CN116223799A - 羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及应用。本发明所述试剂盒的包被抗原包括抗原5蛋白和生发层抗原蛋白；所述抗原5蛋白存在棘球囊液中；而所述生发层抗原有很强的特异性，只存在棘球囊壁中，在棘球囊液中不存在，正好和抗原5形成检测互补关系。经实验验证，本发明提供的试剂盒可以准确的检测羊包虫病感染初期产生的抗原5蛋白抗体和/或生发层抗原蛋白抗体，判断被检动物是否感染包虫病，其敏感性、特异性、稳定性、重复性好，尤其适用于低浓度样本的检测以及疫病的早期诊断，对羊包虫病的防控和畜牧业的发展有着重大意义。

Description

羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及应用。

背景技术

包虫病(hydatidosis,hydatid disease)，又称棘球蚴病，是细粒棘球绦虫的幼虫感染人体所致的疾病，该病为人畜共患病。狗为终宿主，羊、牛是中间宿主，人因误食虫卵成为中间宿主而患包虫病。细粒棘球蚴囊或称包虫囊是寄生在中间宿主家畜和人体内的发育阶段，囊壁由两层构成，内层直接包裹着囊液，称为生发层。生发层之外的角质层系由生发层分泌形成，为无细胞的较坚韧的板层状结构，囊液透明，内有原头节，育囊和子囊，子囊壁的结构与母襄同。本病广布于世界各地，主要流行于畜牧区。

目前包虫病的检测方法有虫卵浓集检查法、槟榔碱法、PCR、酶联免疫吸附分析法等。虫卵浓集检查法通过显微镜观察包虫病虫卵形态来诊断是否感染包虫病，但这种方法费时费力具有高风险，且虫卵形态有差异，不容易区分其物种。槟榔碱法是通过驱除肠壁上的虫体，根据形态学进行鉴定，虽然特异性高，但敏感性不稳定，且操作人员有被感染的风险。PCR技术通过分子工具能准确检测出不同种的包虫病，但需要复杂的仪器设备和专业人员。

酶联免疫吸附分析法具有操作简便、检测速度快的优点，因此得到广泛应用。市场上已经有检测包虫病抗体类型的商品化ELISA试剂盒，但其包被的抗原过于单一或包被同一组织中多抗原的试剂盒并不能全面检测包虫病不同组织中抗原免疫产生的多种抗体。动物感染包虫病后不同组织中抗原免疫后的抗体产生时间和应答水平均存在差异，这样在检测时很容易漏检或者发生交叉反应，其结果会出现假阴性，准确性不高，难以满足临床检测需求。另外，对于那些已经感染的动物，由于感染个体具有中和抗体使得病毒的复制很慢，导致体内特异性蛋白浓度很低，而商品化的ELISA试剂盒敏感性低，使这些低浓度的特异性蛋白很难被检测到，进而会导致部分感染动物的漏检。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明提供了一种抗原5蛋白和生发层抗原蛋白在检测包虫病的应用，所述抗原5蛋白由包括以下任一种核苷酸序列的基因表达得到：

SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或，

SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或，

在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列；

所述生发层抗原蛋白由包括以下任一种核苷酸序列的基因表达得到：

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或，

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或，

在严格条件下可以与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

抗原5存在棘球囊液中，被认为是诊断包虫病的“金标准”；同时包被的生发层抗原有很强的特异性，只存在棘球囊壁中，在棘球囊液中不存在，正好和抗原5形成检测互补关系。只要包虫病感染初期，就能准确检测出包虫病的抗体(抗原5对应的抗体和/或生发层抗原对应的抗体)。

在本发明中，所述抗原5蛋白的表达方法优选包括：将包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的基因插入原核载体，得到重组载体；将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌；

