CN102676562B - 一种对抗体具有广谱吸附能力的融合蛋白制备方法及应用 - Google Patents
一种对抗体具有广谱吸附能力的融合蛋白制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种对抗体具有广谱吸附能力的融合蛋白制备方法及其应用，通过基因工程手段，经过PCR扩增，连接T载体，双酶切得到蛋白A和蛋白G免疫球蛋白结合区基因，然后一起连接到表达载体pET-23a上构成重组质粒，并转化E.coli BL21(DE3)，诱导表达后得到大量含有融合蛋白AG的菌体。通过超声破碎、高温加热、沉淀DNA、弱阴离子交换层析和亲和层析纯化得到融合蛋白AG。该蛋白具有蛋白A和蛋白G的双重优点，结合谱更为广泛，且对血清中白蛋白等非免疫球蛋白物质非特异性吸附低。将该蛋白作为配基连接到固相载体基质上制成吸附剂，解决了蛋白A吸附剂对IgG3结合力弱的不足，可用于抗体纯化以及血液净化等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种对抗体具有广谱吸附能力的融合蛋白AG的制备方法及其在抗体纯化和血液净化等领域中的应用。
背景技术
自身免疫性疾病(Autoimmune diseases，AID)是在特定情况下，机体自身耐受机制遭到破坏，免疫系统将自身的物质错误地识别为外来有害物质，致使自身抗体和自身反应性T淋巴细胞识别并损害机体自身正常细胞、组织、器官，从而导致一系列病变。由于自身抗体和免疫复合物在自身免疫性疾病中的致病性已被证实，通过吸附剂体外清除的方式降低病人血液中自身抗体和免疫复合物的浓度能够明显改善症状，对疾病可以起到缓解和治疗作用，在临床中已得到广泛应用。
蛋白A免疫吸附柱是目前在自身免疫性疾病治疗中用量最大、治疗效果最好的吸附柱。 
和 
是两种最常用的蛋白A类免疫吸附柱，二者均获得了美国食品药品管理局(FDA)认证，广泛用于治疗免疫球蛋白相关疾病。
蛋白A免疫吸附柱的关键成分是功能基蛋白A。蛋白A(Staphylococcus aureus proteinA，SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁的组分，占整个细胞壁蛋白的6.7%，以共价键的形式与胞壁肽聚糖相结合，分子量为42kDa，等电点pH 5.1，易被同位素碘所标记，对热和变性因子稳定，其分子含4个酪氨酸残基，无色氨酸。不含有半胱氨酸，所以分子中不含有二硫键。蛋白A分为三个部分：信号肽序列（S），五个高度同源的IgG结合结构域(E、D、A、B、C)以及锚定蛋白结构域（X）。蛋白A能与人及多种哺乳动物血清IgG中的Fc片段结合，但亲和性各不相同，具有种系选择性。此外，其还能与血清中少量的IgM和IgA结合。同时，蛋白A与人不同类型免疫球蛋白的结合能力也不同，其对IgG的结合率为95%(IgG1100%，IgG2100%，IgG4100%，IgG335%)，IgM 51%，IgA 14%，IgE 7%。ProteinA的结构域示意图（如图6）
然而蛋白A免疫吸附剂在30年的临床应用中也存在一些弊端，譬如其与人IgG3结合力较弱，对于一些致病抗体包含IgG3的疾病如系统性红斑狼疮、扩张性心肌炎等疾病效果不显著。为了克服重组蛋白A吸附剂的上述缺陷，本发明将一段与人IgG3具有较强结合能力的蛋白G的基因与蛋白A的抗体结合结构域基因相连接，实现AG融合蛋白的重组表达，进而制备的融合蛋白AG吸附剂将弥补蛋白A吸附剂对IgG3结合力弱的不足，提高其对系统性红斑狼疮、扩张性心肌炎等疾病的治疗效果。
链球菌蛋白G（Streptococcus protein G，SPG）是一种存在于A、C、G群链球菌的细胞壁的蛋白，完整的蛋白分子量为64～65kDa，对热比较稳定，分子结构中没有二硫键，呈长纤维状。蛋白G分子中包含两至三个序列高度同源的免疫球蛋白结合域（C1、C2、C3），位于分子的C末端，其单结构域由两对反向平行的β片层和中间的一个α螺旋组成。其分子中还包含有信号肽（S）、白蛋白结合结构域(A、B)以及细胞壁锚定蛋白结构域（W、M）。蛋白G具有与人和哺乳动物IgG结合的能力，与人IgG的4个亚类均具有较强结合能力，包括IgG3，但不与IgA、IgM、IgD和IgE结合。研究表明，完整的蛋白G分子可与人IgG的Fc片段以及Fab片段同时结合，还可与人血清白蛋白结合。蛋白G已广泛用作免疫学试剂，主要应用于免疫学探针以及IgG的纯化。Protein G的结构域示意图（如图7）。
可以看出，蛋白A与蛋白G在功能上具有互补性，两者的融合蛋白具有更好的结合特性，既可以弥补蛋白A对于IgG3结合力弱的不足，又可以弥补蛋白G不结合其它类型免疫球蛋白的不足，是更为理想的免疫球蛋白结合蛋白。融合蛋白AG结构示意图（如图8）。
