CN107200776A - 细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法 - Google Patents

细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白，所述细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。并实现了该重组蛋白的高效可溶性表达，然后使用HisPur Cobalt（Clontech）亲和层析纯化蛋白，在使用洗脱缓冲液（200mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl）时得到一种高纯度的细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白。将该纯化蛋白作为包被抗原，可制备得到一种用于检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒。

Description

细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化 方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法。
背景技术
抗原cC1是细粒棘球绦虫成虫cDNA文库中的一个抗原基因。抗原cC1是一种重要的细粒棘球绦虫抗原，可能参与了细粒棘球绦虫信号传导途径，对于细胞的生长、分化具有重要的生理意义。抗原cC1同膜联蛋白家族(Annexin family)成员可能是同源基因，属于Annexin家族。研究该抗原的生理功能，不仅可以了解其对于细粒棘球蚴的寄生、 生长、发育等生命活动中的重要意义，还可以为治疗和预防包虫病提供新的药物靶点和候选疫苗。基于以上研究背景，本发明构建了编码细粒棘球绦虫抗原cC1基因的原核表达质粒，转化入大肠杆菌表达系统，诱导其可溶性表达，并进行蛋白纯化，得到了该蛋白，为其今后的免疫原性、生化特性分析以及功能研究奠定了基础。
发明内容
本发明通过基因工程技术，提供了一种细粒棘球绦虫抗原cC1的原核表达载体pET30a-抗原cC1，利用该载体转化大肠杆菌（BL21-DE3）实现了抗原cC1的高水平可溶性表达。并提供了一种亲和层析纯化方法，纯化出了大量的高纯度的重组抗原cC1，用于抗原cC1免疫原性、生化特性分析以及功能研究，抗包虫疫苗、抗包虫药物的研发及囊型包虫病患者的免疫诊断。
本发明提供细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白，所述细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。
作为优选，所述细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白编码的核苷酸序列为序列表SEQID No.1中第22位-1065位碱基。
本发明还提供上述细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白的可溶性表达，步骤如下：
（1）目的基因抗原cC1的扩增；
（2）构建抗原cC1表达质粒：将步骤（1）制备的目的基因细粒棘球绦虫抗原cC1纯化后酶切，构建入pET-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pET30a-抗原cC1；
（3）将步骤（2）制备的质粒pET30a-抗原cC1转化入E.Coli BL21(DE3)感受态细胞中，将活化表达的菌液加入LB液体培养基中，置于摇床上于37℃，180r/min振荡培养3小时，再加入0.1mmol/L的 IPTG于18℃，诱导振荡培养6小时，离心、超声后收集上清。
本发明还提供上述细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白的纯化方法，是使用HisPurCobalt（Clontech）亲和层析纯化重组蛋白，使用洗脱缓冲液进行洗脱；所述洗脱缓冲液的配方为：200mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH 8.0。
作为优选，步骤如下：
（1）加入20 mM MES缓冲液于HisTALONTM Gravity Columns 预装柱中冲洗介质；
（2）加入超纯水，使其缓慢的流过柱内填充的介质；
（3）加入结合缓冲液，使其缓慢的流过柱内填充的介质；所述结合缓冲液的配方为：50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH8.0；
（4）上样，加入抗原cC1重组蛋白上清液，使蛋白与介质结合后将上清液缓慢流过柱内介质；
（5）加入结合缓冲液，轻轻摇晃悬浮起介质，将该亲和柱置于摇床上，室温下轻轻振摇10分钟，之后缓慢流过柱内介质；所述结合缓冲液的配方为：50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH8.0；
（6）加入漂洗缓冲液，使其缓慢流过柱内介质；所述漂洗缓冲液的配方为：50mM/LNaH2PO4，300mM/L NaCl，20mM/L咪唑，pH8.0；
