CN113341160A

CN113341160A - 一种检测犬、羊等家畜细粒棘球绦虫感染的elisa试剂盒

Info

Publication number: CN113341160A
Application number: CN202110644979.6A
Authority: CN
Inventors: 陈兆国; 吕亚洁; 龚海燕; 米荣升; 黄燕
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center; Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2021-06-09
Filing date: 2021-06-09
Publication date: 2021-09-03

Abstract

本发明公开了一种检测犬、羊等家畜细粒棘球绦虫感染的ELISA试剂盒；所述试剂盒中的包被抗原为重组细粒棘球绦虫14‑3‑3ζ蛋白。本发明首次克隆、表达出细粒棘球绦虫重组蛋白rEg14‑3‑3ζ；免疫印迹显示，重组蛋白具有良好的反应原性；发现rEg14‑3‑3ζ免疫小鼠后，诱导产生良好的体液和细胞免疫反应，主要诱导产生Th1型免疫应答。进一步的，本发明基于rEg14‑3‑3ζ蛋白建立了检测细粒棘球绦虫抗体的间接ELISA方法，制备了ELISA试剂盒，具有较好的敏感性、特异性和重复性，为家畜细粒棘球绦虫感染及囊型包虫病流行病学调查和诊断提供了一种有效的方法。

Description

一种检测犬、羊等家畜细粒棘球绦虫感染的ELISA试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测犬、羊等家畜细粒棘球绦虫感染的ELISA试剂盒；尤其涉及一种检测犬细粒棘球绦虫感染、羊等家畜囊型包虫病的ELISA试剂盒。

背景技术

囊型包虫病(Cystic echinococcosis,CE)是一种复杂的疾病，由带科(Taeniidae)棘球属(Echinococcus)绦虫细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg)的中绦期幼虫寄生于人和动物体内引起的一种慢性人兽共患寄生虫病(胡欢欢和伍卫平，2010)。细粒棘球绦虫的终末宿主是犬、狼等犬科动物；中间宿主是骆驼、羊、牛、猪等偶蹄类动物，偶可感染啮齿类、灵长类和人。

终末宿主的诊断是囊型包虫病防控的重要步骤。犬细粒棘球绦虫感染的常规检测技术主要有尸检、氢溴酸槟榔碱法、显微镜检测、聚合酶链反应(PCR)等分子工具、酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹等免疫学技术。尸检具有高特异性和敏感性，但费力、高风险，并存在伦理问题(PAWLOWSKI et al.,2001)。槟榔碱清除犬小肠中成年绦虫，特异性高，但敏感性并不稳定，既费时，又不适用大规模流行病学调查(CRAIG et al.,2015)。显微镜观察终末宿主粪便中的虫卵极为不便，由于带绦虫科的形态相似，不能区分不同物种的卵，且灵敏度相对有限(ECKERT and DEPLAZES,2004)。与之相比，分子工具在囊型包虫病的诊断中提供了更高的特异性和敏感性，PCR和Real-time PCR技术标准化用于诊断，但需要复杂的设备和专业化人员(ABBASI et al.,2003)。ELISA是检测犬细粒棘球绦虫又一种特异且灵敏的实验室检测方法，不需要复杂的仪器设备，操作简便，而且敏感性高、特异性强，已作为包虫病临床辅助诊断的常规技术之一。尽管已经开发了一些免疫学方法，然而目前尚无可用于犬细粒棘球绦虫检测的商业化试剂盒，CE的免疫学诊断仍然是一项艰巨的任务。

在CE的传播环节中，羊是最适宜的中间宿主，因此，养殖绵羊的畜牧区是该病的主要流行区。家畜感染早期无症状，感染后期严重时，表现被毛逆立，时常脱毛，发育不良，呈现消瘦、咳嗽，长卧不起。病羊一旦病灶破裂，可引起宿主过敏反应，严重时导致过敏性死亡(司塔，2019)。准确地评估流行程度对防控CE至关重要。免疫学检测对实现早期诊断有着不可替代的作用，包虫囊液(hydatid cyst fluid，HCF)是细粒棘球蚴抗原的主要来源，由于特异性低、材料不宜获得，不适宜作为羊CE的诊断抗原。目前，在绵羊和牛等家养动物中，针对CE的免疫诊断技术发展的研究相对较少(JEYATHILAKAN et al.,2011)。近年来，羊CE的诊断主要是利用间接ELISA方法检测感染羊血清中的抗体，这项技术大大提高了诊断的特异性和灵敏度，可以在感染期间检测抗体。为更好地控制CE，筛选具有高敏感性和特异性抗原分子，建立快速、高效的间接ELISA方法是必要的。而筛选合适的诊断抗原分子，则是建立敏感性高、特异性强、重复性好的免疫学检测方法的基础和前提。

