CN111574608A

CN111574608A - 牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用

Info

Publication number: CN111574608A
Application number: CN202010319080.2A
Authority: CN
Inventors: 杨娜; 陈启军; 姜宁; 丁莹莹; 桑晓宇; 冯颖; 陈冉; 王新一
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2020-04-21
Filing date: 2020-04-21
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2040-04-21
Also published as: CN111574608B

Abstract

本发明公开了一种牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用。所述牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原蛋白质，是如下(a1)或(a2)：(a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；(a2)将(a1)限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且功能相同的蛋白质。本发明时间分辨荧光微球作为示踪物，制备免疫层析试纸条在临床上操作简单、诊断快速、灵敏度高、特异性强。

Description

牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用

技术领域

本发明涉及医疗器械技术领域，具体涉及一种牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用。

背景技术

细粒棘球蚴病为一种严重的全球性的人畜共患病，人或反刍动物主要通过误食了细粒棘球绦虫排出的虫卵而发病，被称为“虫癌”。目前，关于细粒棘球蚴病诊断技术的研究投入较少，最常用的诊断方法就是解剖查看虫体，随着分子技术和免疫技术的发展，现在有分子诊断，比如LAMP，免疫学诊断，如ELISA试剂盒法、胶体金等，但从临床应用发现，这些方法检测的准确性不高、方便性不强，无法便于基层工作者操作检测。动物感染细粒棘球蚴时，传统的诊断方法为屠宰时诊断，然而，在屠宰过程中，典型的囊状组织也许是炎性导致的肉芽肿，导致诊断错误；血清学诊断包括胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附试验。这些方法通常使用的是天然棘球囊液，但使用天然棘球囊液的缺点是易于其他患病动物的血清发生交叉反应，制备昂贵且难以进行商品化。虽然，细粒棘球蚴病在人类诊断方面已有很多研究，但在诊断动物方面的研究甚少，且动物在自然感染该病时，抗体反应不明显，易导致诊断错误。因此提高细粒棘球蚴的免疫诊断，寻找一种可靠的抗原，建立一种高效、准确、特异性好而又简便的诊断技术至关重要。

因此，基于细粒棘球蚴转录组的数据，筛选出Hyppthetical EGR_01530。Hypothetical protein EGR_01530含有一个半胱氨酸的保守结构域，研究报道表明在线虫体内的半胱氨酸蛋白可以调节其自身的蛋白酶活性、宿主的蛋白酶活性和调控宿主的免疫反应。并且据Josiah Ochieng等人报道称相关的半胱氨酸超家族可以确保寄生虫在宿主体内生存。

此外，最近，基于表位的抗原已经成为实现高敏感性和特异性捕获机体所产生的抗体，具有成功替代重组抗原的潜力。利用基于表位抗原的诊断方法已经成功应用于各种疾病，例如、利什曼病、锥体虫病、钩端螺旋体病和弓形虫病。并且，随着生物信息学的发展，为此类抗原的设计提供了新的策略。这些技术使重组蛋白的设计和后期的合成成为可能，且这些重组蛋白具有新的抗原性特征，因此，本发明也选取了基于表位的抗原。作为牛细粒棘球蚴层析试纸条的研制。

发明内容

为此，本发明提供一种牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用。

本发明所提供的牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原，是如下(a1)或(a2)：

(a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(a2)将(a1)限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且功能相同的蛋白质。

编码所述抗原蛋白质的核酸分子也是本发明的保护范围。

优选地，所述核酸分子是编码权利要求1所述的蛋白质的基因，所述基因是如下任一所述的DNA分子：

(b1)编码序列如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述的蛋白质的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码权利要求1所述的蛋白的DNA分子。

本发明还提供所述蛋白质配对用于牛细粒棘球蚴病的抗原蛋白质，是如下(c1)或(c2)：

(c1)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的蛋白质；

(c2)将(c1)限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且功能相同的蛋白质。

编码所述抗原蛋白质的核酸分子，也属于本发明的保护范围。

优选地，所述核酸分子是编码权利要求4所述的蛋白质的基因，所述基因是如下任一所述的DNA分子：

(d1)编码序列如SEQ ID NO.4所示的DNA分子；

(d2)在严格条件下与(d1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求4所述的蛋白质的DNA分子；

(d3)与(d1)或(d2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码权利要求4所述的蛋白的DNA分子。