在本发明更具体的实施方式中，得到重组菌后，置37℃，200r/min摇床振荡培养至OD_600nm达到0.6，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，18℃150r/min过夜诱导18h，得到可溶性形式稳定高表达的抗原5蛋白。SEQ ID No.1所示核苷酸序列是优化的大肠杆菌偏爱密码子序列，能在大肠杆菌B L21(DE3)中以可溶性形式表达抗原5蛋白，不仅能提高抗原5蛋白的表达量，还能使获得的抗原5蛋白具有高浓度、高纯度、高活性和高稳定性，用此蛋白包被板子检测结果显示灵敏度、特异性均良好。

在本发明中，所述生发层抗原蛋白的表达方法优选包括：将包括SEQ ID No.2所示核苷酸序列的基因插入原核载体，得到重组载体；将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌；

在本发明更具体的实施方式中，得到重组菌后，置37℃，200r/min摇床振荡培养至OD_600nm达到0.6，加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L，18℃180r/min过夜诱导表达16h，得到可溶性形式稳定高表达的生发层抗原蛋白。SEQ ID No.2所示核苷酸序列是优化的大肠杆菌偏爱密码子序列，能在大肠杆菌B L21(DE3)中以可溶性形式表达生发层抗原蛋白，不仅能提高生发层抗原蛋白的表达量，还能使获得的生发层抗原蛋白具有高浓度、高纯度、高活性和高稳定性，用此蛋白包被板子检测结果显示灵敏度、特异性均良好。

鉴于抗原5和生发层抗原联用的检测互补特性，本发明提供了所述抗原5蛋白和生发层抗原蛋白在制备检测包虫病抗体的产品中的应用。

进一步的，本发明还提供了一种羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，包括包被抗原，所述包被抗原包括所述抗原5蛋白和生发层抗原蛋白。

优选的，所述试剂盒还包括化学发光抗原包被板、酶标二抗、样品稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物和洗涤液中的一种或者多种。本发明利用所述包被抗原，基于化学发光免疫分析方法制备的微孔板式试剂盒能更准确、更敏感性、更高效的进行检测，对预防和控制包虫病的发生和流行具有重要意义。

优选的，本发明所述酶标二抗优选为辣根过氧化物酶标记的二抗。在本发明优选的具体实施方式中，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG抗体。

优选的，本发明所述样品稀释液以磷酸盐缓冲液为基础，添加酪蛋白和Tween-20；以磷酸盐缓冲液的体积为100vol％计，所述酪蛋白的添加量优选为0.4-0.6vol％，更优选为0.5vol％；所述Tween-20的添加量优选为0.4-0.6vol％，更优选为0.5vol％。

优选的，本发明所述发光底物包括发光底物A和发光底物B；所述发光底物A以pH值为7.5-8.5、浓度为0.04-0.06mol/L的Tris缓冲液为基础溶剂，添加0.08-0.12mmol/L的鲁米诺和0.8-1.2g/L的羟基香豆素；所述发光底物B以pH值为5.0-5.5、浓度为0.04-0.06mol/L的醋酸铵溶液为基础溶剂，添加0.06-0.08mmol/L的维生素C和2.7-3.3mmol/L的氨基酸氧化酶。更优选的，所述发光底物A以pH值为8.0、浓度为0.05mol/L的Tris缓冲液为基础溶剂，添加0.1mmol/L的鲁米诺和1g/L的羟基香豆素；所述发光底物B以pH值为5.2、浓度为0.05mol/L的醋酸铵溶液为基础溶剂，添加0.07mmol/L的维生素C和3mmol/L的氨基酸氧化酶。

优选的，所述洗涤液以10倍浓缩计，包括0.018-0.022mol/L的磷酸二氢钠、0.07-0.09mol/L的磷酸氢二钠、1.29-1.45mol/L的氯化钠和0.4-0.6vol％的Tween-20；更优选的，所述洗涤液以10倍浓缩计，包括0.02mol/L的磷酸二氢钠、0.08mol/L的磷酸氢二钠、1.37mol/L的氯化钠和0.5vol％的Tween-20。