14-3-3蛋白又称为酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白(Tyrosine-3-monooxygenase/trytophane-5-monooxygenase)，广泛存在于哺乳动物真核细胞中，是一类高度保守且由不同基因编码的酸性蛋白质家族，已经通过X射线晶体学确定了该家族的7个同工型结构，即β、ε、η、γ、τ、σ和ζ(GARDINO et al.,2006)，所有亚型均具有不变的中心区域，表明它们是由一个共同的祖先进化而来。所有的14-3-3蛋白都是二聚体，每个亚基均由9个α-螺旋组成，形成一个与肽结合的裂口。所有14-3-3蛋白都包含3个不同的保守氨基酸，这与它们特异性功能相关(OBSIL and OBSILOVA,2011)。14-3-3蛋白是丰富的磷酸丝氨酸/苏氨酸结合蛋白，丝氨酸或苏氨酸位点磷酸化通常发生在短的共有结合基序内(MUSLIN etal.,1996)，并以磷酸化依赖和非磷酸化依赖的方式与数百种靶蛋白结合，在许多重要的生理过程中发挥作用，如细胞信号转导、细胞凋亡、肿瘤发生发展过程等(RLOU et al.,2013；POZUELO-RUBLO,2012)。在寄生虫中，目前也已有大量的14-3-3蛋白被发现与鉴定，它们在众多的生理过程中发挥着重要的作用(罗波等，2018)。

14-3-3ζ蛋白作为14-3-3蛋白家族中的重要一员，是一种细胞信号转导分子，以同源或异源二聚体形式存在。寄生虫的基因组包含至少三个编码14-3-3蛋白的基因(ABRAHAMSEN et al.,2004)，NUNES等(2004)证实，棘球绦虫的14-3-3同工型与SILES-LUCAS等(2000)已经指出的来自其他生物的zeta型分子有密切的关系，其序列可代表棘球绦虫中的ζ型14-3-3分子。从某种程度上说，细粒棘球绦虫具有某些癌细胞的属性(KLINKERT et al.,2006)，比如也存在无限生长和增殖潜力、具有调节免疫反应的能力，并可转移，推测棘球绦虫不受控制的增殖可能与14-3-3蛋白家族过表达有关(SILES-LUCASand GOTTSTEIN,2013)，这些蛋白控制着一系列对细胞动态平衡至关重要的过程。在癌症的发育过程中，一些14-3-3蛋白的表达，以及由其调控的途径的活性通常会发生改变(TZIVION et al.,2006)。14-3-3ζ充当细胞信号传导的中心枢纽，可促进多种癌症中细胞的增殖、粘附、存活，并抑制细胞凋亡。将棘球绦虫14-3-3ζ序列与其他生物14-3-3ζ进行比对发现，与哺乳动物肿瘤细胞生长有关的zeta型14-3-3在棘球绦虫中存在高表达现象(KESHAMOUNI et al.,2006)，提示干扰14-3-3ζ蛋白表达可能会抑制棘球蚴的生长，从而成为靶向癌症治疗的新型分子。在泰国肝吸虫(Opisthorchis viverrini)研究中，14-3-3ζ存在于肝吸虫的排泄-分泌(ES)产物中；免疫印迹显示，虫体各发育阶段的ES产物中都能检测出14-3-3ζ蛋白；免疫定位显示，除了肠上皮外，该蛋白在各个组织和器官中均有表达(KAFLE et al.,2017)，推测14-3-3ζ蛋白参与宿主-寄生虫的相互作用，与泰国肝吸虫的致病相关。在刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)中，WEIDNER等(2016)发现Tg14-3-3可以诱导树突状细胞和小胶质细胞的高迁移表型；弓形虫基因组共编码四个14-3-3蛋白，其中至少一个可能与膜相关，推测其可作为疫苗研发的候选分子(ASSOSSOU et al.,2003)。