（7）加入洗脱缓冲液使其缓慢流过柱内介质，收集流穿液；所述洗脱缓冲液的配方为：200mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH8.0。
本发明还提供上述细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白在制备检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒中的应用。
本发明还提供一种检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒中包被抗原为权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白。
作为优选，所述包被抗原用pH 9.6 的0.05M/L碳酸盐缓冲液稀释至终浓度 5μg/ml。
作为优选，所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为含有5%脱脂奶粉的TBST，所述百分比的单位为g/ml。
作为优选，所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为过氧化物酶标记的羊抗人IgG。
本发明提供了一种细粒棘球绦虫抗原cC1基因，还提供了细粒棘球绦虫抗原cC1基因所编码的蛋白质，并提供了一种细粒棘球绦虫抗原cC1的原核表达载体pET30a-抗原cC1。该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点和抗原cC1基因及一个组氨酸标签，从细粒棘球绦虫成虫cDNA文库中克隆出抗原cC1基因，用T7启动子控制它在大肠杆菌中的表达，利用该载体转化大肠杆菌(BL21-DE3)，并在较低温度、较低诱导剂浓度及较短诱导时间条件下诱导该菌，实现抗原cC1的高效可溶性表达：表达的重组蛋白质绝大部分为可溶性蛋白，占大肠杆菌可溶性总蛋白的85%，然后使用HisPur Cobalt（Clontech）亲和层析纯化蛋白，在使用洗脱缓冲液（200mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH8.0）时得到一种高纯度的细粒棘球绦虫抗原cC1。抗原cC1重组蛋白表达量很高，不需要大规模培养细菌，且在特定的诱导条件下呈可溶性表达，纯化该蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。本发明所制备的重组蛋白可以用于囊型包虫病患者的免疫诊断，其作为免疫抗原能够被囊型包虫病患者血清识别，应用于间接ELISA检测时，具备较高的特异性和灵敏度，临床检测符合率高达90％。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为细粒棘球绦虫抗原cC1基因PCR扩增产物电泳结果；
图2为细粒棘球绦虫抗原cC1在不同诱导条件下的原核表达；
图3为细粒棘球绦虫抗原cC1亲和层析纯化结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例一细粒棘球绦虫抗原cC1基因序列及其编码的蛋白质序列
细粒棘球绦虫抗原cC1全长1309个核苷酸，最大的开放阅读框（ORF）位于第22-1065位，含1044bp，起始密码子为atg，终止密码子为taa，编码347个氨基酸，其核苷酸序列及编码的氨基酸序列分别见序列表SEQ ID No.1和2。
核苷酸序列：
氨基酸序列：
实施例二细粒棘球绦虫抗原cC1的原核表达载体pET30a-抗原cC1的克隆构建
1、目的基因抗原cC1的扩增
以细粒棘球绦虫pBluescript ⅡSK-抗原cC1（细粒棘球绦虫pBluescript ⅡSK-抗原cC1从海南医学院寄生虫学教研室获得，社会公众也可从该教研室获得）为模板,根据细粒棘球绦虫抗原cC1基因序列设计如下两对引物：
上游引物序列为：CAGGATCCATGCTCTACTGCCGC，含BamH I 酶切位点，
下游引物序列为：CAGTCGACTTATGTGCAGCCGAGGAG，含Sal I 酶切位点。
扩增抗原cC1基因最大的开放阅读框（ORF）中的基因序列（即22-1065位基因序列），PCR反应条件：98℃预变性5min；98℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸75s，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物电泳结果见图1。
图1为细粒棘球绦虫抗原cC1基因PCR扩增产物电泳结果；其中，M，MarkerⅢ；1，细粒棘球绦虫pBluescript ⅡSK-抗原cC1重组质粒DNA 提取结果；2，抗原cC1 PCR扩增产物。
2、构建抗原cC1表达质粒
PCR产物经纯化后，扩增得到片段被EcoR V和Sal I酶切后并纯化后，构建入pET-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pET30a-抗原cC1，经测序鉴定，抗原cC1的序列信息与目标基因序列一致：核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1中第22-1065位，编码347个氨基酸，编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。