所述洗涤液以10倍浓缩计，pH值优选为7.3-7.5；更优选为7.4。

在本发明中，所述稀释液在使用时，优选使用无菌水将浓缩液稀释为正常浓度后进行使用。

优选的，所述化学发光抗原包被板的包被液以pH值为9.2-9.8的碳酸盐缓冲液为基础溶剂，添加0.9-1.1μg/ml的抗原5蛋白和0.9-1.1μg/ml的生发层抗原蛋白。更优选的，所述化学发光抗原包被板的包被液以pH值为9.6的碳酸盐缓冲液为基础溶剂，添加1μg/ml的抗原5蛋白和1μg/ml的生发层抗原蛋白。1μg/ml的抗原包被浓度在后续光学检测中的光指数和信噪比表现上具有最佳效果。

本发明还提供了所述试剂盒在非疾病诊断目的的细粒棘球绦虫检测中的应用，所述应用包括如下任意一种：

(1)检测饮食产品中是否含有细粒棘球绦虫；

(2)检测畜牧养殖环境中是否含有细粒棘球绦虫；

(3)检测水源中是否含有细粒棘球绦虫。

优选的，所述应用包括如下步骤：

S1、样品经样品稀释液稀释后，加入化学发光抗原包被板中，反应10-20min；

S2、洗涤液洗涤步骤S1所述反应后的化学发光抗原包被板，加入酶标二抗，孵育10-20min；

S3、洗涤液洗涤步骤S2所述孵育后的化学发光抗原包被板，加入发光底物，15-25℃反应4-8min；用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值；

S4、根据步骤S3得到的发光值，判断检测样品中是否含有包虫病抗体；

步骤S1所述稀释的倍数优选为100倍稀释。100倍稀释的样品在后续光学检测中的光指数和信噪比表现上具有最佳效果。

步骤S1所述反应的温度优选为36-38℃，更优选为37℃；反应时间优选为15-20min，更优选为15min。

步骤S2所述孵育的温度优选为36-38℃，更优选为37℃；孵育时间优选为15-20min，更优选为15min。

步骤S3所述反应的时间优选为5-6min，更优选为5min。

步骤S4所述判断的方法包括：

根据公式计算S/P值，S/P值＝(检测样品发光值-阴性对照血清样品发光值)/(阳性对照血清样品发光值-阴性对照血清样品发光值)；

若S/P值＜0.35，判定样品为包虫病抗体阴性；若S/P值≥0.35，判定样品为包虫病抗体阳性。

有益效果：

本发明提供了一种羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，其中，包被抗原包括抗原5蛋白和生发层抗原蛋白；所述抗原5蛋白由包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的基因表达得到；所述生发层抗原蛋白由包括SEQ ID No.2所示核苷酸序列的基因表达得到。其中，所述抗原5蛋白存在棘球囊液中；而所述生发层抗原有很强的特异性，只存在棘球囊壁中，在棘球囊液中不存在，正好和抗原5形成检测互补关系，只要包虫病感染初期，就能准确检测出抗体。本发明提供的试剂盒可适用于包虫病感染后的早期或中后期的抗体检测。同时，本发明SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的基因可以使包被抗原以可溶性形式表达，并能提高包被抗原的表达量、活性和稳定性，提高试剂盒的检测灵敏度。经实验验证，本发明提供的试剂盒可以准确的检测羊包虫病感染初期产生的抗原5蛋白和生发层抗原蛋白抗体，判断被检动物是否感染包虫病，其敏感性、特异性、稳定性和重复性好，尤其适用于低浓度样本的检测以及疫病的早期诊断，对包虫病的防控和畜牧业的发展有着重大意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。

图1是包虫病病原体生物棘球蚴的结构图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。

实施例1

羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，包括化学发光抗原包被板、酶标抗体、血清稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液。

化学发光抗原包被板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板，混合包被包虫病抗原5蛋白和生发层抗原蛋白；

