CN107435045B - 一种优化重组人白细胞介素-2的核苷酸序列及高效可溶性表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种优化重组人白细胞介素‑2的核苷酸序列,所述核苷酸序列为在不改变氨基酸编码序列的情况下按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化,所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,或其互补核苷酸序列。更进一步地,构建了所述核苷酸序列的表达载体、工程菌,并在工程菌中表达重组人白细胞介素‑2;表达的重组人白细胞介素‑2总菌体蛋白的10%‑30%,可溶性表达量占总表达量的3%‑15%。本发明降低了重组人白细胞介素‑2包涵体的量,提高了可溶性蛋白的表达量,为大量生产可溶性重组人白细胞介素‑2创造了条件。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,具体地说,涉及一种优化重组人白细胞介素-2的核苷酸序列及高效可溶性表达方法。
背景技术
白细胞介素-2(Interleukine-2,IL-2),是由白细胞分泌的一种糖蛋白,可介导细胞间的相互作用,在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用。IL-2是机体免疫调节网络中的核心物质,与其他细胞因子有协同和拮抗作用,共同完成机体免疫机能的平衡调节作用;能刺激NK细胞、CTL、LAK细胞的活化和增殖,也能促使T淋巴细胞、NK细胞产生干扰素、肿瘤坏死因子等。所以IL-2作为一种具有广泛生物学活性的细胞因子,在抗病毒、抗细菌感染和抗肿瘤等疾病治疗中被广泛应用。
重组人白细胞介素-2(Recombinant Human Interleukin-2,rhIL-2),以大肠杆菌作为宿主表达虽然取得了很大成功,但是其表达形式均为包涵体,要获得具有生物活性的rhIL-2,需要后续变性、复性等复杂的一系列步骤。rhIL-2含有3个半胱氨酸残基,分别位于第58、105和125位,125位为游离状,复性时二硫键容易错配,而正确的二硫键对于IL-2活性的保持是必需的。另外,rhIL-2具有较强的疏水性,在复性时极易形成聚集体而沉淀,进一步降低了复性效率。由于rhIL-2的原核表达形式为包涵体,且复性效率低,这一缺点成了工业化生产的一个瓶颈,严重限制了工业化的大规模生产。倘若能够提高rhIL-2的可溶性,甚至不产生包涵体,则能够减少步骤,同时大大降低二硫键的错配率,获得活性高的rhIL-2。
申请号为CN93112388.7的中国专利公开了一种人白细胞介素-2的基因合成、表达质粒的构建及产物的生产工艺,通过构建带有天然白细胞介素-2基因的表达质粒,在大肠杆菌中高效表达,表达量达菌体总蛋白的30—40%。本发明还建立了一种高效的包涵体分离技术和获得高比活的白细胞介素-2纯化方法。该技术选用了大肠杆菌使用频率高的密码子,使合成的IL-2基因能在大肠杆菌中高效表达,产生大量的人Il-2,而不改变IL-2的氨基酸顺序;提高了白细胞介素-2在大肠杆菌中的表达量,在制得纯净的包涵体后进行纯化,仍然存在包涵体复性效率低的问题,并未对提高白细胞介素-2的可溶性做出贡献。
申请号为CN201210584912.9的中国专利提供了一种重组猪白细胞介素2及其编码基因、表达、纯化和包涵体复性方法,采用大肠杆菌表达系统对密码子优化后的重组猪白细胞介素2基因进行异源表达。此外,由于原核表达体系中的猪白细胞介素2多以包涵体的形式表达,该发明还提供了重组白细胞介素2包涵体纯化方法,并对该包涵体的复性方法进行了筛选。最终该发明所得重组白细胞介素2活力为1.05×107IU/ml。该技术筛选了包涵体的复性方法,但步骤仍复杂,仍存在错配的缺陷,也并未对提高白细胞介素-2的可溶性做出贡献。
因此本领域迫切需要提供一种能够在大肠杆菌系统高效可溶性表达重组人白细胞介素-2的方法。有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足,提供一种优化重组人白细胞介素-2的核苷酸序列及高效可溶性表达方法,核苷酸序列在不改变氨基酸编码序列的情况下按照大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化,大大提高了表达蛋白的可溶性;在工程菌中表达,降低了重组人白细胞介素-2包涵体的量,提高了可溶性蛋白的表达量,可以为大量生产可溶性重组人白细胞介素-2创造条件。
