CN115724921A - 一种冠状病毒s蛋白、广谱性冠状病毒疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种冠状病毒S蛋白、广谱性冠状病毒疫苗及其应用。本发明通过对冠状病毒S蛋白的非功能区中的一个或多个糖基化位点进行点突变，使得该位点不能进行糖基化修饰，进而降低该区域的免疫原性，突显相对保守的S蛋白功能区的免疫原性。以该冠状病毒S蛋白作为免疫原免疫动物产生的抗体更多的识别不同冠状病毒或相同冠状病毒不同突变株的S蛋白的保守区/功能区，可用于开发广谱性抗冠状病毒抗体和广谱性冠状病毒疫苗。

Description

一种冠状病毒S蛋白、广谱性冠状病毒疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种冠状病毒S蛋白、广谱性冠状病毒疫苗及其应用。

背景技术

冠状病毒是具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，包括中东呼吸综合征(MERS)病毒和严重急性呼吸综合征(SARS)病毒、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)等。棘突蛋白(S蛋白)是冠状病毒的重要结构蛋白，在受体识别和细胞膜融合过程中发挥关键作用。S蛋白由S1和S2两个亚基组成，其中，S1亚基中包含受体结合域，用于识别并结合宿主受体血管紧张素转化酶2或其他宿主细胞表面受体。S蛋白对于冠状病毒的种属特异性的决定具有重要作用，是冠状病毒表面最为重要的抗原决定簇，能够诱导宿主体内产生特异性的抗体。

目前，新型冠状病毒已经有一万多种突变体，给疫苗研发带来了极大的挑战。但是不管新型冠状病毒如何突变，该病毒的感染都必须先通过S蛋白的RBD区域锚定在人的细胞表面，然后利用人细胞表面的弗林(Furin)蛋白酶在S蛋白的S2区域把S蛋白切割为两段，新型冠状病毒的磷脂膜就可以与人细胞膜粘连并发生融合，将新型冠状病毒的基因材料注入人细胞内，利用人的RNA和蛋白合成工具快速地合成病毒的RNA和蛋白，组装形成上亿个新病毒后，从细胞中排出并产生进一步感染。

S蛋白是疫苗的核心靶点，第一代新冠核酸疫苗、腺病毒疫苗和重组蛋白疫苗都是选择了全长S蛋白或其一部分作为疫苗有效组分。新型冠状病毒α、β、γ、δ和Omicron等多个流行株主要在以下4个方面发生了一个或多个方面的变化：

1)S蛋白RBD区域的氨基酸突变(如N501Y)，改变了其与人ACE2或其他细胞受体的亲和力，增多感染途径、甚至跨种属；

2)S蛋白S2区域的氨基酸突变(如D614G)，更容易被细胞弗林蛋白酶切活性，病毒侵入人细胞速度更快；

3)N蛋白的氨基酸突变加强了病毒复制能力，增加病毒载量，传播能力更强；

4)S蛋白的NTD区域的氨基酸突变如糖基化位点附近的氨基酸缺失或出现新的糖基化位点，改变B细胞表位，实现免疫逃逸；

新型冠状病毒α毒株的突变主要在S2上的D614G突变，病毒侵入加快，但是辉瑞的mRNA疫苗对其保护率仍然高达95％；而γ株的突变主要在NTD，辉瑞的mRNA疫苗对其几乎没有保护作用；δ株S蛋白上的突变最少，辉瑞的mRNA疫苗在完成接种之初仍然有90％以上的保护，而δ株N蛋白突变使病毒浓度提高了1200倍。新一代新冠疫苗研发的重点主要在于：如何应对NTD上的突变，防止免疫逃逸。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种降低冠状病毒S蛋白非功能区免疫原性、制备广谱性抗冠状病毒抗体或疫苗的方法。