1988年，Eliasson等人(Eliasson et al.Chimeric IgG-binding Receptors Engineered from Staphylococcal Protein A and Strptococcal Protein G.1988,263(9):4323-4327)首次利用大肠杆菌将蛋白A与蛋白G进行融合表达，得到了包含蛋白A信号肽、5个免疫球蛋白结合区以及蛋白G的3个免疫球蛋白结合区的融合蛋白。该蛋白相对于蛋白A和蛋白G具有更为广泛的免疫球蛋白结合谱，同时也具有更强的结合能力。具体结构如图9（A）所示，表达的融合蛋白（63kDa）在蛋白A和蛋白G之间含有一大段与免疫球蛋白结合无关的区域（11kDa）。另一种融合蛋白是将2个Z区域（将蛋白A的B区域进行改造得到，第30位氨基酸突变，F→A）与蛋白G的C1、C2和C3区域连接而得，结构如图9（B）所示，得到的融合蛋白ZZG虽然结合谱有所扩大，但是由于抗体结合区较少，对IgG的结合能力不如前一种融合蛋白。两种融合蛋白结构示意图（如图9）。
1992年，Sun和Lew（Sun and Lew.Chimaeric protein A/protein G and protein G/alkaline phosphatase as reportermolecules.1992,152:43-48）利用pGEX载体，构建了含有谷胱甘肽-S转移酶（GST）标签、蛋白A的5个免疫球蛋白结合区以及蛋白G的2个免疫球蛋白结合区的重组融合蛋白表达质粒，利用大肠杆菌进行表达。该融合蛋白结合谱较蛋白A或蛋白G广，但是由于加入了GST标签，导致该融合蛋白对血清中其他蛋白有非特异性吸附。一种融合蛋白结构示意图（如图10）。
1995年，APPLIED IMMUNE SCIENCES.INC利用化学合成方法合成了包含蛋白A的B区域及蛋白G的C3区域的蛋白SBG（21.7kDa），且含有部分锚定蛋白区域，具体结构如图11所示。这种融合蛋白获得了蛋白A和蛋白G的优点，但是抗体结合位点较少，片段较小， 吸附效果不如蛋白A或蛋白G(Chimeric Receptor Containing One IgG binding Domain Of ProteinAand Protein G.PCT/US94/09141)。一种融合蛋白结构示意图（如图11）
2004年，上海润龙生物科技有限公司以葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B、C，大消化链球菌蛋白L的B1、B2、B3、B4、B5（高度同源的IgG结合结构域，主要与免疫球蛋白的κ轻链可变区结合），C和G群链球菌蛋白G的C1、C2为结构单元，随机连接，构建重组免疫球蛋白结合分子文库。将该文库展示在噬菌体表面，并以免疫球蛋白对该文库进行3-4轮亲和筛选，获得一系列高亲和力免疫球蛋白结合分子，但是这种打乱结构单元进行重组的方法，破坏了蛋白A、蛋白G和蛋白L原有的免疫球蛋白结合位点的连续性，吸附效果并不十分理想。而且噬菌体展示技术也存在肽库容量较小、难以对毒性分子进行有效表达、肽库的多样性受限、氨基酸修饰受宿主菌限制等缺点(一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法，申请号200410067157.2)。
目前，商品化的用于抗体纯化的吸附材料主要有GE公司的蛋白A吸附材料和蛋白G吸附材料，以及将蛋白A和蛋白G一起共价交联到基质上的吸附材料（protein A+protein G，吸附量35mg IgG/mL胶）。另外，GenScript公司将一种融合蛋白AG固定于固相基质上，用于抗体的分离纯化（吸附量10mg IgG/mL胶），该融合蛋白含有4个蛋白A抗体结合区和2个蛋白G抗体结合区。这些吸附材料目前广泛应用于抗体纯化当中，而其在血液净化领域中的应用尚无报道。
发明内容
本发明是通过基因工程手段，将蛋白A和蛋白G的基因进行融合表达，即经过PCR扩增，连接T载体，双酶切得到编码蛋白A和蛋白G免疫球蛋白结合结构域的基因，然后一起连接到表达载体pET-23a上构成重组质粒，并转化大肠杆菌BL21（DE3），诱导表达后得到大量含有融合蛋白AG的菌体。通过超声破碎、高温加热、沉淀DNA、弱阴离子交换层析和亲和层析纯化融合蛋白AG，获得一种兼具蛋白A和蛋白G优点的融合蛋白。该蛋白可以与人不同亚类免疫球蛋白G选择性结合，且对血液中白蛋白等非免疫球蛋白物质的非特异性吸附低，结合谱更为广泛，弥补了蛋白A用于血液净化领域的不足。将其固定于固相基质表面，制备出一种用于治疗抗体类相关疾病的免疫吸附剂，此吸附剂可用于抗体的分离纯化以及血液净化领域治疗自身免疫性疾病。
本发明所采用的技术方案是：
本发明的一方面在于：公开一种融合蛋白AG基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示，大小为1470bp。
