CN105566475B - 日本血吸虫重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种日本血吸虫重组蛋白，该重组蛋白是由含日本血吸虫Vamp2基因的重组载体经表达而制得。本发明还公开了该日本血吸虫重组蛋白作为日本血吸虫诊断抗原的应用，以及该重组蛋白在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用。本发明的日本血吸虫重组蛋白，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组蛋白的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体并能达到一个较高水平，动物保护实验结果表明该重组蛋白具有发展为抗血吸虫病候选疫苗及新药物靶标的潜力，诊断抗原的效果评估实验结果表明该重组蛋白具有作为诊断抗原的潜力，应用前景广阔。

Description

日本血吸虫重组蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

血吸虫病是一种严重危害人畜健康的重大寄生虫病，流行于全球76个国家和地区，约6.5亿人受感染威胁、2亿人感染，每年死亡人数超过10万。在我国流行的是日本血吸虫病。虽然我国在血吸虫病的防治上已经取得了重大成就，但是由于中间宿主钉螺难以消灭，终末宿主种类多、活动范围广、传染源难以控制，血吸虫重复感染现象严重，且存在免疫逃避现象，全面控制血吸虫病传播的前景仍不容乐观。目前日本血吸虫病的防治难点主要是缺乏安全有效的疫苗；现有的诊断方法敏感性、特异性不理想，且不能区分既往感染和现症感染；吡喹酮是目前唯一大规模应用的药物，且已有抗药性产生的报道。因此要加强血吸虫生长发育关键分子的鉴定，以筛选新的候选疫苗分子、更加敏感、特异的诊断抗原以及新的药物靶标。

日本血吸虫寄生于宿主体内的过程亦是其与宿主不断适应的过程，需要宿主为其提供适宜的生理生化环境，并从宿主体内摄取自身无法合成的营养、激素等信号分子，同时血吸虫能以其复杂的调控机制逃避宿主一系列的抗感染反应，又不会诱发严重的病理损害而使宿主迅速死亡，从而使其生长发育繁殖得以延续。而体被是虫体与宿主接触的直接界面，与虫体的营养摄取、代谢凋亡、信号传导、免疫应答等生理过程密切相关，因此体被表膜蛋白的研究会为进一步发掘日本血吸虫的候选疫苗分子、更加敏感特异的诊断抗原及新的药物靶标提供新的线索。

囊泡运输在细胞的生命活动过程中担任“物流系统”的角色，细胞要把基因表达的产物定向运输到特定的地点行使功能，如神经递质的释放，激素的内分泌及酶和细胞因子的外分泌，胞吞、胞吐等，细胞的这些重大生命过程均依赖于囊泡运输。若囊泡运输出现障碍，则会出现神经系统疾病，代谢性疾病(如糖尿病)和免疫失调病等。囊泡运输的基本过程包括：货物的招募、囊泡出芽、定向运输、入坞锚定、膜融合、货物的释放及蛋白重摄取等，这既是基本的生命过程，又是一个极其复杂的动态过程，受到多种蛋白和调控因子的精密调控。SNARE(可溶性N-乙基马来酰胺敏感因子附着蛋白受体)是促进囊泡膜与靶膜融合的特殊蛋白复合体，被誉为膜融合的“发动机”，而Vamp2(囊泡膜蛋白)是SNARE的重要组成部分，正是其参与形成SNARE的过程拉动了囊泡膜与靶膜的融合。目前的研究表明Vamp2参与形成SNARE的过程是囊泡运输过程中的限速步骤，由此可见囊泡膜蛋白在细胞生命活动中担任着不可取代的角色。

目前关于Vamp2的研究表明：Vamp2主要参与胰岛素依赖性的GLUT4转运过程；其与糖尿病的发病机制密切相关；肉毒神经毒素B型通过裂解Vamp2而发挥其神经毒力作用；Vamp2参与细胞膜的更新成分胆固醇和LDL的运输，并与精卵融合等过程密切相关。还有文献报道日本血吸虫的抗原分子伪装机制可能与虫体宿主间的囊泡运输有关，这将为研究血吸虫的免疫逃避现象提供新思路。本实验室在日本血吸虫体被表膜蛋白质组学的研究中发现了日本血吸虫囊泡膜蛋白SjVamp2，但是其在日本血吸虫生长发育过程中发挥的重要作用还有待进一步研究。