实施例三细粒棘球绦虫抗原cC1的原核表达
在不同诱导条件下，重组蛋白的可溶性表达量有所不同，以下为最佳诱导方法：
制备E.Coli BL21(DE3)感受态细胞，将实施例2制备得到的质粒pET30a-抗原cC1转化入E.Coli BL21(DE3)中，将活化表达抗原cC1的E．coli BL21(DE3)菌液0.5ml，移入300 mLLB液体培养基中，置于摇床上于37℃，180r/min振荡培养3小时，再加入IPTG（0.1mmol/L）于18℃， 140 r/min诱导振荡培养6小时；4℃10000rpm离心10min收集细菌；超声破碎细菌，功率180W，超声10S，间歇10S，30min后提取上清，并进行SDS-PAGE电泳，可见蛋白在上清液中表达量很高，呈可溶性表达（见图2）。重组蛋白质绝大部分为可溶性蛋白，占大肠杆菌可溶性总蛋白的85%。
为了寻找到最佳诱导条件，申请人进行了大量实验，图2为细粒棘球绦虫抗原cC1在不同诱导条件下的原核表达。
其中，A图中，M：Marker；1-4泳道分别为：BL21（DE3）-pET30a-抗原cC1于 37℃，IPTG浓度分别为1、0.5、0.25、0.1 mmol/L，诱导18 h后上清液的电泳图；5-8泳道分别为：BL21（DE3）-pET30a-抗原cC1于 25℃，IPTG浓度分别为1、0.5、0.25、0.1 mmol/L，诱导12 h后上清液的电泳图；
B图中，M：Marker ；1-7泳道分别为：BL21（DE3）-pET30a-抗原cC1于 18℃，IPTG浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.0 mmol/L，诱导6小时后上清液的电泳图。
由图2可见，在诱导温度为37℃，IPTG浓度分别为1、0.5、0.25、0.1 mmol/L，诱导18h后，在上清液中可见呈可溶性表达的抗原cC1，但表达量很低。
将诱导温度降至25℃，IPTG浓度分别为1、0.5、0.25、0.1 mmol/L，诱导12 h后，在上清液中可见呈可溶性表达的抗原cC1，但其表达量较37℃时并未增加。
进一步降低诱导温度至18℃，IPTG浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.0 mmol/L，诱导6 h后，均可使上清液中抗原cC1的表达量增加，且IPTG浓度为0.1mmol/L时，可溶性抗原cC1的表达量最多，故将此条件作为抗原cC1原核诱导表达的最优条件。
实施例四细粒棘球绦虫抗原cC1的亲和层析纯化
应用HisPur Cobalt（Clontech）纯化系统纯化目的蛋白。HisTALONTM GravityColumns预装柱购自日本Clontech公司，型号为：635655。
在滴加各种物质时，滴加速度为1滴/10秒。
不同的纯化方法得到的重组蛋白的纯化效果不同，需要对纯化方法进行优化。以下为部分优化过程：
加入20ml超纯水于HisPur Cobalt预装柱中，使其缓慢的流过柱内填充的介质；加入20ml Tris-结合缓冲液（20mM/L Tris，500mM/L NaCl，20mM/L咪唑，pH8.0）,使其缓慢的流过柱内填充的介质；上样，加入10ml通过超声破碎E.Coli BL21(DE3)- pET30a-抗原cC1提取的上清液, 控制流速使其缓慢流过柱内介质；加入30ml Tris-结合缓冲液（20mM/LTris，500mM/L NaCl，20mM /L咪唑，pH8.0），控制流速使其缓慢流过柱内介质；加入100mM/L咪唑-tris洗脱液（100mM/L咪唑，20mM/L Tris，500mM/L NaCl，pH8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入200mM/L 咪唑-tris洗脱液（200mM/L咪唑，20mM/L Tris，500mM/LNaCl，pH8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入300mM/L 咪唑-tris洗脱液（300mM/L咪唑，20mM/L Tris，500mM/L NaCl，pH8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集。将收集的洗脱液分别进行SDS-PAGE分析，检查蛋白的纯化程度，见图3中的A图。
图3为细粒棘球绦虫抗原cC1HisPur Cobalt亲和层析纯化结果。
其中，在A图中，M：Marker；1，BL21（DE3）E.Coli 诱导后上清；2，BL21（DE3）-pET30a-抗原cC1诱导后上清原样；3，100mM/L 咪唑-tris洗脱液；4，200mM/L 咪唑-tris洗脱液；5，300mM/L 咪唑-tris洗脱液。
由图3中的A图可见：分别用100、200、300 mM/L咪唑-tris洗脱液均能够将目的蛋白洗脱下来，但是蛋白纯度不高，杂蛋白含量很高，故进一步优化蛋白纯化条件，改用以下方法进行纯化。