含上述的核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明中，所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下(a)或(b)中的应用也属于本发明的保护范围：

(a)制备用于检测或者辅助检测牛细粒棘球蚴病的试剂盒；

(b)检测或者辅助检测牛细粒棘球蚴病。

含有是上述所述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；具有(1)或(2)功能的试剂盒也属于本发明的保护范围：

(1)检测或者辅助检测牛细粒棘球蚴病抗体；

(2)检测或者辅助检测动物是否感染牛细粒棘球蚴病。

优选地，所述试剂盒为牛细粒棘球病时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其中，结合垫包被的抗原为权利1所述的蛋白质，检测线包被的抗原为权利要求4所述的蛋白质。

本发明具有如下优点：

本发明表达了基于合成表位蛋白来作为诊断抗原，将antigen B subunit 1、antigen B subunit 2,antigen B subunit 4、EG95、antigen protein、Ag5、EPC1根据其B细胞表位和二级结构的生物信息学分析，截取了部分肽段，用linker重新拼接成重组蛋白质，经过亲和层析纯化，作为时间荧光微球标记的抗原；同时，时间分辨荧光免疫层析技术结合了免疫标记和免疫层析的特点，以时间分辨荧光微球作为示踪物，制备免疫层析试纸条在临床上操作简单、诊断快速、灵敏度高、特异性强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明的pET-28a-Eg-H1重组表达质粒的酶切验证电泳图；

图2为本发明的Eg-H1-His重组蛋白质SDS-PAGE电泳图；

图3为本发明的Eg-H1-His重组蛋白质Western-blot鉴定图；

图4为本发明的pET-28a-Hypothetical protein EGR_01530重组表达质粒的酶切验证电泳图；

图5为本发明的pET-28a-Hypothetical protein EGR_01530重组蛋白质SDS-PAGE电泳图；

图6为本发明的pET-28a-Hypothetical protein EGR_01530重组蛋白质Western-blot鉴定图；

图7为本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条的结构示意图，其中：1-PVC底板；2-样品垫；3-结合垫；4-吸水纸；5-硝酸纤维素薄膜；6-检测线T；7-质控线C；

图8为本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条的特异性检测结果图，其中：1-猪旋毛虫病阳性血清，2-牛肝片吸虫病阳性血清，3-牛脑包虫病阳性血清，4-牛细粒棘球蚴病阳性血清；

图9为本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条的特异性检测结果图，其中：1-6：血清依次按1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200稀释；7：样品稀释液。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中，结合垫、样品垫、底板，购自上海金标生物有限公司；时间分辨荧光微球购自Bangs公司；山羊抗小鼠IgG和小鼠IgG购自Proteintech公司；牛血清白蛋白购自Solarbio公司；磷酸盐购自Solarbio公司；PEG-20000购自Solarbio公司；硝酸纤维膜购自PALL公司。

实施例1、Eg-H1重组抗原的制备

1、pET-28a-Eg-H1重组表达载体构建

本实施例中，采用的Eg-H1的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。Eg-H1为多表位重组抗原，其表位为六钩蚴或原头蚴两个时期特异性的B细胞表位。将antigen B subunit 1、antigen B subunit 2、antigen Bsubunit 4、EG95、antigen protein、Ag5、EPC1根据其B细胞表位和二级结构的生物信息学分析，截取了部分肽段，从而拼接成重组蛋白质，其命名为Eg-H1。

构建pET-28a-Eg-H1表达载体，该表达载体是由上海生物技术有限公司合成，对pET-28a-Eg-H1表达载体经双酶切和测序验证，其中，双酶切的步骤如下：

(1)将pET-28a-Eg-H1表达载体冻干粉的离心管3000rpm/常温离心1min。

(2)用50μL无菌ddH₂O溶解冻干粉，之后用涡旋仪轻轻混匀，掌上离心机瞬离30s。

(3)用NANODROP测浓度。

(4)用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切表达载体质粒pET-28a-Eg-H1，体系表如表1所示，表达质粒双酶切体系，反应条件为37℃/10min。

表1

本实施例的pET-28a-Eg-H1重组表达质粒，目的基因为579bp，用BamHI/XhoI限制性内切酶酶切后鉴定，其双酶切验证结果如图1所示。

将验证正确的重组表达质粒转入BL21(DE3)表达感受态中，进行蛋白小量诱导表达确定培养条件，进行蛋白大量诱导表达，利用不同梯度的咪唑洗脱与蛋白结合后的Ni-Agarose Resin，进而获得高纯度的重组抗原蛋白。