本发明的第二目的在于提供一种冠状病毒S1蛋白或S蛋白。

本发明的第三目的在于提供含有上述冠状病毒S1蛋白或S蛋白的产品或者以冠状病毒S1蛋白或S蛋白作为免疫原制备的冠状病毒抗体。

本发明的主要构思为：利用去伪存真的策略，对新型冠状病毒S蛋白进行去糖基化改造。

每个新型冠状病毒S蛋白上存在22个糖基化，S蛋白糖基化修饰的第一使命是利用其亲水性帮助新合成的S蛋白折叠为正确的3D构象；同时由于糖基结构非常复杂，一部分糖基化(RBD区域)参与到S蛋白和ACE2的结合，影响亲和力；另一部分糖基化(NTD区域)则使得接种者产生的抗体均能够对其进行识别，为将来突变实现免疫逃逸提供条件。

对已经发生的上万种新型冠状病毒S蛋白突变体进行了溯源，对改变了病毒传播率或实现了免疫逃逸的S/RBD蛋白进行了3D结构分析，对将改变ACE-2亲和力和Furin酶切动力学的突变进行了预判，认为冠状病毒S蛋白的NTD区域的单个或多个糖基化不会影响S蛋白的折叠，也不直接参与S蛋白和其受体的结合，更多的是扮演了“马甲”(Decoy)的角色，吸引B细胞的注意力，产生针对这些位点的抗体。比如β、γ、δ和Omicron株，它们都在N17、N74、N149等糖基化位点附近出现简单的氨基酸突变或缺失，可以显著改变S蛋白的B细胞表位，实现免疫逃逸。

基于上述结果，本发明提出去伪存真的策略，对冠状病毒S蛋白进行去糖基化改造，重新设计S蛋白氨基酸序列，将这些为了免疫逃避预留的Decoy糖基化的氨基酸N替换为不能糖基化的A，在体外或体内表达出这些新型冠状病毒S/S1蛋白作为广谱新型冠状病毒疫苗S蛋白亚单位疫苗的候选物。该疫苗不仅能够预防已经传播的新型冠状病毒毒株，还可以预防尚未出现但很有可能出现和传播的新型冠状病毒突变株。

本发明以冠状病毒S蛋白为研究对象，通过将S蛋白的非功能区中的一个或多个糖基化位点进行点突变，导致该位点不能实现糖基化修饰，进而降低该区域的免疫原性，去伪存真来突显相对保守的S蛋白功能区(包括RBD的B细胞表位等)的免疫原性。以该S蛋白作为免疫原免疫动物后产生的抗体更多是识别不同冠状病毒或相同冠状病毒的不同突变株的S蛋白的保守区/功能区，可用于开发广谱性抗冠状病毒抗体和广谱性冠状病毒疫苗。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种降低冠状病毒S蛋白非功能区免疫原性的方法，该方法包括：将冠状病毒S蛋白非功能区的一个或多个糖基化位点进行突变，使得所述糖基化位点不能进行糖基化修饰。

本发明提供一种制备广谱性抗冠状病毒抗体的方法，该方法包括：采用冠状病毒S蛋白免疫动物，诱导动物产生广谱性抗冠状病毒抗体，所述冠状病毒S蛋白的非功能区的一个或多个糖基化位点发生突变，使得所述糖基化位点不能进行糖基化修饰。

本发明还提供一种广谱性冠状病毒疫苗的制备方法，该方法包括：将冠状病毒S蛋白非功能区的一个或多个糖基化位点进行基因突变，使得所述糖基化位点不能进行糖基化修饰，在体外和或体内产生去糖基化的冠状病毒S蛋白，作为疫苗的有效抗原来源。

具体地，以上所述的非功能区为N端结构域(NTD)。

以新型冠状病毒野生型为例，其S蛋白的N端结构域(NTD)的氨基酸序列可以是如SEQ ID NO.1所示的序列中的N端结构域。

本发明中，所述冠状病毒优选为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、非典型肺炎病毒(SARS)、中东呼吸综合征病毒(MERS)、除新型冠状病毒、非典型肺炎病毒、中东呼吸综合征病毒以外的其他冠状病毒中的任意一种。

其中，新型冠状病毒可为选自野毒株、α、β、γ、δ、λ、ζ毒株中的任意一种。

优选地，所述糖基化位点以野生型新型冠状病毒S蛋白(序列如SEQ ID NO.1所示)为例是第17位、第61位、第74位、第122位、第149位、第165位、第234位、第282位氨基酸中的任意一个或多个的组合，或者为选自新型冠状病毒突变株或除新型冠状病毒以外的其他冠状病毒的S蛋白中对应于上述位点的氨基酸中的任意一个或多个的组合。