加入30ml 20 mM MES（2-（N-吗啉）-乙磺酸，pH 5.0） 缓冲液于HisPur Cobalt预装柱中冲洗介质；加入30ml超纯水，使其缓慢的流过柱内填充的介质；加入20ml结合缓冲液（50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH 8.0）以平衡介质，使其缓慢的流过柱内填充的介质；上样，加入10ml通过超声破碎E.Coli BL21(DE3)- pET30a-抗原cC1提取的上清液，轻轻摇晃悬浮起介质，将该亲和柱置于摇床上，室温下轻轻振摇10分钟，使蛋白与介质结合，之后控制流速使上清液缓慢流过柱内介质；加入10ml结合缓冲液（50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH 8.0），轻轻摇晃悬浮起介质，将该亲和柱置于摇床上，室温下轻轻振摇10 min，之后控制流速使其缓慢流过柱内介质；加入20ml漂洗缓冲液（50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，20mM/L咪唑，pH 8.0）以洗脱杂蛋白，控制流速使其缓慢流过柱内介质；加入10ml洗脱缓冲液（200mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH 8.0）使其缓慢流过柱内介质以洗脱目的蛋白，并用5 ml EP管收集流穿液，连续收集，2 ml/管。将收集的流穿液分别进行SDS-PAGE分析，检查蛋白的纯化程度，最终得到纯度很高的抗原cC1（见图3B），该蛋白分子量约为38.28KD。SDS-PAGE结果见图3中的B图。
在图3的B图中，M：Marker ；1，BL21（DE3）E.Coli 诱导后上清；2，BL21（DE3）-pET30a-抗原cC1诱导后上清原样；3-7，200mM/L 咪唑- NaH2PO4洗脱液。
实施例五检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒
检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒包括以下组分：
1、包被抗原：以实施例4得到的纯化的重组蛋白为包被抗原，用pH 9.6 的0.05M/L碳酸盐缓冲液稀释纯化的重组蛋白至终浓度 5 μg/ml；
2、封闭液：5 g脱脂奶粉溶于100 ml TBST中；
3、阴性对照：健康人血清，1:200稀释；
4、酶标二抗：过氧化物酶标记的羊抗人IgG，1:10000稀释；
5、TMB显色液；
6、终止液：2 mol/L浓硫酸。
实施例六细粒棘球绦虫抗原cC1的ELISA检测
以纯化后的重组蛋白为抗原，对 20份感染棘球蚴病人血清样品和 20份健康人血清样品进行间接ELISA检测。具体方法如下：
用pH 9.6 的0.05M/L碳酸盐缓冲液稀释纯化的重组蛋白至终浓度 5 μg/ml，每孔 200μl包被96孔酶标板，4 ℃过夜；甩去孔中液体，以 pH 7.4 的PBST 洗板3 次( 5 min/次)后每孔加入200 μ l封闭液（5 g脱脂奶粉溶于100 ml TBST中），37 ℃封闭1小时。PBST 洗板3 次( 5 min/次)，每孔100 μl分别加入细粒棘球蚴病患者和健康人血清（1：200 稀释），37 ℃温育1小时；PBST 洗板3次，每孔100 μl加入过氧化物酶标记的羊抗人 IgG（1：10000稀释），37 ℃温育1小时；PBST 洗板3次，每孔100 μ l加入TMB显色液，37 ℃避光反应 30分钟，每孔50μ l加入2 mol/L 浓硫酸终止反应，测定吸光度（）值。以健康人血清的均值2倍加标准差为阳性判断值。ELISA检测结果如表1所示，本发明的试剂盒对细粒棘球蚴病患者血清的诊断敏感性为90%（18/20），对细粒棘球蚴病有较好的免疫诊断价值。
表1 细粒棘球绦虫抗原cC1 ELISA检测结果
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法
<210> 1
<211> 1309
<212> DNA
<213> 细粒棘球绦虫抗原cC1核苷酸序列
<400> 1
ccgggggcac cgtgtgcgat tatgctctac tgccgctcct tgattcatct atatactcct 60
gatggggaga aatacaaacc gaccattact ccaacaccgg gattctcacc gaccgctgat 120
gctgagcatc tgaagcgtgc aatgcgaggg atcggcacaa atgaagctga aattatcgag 180
attcttggag gtcgaacttc agctgaaaga atggccattc gcgaagctta tacatcgatt 240
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gtcttgttgt taatccaatc accgtggcag gtgatggcag aggctcttta caaggcaatc 360
aagggggctg gcactaagga acgcgtgctt aatgaaatca ttgccggttg ctcaaaggag 420
gacatccccc atttgaaaga ggcctttgag gaagtgagcg gaggagaaaa ccttgaggat 480
gcgatcaagg gcgacacaag cggcgactac tgcgcagcgc ttttgttagc actctcaggc 540
cagtgtgatg aacctcaggc gatgcaactc aaatgtttaa caccctgcac actcaatcag 600