本发明在实验室前期通过免疫蛋白质组学和质谱技术筛选出多个CE诊断候选抗原分子的基础上，选择Eg14-3-3ζ进行克隆表达，进一步建立犬细粒棘球绦虫、羊细粒棘球蚴感染的间接ELISA检测方法，评估其敏感性和特异性，并用于田间样品的初步检测，为防控CE提供技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测犬细粒棘球绦虫感染、羊等家畜囊型包虫病的ELISA试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种重组细粒棘球绦虫14-3-3ζ蛋白在制备检测囊型包虫病及细粒棘球绦虫感染的特异性抗体和/或试剂盒中的应用。

作为本发明的一个实施方案，所述重组细粒棘球绦虫14-3-3ζ蛋白为如SEQ IDNO.1所示的蛋白，或为与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的同源性≧90％的具有免疫原性的蛋白。优选同源性≧95％。

作为本发明的一个实施方案，所述重组细粒棘球绦虫14-3-3ζ蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。

作为本发明的一个实施方案，所述重组细粒棘球绦虫14-3-3ζ蛋白是以原头蚴cDNA为模板扩增获得eg14-3-3ζ基因片段，eg14-3-3ζ基因片段与载体连接转化获得重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌经诱导表达获得的重组蛋白；所述eg14-3-3ζ基因片段如SEQ IDNO.2所示。

作为本发明的一个实施方案，所述载体为pET-28a。所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

作为本发明的一个实施方案，所述扩增采用的引物对序列如SEQ ID NO.3、4所示。

作为本发明的一个实施方案，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒或免疫印迹检测试剂盒。

作为本发明的一个实施方案，检测的样品为(犬、羊等)家畜的血清；经进一步发展，可用于检测犬粪便。

第二方面，本发明还涉及一种检测家畜囊型包虫病及细粒棘球绦虫感染的ELISA试剂盒，所述试剂盒中的包被抗原为重组细粒棘球绦虫14-3-3ζ蛋白。

作为本发明的一个实施方案，所述试剂盒还包括ELISA检测试剂盒常规组成，所述常规组成包括抗原包被液、酶标板、封闭液、酶标二抗和底物。

所述抗原包被液为0.015mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液。

所述封闭液为5％脱脂奶粉封闭液。

所述酶标二抗为HRP标记的兔抗羊IgG抗体(检测羊囊型包虫病)或HRP标记的兔抗犬IgG抗体(检测犬细粒棘球绦虫感染)。

所述底物为200mL中含10mg TMB和2mL DMSO的磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)，临用前加30％过氧化氢(1.5μL/mL)。

作为本发明的一个实施方案，所述常规组成还包括显色反应终止液、洗涤液和稀释液。

所述显色反应终止液为2mol/L H₂SO₄。

所述洗涤液为含0.05Tween-20的0.01mol/L PBS(pH 7.2)。

所述稀释液为0.015mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液。

作为本发明的一个实施方案，所述试剂盒为检测犬细粒棘球绦虫感染的间接ELISA检测试剂盒或羊细粒棘球蚴感染的间接ELISA检测试剂盒。

在具体的犬血清样品的ELISA检测中，最佳包被浓度为2.0μg/mL，最佳血清稀释度为1:50，最佳的血清作用时间为37℃1h，最佳的酶标二抗工作浓度为1:4000，最佳的酶标二抗作用时间均为37℃1h。在以上条件下，OD_450nm≥0.226，判定为阳性，OD_450nm﹤0.226判定为阴性。

在具体的羊血清样品的ELISA检测中，最佳包被浓度为2.0μg/mL，最佳血清稀释度为1:50，最佳的血清作用时间均为37℃2h，最佳的酶标二抗工作浓度为1:3000，最佳的酶标二抗作用时间为37℃1h。在以上条件下，OD_450nm值不小于0.573，判定为阳性，OD_450nm值小于0.573判定为阴性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明首次克隆、表达出细粒棘球蚴重组蛋白rEg14-3-3ζ；免疫印迹显示，重组蛋白具有良好的反应原性；发现rEg14-3-3ζ免疫小鼠后，诱导产生良好的体液和细胞免疫反应，主要诱导产生Th1型免疫应答。