到目前为止，还没有出现关于日本血吸虫SjVamp2重组蛋白作为血吸虫疫苗、或作为敏感特异的诊断抗原的公开报道。

发明内容

本发明要解决目前缺乏抗血吸虫高效疫苗的技术问题，提供一种日本血吸虫重组蛋白，该重组蛋白包含日本血吸虫囊泡膜蛋白(SjVamp2)的氨基酸序列，具有良好的免疫原性，适于作为抗血吸虫病候选疫苗。

为此，还需要提供一种上述日本血吸虫重组蛋白的制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种重组载体，包含日本血吸虫Vamp2基因，该基因序列是编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

优选的，所述基因序列是SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

更优选的，所述重组载体的空载体为原核表达载体pET28a(+)，所述日本血吸虫Vamp2基因插入在空载体pET28a(+)的EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ两个酶切位点之间。

在本发明的另一方面，还提供了一种日本血吸虫重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组载体经表达而制得。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

构建含日本血吸虫Vamp2基因的重组表达载体；

将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；

培养包含所述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达日本血吸虫Vamp2蛋白。

优选的，还包括步骤：将诱导表达获得的日本血吸虫Vamp2蛋白进一步纯化。

在本发明的一个具体实施例中，构建含日本血吸虫囊泡膜蛋白基因(SjVamp2)的重组表达载体，具体包括以下步骤：利用生物信息学进行分析，根据编码日本血吸虫囊泡膜蛋白(SjVamp2)的核苷酸序列设计PCR引物，并在两端加上特异限制性内切酶酶切位点，PCR扩增核酸片断，再利用特异限制性内切酶EcoRⅠ、XhoI将编码SjVamp2蛋白的核酸片段定向克隆至原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点区，构建重组原核表达质粒pET28a(+)-SjVamp2。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述日本血吸虫重组蛋白的抗血吸虫疫苗。

在本发明的另一方面，还提供了一种日本血吸虫诊断抗原，该诊断抗原为上述日本血吸虫重组蛋白。

在本发明的另一方面，还提供了一种诊断日本血吸虫病的试剂盒，包含上述日本血吸虫诊断抗原。

在本发明的另一方面，还提供了一种能与上述日本血吸虫重组蛋白特异性结合的抗体。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组蛋白在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用。

本发明日本血吸虫重组蛋白，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组蛋白的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体并且能达到一个较高水平，动物保护实验分别诱导34.7％的减虫率和35.1％的减卵率，表明该重组蛋白具有发展为抗血吸虫病候选疫苗及新药物靶标的潜力。诊断抗原的效果评估实验结果显示，本发明重组蛋白作为诊断抗原，敏感性达到96％，特异性达到98％，表明本发明SjVamp2重组蛋白作为诊断抗原有一定潜力，具有很好的应用价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的重组质粒pET28a(+)-SjVamp2的PCR鉴定结果图；

图2是本发明实施例1的日本血吸虫重组蛋白表达及纯化结果图；

图3是本发明实施例2的日本血吸虫重组蛋白免疫原性及抗原性检测结果图；

图4是本发明实施例3的实时定量PCR分析SjVamp2在不同发育阶段血吸虫内的差异表达图；

图5是本发明实施例3的实时定量PCR分析SjVamp2在不同宿主来源虫体中的相对表达量图；

图6是本发明实施例3的实时定量PCR分析SjVamp2在不同剂量吡喹酮治疗后不同时间的相对表达量图；

图7是本发明实施例4的应用免疫荧光技术分析SjVamp2在血吸虫体内组织定位分析图；

图8是本发明实施例5的抗rSjVamp2特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平的检测结果图；

图9是本发明实施例6的应用ELISA技术检测rSjVamp2作为诊断抗原的特异性和敏感性的检测结果图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

本实验室在日本血吸虫体被表膜蛋白质组学的研究中发现了日本血吸虫囊泡膜蛋白SjVamp2，在该基础上对SjVamp2蛋白进行生物信息学分析，应用PCR技术扩增获得日本血吸虫囊泡膜蛋白(SjVamp2)的核苷酸片段，运用基因工程重组技术将该核苷酸片段重组到载体pET28a(+)中，构建了pET28a(+)-SjVamp2原核表达质粒。将重组原核表达质粒pET28a(+)-SjVamp2转化入大肠杆菌BL21(DE3)后进行诱导表达并且纯化到重组蛋白rSjVamp2。