2、蛋白质表达纯化

1)、双酶切验证过后，将重组质粒转化表达感受态

(1)取50μL冰浴完毕的BL21(DE3)放入1.5mL无菌离心管中，置于冰盒中融化，用移液器吸取5μL表达质粒加入其中，在冰上静置30min。

(2)冰浴后，用浮漂将离心管放入水浴锅42℃热激45s，然后，将管转移到冰上，冰浴2min。

(3)在无菌超净台内，在每个离心管中加400-500μL无菌液体LB培养基，220rpm，在37℃摇床培养1h。

(4)先将对应抗性的LB固体平皿置于37℃预热，待平皿内的水蒸气完全挥发后取出备用。

(5)根据实验需求，吸取适量转化之后的感受态细胞，呈散点似的滴加在预热好的平皿中，均匀涂布感受态细胞，放入37℃培养箱。

(6)在37℃恒温培养箱中过夜培养。

2)、pET-28a-Eg-H1中His标签重组蛋白质的小量诱导表达

(1)用无菌白枪头挑取转化后BL21(DE3)的单个菌落，PCR鉴定正确后，接种于10mL含有相应抗性的液体LB培养基，200rpm，37℃恒温培养箱，过夜培养。

(2)次日，在无菌操作台中保菌后，用移液器吸取100μL的菌液接种于10mL含有相对抗性的液体LB培养基中，37℃，200rpm条件下培养，当菌液OD_600nm＝0.6-0.8时，可加入IPTG诱导。

(3)加蛋白诱导剂前，在无菌操作台中，吸100μL未诱导全菌，作为阴性对照。之后，加入0.1M IPTG诱导剂，使IPTG终浓度为0.1mM、0.3mM、0.6mM，在不同的温度进行诱导(16℃、22℃、32℃)。

(4)集取16℃低温培养22h、22℃低温培养18h、32℃恒温培养8h的菌液，收集好的菌液置于15mL除酶管中，在4℃离心机4000rpm离心15min，弃掉上清，菌体沉淀用1mL磷酸盐缓冲液重悬后，取50μL菌液作为诱导后全菌样品，余下的菌液用小型超声破碎仪破碎，仪器的破碎功率为25w，超声2s，停歇3s，观察菌体清澈即可，破碎后的菌液置于1.5mL EP管中，在4℃离心机中5000rpm离心10min，取100μL上清(诱导后上清)后，弃掉上清，沉淀用1mL磷酸盐缓冲液重悬后，取100μL作为诱导后沉淀。

(5)将不同温度和不同IPTG浓度下的上清、沉淀、全菌，分别加入20μL1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，在100℃沸水中煮10min后，取出备用。

(6)将制备好的不同温度和不同IPTG浓度的全菌、上清、沉淀的蛋白样品，各取10μL加样于10％SDS-PAGE蛋白胶电泳中，蛋白电泳槽的设置功率为：电压150V，时间50min。

(6)将切好的蛋白胶放入预先倒入G250-考马斯亮蓝染色液的蛋白染色盒中，在水平摇床上摇晃20min。

(7)将染色完毕的蛋白胶，放入脱色液中，过夜脱色后，用照胶仪观察重组蛋白的表达情况，同时确定转入表达感受态目的基因是否表达、表达量以及表达形式为可溶性存在于上清中还是包涵体存在于沉淀中。

3)、pET-28a-Eg-H1的His标签重组蛋白质的大量表达与纯化

(1)预先从-20℃冰箱取出带有His标签重组蛋白质的菌液，放入4℃冰箱中，待菌液完全融化后，在无菌超净台中，用接种环挑取适量菌液，在Kana抗性培养板采取交叉划线法快速划线后，将培养皿放于37℃恒温培养箱，培养10h。