为解决上述技术问题,本发明采用技术方案的基本构思是:
本发明的第一目的是提供一种优化重组人白细胞介素-2的核苷酸序列,所述核苷酸序列为在不改变氨基酸编码序列的情况下进行密码子优化,所述核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示,或其互补核苷酸序列。
利用基因工程手段,将天然的人白细胞介素-2的核苷酸序列在大肠杆菌等宿主中进行表达已经有多项研究,这些研究也多致力于提高人白细胞介素-2的表达量,但产生的形式均为包涵体。而包涵体存在多种缺点:①表达量低;②纯化困难,包涵体需要变性、复性,纯化步骤多且复杂;③活性低,由于多为包涵体表达,其蛋白未能正确折叠,活性低,且复性过程效率低、易产生错配,进一步降低了活性。
而本发明在不改变氨基酸编码序列的情况下按照大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化,选择适合的密码子以及密码子组合来重组人白细胞介素-2降低蛋白合成的速度,可以增进蛋白的正确折叠,减少包涵体的形成,从而提高可溶性蛋白的表达量。本发明经过多次试验,将同一位置的碱基变为与其不同碱基,并将各位置不同的优化方案进行结合,人工合成多条重组人白细胞介素-2核苷酸序列(至少3条,在此不一一列出),构建载体进行表达,结果发现尽管均利用大肠杆菌的密码子偏好性进行优化,但合成的多条重组人白细胞介素-2核苷酸序列表达的效果大相径庭。本发明经过筛选,获得了可溶性蛋白表达量大大提高的核苷酸序列,即如SEQ ID NO:1所示得核苷酸序列。
本发明优化的重组人白细胞介素-2,与天然人白细胞介素-2的核苷酸序列的同源性为78%,编码的氨基酸序列相同。将本发明的核苷酸序列构建载体,转化筛选得到工程菌,培养诱导,分离纯化可以得到重组人白细胞介素-2。经活性测定后发现生物活性提高,可溶性蛋白表达量提高。
所述核苷酸序列在大肠杆菌中表达的重组人白细胞介素-2占总菌体蛋白的10%-30%,可溶性表达量占总表达量的3%-15%。
本发明的重组人白细胞介素-2核苷酸序列根据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化,适于在大肠杆菌中表达,可溶性表达量占总表达量的3%-15%,优选可以达到9%-15%,与现有技术相比,重组人白细胞介素-2可溶性蛋白表达量大大提高。
本发明的第二目的是提供一种载体,所述载体包括所述的核苷酸序列。
本发明提供的载体,可以为克隆载体、表达载体、整合载体等,包含本发明优化的重组人白细胞介素-2核苷酸序列。如本发明具体实施方式中采用了pET21a载体,包括诱导型启动子Ptac,氨苄青霉素筛选标记。
进一步地,所述的载体为表达质粒,还包括烟草花叶病毒Ω前导序列。
全长68bp的烟草花叶病毒(TMV)前导序列(Ω)具有极为有序的一级结构。Ω序列能显著改善在大肠杆菌内表达的多结构域、多二硫键的重组蛋白的可溶性,增加正确折叠蛋白的比例并减少包涵体的形成。通过减慢蛋白质合成的速度而提高蛋白质折叠的效率,从而增加表达产物的可溶性和有生物活性的产物的产量。本发明在重组人白细胞介素-2的表达载体上插入烟草花叶病毒Ω前导序列,能够进一步增进重组人白细胞介素-2蛋白的正确折叠,更进一步提高可溶性蛋白的表达量。
本发明的第三目的是提供一种工程菌,所述工程菌为具有所述的载体的大肠杆菌。
大肠杆菌为重组人白细胞介素-2表达的主要宿主,本发明的优化的重组人白细胞介素-2核苷酸序列能够在大肠杆菌中高效表达。
进一步地,所述大肠杆菌为BL21(DE3)菌株。
本发明的第四目的是提供一种重组人白细胞介素-2在大肠杆菌中的表达方法,包括以下步骤:
(1)在合适的培养条件下,于培养基中培养具有所述载体的大肠杆菌;
(2)从培养后的大肠杆菌和/或培养基中回收并纯化重组人白细胞介素-2。
进一步地,步骤(1)中所述的大肠杆菌的单菌落,接入LB培养液中过夜活化;然后转接含有抗生素的2YT培养液,37℃震荡培养至OD600=0.5-0.8;加入诱导剂,在合适的诱导蛋白条件下培养。