本发明的一方面在于：公开上述融合蛋白AG基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示。蛋白A和蛋白G之间只有2个氨基酸，既不影响融合蛋白的活性，又不会引起非特异性吸附。
本发明的一方面在于：公开一种重组表达融合蛋白AG基因的质粒，其以pET-23a为重组表达载体，插入上述SEQ ID NO：5所示的融合蛋白AG基因得到的重组表达质粒。
本发明采用高效表达载体pET系列进行表达，表达容易，表达量高，使得低成本、大规模生产成为可能。其中，将SEQ ID NO：5所示的融合蛋白AG基因插入到重组表达载体pET-23a中的具体操作过程，属于本领域技术人员能够掌握的常规技术，具体操作过程见实施例。
本发明的一方面在于：公开一种重组表达融合蛋白AG的重组菌株，将上述的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）得到的重组菌株。其中，转化的具体操作步骤，属于本领域技术人员能够掌握的常规技术，具体操作过程见实施例。
本发明的一方面在于：公开一种利用上述的重组菌株表达融合蛋白AG的方法，其包括如下步骤：利用重组表达载体pET-23a构建含有上述融合蛋白AG基因（即SEQ ID NO：5）的表达质粒；用该质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）宿主细胞，经过培养、筛选得到能够表达融合蛋白AG的重组菌株；IPTG诱导蛋白表达，分离并纯化所表达的蛋白。
分离并纯化所表达的蛋白之前，需要对能够表达融合蛋白AG的重组菌株进行发酵，然后离心收集菌体，再按照每克湿菌加入5mL裂解缓冲液（Tris-Cl，0.01mol/L，pH8.0）的比例进行裂解，超声破碎后，80℃加热处理10-30min，加入终浓度为0.08%-0.12%的PEI溶液沉淀DNA，10,000rpm离心15min收集上清液，并进行超滤换液，换液后分离并纯化所表达的蛋白，其详细的操作过程见实施例。由于此部分操作为本领域技术人员所具有的常规技术，因此未限定到权利要求书中。
具体的，在上述的重组菌株表达融合蛋白AG的方法中，其所述的纯化方法为DEAE弱阴离子交换层析法处理后，再进行IgG-Fc亲和层析。
DEAE弱阴离子交换层析法和IgG-Fc亲和层析法是应用于分离纯化蛋白的常用方法，其具体操作过程见实施例。
本发明的一方面在于：利用上述的方法制备的融合蛋白AG在抗体纯化、制备吸附介质、制备血液净化吸附剂等方面的应用。
本发明的一方面在于：公开一种融合蛋白AG吸附剂，其利用上述的方法制备的融合蛋白AG，将其作为配基连接到固相载体基质Sepharose CL 4B上制成吸附剂。该吸附剂解决了蛋白A吸附剂对IgG3结合力弱的不足，结合谱更为广泛，且对血清中白蛋白等非免疫球蛋白物质的非特异性吸附低，可用于抗体的分离纯化以及血液净化领域治疗自身免疫性疾病。
具体的，在上述的吸附剂中，制备吸附剂的配基键合量为2-10mg/mL胶。
具体的，在上述的吸附剂中，制备吸附剂的配基键合量为9-10mg/mL胶。
有益效果
本发明的优点在于：本发明公开的用于抗体纯化和血液净化的免疫吸附剂所使用的配基蛋白为重组表达的融合蛋白AG，其不含有蛋白A的信号肽和细胞壁锚定蛋白结构域，以及蛋白G的信号肽、白蛋白结合结构域和细胞壁锚定蛋白结构域，同时，蛋白A和蛋白G之间只有2个氨基酸，没有引入大段与免疫球蛋白结合无关的区域，从而在不影响活性的前提下，避免了非免疫球蛋白结合区引起的非特异性吸附，使其对于免疫球蛋白的结合更具有选择性。同时，本发明公开了上述免疫球蛋白结合蛋白的基因工程制备方法，采用高效表达载体pET系列进行表达，表达容易，表达量高，使得低成本、大规模生产成为可能。另一方面，融合蛋白AG含有较多的抗体结合区，对抗体有较好的结合能力，以融合蛋白AG为配基的免疫吸附剂可以更为广谱地结合免疫球蛋白，高载量的吸附血清中的抗体组分以及类风湿因子、抗核抗体等自身抗体，与现有技术相比，结合谱更广，结合力更强。同时，该吸附剂弥补了蛋白A对IgG3类抗体结合力弱的不足，可以用于血浆中自身抗体和免疫复合物的清除，并且对于一些致病抗体包含IgG3的疾病如系统性红斑狼疮、扩张性心肌炎等疾病的医治效果更为显著。
附图说明
图1为本发明构建的重组表达载体pET-23a-CPAG，是在载体pET-23a中连入蛋白A和蛋白G完整的抗体结合功能区基因。
图2PCR扩增编码蛋白A和蛋白G免疫球蛋白结合区域的基因，图中显示了spa和spg基因的大小分别在900bp和600bp左右，理论结果分别为917bp和615bp，实验结果与预期结果一致，而且PCR产物的纯度较高，特异性较好，没有非特异性条带。