对于以上所述的新型冠状病毒突变株或除新型冠状病毒以外的其他冠状病毒的S蛋白对应于野生型新型冠状病毒S蛋白的第17位、第61位、第74位、第122位、第149位、第165位、第234位、第282位的氨基酸，本领域技术人员可通过将新型冠状病毒突变株或除新型冠状病毒以外的其他冠状病毒的S蛋白与野生型新型冠状病毒S蛋白进行序列比对，确定对应于上述位点的氨基酸位置和氨基酸类型。

在本发明的一些实施方式中，所述糖基化位点为选自以下(1)-(6)的任一种：

(1)所述糖基化位点为S蛋白的第17位、第74位、第149位氨基酸的组合；

(2)所述糖基化位点为S蛋白的第61位、第122位、第165位氨基酸的组合；

(3)所述糖基化位点为S蛋白的第17位、第74位、第149位、第282位氨基酸的组合；

(4)所述糖基化位点为S蛋白的第17位、第61位、第74位氨基酸的组合；

(5)所述糖基化位点为S蛋白的第122位、第149位、第165位氨基酸的组合；

(6)所述糖基化位点为S蛋白的第17位、第165位氨基酸的组合。

优选地，对于新型冠状病毒而言，所述糖基化位点为选自新型冠状病毒S蛋白(序列如SEQ ID NO.1所示)的N17、N61、N74、N122、N149、N165、N234、N282中的任意一个或多个的组合。

在本发明的一些实施方式中，对于新型冠状病毒而言，所述糖基化位点为选自以下(1)-(6)的任一种：

(1)所述糖基化位点为新型冠状病毒S蛋白的N17、N74、N149的组合；

(2)所述糖基化位点为新型冠状病毒S蛋白的N61、N122、N165的组合；

(3)所述糖基化位点为新型冠状病毒S蛋白的N17、N74、N149、N282的组合；

(4)所述糖基化位点为新型冠状病毒S蛋白的N17、N61、N74的组合；

(5)所述糖基化位点为新型冠状病毒S蛋白的N122、N149、N165的组合；

(6)所述糖基化位点为新型冠状病毒S蛋白的N17、N165的组合。

优选地，以上所述的糖基化位点的突变为：将所述糖基化位点的氨基酸突变为丙氨酸(A)或甘氨酸(G)或丝氨酸(S)。

优选地，以上所述的糖基化位点的突变为选自N17A/G/S、N61 A/G/S、N74 A/G/S、N122 A/G/S、N 149 A/G/S、N165 A/G/S、N234 A/G/S、N282A/G/S中的任意一个或多个的组合。

以上所述的糖基化位点的突变的含义为：以N17A/G/S为例，第17位N突变为A或G或S。

在本发明的一些实施方式中，所述糖基化位点的突变为选自以下(1)～(9)中的任一种：(1)N17A、(2)N74A、(3)N149A、(4)N17A和N74A、(5)N74A和N149A、(6)N17A、N74A和N149A、(7)N17A和N149A、(8)N17A、N61A和N149A、(9)N17A、N61A和N74A。

在本发明的一些实施方式中，对于新型冠状病毒而言，所述糖基化位点的突变为以下(1)-(6)的任一种：

(1)糖基化位点的突变为N17 A/G/S、N74 A/G/S、N 149 A/G/S的组合；

(2)糖基化位点的突变为N61 A/G/S、N122 A/G/S、N165 A/G/S的组合；

(3)糖基化位点的突变为N17A/G/S、N74 A/G/S、N 149 A/G/S、N282A/G/S的组合；

(4)糖基化位点的突变为N17A/G/S、N61 A/G/S、N74 A/G/S、的组合；

(5)糖基化位点的突变为N122 A/G/S、N 149 A/G/S、N165 A/G/S的组合；

(6)糖基化位点的突变为N17A/G/S、N165A/G/S的组合。

另一方面，本发明提供一种冠状病毒S1蛋白，所述S1蛋白的非功能区的一个或多个糖基化位点发生突变，使得所述糖基化位点不能进行糖基化修饰。

优选地，所述非功能区为N端结构域(NTD)。

进一步优选地，所述糖基化位点为选自野生型新型冠状病毒S1蛋白(序列如SEQID NO.1所示)的第17位、第61位、第74位、第122位、第149位、第165位、第234位、第282位氨基酸中的任意一个或多个的组合，或者新型冠状病毒突变株或除新型冠状病毒以外的其他冠状病毒的S蛋白中对应于上述位点的氨基酸中的任意一个或多个的组合。