包被过程为：将抗原5蛋白和生发层抗原蛋白加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使抗原5蛋白和生发层抗原蛋白蛋白的浓度均为1ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到化学发光板中。4℃孵育18h；甩掉化学发光板中的蛋白包被液，向每孔中加入150uL/孔的5％BSA-PBST进行封闭，37℃封闭2h；甩掉化学发光板中的封闭液，25℃干燥2h，放入干燥剂，密封包装，2-8℃保存；

抗原5蛋白为重组蛋白，获得方式为：

将包虫病抗原5蛋白基因序列优化为大肠杆菌偏爱密码子序列，插入到原核载体pET-32a中，转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行培养，接种后将培养基置37℃，200r/min摇床振荡培养至OD_600nm达到0.6，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，18℃，150r/min过夜诱导表达18h，经过优化培养时间、诱导温度、IPTG浓度、诱导时间，使抗原5蛋白以可溶性形式表达并且提高了抗原5蛋白的表达量。洗脱缓冲液组分分别如下：Binding Buffer为20MM Tris-HCl、5MM Imidazole、500MM NaCl；Washing Buffer为20MM Tris-HCl、20MM Imidazole、500MM NaCl；Elution Buffer为20MM Tris-HCl、300MM Imidazole、500MM NaCl。使用Ni-NTA琼脂糖纯化树脂柱子进行洗脱纯化，将纯化后的蛋白液加入提前处理好的纤维素透析袋，夹紧透析袋两端，放入PBS缓冲液(pH＝7.9)中，4℃低速搅拌条件下进行透析。间隔5h换液一次，共透析5次。将透析后的蛋白液用20mmol/L Tris、150mmol/L NaCl、pH7.9的缓冲液再次透析，得到浓缩的纯化蛋白。通过优化洗脱缓冲液组分、试剂浓度和优化纯化、透析、浓缩的工艺流程，获得高浓度(2.5mg/ml)、高纯度(96％)、活性和稳定性较好的抗原5蛋白，用此蛋白包被板子检测结果显示灵敏度、特异性均良好。抗原5蛋白重组的基因，其包括SEQID NO.1所示核苷酸序列，该基因序列是为了在大肠杆菌中高效表达所述重组蛋白，根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，对密码子进行优化。不同物种对同义密码子的使用频率不同，密码子使用频率和基因的表达量相关，如果基因使用了和tRNA更相似的密码子，它就可以减少与对应的tRNA分子匹配的时间，使具有较高表达量。在此对基因序列进行密码子优化，适用于大肠杆菌表达，可以提高蛋白表达效率。

生发层抗原蛋白为重组蛋白，获得方式为:

将包虫病生发层抗原蛋白基因序列优化为大肠杆菌偏爱密码子序列，插入到原核载体pET-32a中，转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行培养，接种后将培养基置37℃，200r/min摇床振荡培养至OD_600nm达到0.6，加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L，18℃、180r/min过夜诱导表达16h，经过优化培养时间、诱导温度、IPTG浓度、诱导时间，使生发层抗原蛋白以可溶性形式表达并且提高了生发层抗原蛋白的表达量。洗脱缓冲液组分分别如下：Binding Buffer为20MM Tris-HCl、5MM Imidazole、500MM NaCl；Washing Buffer为20MM Tris-HCl、25MMImidazole、500MM NaCl；Elution Buffer为20MM Tris-HCl、400MM Imidazole、500MMNaCl。使用Ni-NTA琼脂糖纯化树脂柱子进行洗脱纯化，将纯化后的蛋白液加入提前处理好的纤维素透析袋，夹紧透析袋两端，放入PBS缓冲液(pH＝7.9)中，4℃低速搅拌条件下进行透析。间隔5h换液一次，共透析5次。将透析后的蛋白液用20mmol/L Tris、150mmol/L NaCl、pH7.9的缓冲液再次透析，得到浓缩的纯化蛋白。通过优化洗脱缓冲液组分、试剂浓度和优化纯化、透析、浓缩的工艺流程，获得一种高浓度(2.3mg/ml)、高纯度(95％)、活性和稳定性较好的生发层抗原蛋白，用此蛋白包被板子检测结果显示灵敏度、特异性均良好。生发层抗原蛋白重组的基因，其包括SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，该基因序列是为了在大肠杆菌中高效表达所述重组蛋白，根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，对密码子进行优化。不同物种对同义密码子的使用频率式不同的，密码子使用频率和基因的表达量相关，如果基因使用了和tRNA更相似的密码子，它就可以减少与对应的tRNA分子匹配的时间，使具有较高表达量。在此对基因序列进行密码子优化，适用于大肠杆菌表达，可以提高蛋白表达效率。