本发明挑选一个含有上述载体的大肠杆菌单菌落,接入50ml的LB培养液,在250ml摇瓶中37℃震荡培养过夜至对数中后期,这样对菌株进行活化;然后转接入营养更丰富的含有氨苄青霉素的2YT培养液中,37℃震荡培养至OD600=0.5-0.8,此时,处于对数中期,菌体生长状态最旺盛,此时加入诱导剂诱导培养以便于重组人白细胞介素-2的表达。
进一步地,所述合适的诱导蛋白条件包括:培养具有所述载体的大肠杆菌时,用1.0mM的IPTG在15℃-37℃条件下诱导4-20h,优选用1.0mM的IPTG在15℃条件下诱导20h。
在诱导蛋白表达时,降低发酵菌的生长温度,较低的生长温度可以降低无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用,从而可减少包涵体的形成。本发明的优化的重组人白细胞介素-2核苷酸序列在低温诱导条件下,可溶性蛋白的表达量进一步提高。
本发明步骤(1)诱导完成后,离心收集菌体,将菌体洗涤两次,悬浮于20ml 20mMPB(pH7.0)中;样品置于冰上,超声破碎仪中破碎,然后进行纯化。
进一步地,步骤(2)中所述纯化重组人白细胞介素-2包括阳离子交换层析和疏水层析两步纯化。
更进一步地,所述阳离子交换层析纯化包括:收集菌体后超声破碎,将上清,用磷酸调至pH6.0,0.45μm滤膜过滤,然后上样至平衡好的CM柱上,上样完毕后,缓冲液洗去未结合蛋白,洗脱液线性梯度洗脱,收集洗脱峰;
所述疏水层析纯化包括:将经CM柱层析收集的样品,用H3PO4调pH3.5,上样至平衡好的Pheny CM柱上,上样完毕,用pH3.5的H3PO4-H2O洗去杂蛋白,洗脱液线性梯度洗脱,收集洗脱峰,得到纯化后的重组人白细胞介素-2。纯化得到的重组人白细胞介素-2可以进行生物学活性分析。
采用上述技术方案后,本发明与现有技术相比具有以下有益效果:
(1)本发明的优化的重组人白细胞介素-2的核苷酸序列,适合在大肠杆菌中表达,在不改变氨基酸编码序列的情况下,提高了表达蛋白的可溶性,降低了包涵体的形成;
(2)采用低温表达诱导的重组人白细胞介素-2,可自然正确折叠,可溶性高,生物学活性强,为大量生产可溶性重组人白细胞介素-2创造了条件。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分,用来提供对本发明的进一步的理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,但不构成对本发明的不当限定。显然,下面描述中的附图仅仅是一些实施例,对于本领域普通技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中:
图1是本发明重组人白细胞介素-2优化前后核苷酸序列比较;其中,“原始序列”对应的行为人白细胞介素-2天然核苷酸序列,“优化序列”对应的行为本发明优化后的重组人白细胞介素-2核苷酸序列。
图2是本发明实施例四的重组人白细胞介素-2(SEQ ID NO:1编码)在不同诱导温度下的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图;其中,M,预染的蛋白上样maker(14.4-116KD),T,诱导后总蛋白;S,诱导后可溶蛋白;I,诱导后不溶蛋白。
图3是本发明实施例五优化的重组人白细胞介素-2的CM柱层析纯化和Pheny柱层析纯化的结果;其中,a为A280,即蛋白峰;b为A260。
图4是本发明实施例五两次纯化的目的蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图;其中,1,第一步纯化,CM柱层析纯化;2,第二步纯化,Pheny柱层析纯化。
图5是rhIL-2刺激CTLL-2细胞的增殖的生长曲线图;其中,待检品为纯化的重组人白细胞介素-2。
图6是本发明对比例一的天然人白细胞介素-2(SEQ ID NO:2编码)在不同诱导温度下的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图;其中,M,预染的蛋白上样maker(14.4-116KD),T,诱导后总蛋白;S,诱导后可溶蛋白;I,诱导后不溶蛋白。
图7是本发明试验例二的重组人白细胞介素-2(SEQ ID NO:3编码)在不同诱导温度下的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图;其中,M,预染的蛋白上样maker(14.4-116KD),T,诱导后总蛋白;S,诱导后可溶蛋白;I,诱导后不溶蛋白。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例一重组人白细胞介素-2核苷酸序列的密码子优化