(2)次日取出培养皿，用白枪头挑取形态圆润的1-2mm的单菌落，接种于20mL Kana抗性的液体LB培养基中，37℃恒温摇床中200rpm，过夜培养。

(3)在无菌操作台中，吸取5mL过夜培养的菌液，加入500mL含有Kana抗性的液体LB培养基中，37℃恒温摇床，200rpm摇3h后，测量菌液的OD值。

(4)若分光光度计的OD值为0.6-0.8之间，证明该菌液以达到生长曲线的峰值，根据该蛋白在小量诱导表达时优化完毕的条件，进行培养。

(5)将摇好的菌液从锥形瓶中分到若干个无菌50mL离心管中，在低温离心机中，4000rpm离心15min，将上清弃到废液缸中，每管再加入5mL PBS将沉淀用涡旋器重悬，集入到两个无菌50mL离心管中，同样条件下再次离心，最后用每管菌液再加入30mL PBS重悬洗涤后，在4℃离心机中4000rpm离心20min后，弃掉上清。

(6)提前30min将冷却机设置为3℃预冷，启动高压破碎仪，等待气压缓冲完毕后，用75％酒精、ddH₂O、His Binding Buffer依次通过破碎管，两遍后，排气、排废液。

(7)根据菌体沉淀量，加入适量的PBS，用涡旋器将菌体沉淀完全重悬，倒入高压破碎管中反复破碎3-4次后，用超高速4℃离心机，12000rpm离心5min，留取上清备用。

(8)将空纯化柱先用His Binding Buffer润洗两遍，留有少量的His BindingBuffer，根据上清液的量，吸取适量的Ni-Agarose Resin，缓缓加入纯化柱中，待Ni-珠子完全下沉到底部时，打开底部开关，排出废液后，在使用适量的His Binding Buffer过柱洗涤填料。

(9)将步骤(7)收集的上清加入处理完毕后的Ni-Agarose Resin填料中，置于水平旋转仪上，在4℃展柜中，缓慢感作3h。

(10)将结合完毕后的上清与Ni-Agarose Resin的混合物倒入纯化柱中，待Ni-Agarose Resin完全沉淀后，打开底部开关，调整流速，待Ni-Agarose Resin完全在纯化柱内时，过柱完毕。

(11)第一次摸索His重组蛋白纯化的条件时，先用从低到高浓度的咪唑洗脱：bingding buffer、20、40、60、80、100、250、500mM，每次2mL依次洗脱并用2mL无菌离心管收集，暂时储存在冰盒内。

(12)将不同浓度梯度的咪唑洗脱下来的蛋白、过柱液、以及最后一遍洗脱后的Ni-Agarose Resin，分别制取样品，进行蛋白凝胶电泳，用蛋白照胶仪观测目的条带后，决定该蛋白的洗杂和洗脱浓度。

4)、pET-28a-Eg-H1的His标签重组蛋白质的Western-blot鉴定

(1)SDS-PAGE电泳跑胶

(2)根据蛋白胶的大小，裁剪适当大小的PVDF膜，并用甲醇激活2min，将定性滤纸剪成合适大小，浸泡在转膜液中，赶出滤纸与滤纸间的气泡，转膜时，夹子的黑面水平放在下面，上面依次为吸水网-3层定性滤纸-蛋白胶-PVDF膜-3层定性滤纸-吸水网，确保无气泡后，将夹子合上，放入转膜槽内，并且夹子的黑面对转膜槽的黑面，夹子的透明面对转膜槽的红面，检查好正负极，开始转膜，设置的功率为：电流200mA，时间为85min。

(3)转膜后，将PVDF膜放入提前配制完毕的含有封闭液(5％脱脂奶)的塑料盒中，放入37℃培养箱中，摇床上摇动封闭1h。

(4)用含有His-tag单抗(1:10000)的5％脱脂奶封闭，4℃孵育过夜。

(5)PBST洗膜，每次5min，洗4次。

(6)用PBST稀释AP山羊抗小鼠IgG 1:15,000稀释，37℃孵育50min。

(7)重复步骤(5)。

(8)配取适量的BCIP/NET显色试剂，进行避光显色2-3min，观察结果并扫描。

5)、pET-28a-Eg-H1验证结果，如图2和图3所示，其中，图2为Eg-H1-His重组蛋白质SDS-PAGE电泳图，图3为Eg-H1-His重组蛋白质Western-blot鉴定图。

实施例2、Hypothetical protein EGR_01530重组抗原的制备

1、pET-28a-Hypothetical protein EGR_01530表达载体的构建

本实施例中，采用的Hypothetical protein EGR_01530的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。Hypothetical protein EGR_01530抗原为含有一个半胱氨酸结构域的假定蛋白。

