.01mol/L pH7.4的PBS溶液中，振荡作为样本溶液；
S3、用移液器吸取处理好的样本溶液加入反应微孔中，然后继续加入荧光素标记的禽白血病重组P27蛋白溶液、样本处理液，室温孵育10min；同时做阳性对照和阴性对照；所述阴性对照为采用样本稀释液进行检测；
S4、利用荧光偏振免疫分析仪读取荧光偏振信号，根据阴性对照与样本检测的荧光偏振值之差，即ΔFP值确定样本检测结果，样本中病毒含量与荧光偏振值呈负相关关系。
8.根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于，在步骤S3中，所述样本溶液加入量为100μL，所述荧光素标记的禽白血病重组P27蛋白溶液为50μL，所述样本处理液50μL。
9.根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于，在步骤S4中，ΔFP值大于或等于20mP时判为阳性，ΔFP值小于20mP时判定为阴性。
10.根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于，在步骤S2中，泄殖腔拭子或胎粪样品检测时无需稀释，所述蛋清样品在96孔血清稀释板中按1:1的比例用样本稀释液进行稀释。
CN201910452217.9A 2019-05-28 2019-05-28 用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法 Pending CN110261607A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910452217.9A CN110261607A (zh) 2019-05-28 2019-05-28 用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910452217.9A CN110261607A (zh) 2019-05-28 2019-05-28 用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110261607A true CN110261607A (zh) 2019-09-20

Family

ID=67915705

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910452217.9A Pending CN110261607A (zh) 2019-05-28 2019-05-28 用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110261607A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114397449A (zh) * 2022-01-05 2022-04-26 中科国创(南平)生物科技有限公司 一种elisa检测胎粪中禽白血病病毒抗原的样品稀释液
CN115725792A (zh) * 2022-09-20 2023-03-03 江苏省家禽科学研究所 一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005054854A1 (en) * 2003-11-05 2005-06-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Naval Medical Research Center Fluorescence polarization instruments and methods for detection of exposure to biological materials by fluorescence polarization immunoassay of saliva, oral or bodily fluids
CN103163299A (zh) * 2013-02-05 2013-06-19 扬州大学 禽白血病双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒
CN103257231A (zh) * 2013-05-03 2013-08-21 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 一种用于检测禽白血病p27的酶联免疫反应载体及试剂盒
CN106353496A (zh) * 2016-11-10 2017-01-25 中国兽医药品监察所 布鲁氏菌荧光偏振（fpa）检测试剂盒
CN106872706A (zh) * 2017-01-25 2017-06-20 中国农业科学院油料作物研究所 一种用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005054854A1 (en) * 2003-11-05 2005-06-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Naval Medical Research Center Fluorescence polarization instruments and methods for detection of exposure to biological materials by fluorescence polarization immunoassay of saliva, oral or bodily fluids
CN103163299A (zh) * 2013-02-05 2013-06-19 扬州大学 禽白血病双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒
CN103257231A (zh) * 2013-05-03 2013-08-21 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 一种用于检测禽白血病p27的酶联免疫反应载体及试剂盒
CN106353496A (zh) * 2016-11-10 2017-01-25 中国兽医药品监察所 布鲁氏菌荧光偏振（fpa）检测试剂盒
CN106872706A (zh) * 2017-01-25 2017-06-20 中国农业科学院油料作物研究所 一种用于检测甲萘威的荧光偏振免疫分析方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114397449A (zh) * 2022-01-05 2022-04-26 中科国创(南平)生物科技有限公司 一种elisa检测胎粪中禽白血病病毒抗原的样品稀释液
CN115725792A (zh) * 2022-09-20 2023-03-03 江苏省家禽科学研究所 一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒
CN115725792B (zh) * 2022-09-20 2024-01-30 江苏省家禽科学研究所 一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105950563B (zh) 杂交瘤细胞株7e3及其分泌的抗口蹄疫a型病毒的单克隆抗体与应用
Peng et al. Development of an immunochromatographic strip for rapid detection of H9 subtype avian influenza viruses
CN109187967B (zh) 一种检测并区分o型、a型口蹄疫病毒的双联快速检测卡及其制备方法
CN107037212B (zh) 猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒
CN108918869B (zh) fiber2蛋白及其重组蛋白在检测血清4型禽腺病毒抗体方面的应用
CN110261607A (zh) 用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法
CN106636004A (zh) 一种tmv‑cmv‑pvy三重病毒胶体金快速检测试纸条
CN111596064B (zh) 同时检测pedv和tgev的速测卡及其制备、使用方法
CN111999496A (zh) 一种SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒及其制备方法
CN109187968A (zh) 一种猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的二联金标检测试纸及其制备方法
CN109374887A (zh) 牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金检测试剂盒及其应用
CN101799470A (zh) 布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒
CN110967480A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及应用
CN1286971C (zh) 一种单克隆抗体,包含该单克隆抗体的检测试剂盒及应用
CN100402553C (zh) 制备单克隆抗体的方法
CN108103002B (zh) Mdck细胞宿主残留蛋白的制备及其用途
CN109521199A (zh) 一种用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒及其应用
CN110174516A (zh) 鹅细小病毒vp3蛋白抗原elisa检测试剂盒及检测方法和应用
CN109374886A (zh) 牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒及其应用
CN109180519A (zh) 一种喹乙醇代谢物抗原、抗体及酶联免疫检测试剂盒与检测方法
CN106279408B (zh) 抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原、抗体检测中的应用
CN101012445A (zh) 一种鸡禽流感疫苗免疫与病毒野毒感染的胶体金免疫层析快速鉴别诊断试剂盒及应用
CN106795560A (zh) 检测多种流感的试剂盒和使用其检测流感的方法
CN101363865B (zh) 一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用
CN113801854B (zh) 分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190920