2)本发明基于rEg14-3-3ζ蛋白建立了犬细粒棘球绦虫感染的间接ELISA检测方法；rEg14-3-3ζ-iELISA的特异性均高于商品化ELISA试剂盒。

3)基于rEg14-3-3ζ蛋白建立了羊细粒棘球蚴感染的间接ELISA检测方法；rEg14-3-3ζ-iELISA方法敏感性高于商品化试剂盒，特异性较好。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为eg14-3-3zeta基因的PCR扩增示意图；其中，M：DL1000 DNA分子质量标准；1、2：eg14-3-3zeta基因扩增产物；

图2为重组质粒的双酶切鉴定结果示意图；其中，M：DL5000 DNA分子质量标准；1：未酶切的重组质粒pET-28a-eg14-3-3zeta；2：重组质粒pET-28a-eg14-3-3zeta的双酶切产物；3：eg14-3-3zeta基因PCR产物；

图3为pET-28a-eg14-3-3zeta转化菌的诱导表达示意图；其中，M：低分子量蛋白质量标准；1：诱导前的pET-28a转化菌；2：诱导后的pET-28a转化菌；3：诱导前的pET-28a-eg14-3-3zeta转化菌；4：诱导后的pET-28a-eg14-3-3zeta转化菌；5：诱导后的pET-28a-eg14-3-3zeta转化菌裂解上清；6：诱导后的pET-28a-eg14-3-3zeta转化菌裂解沉淀；

图4为Eg14-3-3ζ纯化蛋白的SDS-PAGE分析示意图；其中，M：低分子量蛋白质量标准；1：诱导后的pET-28a转化菌；2：诱导后的pET-28a-eg14-3-3zeta转化菌裂解上清；3～4：经His柱纯化产物；

图5为rEg14-3-3ζ重组蛋白的Western blot分析示意图；其中，M：低分子量蛋白质量标准；1：鼠抗rEg14-3-3ζIgG血清；2：健康鼠血清；3：细粒棘球蚴感染羊血清；4：健康羊血清；5：细粒棘球绦虫感染犬血清；6：健康犬血清；

图6为免疫小鼠血清效价示意图；

图7为免疫小鼠血清抗体IgG变化示意图；

图8为免疫小鼠血清中IL-2、IL-12、IFN-γ变化水平检测示意图；

图9为免疫小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10变化水平检测示意图；

图10为两种间接ELISA方法的交叉反应性示意图；

图11为间接ELISA敏感性与特异性分析示意图；其中，A：rEg14-3-3ζ-iELISA敏感性与特异性分析，临界值是0.226；B：检测试剂盒敏感性与特异性分析，临界值是0.202。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1：Eg14-3-3ζ编码基因的扩增和重组质粒的构建

根据GenBank中细粒棘球绦虫14-3-3ζ基因序列(蛋白登录号：EUB61917.1 SEQ IDNO.1；基因登录号：XM_024492439.1SEQ ID NO.2；)，设计引物并引入酶切位点，Eg14-3-3ζF2为：5’-GCGTCGACAGATGGCTGAGCTTCTGTCC-3’(下划线为Sal I酶切位点)SEQ ID NO.3，R2为：5’-ATTGCGGCCGCTTATTCAGCACCCTCGGT-3’(下划线为NotⅠ酶切位点)SEQ ID NO.4。

利用细粒棘球绦虫原头蚴，提取其总RNA，反转录成cDNA，以此为模板，利用合成的上、下游引物，扩增获得eg14-3-3ζ基因(图1)，大小约为771bp，与预期大小相符。采用DNA回收试剂盒回收目的片段，将凝胶回收的eg14-3-3ζ基因片段和pET-28a(+)载体在37℃恒温水浴锅中分别用SalⅠ和NotⅠ酶切2h。使用分光光度仪分别测定其浓度，按目的片段浓度：pET-28a(+)载体浓度为3～4:1的比例，使用T4连接酶于16℃微量恒温器中连接过夜。将连接产物10μL转化至E.coli DH5α感受态细胞，冰上静置30min；42℃水浴锅中热激90s，再冷激3min；混合液中加入800μL无抗LB，200r/min震荡45min。离心弃上清，加100μL无抗LB重悬。取菌液涂板(含卡那霉素)，置于37℃恒温培养箱过夜。每个平板挑取单菌落，分别转移至含卡那霉素抗性LB液体培养基中，200r/min震荡6h，取3μL进行菌液PCR鉴定，与目的条带大小一致的样品，送样测序。比对序列，完全正确的菌液，以1:100的比例接种扩大培养备用，剩余样品菌液于-80℃保存。采用无内毒素质粒大提试剂盒，按说明书方法提取重组质粒，经SalⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确(图2)，命名为重组质粒pET-28a-eg14-3-3ζ，序列测定显示插入片段与已登录的eg14-3-3ζ基因核苷酸序列(登录号：XM_024492439.1)完全相同。