在本发明的一些实施方式中，所述糖基化位点为选自以下(1)-(6)的任一种：

(1)所述糖基化位点为S蛋白的第17位、第74位、第149位氨基酸的组合；

(2)所述糖基化位点为S蛋白的第61位、第122位、第165位氨基酸的组合；

(3)所述糖基化位点为S蛋白的第17位、第74位、第149位、第282位氨基酸的组合；

(4)所述糖基化位点为S蛋白的第17位、第61位、第74位氨基酸的组合；

(5)所述糖基化位点为S蛋白的第122位、第149位、第165位氨基酸的组合；

(6)所述糖基化位点为S蛋白的第17位、第165位氨基酸的组合。

优选地，对于新型冠状病毒而言，所述糖基化位点为选自新型冠状病毒S1蛋白(序列如SEQ ID NO.1所示)的N17、N61、N74、N122、N 149、N165、N234、N282中的任意一个或多个的组合。

优选地，以上所述的糖基化位点的突变为：将所述糖基化位点的氨基酸突变为丙氨酸(A)或甘氨酸(G)或丝氨酸(S)。

对于新型冠状病毒而言，所述糖基化位点的突变为选自N17A/G/S、N61A/G/S、N74A/G/S、N122A/G/S、N 149A/G/S、N165A/G/S、N234A/G/S、N282A/G/S中的任意一个或多个的组合。

上述突变为以SEQ ID NO.1所示序列为基础所进行的突变。

在本发明的一些实施方式中，所述糖基化位点的突变为选自以下(1)～(9)中的任一种：(1)N17A、(2)N74A、(3)N149A、(4)N17A和N74A、(5)N74A和N149A、(6)N17A、N74A和N149A、(7)N17A和N149A、(8)N17A、N61A和N149A、(9)N17A、N61A和N74A。

在本发明的一些实施方式中，对于新型冠状病毒而言，所述糖基化位点的突变为以下(1)-(6)的任一种：

(1)糖基化位点的突变为N17A/G/S、N74A/G/S、N 149A/G/S的组合；

(2)糖基化位点的突变为N61A/G/S、N122A/G/S、N165A/G/S的组合；

(3)糖基化位点的突变为N17A/G/S、N74A/G/S、N 149A/G/S、N282A/G/S的组合；

(4)糖基化位点的突变为N17A/G/S、N61A/G/S、N74A/G/S、的组合；

(5)糖基化位点的突变为N122A/G/S、N 149A/G/S、N165A/G/S的组合；

(6)糖基化位点的突变为N17A/G/S、N165A/G/S的组合。

具体地，所述冠状病毒S1蛋白(糖基化位点突变后的S1蛋白)的氨基酸序列如SEQID NO.2-10任一所示。

进一步地，本发明提供一种冠状病毒S蛋白，其包含以上所述的冠状病毒S1蛋白。

以上所述的S蛋白以所述冠状病毒S1蛋白为S1亚基。

本发明提供编码所述冠状病毒S1蛋白或所述冠状病毒S蛋白的基因。

根据上述提供的S1蛋白和S蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员能够获得其编码基因的序列。基于密码子的简并性，编码上述蛋白的基因序列不止一种，所有能够编码上述蛋白的基因均在本发明的保护范围内。

本发明还提供含有所述基因的生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、病毒、细菌或动物细胞。

其中，所述表达盒可为在所述基因的上游或下游连接用于驱动其转录、翻译的元件得到的重组DNA。所述载体可为表达载体或克隆载体，包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、转座子等。