构建原核表达载体pET-28a-Hypothetical protein EGR_01530表达质粒，该表达载体是上海生物技术有限公司合成，其双酶切的步骤如下：

(1)将装有目的基因的表达载体冻干粉的离心管3000rpm/常温离心1min。

(3)用NANODROP测浓度。

(4)用限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切表达载体质粒pET-28a-Hypotheticalprotein EGR_01530，体系表如表2所示，表达质粒双酶切体系，反应条件为37℃/10min。

表2

pET-28a-Hypothetical protein EGR_01530重组表达质粒，目的基因为825bp，用NdeI/XhoI限制性内切酶酶切后鉴定，其双酶切验证结果如图4所示。该表达载体经双酶切和测序正确后，转入BL21(DE3)表达感受态中，进行蛋白小量诱导表达确定培养条件后，进行蛋白大量诱导表达利用不同梯度的咪唑洗脱与蛋白结合后的Ni-Agarose Resin，进而获得高纯度的重组抗原。

2、pET-28a-Hypothetical protein EGR_01530蛋白质表达纯化与验证的过程如实施例1中蛋白质的表达和纯化过程，其中，pET-28a-Hypothetical protein EGR_01530验证结果如图5和图6所示，图5为Hypothetical protein EGR_01530-His重组蛋白质SDS-PAGE，图6为Hypothetical protein EGR_01530-His重组蛋白质Western-blot鉴定图。

实施例3、牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备

如图7所示，本实施例提供的时间分辨荧光免疫层析试纸条包括PVC底板以及位于PVC底板1上的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素薄膜5(NC膜、层析膜)、吸水纸4。其中，硝酸纤维素膜的一端与结合垫一端连接，硝酸纤维膜的另一端与吸水纸的一端连接，样品垫的一端与结合垫的另一端连接；结合垫上包被有时间分辨荧光标记的Eg-H1重组抗原，硝酸纤维素薄膜上靠近结合垫一侧设检测线6，靠近吸水垫的一层设质控线7，检测线6上包被有Hypothetical protein EGR_01530重组抗原涂层。取75μL用样品稀释液稀释后的血清待检样本，滴加在样品垫加样孔内，待15min后，用紫外灯照射试纸条观察结果，如果滴加待检样品后检测线和质控线均显色，证明该样品为阳性；如果滴加待检样品后只有质控线显色，证明该样品为阴性。

其中，荧光微球标记重组抗原Eg-H1和小鼠IgG制备过程为：取100μL荧光微球加入适量的EDC，放置于涡旋振荡仪振荡混匀后，室温孵育30min。所需用量的重组抗原Eg-H1、小鼠IgG，用0.01M磷酸盐缓冲液定容至500μL，混合均匀后加入处理好的荧光微球中，立即振荡混均，置于旋转混合仪，室温避光孵育1h。上述反应完成后，加入2％BSA，置于旋转混合仪，室温避光孵育1h。12000rpm离心20min去除上清，得到的浓缩的重组抗原和小鼠IgG，加入适量的荧光微球工作液，放入4℃密封避光保存。样品垫中上有加样孔，荧光结合垫包被有时间分辨荧光微球标记的Eg-H1重组抗原，硝酸纤维素膜的检测线上包被Hpotheticalprotein EGR_01530重组抗原，质控线上包被山羊抗小鼠IgG。

确定牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条最佳检测反应条件：

1、阳性样本和阴性样本的加样量均为75μL(血清与稀释液的比例为1:2)，其反应时间均为15min。检测线T线和质控线C线的包被参数为0.75μL/cm喷洒在NC膜上进行抗原或者抗体的包被。

2、检测线T线包被抗原：将Hypothetical protein EGR_01530重组抗原1.0mg/mL，2.0mg/mL，3.0mg/mL制备成三种工作浓度进行包被，C线山羊抗小鼠IgG以2.0mg/mL浓度包被。放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱烘干16h。搭配荧光垫和样品垫，制备牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条。在荧光免疫分析仪读取T线、C线值，计算出T/C，已确定最佳的包被抗原浓度。当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

如表3所示，包被抗原浓度的检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当Hypothetical protein EGR_01530重组抗原浓度为2.0mg/mL时，是最适包被量。

表3

2、标记抗原浓度的确定：以相同标记方法，用处理好的荧光微球分别标记不同量的Eg-H1抗原，标记量分别为：25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。以4倍的稀释浓度对其稀释制备牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条，在荧光免疫分析仪读取T线、C线检测值，计算出T/C，以确定最佳的标记抗原浓度。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