实施例2：重组蛋白的表达与纯化

将构建成功重组质粒pET-28a-eg14-3-3zeta转化到E.coli BL21(DE3)表达重组蛋白。在IPTG诱导下，重组质粒转化菌成功表达了重组Eg14-3-3ζ(recombinant Eg14-3-3ζ,rEg14-3-3ζ)，重组蛋白可溶(图3)。经Ni-NTA-His柱亲和纯化后，获得了高纯度蛋白，相对分子量约为35kDa(图4)，符合预期大小。经BCA法测定，rEg14-3-3ζ的浓度分别为0.917mg/mL。

实施例3：重组蛋白的抗原性分析

通过Western blot分析了rEg14-3-3ζ的抗原性。免疫印迹结果表明，rEg14-3-3ζ识别细粒棘球蚴感染羊血清、细粒棘球绦虫感染犬血清和鼠抗rEg14-3-3ζIgG血清，在约35kDa处出现明显的单一条带(图5)，而不与健康羊血清、健康犬、健康鼠血清反应。

实施例4：抗Eg14-3-3ζ抗体的制备及免疫效果初步观察

4.1鼠抗rEg14-3-3ζ血清制备及效价测定

将实验动物小鼠随机分成3组，10只/组，分为rEg14-3-3ζ免疫组、PBS免疫组和空白对照组。采用皮下多点注射，初次免疫使用弗氏完全佐剂完全乳化，之后加强免疫使用弗氏不完全佐剂乳化，每两周免疫一次，共免疫3次。于第3次免疫后1w，采用乙醚将小鼠麻醉，采集血液，4℃冰箱静置2h以上。分离血清，采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清效价。结果显示，抗rEg14-3-3ζ血清在稀释度1:204800的情况下，实验孔OD_450nm与阴性血清OD_450nm的比值(P/N值)仍大于2.1(图6)。

4.2血清抗体IgG水平的检测

采取不同时间段免疫血清，结果显示，从第2w(一免后2w)到第6w(三免后2w)，rEg14-3-3ζ免疫组与对照组相比，血清抗体IgG水平均呈现极限著升高(****p<0.0001)；免疫组与对照组和免疫前相比，增高水平有统计学意义(****p<0.0001)(图7)。

4.3细胞因子检测

使用细胞因子检测试剂盒，检测免疫组、空白、PBS对照组血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12(p70)和IFN-γ的含量变化。结果发现，rEg14-3-3ζ免疫组IL-2的水平与对照组相比呈极限著升高(***p<0.001)。rEg14-3-3ζ免疫组IL-12(p70)水平升高与对照组相比呈极显著差异(****p<0.0001)。rEg14-3-3ζ免疫组与对照组相比，IFN-γ水平的升高均有显著差异(*p<0.05)，差异有统计学意义(图8)。在IL-6变化水平检测中，免疫组与对照组相比无显著升高(p>0.05)。对于IL-4、IL-10，rEg14-3-3ζ免疫组与对照组相比，明显增高，呈极显著差异(****p<0.0001)(图9)。