酶标抗体为：辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG抗体。

血清稀释液为：含5％(v/v)酪蛋白和0.5％(v/v)Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。

发光底物A为：含有0.1mmol/L的鲁米诺和1.2g/L的羟基香豆素；溶剂为0.05mol/L、pH＝8.0的Tris缓冲液；

发光底物B为：含有0.07mmol/L的维生素C和3mmol/L氨基酸氧化酶，溶剂为0.05mol/L、pH＝5.2的醋酸铵溶液。

10倍浓缩洗涤液为：0.02mol/L的磷酸二氢钠、0.08mol/L的磷酸氢二钠、1.37mol/L的氯化钠和0.5％(v/v)Tween-20，pH＝7.4。

羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒的检测步骤如下：

将待检血清用血清稀释液1：100倍稀释，取100uL分别加入到化学发光抗原包被板中，同时设置包虫病阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。将化学发光抗原包被板于37℃反应15min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％BSA-PBST稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG抗体，37℃孵育15min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物A和发光底物B，15-25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。

实施例2

羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒方法的建立。

通过棋盘滴定的方法，确定最佳包被浓度及血清稀释倍数。其中抗原5蛋白和生发层抗原蛋白分别做了2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml和0.1ug/ml的梯度，包虫病阳性对照和阴性对照血清分别做了1：10、1：20、1：50、1：100倍稀释。通过综合考虑光指数和信噪比，包被条件确定为抗原5蛋白和生发层抗原蛋白均为1ug/ml包被。血清稀释倍数为1：100。

实施例3

羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒临界值的确定，应用本发明所述试剂盒，对已知背景的血清进行检测。

利用试剂盒对60份包虫病阳性样品和180份阴性样品进行检测，计算每份样品的S/P值，采用SPSS 16.0软件对所有血清样本的S/P值进行分析。使用非参数法构建ROC曲线，并以Youden指数最大的切点作为阴阳性判断的临界点。同时确定该试剂盒的敏感性和特异性。最终将本试剂盒的判定标准定为：S/P值＜0.35，样品判定为包虫病抗体阴性；S/P值≥0.35，样品判定为包虫病抗体阳性。在此判定标准下，临界值对应的包虫病抗体检测敏感性为96.22％，特异性为93.16％；证明本诊断方法的准确率高，该试剂盒具有很高的诊断价值。

实施例4

羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒敏感性和特异性检测。

将包虫病阳性血清分别用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048，稀释好的样品直接进行检测。将裂头蚴、弓形虫、隐形孢子虫、巴贝斯虫、旋毛虫以及吸血虫抗体阳性的血清样品按1：100倍进行稀释，稀释好的样品直接进行检测，同时设置阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。将稀释好的样品加入化学发光抗原包被板中，于37℃反应15min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％BSA-PBST稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG抗体，37℃孵育15min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物A和发光底物B，15-25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。检测结果用S/P值来评价，S/P公式如下：S/P＝(检测样品发光值-阴性对照血清样品发光值)/(阳性对照血清样品发光值-阴性对照血清样品发光值)。

结果:本发明的羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒具有良好的敏感性，检测阳性血清的敏感性能达到1:1024。本发明的羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒具有良好的特异性，与上述裂头蚴、弓形虫、隐形孢子虫、巴贝斯虫、旋毛虫以及吸血虫抗体阳性的血清样品均无交叉反应。因此，本发明的试剂盒敏感性高，特异性强。具体结果参见表1。