如表4所示，标记抗原浓度的检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。当标记抗原Eg-H1浓度为50μg/mL时，是最适的结合垫标记浓度。

表4

3、荧光标记溶液稀释比例的确定

将标记好的时间分辨荧光微球分别作2倍、4倍、8倍，3种稀释度稀释。制备牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条，在荧光免疫分析仪读取T线、C线检测值，计算出T/C，以确定最佳的荧光标记溶液稀释比例。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表5，荧光标记溶液稀释比例的检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当荧光标记溶液稀释比例为4倍时，为最佳的荧光标记溶液最适稀释比例。

表5

4、荧光工作液的确定

按确定的荧光标记溶液稀释比例，选取合适的荧光微球悬浮液，其分为三组：第一组为：0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、0.05％BSA、0.05％Tween20，调至pH＝7.9；第二组为：0.01M磷酸盐缓冲液，调至pH＝7.5；第三组为：0.1MTris-HCl、0.1％BSA(5mL)、10％S9、10％Tween20、10％PEG12000、3g海藻糖。制备牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条，在荧光免疫分析仪读取T线、C线检测值，计算出T/C，以确定最适的荧光工作液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

如表6所示，荧光工作液检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组荧光工作液时，为最佳的荧光工作液。

表6

5、样品垫处理液的确定

为了是使样品中的抗体能更好的与结合垫中荧光微球标记的抗原结合，配制了三种样品垫处理液，分为三组。第一组为：1％BSA、0.1％Triton-100、0.02mol/L的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；第二组为：0.1M Na₂B₄O₇·10H₂O、1％PVP、0.2％Casein-Na、1％Triton-X100、1％Tetronic 1307、0.2％NaN₃，调至pH＝9.3；第三组为：0.5M硼酸缓冲液、1％TritonX-100、1％PVP、2％NaCl，调至pH＝9.0。制备牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条，在荧光免疫分析仪读取T线、C线检测值，计算出T/C，以确定最适的样品垫处理液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

如表7所示，样品垫处理液检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组样品垫处理液时，为最佳的样品垫处理液。

表7

6、反应时间的确定

用移液器吸取75μL样本加入到150μL样本缓冲液内，充分混匀30s-60s用移液器吸取75μL混合后的样本，滴加到检测卡的加样孔内，待反应10min，15min，20min后分别进行读数。在荧光免疫分析仪读取T线、C线检测值，计算出T/C，已确定最佳反应时间。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

如表8所示，反应时间的检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本，层析检测试纸条最佳反应时间为15min。

表8

7、样品缓冲液的确定

为了确保抗原抗体充分反应，摸索了三种样品稀释液，分成三组，分别为：第一组：pH＝7.8的0.02MTris-HCl、0.9％NaCl、0.1％BSA、0.5％Tween-20、0.1％NaN₃；第二组：pH＝7.8的0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、1.5％BSA、0.01％Tween-20、0.1％NaN₃；第三组：pH＝7.8的PBS缓冲液。在荧光免疫分析仪读取T线、C线检测值，计算出T/C，以确定最适的样品稀释液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

如表9所示，样品缓冲液的检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现第二组样品缓冲液为最佳的样品稀释液。

表9

8、样品稀释比例的确定

样本与样品缓冲液，分别按照下表10样本与样品缓冲液稀释比例，进行混合，混合后的样本，滴加至检测卡加样孔中，在荧光免疫分析仪读取T线、C线检测值，计算出T/C，以确定最适的样本稀释比例。

表10

如表11所示，样品稀释液的检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现最适的稀释比例为1:2(样品体积:样品缓冲液)

表11

试验实施例、本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条特异性、敏感性、准确性测定

1、本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条的特异性

对猪旋毛虫病阳性血清、牛肝片吸虫病阳性血清、牛脑包虫病阳性血清样本进行检测，除牛细粒棘球蚴病的阳性血清外，在荧光免疫分析仪下，其他非牛细粒棘球蚴病原体的血清在检测线T线均没有检测到信号，只有C线有出现条带，即为阴性，检测结果如图8所示，其中：1-猪旋毛虫病阳性血清，2-牛肝片吸虫病阳性血清，3-牛脑包虫病阳性血清，4-牛细粒棘球蚴病阳性血清。