基于上述S1蛋白、S蛋白的功能，本发明提供所述冠状病毒S1蛋白或所述冠状病毒S蛋白或所述蛋白的基因或含有所述基因的生物材料的如下任一种应用：

(1)在制备冠状病毒疫苗中的应用；

(2)在制备冠状病毒诊断试剂或试剂盒中的应用；

(3)在检测冠状病毒中的应用；

(4)在制备抗冠状病毒的抗体中的应用；

(5)在制备冠状病毒免疫血清中的应用；

(6)在制备预防或治疗冠状病毒感染的药物中的应用；

(7)在制备抑制冠状病毒增殖的药物中的应用；

(8)在筛选用于治疗冠状病毒的药物中的应用；

(9)在冠状病毒疫苗质量控制中的应用。

优选地，以上应用中，所述冠状病毒为新型冠状病毒。

以上应用中，所述诊断试剂为抗体诊断试剂或抗原诊断试剂。

优选地，所述抗体诊断试剂为抗体ELISA试剂盒诊断试剂或金标试纸条诊断试剂。所述抗原诊断试剂为双抗体夹心法ELISA试剂盒或金标试纸条诊断试剂。

本发明提供含有所述冠状病毒S1蛋白或所述冠状病毒S蛋白的产品，所述产品为选自冠状病毒S蛋白的NTD融合蛋白、冠状病毒S1蛋白的融合蛋白、冠状病毒S蛋白的融合蛋白、冠状病毒疫苗、冠状病毒的诊断试剂或试剂盒、预防或治疗冠状病毒感染的药物中的任一种。

优选地，所述冠状病毒为新型冠状病毒。

具体地，所述产品为冠状病毒疫苗，所述冠状病毒疫苗为重组蛋白疫苗、核酸疫苗或病毒载体类疫苗。

优选地，所述冠状病毒疫苗为新型冠状病毒重组蛋白疫苗、新型冠状病毒核酸疫苗、新型冠状病毒载体类疫苗。

其中，所述重组蛋白疫苗可为新型冠状病毒S重组蛋白疫苗、新型冠状病毒S1重组蛋白疫苗、新型冠状病毒RBD重组蛋白疫苗。

所述核酸疫苗可为新型冠状病毒S蛋白核酸疫苗、新型冠状病毒S1蛋白核酸疫苗、新型冠状病毒RBD核酸疫苗。

所述病毒载体类疫苗可为新型冠状病毒S蛋白病毒载体疫苗、新型冠状病毒S1蛋白病毒载体疫苗、新型冠状病毒RBD病毒载体疫苗。

本发明还提供一种新型冠状病毒抗体，其为以所述新型冠状病毒S1蛋白或所述新型冠状病毒S蛋白为免疫原制备得到。

本发明的有益效果在于：本发明通过对S蛋白的非功能区中的一个或多个糖基化位点进行点突变，使得该位点不能进行糖基化修饰，进而降低该区域的免疫原性，突显相对保守的S蛋白功能区的免疫原性。以该S蛋白作为免疫原免疫动物产生的抗体能够识别不同冠状病毒或相同冠状病毒的不同突变株的S蛋白的保守区/功能区，可用于开发广谱性抗冠状病毒抗体和广谱性冠状病毒疫苗。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同糖基化位点突变的S1蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果。

图2为本发明实施例2中不同糖基化位点突变的S1突变体1-Fc蛋白(S1M1-Fc)和S1突变体2-Fc蛋白(S1M2-Fc)蛋白免疫小鼠针对野毒株S1蛋白的抗体滴度，其中，S1M1-Fc和S1M2-Fc免疫所得抗体和野毒株S1蛋白有强烈交叉反应。

图3为本发明实施例3中糖基化位点突变的广谱性新型冠状病毒S1蛋白(PDC036pan-S1-Fc)诱导产生的抗体与不同新型冠状病毒突变株进行血清学交叉反应结果，PDC038和PDC039分别为未进行糖基化位点突变的对照δ毒株S1蛋白诱导产生抗体的结果。

图4为本发明实施例4中冠状病毒疫苗产生野毒株新冠假病毒中和滴度结果，其中，Rabbit1#和2#分别代表2只免疫兔。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1糖基化位点突变的新型冠状病毒S1/S蛋白的基因合成和蛋白制备