gtcgtgaacc ccggtcttgc cgaaagtgat gcgaaggagc tgtacgcttg tggtgaaggg 660
cgaccaggca cggcggagag tcgtttcatg cgtcccatca ttaaccgatc attccttcaa 720
atgcgcctaa cggacgaggc ctacactcgg gcatacggtc acccattgat tgatgcaata 780
aaaaaggaga cttcgggaga ctttgaacac tttctcgtga ctagagttcg atacgccatt 840
gatcgtgctg ctctctttgc cgaacttctt cattttgcca tcagtggacc gggtacaagg 900
gattccacct tgcaacgcat tttagcccta agggctgaca ccgatttggg aaccatcaag 960
gagaagtacg aggagctcta tggcgaagcc ttagaagcgg cgatcaaggg tgatacttct 1020
ggagactata gggctctttg cttaaaactc ctcggctgca cataactggg gtcttggcaa 1080
attggtctct atattttggt taaagctctc ccccttcata atcttttggt tttcattcca 1140
gcttttctgt aatgcaactt cttcaactat ccttgctttc tgttcttggt cagtttgtga 1200
aaggttaagc tcgatgttgt aattcctttc aataaaattg tgtacttgcg tttaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa acatgtcggc cgcctcggcc tatgtgcggc cgccaccgc 1309
<210> 2
<211> 347
<212> PRT
<213> 细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白
<400> 2
Met Leu Tyr Cys Arg Ser Leu Ile His Leu Tyr Thr Pro Asp Gly Glu
1 5 10 15
Lys Tyr Lys Pro Thr Ile Thr Pro Thr Pro Gly Phe Ser Pro Thr Ala
20 25 30
Asp Ala Glu His Leu Lys Arg Ala Met Arg Gly Ile Gly Thr Asn Glu
35 40 45
Ala Glu Ile Ile Glu Ile Leu Gly Gly Arg Thr Ser Ala Glu Arg Met
50 55 60
Ala Ile Arg Glu Ala Tyr Thr Ser Ile Ser Ser Lys Thr Leu His Asp
65 70 75 80
Ala Leu Lys Ser Glu Leu Ser Gly His Phe Arg Glu Leu Val Leu Leu
85 90 95
Leu Ile Gln Ser Pro Trp Gln Val Met Ala Glu Ala Leu Tyr Lys Ala
100 105 110
Ile Lys Gly Ala Gly Thr Lys Glu Arg Val Leu Asn Glu Ile Ile Ala
115 120 125
Gly Cys Ser Lys Glu Asp Ile Pro His Leu Lys Glu Ala Phe Glu Glu
130 135 140
Val Ser Gly Gly Glu Asn Leu Glu Asp Ala Ile Lys Gly Asp Thr Ser
145 150 155 160
Gly Asp Tyr Cys Ala Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Gly Gln Cys Asp
165 170 175
Glu Pro Gln Ala Met Gln Leu Lys Cys Leu Thr Pro Cys Thr Leu Asn
180 185 190
Gln Val Val Asn Pro Gly Leu Ala Glu Ser Asp Ala Lys Glu Leu Tyr
195 200 205
Ala Cys Gly Glu Gly Arg Pro Gly Thr Ala Glu Ser Arg Phe Met Arg
210 215 220
Pro Ile Ile Asn Arg Ser Phe Leu Gln Met Arg Leu Thr Asp Glu Ala
225 230 235 240
Tyr Thr Arg Ala Tyr Gly His Pro Leu Ile Asp Ala Ile Lys Lys Glu
245 250 255
Thr Ser Gly Asp Phe Glu His Phe Leu Val Thr Arg Val Arg Tyr Ala
260 265 270
Ile Asp Arg Ala Ala Leu Phe Ala Glu Leu Leu His Phe Ala Ile Ser