2、本发明的时间分辨荧光层析试纸条的敏感性

阳性血清倍比稀释后，分别将稀释好的样本滴加到样品垫中，15min后在荧光免疫层析下观测检测线T线的荧光强度。结果显示，当阳性血清稀释比例为1:1600时，可以清晰的看见检测线T线、质控线C线，当阳性血清稀释比例为1:3200时，T线的亮度很微弱，但C线依旧亮度明显，证明检测结果有效，检测结果如图9所示。

3、本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条的准确性

为了进一步验证时间分辨荧光免疫层析法检测的有效性，用两种商品化ELISA试剂盒和该方法分别检测了50份牛细粒棘球蚴病的阳性血清和50份健康牛血清，检测结果如表12所示，本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条与两种商业化ELISA试剂盒的比较结果发现基于时间分辨荧光免疫层析试纸条的检出准确率更高。

表12

本发明采用重组抗原替代了天然棘球囊液作为包被抗原，与时间分辨荧光免疫层析法结合制备检测试纸条，检测过程操作更简便、敏感性和准确性更好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用

<130> GG20753252A

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 252

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Asp Asp Gly Leu Thr Ser Thr Ser Arg Ser Val Met Lys Met Phe

1 5 10 15

Gly Glu Val Lys Tyr Phe Phe Glu Arg Asp Pro Leu Gly Gln Lys Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asp

35 40 45

Glu Pro Lys Ala His Met Gly Gln Val Val Lys Lys Arg Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Arg Asp Phe Phe Arg Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

65 70 75 80

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gly Glu Ile Arg Asp Phe Phe Arg

85 90 95

Ser Asp Pro Leu Gly Gln Lys Leu Val Ala Leu Gly Arg Asp Leu Thr

100 105 110

Ala Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg

130 135 140

Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Asn Cys

165 170 175

Asp Gln Gly Lys Ala Gln Ser Ala Asn Val Thr Gly Gly Gly Gly Gly

180 185 190

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Cys Ser Pro His

195 200 205

Thr Cys Leu Glu His Arg Tyr Arg Arg Cys Val Asp Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys Ile Ser Cys

225 230 235 240

Ala Glu Leu Lys Ser Ala Leu Gln Ser Cys Ser Ala

245 250

<210> 2

<211> 579

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atggatgatg gcctcacctc gacgtcgagg agtgtgatga aaatgtttgg cgaagtgaag 60

tacttcttcg aacgtgatcc gttgggtcag aaaggggsgg ggsggggsaa agatgagcca 120

aaagcacaca tggggcaagt ggtaaaaaaa agatggggtg aacttcgaga cttctttaga 180

aatgatgggg sggggsgggg sttgggcgaa attcgggact tctttagaag tgatccactg 240

ggtcaaaaac ttgttgctct tggcagggac ctgactgcca tcggggsggg gsggggsaaa 300

ggaatgggcg tagagacaag gacaacagag actccgctcc gtaaacactt caatttgact 360

cctgtgggtt ctcagggcat tggggsgggg sggggsactg gcaattgtga tcaaggaaaa 420

gcacaaagtg ccaatgtgac aggaggggsg gggsggggsg agtgttcccc ccatacctgc 480

ctcgaacatc gctatcgtcg ctgtgtggac ggggsggggs ggggstcagc agagcctctc 540

gatgacgacc atgtgagggc tttcttagat aagctctga 579

<210> 3

<211> 274

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Asn Arg Phe Val Leu Leu Phe Leu Ser Phe Leu Val Ala Ile Ser