以新型冠状病毒S1/S蛋白为对象，将其中对应于野生型新型冠状病毒S1蛋白(序列如SEQ ID NO.1所示)的第17位、第61位、第74位、第122位、第149位、第165位、第234位、第282位糖基化位点中的一个或几个氨基酸进行突变，得到携带不同糖基化位点突变的新型冠状病毒S1蛋白，其中，部分突变的新型冠状病毒S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2-10所示。

合成含有上述糖基化位点突变的新型冠状病毒S1蛋白的NTD编码基因和全长S1/S蛋白编码基因，并将各编码基因分别插入到哺乳动物细胞表达载体中，获得重组质粒。同时合成野毒株(WT)、α、β、γ、δ、λ、ζ毒株的S-His、S1-His、S1-Fc、RBD-Dimer-His、RBD-Fc等对照蛋白的基因，并将各编码基因分别插入到哺乳动物细胞表达载体中，获得重组质粒。

将重组质粒转染至哺乳动物细胞中，培养转染后的哺乳动物细胞，在培养上清液中检测到不同浓度的上述糖基化位点突变和不同突变株的新型冠状病毒S、S1和RBD的His标签或Fc融合蛋白。部分数据见表1，部分去糖基化的S1蛋白(pS1-His，去糖基化的S1蛋白的序列如SEQ ID NO.7所示)的瞬转表达量与野毒株S1蛋白相近。

表1 不同S1-His蛋白表达上清液蛋白浓度评价

根据蛋白所带标签，分别选用Ni柱或Protein A亲和柱进行纯化，对表达的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，部分纯化蛋白的SDS-PAGE-考染如图1所示。图中第6和第7泳道为部分去糖基化S1-Fc融合蛋白(pan-S1-Fc，第6和第7泳道为融合蛋白中的S1蛋白的序列如SEQID NO.7所示),由于缺少糖基化，蛋白的表观分子量显得比突变株的S1-Fc蛋白略小，符合预期。

同时用BCA和OD280测定纯化蛋白，计算表达和纯化得率。如表2所示，部分去糖基化的S1-Fc融合蛋白(pan S1-Fc，融合蛋白中S1蛋白的序列如SEQ ID NO.7所示)的瞬转表达纯化得率为14mg/mL，介于不同突变株的表达水平之间。

表2 不同S/S1/RBD蛋白的表达和纯化得率

Rec.Protein	Cells	Yield
			δ-RBD-Dimer	293F	23.4mg/L
pan S1-Fc	293F	14mg/L
			γ-RBD-Fc	293F	4.905mg/L
γ-S1-Fc+	293F	2.13mg/L
			γ-S1-His	293F	4.85mg/L
δplus-RBD-Fc	293F	44.45mg/L
			pan S1-His	CHO	4.685mg/L
δplus-S1-His+	293F	8.96mg/L
			δplus-RBD-Dimer-His+	293F	50mg/L

以上结果表明，糖基化位点的部分去除，使S/S1重组蛋白的表观分子量有所变小，但是不影响其正常表达。

实施例2糖基化位点突变的新型冠状病毒S1蛋白的免疫效果分析

在佐剂的帮助下，利用实施例1制备的糖基化位点突变的新型冠状病毒的S1-Fc免疫4周龄雌性BALB/c小鼠，第0、14、28天肌肉注射0-6μg。采集不同时间点的血液样本，测定抗体水平。

如图2所示，以实施例1制备的糖基化位点突变的新型冠状病毒的S1-Fc(S1M1-Fc和S1M2-Fc，其中S1M1-Fc中的S1蛋白的序列如SEQ ID NO.5所示，S1M2-Fc中的S1蛋白的序列如SEQ ID NO.6所示)免疫小鼠后，均能够诱导上述免疫动物产生较高的针对野毒株S1-His的抗体滴度。