图3高密度培养过程中，E coli BL21(DE3)（pET-23a-CPAG）的全菌体SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中泳道1为低分子量蛋白marker，泳道2为诱导前的蛋白表达，泳道3-9分别为诱导后2-6小时的蛋白表达。通过此方法，可以快速得到大量含有融合蛋白AG的菌体，具体密度可以达到60g/L(湿菌)，表达量在30%以上。表达的蛋白分子量大小约为54kDa，理论上融合蛋白AG的分子量为54336.6Da，与预期结果一致。
图4以融合蛋白AG和蛋白A为配基的吸附剂对血清中抗体的吸附效果比较，其中泳道1为低分子量蛋白marker，泳道2为融合蛋白AG免疫吸附剂作用后的血清样品，泳道3-4分别为蛋白A吸附剂作用后的血清样品，泳道5为不经任何作用的血清样品。融合蛋白AG 吸附剂对血清中免疫球蛋白的吸附效果与蛋白A吸附剂相比基本相同，都具有显著的去除效果，但是融合蛋白AG吸附剂的特异性好于蛋白A吸附剂。
图5以融合蛋白AG和蛋白A为配基的吸附剂对人血清各组分的吸附效果比较。结果表明本发明融合蛋白AG吸附剂对血清中各类型免疫球蛋白的吸附效果与蛋白A吸附剂相比，规律基本相同，都具有显著的去除效果，但是融合蛋白AG吸附剂在配基键合量摩尔数低于蛋白A吸附剂的情况下，对IgG具有更高的结合容量，这也体现在融合蛋白AG吸附剂对RF的吸附上。融合蛋白AG吸附剂在对于IgG3的去除上，明显弥补了蛋白A免疫吸附剂的不足。同时，对于IgA、IgM、IgE的去除，2种吸附剂相当，可以看出，融合蛋白AG吸附剂亦弥补了蛋白G不结合除IgG外其他免疫球蛋白的不足。在对C3、C4补体和人血清白蛋白的吸附上，两种吸附剂均未显示出非特异性吸附。
图6Protein A的结构域示意图。
图7Protein G的结构域示意图。
图8融合蛋白AG结构示意图。
图9两种融合蛋白结构示意图。
图10一种融合蛋白结构示意图。
图11一种融合蛋白结构示意图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本文实施例中所述的试剂、实验仪器等，如无特殊说明，均由常规途径购得或常规方法制备。实施例中，为方便描述也将融合蛋白AG缩写为CPAG。
实施例1：pET-23a-CPAG重组质粒的构建与鉴定
以pET-23a（商品信息：Biovec，USA）作为表达载体；蛋白A基因包括免疫球蛋白结合结构域E、D、A、B、C，不包含信号肽以及细胞壁锚定蛋白区域；蛋白G基因包括免疫球蛋白结合结构域C1、C2、C3，不包括信号肽、白蛋白结合结构域以及细胞壁锚定蛋白区域；下面以大肠杆菌BL21（DE3）作为表达宿主，进行具体介绍。
一、含有蛋白A基因和蛋白G基因的质粒的提取
含有蛋白A基因的质粒保存于E.coli BL21（DE3）-spa1中，菌株为本研究室保存（林雪，蛋白A的重组表达及重组菌的发酵过程优化，硕士论文）。含有蛋白G基因的质粒由中美泰和生物技术有限公司合成，保存于E.coli DH5α（pBSK-spg）中，菌株为本研究室保存（Olsson,A.,Eliasson,M.,et al.Structure and evolution of the repetitive gene encoding streptococcal protein G.Eur.J.Biochem.168(2),319-324(1987)PUBMED 3665928 GenBank:X06173.1）。质粒提取试剂盒 （Code：DV801A）购自宝生物工程（大连）有限公司。
含有蛋白A基因和蛋白G基因的质粒的提取方法参照宝生物工程（大连）有限公司生产的质粒提取试剂盒（Code：DV801A）说明书。以含有蛋白A基因的质粒（pET-23a-spa1）的提取为例，具体方法如下：
(1)大肠杆菌的培养。将含有pET-23a-spa1的大肠杆菌接种至含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠)中，37℃过夜培养。
(2)取1～4mL的过夜培养菌液，12,000rpm离心2分钟，弃上清。
(3)用250μL的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。
(4)加入250μL的Solution Ⅱ轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。
(5)加入400μL的4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。
(6)室温12,000rpm离心10分钟，取上清。
(7)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
(8)将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
(9)将500μL的Rinse A加入Spin Column中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。