本发明应用生物信息学方法和基因工程技术获得重组蛋白rSjVamp2后，通过western blot分析此蛋白的抗原性和免疫原性，试验结果表明重组蛋白rSjVamp2具有良好的抗原性和免疫原性。该重组蛋白在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗该重组蛋白的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体，且这些抗体能达到一个较高的水平，动物保护实验分别诱导34.7％的减虫率和35.1％的减卵率，这些实验结果表明，本发明重组蛋白诱导产生的特异性抗体在杀伤虫体中起到了一定的作用，也预示该重组蛋白具有发展为抗血吸虫病候选疫苗的潜力，应用价值广阔。诊断抗原的效果评估实验结果显示，本发明重组蛋白作为诊断抗原，敏感性达到96％，特异性达到98％，预示该SjVamp2重组蛋白作为诊断抗原也有很好的应用价值。

实施例1日本血吸虫重组蛋白的表达和纯化

1.方法

1.1重组表达质粒的构建

根据NCBI登录号为gb|AAP05935.1|的SjVamp2氨基酸序列，找到编码区开放阅读框的基因序列，并设计引物，上游引物P1：5’-GTGGAATTCATGTCAGCCGACAC-3’(含EcoR Ⅰ酶切位点，SEQ ID NO.3)；下游引物P2：5’-GTTCTCGAGTCACTGAGTAGCACTTCCA-3’(含XhoⅠ酶切位点，SEQ ID NO.4)，用于扩增SjVamp2基因序列。以日本血吸虫42天虫体的cDNA为模板，PCR扩增其含有ORF的cDNA片段，反应组成如下：

PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30sec，56.5℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃，10min。PCR产物纯化后连接pMD19-T载体，转化DH5α细胞，挑取单克隆，进行PCR菌液鉴定，阳性克隆送上海华津公司测序。用上述测序正确的pMD19-T-SjVamp2/DH5α转接LB液体培养基，按照试剂盒说明书，小量提取质粒DNA，采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切体系在42℃恒温仪中双酶切30min。酶切产物利用凝胶回收纯化的方法得到带有粘性末端的DNA目的片段，并将其定向克隆到原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点中，16℃连接过夜。由此，构建得到重组质粒pET28a(+)-SjVamp2，将其转化到BL21(DE3)细胞中，挑取单克隆，进行PCR菌液鉴定，抽提阳性克隆质粒进行双酶切鉴定，并送上海华津公司测序。

1.2重组蛋白pET28a(+)-SjVamp2的表达与纯化

将测序正确的pET28a(+)-SjVamp2/BL21菌液转接到500ml含有卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃恒温振荡培养，当OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG，使其终浓度为1mmol/L进行诱导表达。分别于诱导后0、1、2、3、4、5、6小时取出1ml菌液，4℃12000×g离心3min，倒掉上清，用50μl PBS充分悬浮沉淀，随后加入50μl蛋白电泳上样缓冲液并吹打混匀。沸水煮样5min，进行SDS-PAGE电泳。

剩余的诱导了6个小时的菌液，4℃12000×g离心15min，倒掉上清，用20ml PBS充分悬浮沉淀，反复冻融三次后，冰浴超声15min(超声5s，停45s)，随后4℃12000×g离心15min，收集上清。再用10ml 8mol/L尿素溶解沉淀，完全溶解后4℃12000×g离心15min，收集上清。将收集的上清样品，混合蛋白上样缓冲液，沸水煮样5min后，直接进行SDS-PAGE分析。重组蛋白在大肠杆菌中成功表达，为不可溶表达，用8M尿素溶解上清作为样品，按照说明书利用Ni-NTA His-Bind Resin纯化得到重组蛋白。

2.结果

2.1重组质粒pET28a(+)-SjVamp2的构建及鉴定

利用限制性内切酶EcoR I、Xho I将PCR出的SjVamp2目的核苷酸片段亚克隆入载体pET28a(+)中，PCR、酶切鉴定重组原核表达质粒均出现与预期大小一致的DNA片段。对阳性克隆的菌落小量液体培养后，将菌液样本送上海华津生物公司进行测序，结果证实构建的重组质粒编码的阅读框核苷酸序列正确。PCR鉴定结果如图1所示，图1中，M：Marker；1、2、3均为PCR获得的大小为483bp左右的SjVamp2目的核苷酸片段。