实施例3糖基化位点突变的新型冠状病毒S1蛋白诱导产生抗体的广谱性检测

在佐剂的帮助下，利用实施例1制备的糖基化位点突变的新型冠状病毒和野毒株、α、β、γ、δ、λ、ζ毒株的S1-Fc、RBD-Dimer-His、RBD-Fc分别免疫12～15周龄雌性新西兰大耳白兔，第0、14、28天肌肉注射0-6μg。采集不同时间点的血液样本，测定抗体水平和中和效价。

利用实施例1制备的糖基化位点突变的新型冠状病毒S1蛋白分别免疫动物，诱导产生抗新型冠状病毒抗体，将产生的抗体与不同新型冠状病毒突变株进行血清学交叉反应检测。结果表明，实施例1制备的糖基化位点突变的新型冠状病毒S1蛋白(pS1-Fc，其中糖基化位点突变的新型冠状病毒S1蛋白的序列如SEQ ID NO.7所示)诱导的抗体与不同新型冠状病毒突变株均具有更广谱的交叉反应(见表3和图3)，抗体滴度高于1：2万。

表3

注：表3中，K代表千、W代表万；δ+-RBD-Dimer和δ+-RBD-Fc为未进行糖基化位点突变的对照δ毒株S1蛋白诱导产生抗体的结果。

实施例4利用糖基化位点突变的新型冠状病毒S1蛋白开发的冠状病毒疫苗

将实施例1制备的糖基化位点突变的新型冠状病毒panS1-Fc蛋白(其中糖基化位点突变的新型冠状病毒S1蛋白的序列如SEQ ID NO.7所示)，加入铝佐剂和或其他佐剂制备得到新型冠状病毒疫苗，用其对动物免疫(新西兰大耳白兔)后，可以产生较高的δ+新冠假病毒中和滴度，如图4所示。

该新型冠状病毒疫苗对于不同新型冠状病毒突变株均具有较高的保护力，是一种广谱性的新型冠状病毒疫苗。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (15)

1.一种降低冠状病毒S蛋白非功能区免疫原性的方法，其特征在于，包括：将冠状病毒S蛋白非功能区的一个或多个糖基化位点进行突变，使得所述糖基化位点不能进行糖基化修饰。

2.一种制备广谱性抗冠状病毒抗体的方法，其特征在于，包括：采用冠状病毒S蛋白免疫动物，诱导动物产生广谱性抗冠状病毒抗体，

所述冠状病毒S蛋白的非功能区的一个或多个糖基化位点发生突变，使得所述糖基化位点不能进行糖基化修饰。

3.一种广谱性冠状病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括：将冠状病毒S蛋白非功能区的一个或多个糖基化位点进行基因突变，使得所述糖基化位点不能进行糖基化修饰，在体外和/或体内产生去糖基化的冠状病毒S蛋白，作为疫苗的有效抗原来源。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述非功能区为N端结构域。

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述冠状病毒为新型冠状病毒、非典型肺炎病毒、中东呼吸综合征病毒、除新型冠状病毒、非典型肺炎病毒、中东呼吸综合征病毒以外的其他冠状病毒中的任意一种；

优选地，所述新型冠状病毒为选自野毒株、α、β、γ、δ、λ、ζ毒株中的任意一种。

6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述糖基化位点为选自序列如SEQ ID NO.1所示的野生型新型冠状病毒S蛋白的第17位、第61位、第74位、第122位、第149位、第165位、第234位、第282位氨基酸中的任意一个或多个的组合，或者为选自新型冠状病毒突变株或除新型冠状病毒以外的其他冠状病毒的S蛋白中对应于上述位点的氨基酸中的任意一个或多个的组合；

优选地，所述冠状病毒为新型冠状病毒，所述糖基化位点为选自序列如SEQ ID NO.1所示的新型冠状病毒S蛋白的N17、N61、N74、N122、N149、N165、N234、N282中的任意一个或多个的组合；

更优选地，所述糖基化位点的突变为选自N17A/G/S、N61 A/G/S、N74 A/G/S、N122 A/G/S、N 149A/G/S、N165 A/G/S、N234 A/G/S、N282A/G/S中的任意一个或多个的组合；

更优选地，所述糖基化位点的突变为选自以下(1)～(9)中的任一种：(1)N17A、(2)N74A、(3)N149 A、(4)N17A和N74 A、(5)N74 A和N149 A、(6)N17A、N74 A和N149 A、(7)N17A和N149A、(8)N17A、N61 A和N149 A、(9)N17A、N61 A和N74 A。