(10)将700μL的Rinse B加入Spin Column中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。
(11)重复操作步骤10。
(12)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心1分钟。
(13)将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入60μL的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。
(14)12,000rpm离心1分钟洗脱DNA得到含有蛋白A基因的质粒（pET-23a-spa1）。
含有蛋白G基因的质粒（pBSK-spg）的提取方法同含有蛋白A基因的质粒的提取。
二、蛋白A基因（spa）的PCR扩增
根据NCBI中收录的金黄色葡萄球菌（ATCC6538）蛋白A（SPA）的序列（登录号：EU965225.1），利用生物学软件Primer Premier 5.0辅助设计引物。上游引物为序列SEQ ID NO：1所示的序列，含有Nde I酶切位点；下游引物为序列SEQ ID NO：2所示的序列，含有EcoRI酶切位点。
PCR过程使用的模板为步骤（一）提取的质粒pET-23a-spa1，使用的rTaq DNA聚合酶(Code：DR001A)等均购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。
具体反应体系如下：在0.2mL的PCR反应管中依次加入：
反应体系为20μL。94℃预变性5min后，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸10min。
三、蛋白G基因（spg）的PCR扩增
根据NCBI中收录的链球菌（G148）蛋白G（SPG）的序列（登录号：X06173.1），利用生物学软件Primer Premier 5.0辅助设计引物。上游引物为序列SEQ ID NO：3所示的序列，含有EcoR I酶切位点；下游引物为序列SEQ ID NO：4所示的序列，含有BamHI酶切位点。PCR过程使用的模板为步骤（一）提取的质粒pBSK-spg，使用的rTaq DNA聚合酶(Code：DR001A)等均购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。
反应体系：在0.2mL的PCR反应管中依次加入：
反应体系为20μL。94℃预变性5min后，94℃变性30s，44℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸10min。
四、琼脂糖凝胶电泳
1.0%的琼脂糖凝胶，用于PCR产物的电泳，琼脂糖加热溶解后，每20mL琼脂糖溶液加入1μLGoldview染料，摇匀后倒入模具冷却定型。取DNA 5μL与6×DNA凝胶加样缓冲液1μL混匀后，上样电泳。电压5V/cm，50min后，在凝胶成像分析系统中观察结果，结果如附图2所示，图中显示了spa和spg基因的大小分别在900bp和600bp左右，理论结果 分别为917bp和615bp，实验结果与预期结果一致，而且PCR产物的纯度较高，特异性较好，没有非特异性条带。
五、PCR产物的回收纯化
含有编码蛋白A和蛋白G免疫球蛋白结合区域的基因（分别为917bp和615bp）经过1%琼脂糖凝胶电泳后，进行回收，DNA回收试剂盒（Code：DV805A）购自宝生物工程（大连）有限公司。
含有蛋白A和蛋白G基因的DNA的回收方法参照宝生物工程（大连）有限公司生产的DNA纯化/回收试剂盒（Code：DV805A）说明书。具体方法如下：
(1)用浓度1.0%的琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其他DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀切下所要回收的DNA片段的琼脂块，放入1.5mL离心管中。
(2)称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg≈1μL进行计算。
(3)向胶块中加入3倍胶体积的DR-I buffer。75℃加热融化胶块，间断振荡混合，使胶块充分融化。
(4)向上述胶块融化液中加入DR-I buffer量的1/2体积量的DR-II buffer，均匀混合。
(5)将Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。
(6)将500μL的Rinse A加入Spin Column中，12,000rpm离心30s，弃滤液。