275 280 285
Gly Pro Gly Thr Arg Asp Ser Thr Leu Gln Arg Ile Leu Ala Leu Arg
290 295 300
Ala Asp Thr Asp Leu Gly Thr Ile Lys Glu Lys Tyr Glu Glu Leu Tyr
305 310 315 320
Gly Glu Ala Leu Glu Ala Ala Ile Lys Gly Asp Thr Ser Gly Asp Tyr
325 330 335
Arg Ala Leu Cys Leu Lys Leu Leu Gly Cys Thr
340 345

Claims (10)

1.细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白，其特征在于：所述细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。
2.根据权利要求1所述的细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白，其特征在于：所述细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白编码的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1中第22位-1065位碱基。
3.权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白的可溶性表达，其特征在于：步骤如下：
（1）目的基因抗原cC1的扩增；
（2）构建抗原cC1表达质粒：将步骤（1）制备的目的基因细粒棘球绦虫抗原cC1纯化后酶切，构建入pET-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pET30a-抗原cC1；
（3）将步骤（2）制备的质粒pET30a-抗原cC1转化入E.Coli BL21(DE3)感受态细胞中，将活化表达的菌液加入LB液体培养基中，置于摇床上于37℃，180r/min振荡培养3小时，再加入0.1mmol/L的 IPTG于18℃，诱导振荡培养6小时，离心、超声后收集上清。
4.权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白的纯化方法，其特征在于：是使用HisPur Cobalt（Clontech）亲和层析纯化重组蛋白，使用洗脱缓冲液进行洗脱；所述洗脱缓冲液的配方为：200mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH8.0。
5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于：步骤如下：
（1）加入20 mM MES缓冲液于HisTALONTM Gravity Columns 预装柱冲洗介质；
（2）加入超纯水，使其缓慢的流过柱内填充的介质；
（3）加入结合缓冲液，使其缓慢的流过柱内填充的介质；所述结合缓冲液的配方为：50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH8.0；
（4）上样，加入抗原cC1重组蛋白上清液，使蛋白与介质结合后将上清液缓慢流过柱内介质；
（5）加入结合缓冲液，轻轻摇晃悬浮起介质，将该亲和柱置于摇床上，室温下轻轻振摇，60 r/min，10分钟之后使结合缓冲液缓慢流过柱内介质；所述结合缓冲液的配方为：50mM/LNaH2PO4，300mM/L NaCl ，pH8.0；
（6）加入漂洗缓冲液，使其缓慢流过柱内介质；所述漂洗缓冲液的配方为：50mM/LNaH2PO4，300mM/L NaCl，20mM/L咪唑，pH8.0；
（7）加入洗脱缓冲液使其缓慢流过柱内介质，收集流穿液；所述洗脱缓冲液的配方为：200mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH8.0。
6.权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白在制备检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒中的应用。
7.一种检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒，其特征在于：所述ELISA试剂盒中包被抗原为权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫抗原cC1重组蛋白。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述包被抗原用pH 9.6 的0.05M/L碳酸盐缓冲液稀释至终浓度 5μg/ml。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为含有5%脱脂奶粉的TBST，所述百分比的单位为g/ml。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为过氧化物酶标记的羊抗人IgG。
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