实施例5：犬细粒棘球绦虫间接ELISA检测方法的建立及试剂盒组装

5.1确定最佳抗原包被浓度和血清稀释度

采用方阵法确定最佳抗原包被浓度和血清稀释度。结果显示，rEg14-3-3ζ-iELISA最佳包被浓度为2.0μg/mL，最佳血清稀释度为1:50(表1)。

表1rEg14-3-3ζ-iELISA最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定

5.2确定血清最佳作用时间

结果显示，rEg14-3-3ζ-iELISA最佳的血清作用时间为37℃1h(表2)。

表2rEg14-3-3ζ-iELISA最佳血清作用时间

5.3确定酶标二抗最佳的工作浓度

结果显示，rEg14-3-3ζ-iELISA最佳的酶标二抗工作浓度为1:4000(表3)。

表3rEg14-3-3ζ-iELISA最佳酶标二抗工作浓度

5.4确定酶标二抗最佳的工作时间

结果显示，rEg14-3-3ζ-iELISA最佳的酶标二抗作用时间均为37℃1h(表4)。

表4rEg14-3-3ζ-iELISA最佳酶标二抗作用时间

5.5临界值的确定

通过检测的28份犬阴性血清样品来确定临界值，结果显示，rEg14-3-3ζ-iELISA平均值为0.161，标准差为0.022，cut-off

为0.226，即OD_450nm≥0.226，可判定为阳性，OD_450nm﹤0.226判定为阴性；犬包虫病试剂盒(Canine Hydatidosis IgG ELISA Kit)购自上海瑞番生物科技有限公司，临界值的计算参照说明书，为0.202。

5.6重复性试验

重复性试验结果显示，rEg14-3-3ζ-iELISA批内变异系数最高值为5.19％，不同批次的批间变异系数最高值为9.46％，均小于10％(表5)。说明建立的rEg14-3-3ζ-iELISA方法重复性较高。

表5rEg14-3-3ζ-iELISA重复性试验

5.7交叉反应试验结果

分别与感染多房棘球绦虫、感染裂头蚴、感染弓形虫、感染隐孢子虫、感染巴贝斯虫、感染旋毛虫及感染血吸虫的阳性鼠血清进行交叉反应试验，结果显示，rEg14-3-3ζ-iELISA检测所有血清样品OD_450nm值均低于临界值(图10)。表明rEg14-3-3ζ-iELISA对其他寄生虫血清样品不发生交叉反应。

5.8敏感性和特异性试验

从24份已知犬阳性血清中，共检出20份阳性；46份犬阴性血清中检出46份阴性，即敏感性为83.33％(20/24)，特异性为100％(46/46)。犬包虫病IgG ELISA试剂盒(CanineHydatidosis IgG ELISA Kit，购自上海瑞番生物科技有限公司)从24份已知犬阳性血清中，共检出24份阳性；46份犬阴性血清中检出41份阴性，所以其敏感性为100％(24/24)，特异性为89.13％(41/46)(图11)。表明rEg14-3-3ζ-iELISA的特异性高于犬包虫病IgG ELISA试剂盒。这提示该间接ELISA方法是针对犬细粒棘球绦虫有效且可靠的检测工具。

5.9试剂盒组装

将抗原包被液(0.015mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液)、5％脱脂奶粉封闭液、稀释液(0.015mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液)、1:4000稀释的HRP标记的兔抗犬IgG抗体、阳性血清、阴性血清、TMB-H₂O₂底物显色液[含TMB和DMSO的磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)，以及30％过氧化氢(1.5μL/mL)]、2mol/L硫酸终止液、洗涤液(含0.05Tween-20的0.01mol/L pH 7.2PBS)，以及使用说明书，组装成试剂盒。

实施例6：羊细粒棘球蚴间接ELISA检测方法的建立及试剂盒的组装

6.1确定最佳抗原包被浓度和血清稀释度

采用方阵法确定最佳抗原包被浓度和血清稀释度。结果显示，rEg14-3-3ζ-iELISA最佳包被浓度为2.0μg/mL，最佳血清稀释度为1:50(表6)。

表6rEg14-3-3ζ-iELISA最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定

6.2确定血清最佳作用时间

实验结果显示，rEg14-3-3ζ-iELISA最佳的血清作用时间均为37℃2h(表7)。

表7rEg14-3-3ζ-iELISA最佳血清作用时间

6.3确定酶标二抗最佳的工作浓度

实验结果显示，rEg14-3-3ζ-iELISA最佳的酶标二抗工作浓度为1:3000(表8)。

表8rEg14-3-3ζ-iELISA最佳酶标二抗工作浓度

6.4确定酶标二抗最佳的工作时间

rEg14-3-3ζ-iELISA最佳的酶标二抗作用时间为37℃1h(表9)。

表9rEg14-3-3ζ-iELISA最佳酶标二抗作用时间

6.5临界值的确定

采用40份羊阴性血清样本计算临界值，结果显示，rEg14-3-3ζ-iELISA平均值为0.408，标准差为0.0553，cut-off

为0.573，即OD_450nm值不小于0.573，理论上可判定为阳性，OD_450nm值小于0.573判定为阴性；商品化检测试剂盒羊包虫病抗体快速检测试剂盒购自深圳绿诗源生物技术有限公司，临界值的计算参照说明书。