(7)将700μL的Rinse B加入Spin Column中，12,000rpm离心30s，弃滤液。
(8)重复(7)。
(9)将Spin Column安置于新的1.5mL离心管中，在Spin Column膜的中央处加入25μL的Elution Buffer，室温放置1min。
(10)12,000rpm离心1min洗脱DNA。
得到编码蛋白A和蛋白G免疫球蛋白结合区域的基因spa和spg。
六、T载体连接反应
采用宝生物工程(大连)有限公司生产的 
Simple Vector（Code：D103A）试剂盒，将上述步骤（五）纯化得到的目的片段spa、spg，分别与载体pMD18-T Vector以一定比例混合，16℃反应数小时构建重组质粒。反应体系分别如下：
16℃反应数小时。
16℃反应数小时。
七、转化及其鉴定
将步骤（六）获得的连接产物，分别加入大肠杆菌感受态细胞（购自宝生物工程(大连)有限公司，Code：D9057S）中，以热激法转化大肠杆菌，涂布于固体LB培养基表面(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂粉)，并于恒温培养箱中37℃恒温培养过夜。选取阳性菌落在恒温摇床中，37℃，180rpm扩大培养，然后提取质粒DNA，分别命名为pMD18-T-spa和pMD18-T-spg。
八、酶切连接反应
将上述提取得到的pMD18-T-spa和pMD18-T-spg两种质粒分别进行双酶切，同时将表达载体pET-23a进行双酶切。Nde I（Code：D1161A）、EcoR I（Code：D1040A）和BamHI（Code：D1010A）购自宝生物工程(大连)有限公司。酶切体系分别如下所示。
重组质粒pMD18-T-spa使用Nde I和EcoR I进行双酶切进行鉴定，反应体系如下：
酶切反应温度为30℃，时间为4h。
重组质粒pMD18-T-spg使用EcoR I和BamHI进行双酶切进行鉴定，反应体系如下：
酶切反应温度为30℃，时间为4h。
pET-23a表达载体使用Nde I和BamHI进行双酶切进行鉴定，反应体系如下：
酶切反应温度为30℃，时间为4h。
pMD18-T-spa、pMD18-T-spg和pET-23a双酶切后，进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，方法同上（四、琼脂糖凝胶电泳）。然后采用宝生物工程(大连)有限公司生产的DNA纯化/回收试剂盒（DV805A）进行纯化，方法同上（五、PCR产物的回收纯化）。纯化后的产物（分别为：spa、spg、pET-23a载体DNA）按照一定比例混合，用T4DNA连接酶在16℃下连接数小时。T4DNA连接酶（Code：D2011A）购自宝生物工程(大连)有限公司。连接反应具体体系如下：
16℃，反应过夜。
九、转化及其鉴定
将步骤（八）获得的连接产物加入大肠杆菌感受态细胞（购自宝生物工程(大连)有限公司，Code：D9057S）中，以热激法转化大肠杆菌DH5α，涂布于固体LB培养基表面，并于恒温培养箱中37℃恒温培养过夜。选取阳性菌落在恒温摇床中，37℃，180rpm扩大培养，然后提取质粒DNA。双酶切进行验证，产生了1500bp左右的条带。PCR进行验证，在1500bp左右有特异条带，效果较好。双酶切验证和PCR验证均确认与预期的蛋白A和蛋白G功能区核苷酸大小一致，大小为1470bp。将上述质粒送去宝生物工程(大连)有限公司测序验证核苷酸序列，确认与预期的蛋白A和蛋白G功能区核苷酸序列一致，将本表达质粒命名为pET-23a-CPAG，其中表达融合蛋白AG的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。将含有重组质粒的大肠杆菌命名为E.coli DH5α（pET-23a-CPAG）。
实施例2：融合蛋白AG的表达和纯化
采用宝生物工程（大连）有限公司生产的质粒提取试剂盒（Code：DV801A）提取质粒pET-23a-CPAG，并以热激法转化大肠杆菌BL21（DE3），涂布于固体LB培养基表面，并于恒温培养箱中37℃恒温培养过夜。在超净工作台中，使用接种环挑取多个阳性克隆，接种到含有20mL LB液体培养基的50mL三角瓶中，同时加入100mg/L的氨苄青霉素，37℃摇床培养过夜。将培养好的摇瓶种子以1%接种量接入装有2L发酵培养基的发酵罐中，37℃培养。培养过程中逐渐提高搅拌转速和通气量，维持溶氧水平>30%。当发酵液pH值和溶氧迅速上 升时，开始流加C源和N源（葡萄糖、酵母提取物）等营养物质。当OD600nm达到15-25时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至0.2mmol/L进行诱导，诱导时间约为2-6h。开始补料后通过氨水和2mol/L硫酸溶液控制pH6.0-8.0。通过此方法，可以快速得到大量含有融合蛋白AG的菌体，具体密度可以达到>60g/L(湿菌)，表达量在30%以上。具体表达结果如附图3所示，表达的蛋白分子量大小约为54kDa，理论上融合蛋白AG的分子量为54336.6Da，与预期结果一致。融合蛋白AG的氨基酸序列见SEQ ID NO：6。