7.一种冠状病毒S1蛋白，其特征在于，所述S1蛋白的非功能区的一个或多个糖基化位点发生突变，使得所述糖基化位点不能进行糖基化修饰；

优选地，所述非功能区为N端结构域；

更优选地，所述糖基化位点为选自序列如SEQ ID NO.1所示的野生型新型冠状病毒S1蛋白的第17位、第61位、第74位、第122位、第149位、第165位、第234位、第282位氨基酸中的任意一个或多个的组合，或者为选自新型冠状病毒突变株或除新型冠状病毒以外的其他冠状病毒的S蛋白中对应于上述位点的氨基酸中的任意一个或多个的组合。

8.根据权利要求7所述的冠状病毒S1蛋白，其特征在于，所述冠状病毒为新型冠状病毒，所述糖基化位点为选自序列如SEQ ID NO.1所示的新型冠状病毒S1蛋白的N17、N61、N74、N122、N149、N165、N234、N282中的任意一个或多个的组合；

优选地，所述糖基化位点的突变为选自序列如SEQ ID NO.1所示的新型冠状病毒S1蛋白的N17A/G/S、N61 A/G/S、N74 A/G/S、N122A/G/S、N 149A/G/S、N165 A/G/S、N234 A/G/S、N282A/G/S突变中的任意一个或多个的组合；

更优选地，所述糖基化位点的突变为选自以下(1)～(9)中的任一种：(1)N17A、(2)N74A、(3)N149 A、(4)N17A和N74 A、(5)N74 A和N149 A、(6)N17A、N74 A和N149 A、(7)N17A和N149A、(8)N17A、N61 A和N149 A、(9)N17A、N61 A和N74 A；

更优选地，所述冠状病毒S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2-10任一所示。

9.一种冠状病毒S蛋白，其特征在于，其包含权利要求7或8所述的冠状病毒S1蛋白。

10.编码权利要求7或8所述的冠状病毒S1蛋白或权利要求9所述的冠状病毒S蛋白的基因。

11.含有权利要求10所述的基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括表达盒、载体、病毒、细菌或动物细胞。

12.权利要求7或8所述的冠状病毒S1蛋白或权利要求9所述的冠状病毒S蛋白或权利要求10所述的基因或权利要求11所述的生物材料的如下任一种应用：

(1)在制备冠状病毒疫苗中的应用；

(2)在制备冠状病毒诊断试剂或试剂盒中的应用；

(3)在检测冠状病毒中的应用；

(4)在制备抗冠状病毒的抗体中的应用；

(5)在制备冠状病毒免疫血清中的应用；

(6)在制备预防或治疗冠状病毒感染的药物中的应用；

(7)在制备抑制冠状病毒增殖的药物中的应用；

(8)在筛选用于治疗冠状病毒的药物中的应用；

(9)在冠状病毒疫苗质量控制中的应用；

优选地，所述冠状病毒为新型冠状病毒。

13.含有权利要求7或8所述的冠状病毒S1蛋白或权利要求9所述的冠状病毒S蛋白的产品，其特征在于，所述产品为选自冠状病毒S蛋白的NTD融合蛋白、冠状病毒S1蛋白的融合蛋白、冠状病毒S蛋白的融合蛋白、冠状病毒疫苗、冠状病毒的诊断试剂或试剂盒、预防或治疗冠状病毒感染的药物中的任一种；

优选地，所述冠状病毒为新型冠状病毒。

14.根据权利要求13所述的产品，其特征在于，所述产品为冠状病毒疫苗，所述冠状病毒疫苗为重组蛋白疫苗、核酸疫苗或病毒载体类疫苗；

优选地，所述冠状病毒疫苗为新型冠状病毒重组蛋白疫苗、新型冠状病毒核酸疫苗、新型冠状病毒载体类疫苗。

15.抗冠状病毒抗体，其特征在于，其为以权利要求7或8所述的冠状病毒S1蛋白或权利要求9所述的冠状病毒S蛋白为免疫原制备得到。

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