2.2pET28a(+)-SjVamp2在大肠杆菌中的表达与重组蛋白的纯化

在1mM IPTG诱导下，重组原核表达质粒pET28a(+)-SjVamp2在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，大小为21kD，并经纯化得到了较纯的重组蛋白(见图2)。图2中，M：maker；1：IPTG诱导的pET28a空载体产物；2：未诱导的重组质粒pET28a(+)-SjVamp2产物；3：IPTG诱导的重组质粒pET28a(+)-SjVamp2产物；4、5均为Ni-his柱纯化后的rSjVamp2蛋白。

实施例2日本血吸虫重组蛋白rSjVamp2的抗原性及免疫原性检测

1.Western Blotting分析重组蛋白的抗原性及免疫原性

以纯化后的rSjVamp2蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后在4℃下，采用130mA，1h转移到NC膜上，封闭过夜，之后分别以rSjVamp2蛋白的特异性抗体血清和全虫免疫兔血清为一抗进行western blot，分析rSjVamp2蛋白的抗原性及免疫原性。

2.Western Blot分析重组蛋白的抗原性及免疫原性的结果

Western blot结果显示，以上述两种血清作为一抗，在21kD大小处均出现了较为明显的条带，表明rSjVamp2蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。图3是以rSjVamp2蛋白的特异性抗体血清为一抗的western blot结果图。

实施例3日本血吸虫SjVamp2的转录水平分析

1.方法

1.1实时定量PCR分析SjVamp2在血吸虫不同发育阶段的表达量情况

以日本血吸虫α-Tublin为内参基因，其实时定量PCR上游扩增引物为5'-CTGATTTTCCATTCGTTTG-3'(SEQ ID NO.5)；下游引物为5'-GTTGTCTACCATGAAGGCA-3'(SEQID NO.6)。而针对SjVamp2实时定量PCR的上游扩增引物为5'-ACAACCTCGACCACAGAACAAG-3'(SEQ ID NO.7)，下游引物为5'-TTCCTGCACTAGCCTCGAATTG-3'(SEQ ID NO.8)。

取日本血吸虫尾蚴、7、14、21、28、35、42天虫体以及42天雌、雄虫体和虫卵，提取各期别虫体总的RNA。采用Prime Script RTreagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒，去除RNA样品中的基因组DNA并反转录成cDNA。以α-Tublin为内参，采用SYBR Green荧光染料法、利用ABI 7500 Real-Time PCR仪器进行实时定量PCR检测SjVamp2在不同发育时期虫体中的相对表达量。

反应体系为：

反应条件：95℃预变性30s，然后95℃5s，60℃34s，共40个循环。其中60℃34s时收集荧光信号。每个反应均做三个重复孔。采用双标准曲线法,利用ABI 7500SystemSoftware进行数据分析。

1.2实时定量PCR分析SjVamp2在不同宿主来源虫体中表达量情况

取大鼠来源的14、28、35、42天虫体，提取总的RNA，并反转录成cDNA，以其为模板做real-time PCR，分析SjVamp2在大鼠来源虫体中的表达量情况，并分别与同一时期在小鼠来源虫体中的表达量进行比较，其他步骤同上。

1.3实时定量PCR分析不同剂量吡喹酮对SjVamp2基因转录水平的影响

将感染了100条日本血吸虫尾蚴35天的BALB/c小鼠，随机分成对照组、高剂量治疗组和低剂量治疗组，并分别灌胃给药CMC-Na(羧甲基纤维素钠)溶液、吡喹酮200mg/kg和吡喹酮40mg/kg，分别于灌胃后30min,4h,12h,36h剖杀，收集经PBS洗涤后的虫体。用实时定量PCR分析不同剂量吡喹酮对SjVamp2基因转录水平的影响，其他步骤同上。