发酵过程中所使用的溶液配方如下：
发酵后，6,000rpm离心5min收集菌体，然后按照5mL/g湿菌加入裂解缓冲液（Tris-Cl，0.01mol/L，pH8.0），并超声进行破碎。破碎后，80℃加热处理10-30min，加入终浓度为0.08%-0.12%PEI溶液沉淀DNA，10,000rpm离心15min收集上清液，并进行超滤换液。换液后通过DEAE弱阴离子交换层析和IgG-Fc亲和层析纯化融合蛋白AG。具体层析方法如下：
DEAE弱阴离子交换层析：
(1)洗胶：取偶联DEAE后的凝胶，依次用去离子水、0.1mol/L HCl溶液、0.1mol/L NaOH溶液、去离子水反复抽滤清洗，抽干后置于25mL锥形瓶内，加入去离子水使之成为悬浊液。
(2)装柱：使用AKTA purifier100层析系统，连接好管路后，使柱子和管路中充满去离子水。边放水边加入凝胶的悬浊液，使凝胶自然沉降，液面始终高于凝胶沉降面，防止胶体中进入气泡。胶体沉降好后，保持液面高于胶面2~3毫米，密封柱子。
(3)平衡：用Tris缓冲液（0.01mol/L，pH 8.0）平衡柱床，直到紫外检测器的示数不再变化为止。
(4)上样：将上述得到的洗滤后的溶液过滤上样。上样量控制在吸附载量的20%。
(5)冲洗：上样结束后，继续用Tris缓冲液（0.01mol/L，pH 8.0）冲洗5个柱床体积。
(6)洗脱：洗脱采用Tris缓冲液（0.01mol/L，pH 8.0）和Tris含盐缓冲液（0.01mol/L，含1mol/L NaCl，pH 8.0）线性洗脱，逐步洗脱柱子上吸附的蛋白，直到紫外检测器示数基本稳定，不再变化为止。回收洗脱液，测量体积。
亲和层析操作方法如下所述：
(1)洗胶：取偶联IgG-Fc后的凝胶（贾凌云专利，申请号：201010227638.0），依次用去离子水、柠檬酸缓冲液（0.1mol/L，pH 2.3，配制0.1mol/L柠檬酸和0.1mol/L柠檬酸钠溶液，两种溶液混合调节pH至2.3）、去离子水反复抽滤清洗，抽干后置于25mL锥形瓶内，加入去离子水使之成为悬浊液。
(2)装柱：连接好管路后，使柱子和管路中充满去离子水。边放水边加入凝胶的悬浊液，使凝胶自然沉降，液面始终高于凝胶沉降面，防止胶体中进入气泡。胶体沉降好后，保持液面高于胶面2~3毫米，密封柱子。管路前接恒流蠕动泵，后接紫外检测器（事先用平衡缓冲液预冲洗，经过光强和基线调整）。
(3)平衡：用PBS缓冲液（0.01mol/L，pH 7.4，配制0.01mol/L K2HPO4和0.01mol/LKH2PO4溶液，两种溶液混合调节pH至7.4）平衡柱床，直到紫外检测器的示数不再变化为止。
(4)上样：采用动态上样，即在柱床冲洗平衡后，以100cm/h的流速上样。当紫外检测器的示数迅速上升的时候，回收流穿液。
(5)冲洗：上样结束后，继续用PBS缓冲液冲洗柱床，直到紫外检测器示数基本稳定，不再变化为止，停止回收流穿液，测量流穿液体积。
(6)洗脱：采用一步洗脱方式，用柠檬酸缓冲液作为洗脱液，逐步洗脱柱子上吸附的蛋白，直到紫外检测器示数基本稳定，不再变化为止。回收洗脱液，测量体积。
实施例3：融合蛋白AG吸附剂的合成
将上述纯化的融合蛋白AG偶联到Sepharose CL 4B上，具体方法如贾凌云等人专利CN1367181 A所述实施例1-4，具体方法为Sepharose CL 4B（购自美国通用电气公司）为基质，经过环氧活化后连接双氨基试剂、戊二醛作为连接臂，然后偶联配基融合蛋白AG，经封闭和还原后合成吸附介质——融合蛋白AG吸附剂（CPAG-Sepharose）。通过控制融合蛋白AG的用量，控制吸附剂的配基键合量为2-10mg/mL胶。
实施例4：以融合蛋白AG和蛋白A为配基的吸附剂，对人血清各组分的吸附效果评价
配基键合量为9.93mg/mL胶的融合蛋白AG吸附剂用PBS缓冲液（0.01mol/L，pH 7.4，含0.9%NaCl）冲洗3次。评价方法为血清静态吸附（邳志前，抗体类吸附剂的合成过程优化及性能评价，硕士论文），称取吸附剂1mL加入到盛有2mL人血清（大连医科大学附属第二医院提供）的样品瓶中，37℃温育2小时。以Sepharose CL 4B作为空白对照，平行做3次。 抗体浓度采用免疫生化分析仪：SIEMENS：BN ProSpec(德国)测定。检测吸附前后血清样品中各组分的浓度，并与蛋白A吸附剂（SPA-Sepharose。蛋白A自制，33kDa，根据贾凌云专利制备，申请号：201010227290.5）进行比较，具体结果如表1、附图4和附图5所示。