表1羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒的敏感性和特异性检测结果

实施例5

一种羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒重复性检测。

将5个背景清楚的血清在同一个化学发光抗原包被板上各做5个重复，计算其批内变异系数(CV)。同时将这5个背景清楚的血清在不同的3个批次化学发光抗原包被板上做重复，计算其批间变异系数(CV)。结果批内与批间CV均小于10％，具有良好的重复性。具体结果参见表2。

表2羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒重复性检测结果

实施例6

羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒稳定性检测。

将化学发光抗原包被板置于37℃，10天后，检测敏感性和特异性。将包虫病阳性血清分别用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048，稀释好的样品直接进行检测。将裂头蚴、弓形虫、隐形孢子虫、巴贝斯虫、旋毛虫以及吸血虫抗体阳性的血清样品按1：100倍进行稀释，稀释好的样品直接进行检测。同时设置包虫病阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。结果表明，37℃保存10天，化学发光抗原包被板的敏感性和特异性不变。因此，化学发光抗原包被板具有良好的稳定性。

实施例7

羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒与多组对照包虫病抗体ELISA试剂盒对已知包虫病抗体均为阳性样本的检测结果。

实验组：羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒

对照组1：Eg95抗原包被的包虫病抗体ELISA试剂盒

对照组2：抗原5(来源同实验组)和Eg95抗原混合包被的包虫病抗体ELISA试剂盒

对照组3：生发层抗原(来源同实验组)和Eg95抗原混合包被的包虫病抗体ELISA试剂盒

包虫病抗体ELISA试剂盒对照组1、对照组2和对照组3的包被抗原不同，分别为Eg95抗原包被、抗原5(来源同实验组)和Eg95抗原混合包被、生发层抗原(来源同实验组)和Eg95抗原混合包被；试剂类型及规格一致，均为：酶标记物，规格为12ml；样品稀释液，规格为25ml；阴性对照，规格为1ml；阳性对照，规格为1ml；显色液，规格为12ml；10×浓缩洗涤液，规格为50ml；对照组1、对照组2和对照组3的检测方法一致，具体为：使用前将试剂盒置室温至少30min，恢复至室温。取所需用量板条，设阴性、阳性对照各2孔，未用的板条尽快密封，2-8℃保存。阴性、阳性对照孔分别加入阴性、阳性对照100μL；样品孔每孔加入稀释后的样品100μL，置37℃反应30min。扣去孔内液体，每孔加300μL洗涤液，共重复洗涤5次，拍干。每孔加酶标物100μL，置37℃反应30min。扣去孔内液体，每孔加300μL洗涤液，共重复洗涤5次，拍干。每孔依次加显色液100μL，置37℃避光反应15min。每孔加终止液50μL，混匀，于450nm测定各孔吸光值(OD值)。实验正常的情况下，阴性对照OD值≤0.2，阳性对照OD值-阴性对照OD值≥0.5，否则实验无效。S/P＝样品OD值/阳性对照OD值。S/P≥0.3，判断为阳性；S/P<0.3，判断为阴性。

分别用羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒与多组对照包虫病抗体ELISA试剂盒，检测收集的21份已知抗体阳性样本，结果化学发光试剂盒全部检出，对照组1、对照组2和对照组3包虫病抗体ELISA试剂盒分别检出包虫病抗体阳性16份、18份、17份，化学发光试剂盒对阳性样本的检出率高于以上多组对照包虫病抗体ELISA试剂盒。具体结果见表3。

表3不同试剂盒对已知阳性样本的检测结果

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实施例8

羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒(实验组)与多组对照ELISA试剂盒(多组对照ELISA试剂盒的试剂类型、规格及检测方法同实施例7)对包虫病阳性血清敏感性比对结果。