6.6重复性试验

重复性试验结果显示，rEg14-3-3ζ-iELISA批内变异系数为0.65％～2.72％，批间变异系数为1.49％～9.77％，均小于10％，说明该rEg14-3-3ζ-iELISA方法重复性较高(表10)。

表10rEg14-3-3ζ重复性试验

6.7交叉反应试验结果

以rEg14-3-3ζ蛋白为抗原包被，分别与感染多房棘球绦虫、捻转血矛线虫和血吸虫的羊血清进行交叉反应试验。结果显示，rEg14-3-3ζ-iELISA检测OD₄₅₀值除感染多房棘球绦虫羊血清样品外，所有血清样品均在临界值以下(表11)。这表明，rEg14-3-3ζ-iELISA可以同时检测感染细粒棘球蚴和多房棘球绦虫羊血清，而对其他寄生虫血清样品不发生交叉反应。

表11交叉反应性试验

6.8检测方法的敏感性、特异性

用rEg14-3-3ζ-iELISA对31份羊阳性血清做检测，共检出28份阳性，其敏感性为90.32％(28/31)；对70份羊阴性血清做检测，共检出64份阴性，所以其特异性为91.43％(64/70)。采用羊包虫病抗体快速检测试剂盒(购自深圳绿诗源生物技术有限公司)对31份羊阳性血清做检测，共检出25份阳性，其敏感性为80.65％(25/31)；对70份羊阴性血清做检测，共检出66份阴性，所以其特异性为94.29％(66/70)(表12)。

表12检测方法敏感性及特异性分析

6.9田间样品检测结果

采用已建立的rEg14-3-3ζ-iELISA以及羊包虫病抗体快速检测试剂盒(购自深圳绿诗源生物技术有限公司)分别对540份羊血清样本进行检测，其中rEg14-3-3ζ-iELISA检测呈阳性的有150份，阳性率为27.78％(150/540)；试剂盒检测呈阳性的有146份，阳性率为27.04％(146/540)。

6.10试剂盒组装

将抗原包被液(0.015mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液)、5％脱脂奶粉封闭液、稀释液(0.015mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液)、1:3000稀释的HRP标记的兔抗羊IgG抗体、阳性血清、阴性血清、TMB-H₂O₂底物显色液[含TMB和DMSO的磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)，以及30％过氧化氢(1.5μL/mL)]、2mol/L硫酸终止液、洗涤液(含0.05Tween-20的0.01mol/L pH 7.2PBS)，以及使用说明书，组装成试剂盒。

综上，本发明首次克隆、表达出细粒棘球蚴重组蛋白rEg14-3-3ζ；免疫印迹显示，重组蛋白具有良好的反应原性；发现rEg14-3-3ζ免疫小鼠后，诱导产生良好的体液和细胞免疫反应，主要诱导产生Th1型免疫应答。基于rEg14-3-3ζ蛋白建立了犬细粒棘球绦虫间接ELISA检测方法；rEg14-3-3ζ-iELISA的特异性均高于商品化ELISA试剂盒。基于rEg14-3-3ζ蛋白建立了羊细粒棘球蚴间接ELISA检测方法；rEg14-3-3ζ-iELISA方法敏感性高于商品化试剂盒，特异性较好。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120> 一种检测犬、羊等家畜细粒棘球绦虫感染的ELISA试剂盒

<130> DD14382

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 256

<212> PRT

<213> 细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)

<400> 1

Met Ala Glu Leu Leu Ser Thr Glu Trp Leu Lys Asp Leu Pro Leu Lys

1 5 10 15

Asp Arg Asp Ser Tyr Val Asn Thr Ala Lys Cys Leu Glu Gln Ala Glu

20 25 30

Arg Phe Asp Asp Met Ala Val Cys Met Lys Glu Val Thr Arg Phe Asp

35 40 45

Lys Glu Leu Asn Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Phe Lys

50 55 60

Asn Val Val Gly Ser Arg Arg Asn Ser Tyr Arg Val Leu Ser Ser Arg

65 70 75 80

Leu Ala Arg Thr Gln Asp Pro Glu Lys Gln Ala Leu Thr Arg Glu Tyr

85 90 95

Leu Asp Ile Leu Gln Lys Glu Leu Asn Ala Ile Cys Ser Asp Val Leu

100 105 110

Gln Leu Ile Glu Glu Arg Leu Tyr Pro Ser Cys Ser Asn Ala Glu Gly

115 120 125

Lys Val Phe Tyr Lys Lys Met Met Gly Asp Tyr Tyr Arg Tyr Lys Ala

130 135 140

Glu Asn Ala Lys Gly Glu Asp His Lys Gln Val Val Glu Ala Ser Leu

145 150 155 160

Lys Ala Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Ile Ala Asn Glu Lys Leu Ser Cys