表1CPAG-Sepharose和SPA-Sepharose对血清中组分吸附的比较
评价结果表明本发明融合蛋白AG吸附剂对血清中各类型免疫球蛋白的吸附效果与蛋白A吸附剂相比规律基本相同，都具有显著的去除效果，但是融合蛋白AG吸附剂在配基键合量摩尔数低于蛋白A吸附剂的情况下，对于IgG的去除率并没有比蛋白A吸附剂低，可以看出，融合蛋白AG吸附剂具有更高的结合容量，这也体现在融合蛋白AG吸附剂对RF的吸附上。融合蛋白AG吸附剂在对于IgG3的去除上，明显弥补了蛋白A免疫吸附剂的不足，效果明显优于蛋白A吸附剂。同时，对于IgA、IgM、IgE的去除，2种吸附剂相当，可以看出，融合蛋白AG吸附剂亦弥补了蛋白G不结合除IgG外其他免疫球蛋白的不足。在对C3、C4补体和人血清白蛋白的吸附上，两种吸附剂均未显示出非特异性吸附。融合蛋白AG结合了蛋白A和蛋白G功能的优势。另外，测定结果也表明融合蛋白AG吸附剂对血浆中非抗体组分，如白蛋白、胆固醇、补体、甘油三酯、脂蛋白等组分没有明显的吸附。
实施例5：以融合蛋白AG为配基的吸附剂，对不同个体人血清中RF和ANA的吸附效果评价
吸附剂用PBS缓冲液（0.01mol/L，pH 7.4，含0.9%NaCl）冲洗3次，评价方法为血清静态吸附，称取吸附剂1mL加入到盛有2mL血清的样品瓶中，37℃温育2小时。检测吸附前后血清样品中类风湿因子（RF）和抗核抗体（ANA）的浓度，具体结果如表2所示。
表2CPAG-Sepharose对血清中RF和ANA的去除效果
表2显示了融合蛋白AG吸附剂对8例个体中RF的去除效果和8例个体中ANA的去除效果。结果表明融合蛋白AG吸附剂对来源于不同患者，具有不同初始浓度的RF普遍具有较好的去除效果。8例被测样品中有5例的去除率大于80%，全部被测样品RF的去除率均大于70%，总体上融合蛋白AG吸附剂对RF显示了很好的吸附效果，而蛋白A吸附剂9例被测样品中有6例的去除率大于70%，去除率最低的为54.2%（邳志前,抗体类吸附剂的合成过程优化及性能评价，硕士论文)。另外表2也表明融合蛋白AG吸附剂对来源于不同患者，具有不同初始浓度的ANA普遍具有较好的去除效果。8例被测样品中有5例ANA转为阴性，蛋白A吸附剂14例被测样品全部转化为阴性（邳志前,抗体类吸附剂的合成过程优化及性能评价)。可能是样品中ANA的含量高于融合蛋白AG吸附剂对于ANA的吸附容量，从数据中也可看出，吸附前ANA滴度在1∶1000的样品，吸附后均变为阴性，而1∶3200的样品，均有ANA的残留，对于这种情况，可以考虑提高配基键合量，到达更好的去除效果。此外，由于血清体系的复杂性，不同个体间血清环境的差异也会对ANA的去除效果产生一定的影响。但总体上融合蛋白AG吸附剂对ANA显示了较好的吸附效果。预示着融合蛋白AG吸附剂对于类风湿性关节炎（RA）和系统性红斑狼疮（SLE）会有较好的效果。
Claims (2)
1.一种融合蛋白AG 基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO ：5 所示。
2.如权利要求1 所述的融合蛋白AG 基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ IDNO ：6 所示。
3. 一种重组表达融合蛋白AG 基因的质粒，其特征在于：以pET-23a 为表达载体，插入权利要求1 所述的融合蛋白AG 基因得到的重组表达质粒。
4. 一种重组表达融合蛋白AG 的重组菌株，其特征在于：由权利要求3 所述的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) 得到的重组菌株。
5. 利用权利要求4 所述的重组菌株表达融合蛋白AG 的方法，其特征在于：包括如下步骤：利用表达载体pET-23a 构建含有权利要求1 所述融合蛋白AG 基因的重组表达质粒；用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) 宿主细胞，经过培养、筛选得到能够表达融合蛋白AG 的重组菌株；培养该菌株，IPTG 诱导蛋白表达；分离并纯化所表达的蛋白。
6. 根据权利要求5 所述的重组菌株表达融合蛋白AG 的方法，其特征在于：所述的纯化方法为DEAE 弱阴离子交换层析法处理后，再进行IgG-Fc 亲和层析。
7. 利用权利要求5 所述的方法制备的融合蛋白AG在抗体纯化、制备吸附介质或制备血液净化吸附剂方面的应用。
8. 一种融合蛋白AG 吸附剂，其特征在于：利用权利要求5 所述的方法制备的融合蛋白AG，将其作为配基连接到固相载体基质Sepharose CL 4B 上制成吸附剂。
9. 根据权利要求8 所述的吸附剂，其特征在于：其中，制备吸附剂的配基键合量为2 ～10mg/mL 胶。
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