2.结果

2.1实时定量PCR分析SjVamp2在血吸虫不同发育阶段的相对表达量情况

以管家基因α-Tublin为内参，利用实时定量PCR检测SjVamp2在虫卵、尾蚴，7d、14d、21d、28d、35d、42d血吸虫虫体及42d雌、雄虫体中的表达情况。结果如图4所示，SjVamp2在日本血吸虫各个虫体阶段均有转录，其中在42d虫体中的转录水平最高，28d次之，尾蚴中表达量最低。并且SjVamp2基因在42d雌虫中的转录量显著高于42d雄虫。

2.2实时定量PCR分析SjVamp2在大鼠和小鼠来源虫体中表达量情况

以管家基因α-Tublin为内参，利用实时定量PCR检测SjVamp2在大鼠来源的14d、28d、35d、42d血吸虫虫体中的表达情况，并与其在同一时期小鼠来源的虫体中表达情况进行对比。结果如图5所示，SjVamp2在大鼠来源的42d血吸虫虫体中的表达量最高，而在14d、28d、35d虫体中的表达量相差不大(见图5A)；在28d和42d虫体中，SjVamp2在小鼠源虫体中的表达量极显著高于在大鼠源中的表达量(p<0.001)，而在35d虫体中的表达量，两个来源的相近(见图5B)。但是，在14d虫体中的表达量，大鼠源中的表达量高于小鼠源中的表达量(p<0.01)。

2.3实时定量PCR分析不同剂量吡喹酮对SjVamp2基因转录水平的影响

以管家基因α-Tublin为内参，利用实时定量PCR分别检测不同剂量吡喹酮对SjVamp2基因转录水平的影响，结果如图6所示，图6A中，低剂量给药组在给药30min和4h后，SjVamp2的转录水平低于对照组，而给药12h和36h后，SjVamp2的转录水平显著高于对照组。图6B中，高剂量给药组在给药30min后，SjVamp2的转录水平最高，明显高于对照组，给药4h后低于对照组，给药12h后又高于对照组，给药36h后SjVamp2的转录水平最低。

实施例4日本血吸虫SjVamp2蛋白组织定位的分析

1.间接免疫荧光技术分析SjVamp2蛋白的组织定位情况

取7d、14d、21d、28d、35d、42d及42d雌虫、雄虫做冰冻切片，固定并封闭切片后，以小鼠抗SjVamp2的三免血清为一抗，cy3标记的羊抗鼠IgG(H+L)为二抗，DAPI染色，于日本nikon公司的荧光显微镜观察定位情况，设置阴性对照。

2.间接免疫荧光技术分析SjVamp2蛋白的组织定位的结果

结果显示，SjVamp2蛋白在各个时期的虫体中均分布于表膜，少量存在于组织，其中在28d和42d的虫体中分布量比较大。如图7所示，在28天虫体中，与阴性对照组相比，SjVamp2蛋白明显分布于虫体表膜，且分布量很大。

实施例5日本血吸虫重组蛋白r SjVamp2的免疫预防实验

1.方法步骤

1.1动物免疫保护实验

将6周龄BALB/c小鼠，分为三组，即重组蛋白rSjVamp2免疫组，206佐剂对照组和PBS对照组，每组10只小鼠。重组蛋白免疫组小鼠每次免疫时，每只小鼠皮下注射100μL重组蛋白rSjVamp2(20μg)和206佐剂的乳化液。206佐剂对照组每只小鼠每次皮下注射100μL206佐剂和PBS的乳化液。PBS对照组每只小鼠每次皮下注射100μLPBS。总共免疫三次，每次间隔2周，在每次免疫后1周，对每只小鼠眼眶采血，收集血清，于-20℃保存备用。三次免疫后两周，每只小鼠腹部感染40±2条尾蚴，感染42天后，采用肝静脉灌注法收集虫体并且计数。收集肝脏，称取1g肝脏，用10ml PBS悬浮，充分匀浆后加入等体积的10％的NaOH溶液，在56℃消化15min。每次取50μL消化液，均匀地铺在计数板上，在显微镜下计数虫卵的个数，每个样品重复三次，取平均数并转换成平均每克肝组织中虫卵数(EPG)。计算减虫率和肝脏减卵率，计算公式如下：