165 170 175

Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Tyr Ser Val Phe Tyr

180 185 190

Tyr Glu Ile Met Asn Ser Pro Asp Arg Ala Cys Gln Leu Ala Lys Lys

195 200 205

Ala Phe Asp Asp Ala Val Ser Asp Val Asp Ser Ala Asn Asp Asp Ser

210 215 220

Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn Leu Ala

225 230 235 240

Leu Trp Thr Ser Asp Pro Glu Glu Thr Glu Asn Thr Glu Gly Ala Glu

245 250 255

<210> 2

<211> 771

<212> DNA

<213> 细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)

<400> 2

atggctgagc ttctgtccac tgagtggctt aaggatttgc ccctgaagga tcgtgattcg 60

tatgttaata cggcaaaatg tcttgagcag gctgaacggt tcgatgacat ggctgtttgt 120

atgaaggaag tgacgaggtt tgacaaggaa ttaaacaatg aggaacgaaa tctcctttcc 180

gttgcattta aaaatgttgt tgggtctcga cgcaactctt atcgagtgct gtcaagtcgg 240

ctggctcgaa ctcaggatcc tgaaaaacag gctcttacga gggagtattt agatattctt 300

cagaaagaac ttaatgccat ctgctcggat gtcttgcaac tcattgagga gaggctatat 360

ccttcatgtt ccaatgccga ggggaaggtc ttctacaaga agatgatggg ggactactat 420

cgatataaag cagaaaacgc caaaggcgag gaccacaagc aggtcgtgga ggcctctctt 480

aaggcttatg aagaggccac tgagattgca aacgagaagc ttagttgcac gcatccaatt 540

cgtcttggtc ttgctttgaa ctattccgtc ttttattatg aaatcatgaa tagtcctgac 600

agagcgtgcc aacttgctaa gaaggctttt gatgatgctg tcagcgatgt tgacagtgcc 660

aacgacgatt cgtacaagga cagtactctt atcatgcagc tccttcgcga taaccttgca 720

ctttggacct ccgatcccga ggagactgag aataccgagg gtgctgaata a 771

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgtcgacag atggctgagc ttctgtcc 28

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attgcggccg cttattcagc accctcggt 29

Claims

1.一种重组细粒棘球绦虫14-3-3ζ蛋白在制备检测囊型包虫病及细粒棘球绦虫感染的特异性抗体和/或试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组细粒棘球绦虫14-3-3ζ蛋白为如SEQ ID NO.1所示的蛋白，或为与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的同源性≧90％的具有免疫原性的蛋白。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组细粒棘球绦虫14-3-3ζ蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组细粒棘球绦虫14-3-3ζ蛋白是以细粒棘球绦虫原头蚴cDNA为模板扩增获得eg14-3-3ζ基因片段，eg14-3-3ζ基因片段与载体连接转化获得重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌经诱导表达获得的重组蛋白；所述eg14-3-3ζ基因片段如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述扩增采用的引物对序列如SEQ IDNO.3、4所示。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为间接ELISA检测试剂盒或免疫印迹检测试剂盒。

7.一种检测囊型包虫病及细粒棘球绦虫感染的间接ELISA试剂盒，所述试剂盒中的包被抗原为重组细粒棘球绦虫14-3-3ζ蛋白。

8.根据权利要求7所述的检测囊型包虫病及细粒棘球绦虫感染的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ELISA检测试剂盒常规组成，所述常规组成包括抗原包被液、酶标板、封闭液、酶标二抗和底物。

9.根据权利要求8所述的检测囊型包虫病及细粒棘球绦虫感染的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为HRP标记的兔抗羊IgG抗体或HRP标记的兔抗犬IgG抗体。

10.根据权利要求7所述的检测囊型包虫病及细粒棘球绦虫感染的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述常规组成还包括显色反应终止液、洗涤液和稀释液。