1 5 10 15

Leu Ala Cys Arg Gln Gln Glu Arg Ser Val Ala Val Pro Ser Ser Arg

20 25 30

Gly Ile Val Gly Gly Ile Thr Pro Ile Thr Lys Glu Asp Met Asn Glu

35 40 45

Met Met Phe Gln Asp Ala Leu Thr Glu Val Met Lys Asn Leu Asp Glu

50 55 60

Val Asn Glu Cys His Ser Phe Arg Leu Val Lys Val Ile Glu Ala Thr

65 70 75 80

Gln Gln Val Val Ala Gly Met Lys Tyr Val Val Lys Leu Glu Val Thr

85 90 95

Pro Ile Tyr Ser Ser Asp Asn Gly Glu Glu Cys Ser Lys Pro Cys Tyr

100 105 110

His Gly Leu Ser Gly Asn Lys Gln Ala Ile Ala Ala Ile Val Tyr Gln

115 120 125

Pro Trp Arg Asp Pro Lys His His Ile Thr Phe Lys Pro Asn Asn Glu

130 135 140

Gly Ser Ala Asp Phe Ser Lys Asn Gly Lys Leu Ile Thr Ser Cys Glu

145 150 155 160

Leu Pro Glu Gly Thr Ile Leu Ser Pro Lys Glu Met Thr Ser Glu Gln

165 170 175

Phe Gln Glu Val Val Arg Ser Gly Ile Glu Arg Leu Asp Arg Asn Ala

180 185 190

Ser Arg Cys Phe Arg Tyr Glu Leu Met Asp Val Ile Glu Gly Lys Arg

195 200 205

Met Met Thr Ser Asn Leu Lys Tyr Glu Trp Arg Met Lys Val Lys Arg

210 215 220

Ile Tyr Asp Glu Ser Met Leu Gly Cys Ile Gly Ala Cys Ala Asp Asp

225 230 235 240

Cys Ser Gly Ile Glu Ile Tyr Arg Ala Ser Ala Phe Ala Ser Pro Phe

245 250 255

His Gly Gly Thr Pro Glu Ile Leu Ser Ile Glu Tyr Gln Asp Pro Thr

260 265 270

Ala Leu

<210> 4

<211> 825

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atgaatcggt ttgttcttct gttcctctcc ttccttgtcg ccatctcgct tgcgtgcaga 60

cagcaagagc gcagcgttgc tgtcccttcc tcgagaggca tagtcggcgg tattactccc 120

ataaccaagg aggacatgaa tgagatgatg tttcaggacg ctcttacaga ggtaatgaag 180

aatttagacg aagtgaacga atgtcactcc ttccgacttg tcaaagttat tgaagctaca 240

caacaggttg tcgctggaat gaaatatgtc gtaaagctag aggtcactcc tatctattcc 300

agtgataatg gcgaggaatg ttcaaagcct tgctaccatg gtttaagtgg aaataagcaa 360

gcaatagctg cgattgtgta tcaaccatgg agggatccca agcatcacat cacttttaag 420

cccaacaatg aaggttctgc agatttcagt aaaaatggaa agctaattac tagctgtgaa 480

ttaccagaag ggacgattct gtcccctaaa gaaatgacat cagaacaatt tcaagaggtg 540

gtccgaagtg gtatcgaaag attggataga aatgccagca gatgctttcg gtacgagctc 600

atggatgtga ttgaaggaaa gagaatgatg acctcgaacc tgaagtatga atggaggatg 660

aaagtgaaga gaatttacga tgagtctatg cttggttgta ttggtgcctg cgccgacgac 720

tgctcaggca ttgaaattta cagggccagt gccttcgcaa gtccgttcca cggcggaaca 780

ccagagatcc tgagtattga gtatcaagac cccacagccc tatga 825

Claims

1.蛋白质，是如下(a1)或(a2)：

(a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

2.编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是编码权利要求1所述的蛋白质的基因，所述基因是如下任一所述的DNA分子：

(b1)编码序列如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

4.与权利要求1所述蛋白质配对用于检测牛细粒棘球蚴病的蛋白质，是如下(c1)或(c2)：

(c1)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的蛋白质；

5.编码权利要求4所述蛋白质的核酸分子。

6.如权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是编码权利要求4所述的蛋白质的基因，所述基因是如下任一所述的DNA分子：

(d1)编码序列如SEQ ID NO.4所示的DNA分子；

7.含权利要求2-3或权利要求5-6所述的核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

8.权利要求1或4所述的蛋白质、权利要求2、3、5或6所述的核酸分子、权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下(a)或(b)中的应用：

(a)制备用于检测或者辅助检测牛细粒棘球蚴病抗体的试剂盒；

(b)检测或者辅助检测牛细粒棘球蚴病抗体。

9.试剂盒，含有权利要求1或4所述的蛋白质或权利要求2、3、5或6所述的核酸分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述试剂盒具有(1)或(2)功能：

(1)检测或者辅助检测牛细粒棘球蚴病抗体；

(2)检测或者辅助检测牛是否感染细粒棘球蚴病。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，

所述试剂盒为细粒棘球病时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其中，结合垫包被的抗原为权利1所述的蛋白质，检测线包被的抗原为权利要求4所述的蛋白质。