将包虫病阳性血清分别用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048。分别用羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒、多组对照包虫病抗体ELISA试剂盒检测各个稀释度的样本。结果化学发光试剂盒检测包虫病抗体阳性血清的敏感性能达到1:1024，多组对照包虫病抗体试剂盒检测包虫病抗体阳性血清的敏感性能达到1:512，化学发光试剂盒敏感性更高。具体结果见表4。

表4不同试剂盒的敏感性对比结果

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.抗原5蛋白和生发层抗原蛋白在制备羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒的应用，其特征在于，所述抗原5蛋白由包括以下任一种核苷酸序列的基因表达得到：

SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或，

SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或，

在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列；

所述生发层抗原蛋白由包括以下任一种核苷酸序列的基因表达得到：

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或，

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或，

在严格条件下可以与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

2.检测试剂盒，其特征在于，包括包被抗原，所述包被抗原包括权利要求1所述抗原5蛋白和生发层抗原蛋白。

3.根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于，所述抗原5蛋白的表达方法包括：将包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的基因插入原核载体，得到重组载体；将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌；或者，所述生发层抗原蛋白的表达方法包括：将包括SEQ IDNo.2所示核苷酸序列的基因插入原核载体，得到重组载体；将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

4.根据权利要求2或3所述检测试剂盒，其特征在于，还包括化学发光抗原包被板、酶标二抗、样品稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物和洗涤液中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液中含有磷酸盐缓冲液、酪蛋白和Tween-20；以磷酸盐缓冲液的体积为100vol％计，酪蛋白的含量为0.4-0.6vol％，Tween-20的含量为0.4-0.6vol％。

6.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述发光底物包括发光底物A和发光底物B；所述发光底物A以pH值为7.5-8.5、浓度为0.04-0.06mol/L的Tris缓冲液为基础溶剂，添加0.08-0.12mmol/L的鲁米诺和0.8-1.2g/L的羟基香豆素；所述发光底物B以pH值为5.0-5.5、浓度为0.04-0.06mol/L的醋酸铵溶液为基础溶剂，添加0.06-0.08mmol/L的维生素C和2.7-3.3mmol/L的氨基酸氧化酶。

7.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液以10倍浓缩计，包括0.018-0.022mol/L的磷酸二氢钠、0.07-0.09mol/L的磷酸氢二钠、1.29-1.45mol/L的氯化钠和0.4-0.6vol％的Tween-20；

优选的，所述洗涤液以10倍浓缩计，pH值为7.3-7.5。

8.根据权利要求4-7任意一项所述检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光抗原包被板的包被液以pH值为9.2-9.8的碳酸盐缓冲液为基础溶剂，添加0.9-1.1μg/ml的抗原5蛋白和0.9-1.1μg/ml的生发层抗原蛋白。

9.权利要求1所述抗原5蛋白和生发层抗原蛋白，或者，权利要求2-8任意一项所述检测试剂盒在非疾病诊断目的的细粒棘球绦虫检测中的应用，其特征在于，所述应用包括如下任意一种：

(1)检测饮食产品中是否含有细粒棘球绦虫；

(2)检测畜牧养殖环境中是否含有细粒棘球绦虫；

(3)检测水源中是否含有细粒棘球绦虫。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，包括如下步骤：

S1、样品经样品稀释液稀释后，加入化学发光抗原包被板中，反应10-20min；

S2、洗涤液洗涤步骤S1所述反应后的化学发光抗原包被板，加入酶标二抗，孵育10-20min；

S3、洗涤液洗涤步骤S2所述孵育后的化学发光抗原包被板，加入发光底物，15-25℃反应4-8min；用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值；

S4、根据步骤S3得到的发光值，判断检测样品中是否含有包虫病抗体；

步骤S4所述判断的方法包括：

根据公式计算S/P值，S/P值＝(检测样品发光值-阴性对照血清样品发光值)/(阳性对照血清样品发光值-阴性对照血清样品发光值)；

若S/P值＜0.35，判定样品包虫病抗体阴性；若S/P值≥0.35，判定样品包虫病抗体阳性。

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