减虫率＝[1-免疫组平均虫荷数/对照组平均虫荷数]×100％；

肝脏减卵率＝[1-免疫组EPG/对照组EPG]×100％。

1.2特异性抗体水平的检测

利用间接ELISA技术，以l0μg SjVamp2重组蛋白4℃包被过夜，次日以1.5％小牛血清白蛋白(PBST稀释)于37℃封闭1h，收集到的三次小鼠免疫血清作一抗，于37℃温育1h，以HRP-兔抗小鼠IgG(1:2500)做二抗，于37℃温育1h，各步骤间用PBST洗涤3次，每次5min，最后以可溶性TMB溶液进行显色，2mol/L硫酸终止反应，在450nm波长处读取OD₄₅₀值，分别检测由重组蛋白SjVamp2诱导产生的特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a的水平。

2.结果

2.1重组蛋白rSjVamp2诱导的免疫保护效果

动物保护实验表明免疫重组蛋白rSjVamp2在小鼠体内诱导部分免疫保护效果。与PBS空白对照组相比，免疫重组蛋白rSjVamp2在BALB/c小鼠中分别诱导了34.7％的减虫率(P<0.01)和35.1％的减卵率(P<0.05)，见下表1。

表1免疫重组蛋白rSjVamp2在小鼠体内诱导的免疫保护

2.2特异性抗体水平的检测

应用ELISA方法检测重组免疫组、206佐剂对照组和PBS对照组小鼠血清中抗rSjVamp2特异性IgG水平的变化，结果如图8所示。从图8A中可见，第二次免疫重组蛋白rSjVamp2后，免疫组的小鼠血清中特异IgG抗体滴度迅速升到较高水平，到第三次免疫特异IgG抗体滴度达到最高，并持续到感染尾蚴42天后剖杀时。而在206佐剂对照组和PBS空白对照组的小鼠血清中，特异性抗rSjVamp2的IgG抗体滴度在整个过程中一直维持在较低水平，变化不明显。这说明，免疫重组蛋白能够在小鼠体内诱导较高水平的特异性IgG抗体(P<0.01)。

用间接ELISA方法检测每组小鼠血清中抗rSjVamp特异性抗体IgG1、IgG2a变化，用重组蛋白rSjVamp2二免后，小鼠抗rSjVamp2重组蛋白特异性IgG1、IgG2a抗体水平显著升高，三免达到最高，并持续到42天剖杀。而206佐剂对照组和空白对照组三次免疫后及剖杀时特异性IgG1、IgG2a抗体水平都没有明显变化(见图8B、图8C)。进一步分析IgG1与IgG2a的比值，结果显示重组蛋白免疫后IgG1/IgG2a的比值在二免时达到最高、一免和三免相差不大(见图8D)。

实施例6日本血吸虫重组蛋白rSjVamp2作为诊断抗原的效果评估实验

1.应用ELISA技术检测rSjVamp2作为诊断抗原的敏感性及特异性

将rSjVamp2作为诊断抗原以5μg/ml的量包被过夜，明胶封闭，利用ELISA技术检测75份水牛阳性血清和60份水牛阴性血清，以判断rSjVamp2作为诊断抗原的敏感性和特异性，同时设置可溶性虫卵抗原(SEA)作对照。

2.应用ELISA技术检测rSjVamp2作为诊断抗原的敏感性及特异性的效果

以可溶性虫卵抗原(SEA)为对照，将rSjVamp2作为诊断抗原检测75份水牛阳性血清和60份水牛阴性血清。结果如图9所示，作为诊断抗原rSjVamp2的敏感性达到96％，略低于SEA的100％；rSjVamp2的特异性达到98％，明显高于SEA的89％，说明rSjVamp作为诊断抗原有一定的潜力。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种抗血吸虫疫苗，其特征在于，包含日本血吸虫重组蛋白，该日本血吸虫重组蛋白是由包含日本血吸虫Vamp2基因的重组载体经表达而制得，所述Vamp2基因序列是编码SEQID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列，该Vamp2基因插入在空载体pET28a(+)的EcoR I和Xho I两个酶切位点之间。

2.日本血吸虫重组蛋白在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用，所述日本血吸虫重组蛋白是由包含日本血吸虫Vamp2基因的重组载体经表达而制得，所述Vamp2基因序列是编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列，该Vamp2基因插入在空载体pET28a(+)的EcoR I和Xho I两个酶切位点之间。

3.包含日本血吸虫Vamp2基因的重组载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用，所述Vamp2基因序列是编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列，该Vamp2基因插入在空载体pET28a(+)的EcoR I和Xho I两个酶切位点之间。

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