重组人白细胞介素-2核苷酸序列是基于NCBI(LOCUS:NM_000586),去掉信号肽序列,在保证氨基酸序列不变的情况下,考虑mRNA二级结构自由能及稳定性、影响表达的基序等,替换并使用E.coli中偏爱密码子优化基因序列,然后进行全基因合成。
重组人白细胞介素-2核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技公司合成,具体序列如SEQ ID NO:1所示;所合成的核苷酸序列全长405bp,构建在克隆载体中测序验证正确。与天然人白细胞介素-2基因(具体序列如SEQ ID NO:2)相比,本发明所合成的重组人白细胞介素-2核苷酸序列,将天然人白细胞介素-2基因中的部分密码子改为大肠杆菌偏好密码子,但是没有涉及到氨基酸的改变(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示),属同义突变,与天然人白细胞介素-2核苷酸序列的同源性为76.79%。
实施例二重组表达载体的构建
载体与试剂:载体pET21a和菌种DH5α均由江苏大学谭小力教授惠赠;限制性内切酶、DNA marker均购于大连宝生物工程有限公司。
pET21a包括氨苄青霉素筛选标记、诱导型启动子Ptac、多克隆位点。将带有405bp优化的rhIL-2序列的克隆载体及pET21a质粒分别使用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切,将两个片段用T4连接酶进行连接,得到pET21a/rhIL-2质粒,rhIL-2插入pET21a的多克隆位点中,上游为Ptac。将连接产物用热激发转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选克隆,小量制备质粒,通过双酶切及测序鉴定筛选阳性克隆。
本发明中,所有经PCR鉴定为阳性的质粒,送上海生工生物有限公司进行测序,测序正确的加甘油冷冻保存,并进行下一步实验。
实施例三高效可溶性表达工程菌的筛选获得及诱导培养
(1)实施例二中获得的重组质粒转化进入宿主菌,即大肠杆菌BL21(DE3),也就是本发明的工程菌,氨苄青霉素固体培养基平板上筛选获得阳性转化子。
(2)挑选一个阳性转化子,接入50ml的LB培养液,在250ml摇瓶中37℃震荡培养过夜至对数中后期,即过夜活化,1:100(v/v)接种于50ml 2×YT液体培养基中(含0.1mg/ml氨苄青霉素),37℃摇床培养至OD600=0.6;
(3)加入诱导剂IPTG,使其终浓度为1mM;分别于不同条件下培养(A、37℃摇床培养4h;B、25℃摇床培养6h;C、15℃摇床培养20h);离心收集菌体,弃上清,菌体用ddH2O洗涤2次,-20℃保存备用。
实施例四优化的重组人白细胞介素-2的表达定位分析
将诱导后收集的菌体,悬浮于20ml 20mM PB(pH7.0)中;样品置于冰上,超声破碎仪中破碎,条件为:工作5s,停止10s,共30min。镜检90%以上细胞破碎;破碎后样品,取50ul留样作为总蛋白进行SDS-PAGE检测;剩余样品12000rpm,离心30min;取出上清,作为可溶蛋白进行SDS-PAGE检测;沉淀悬浮于20ml(等体积)20mM PB(pH7.0)中,作为不可溶蛋白进行SDS-PAGE检测。SDS-PAGE检测结果如图2所示。
结合图2,工程菌在37℃、25℃和15℃条件下诱导后可溶性rhIL-2表达量分别为6.0%、6.5%和9.4%,在低温诱导时目的蛋白有较大的可溶性表达量。
实施例五优化的重组人白细胞介素-2的纯化
将超声破碎后上清,用磷酸调pH6.0,0.45μm滤膜过滤;以10ml/min流速上样至平衡好的CM柱上;上样完毕,5个柱体积平衡Buffer(20mmol/L PB pH6.0)洗去未结合蛋白;10ml/min流速,0-100%洗脱液B线性梯度洗脱(洗脱液A:20mmol/L PB pH7.0,洗脱液B:20mmol/L PB+0.5mol/L NaCl,pH7.0),收集洗脱峰。
将经CM柱层析收集的样品,用H3PO4调pH3.5,上样至平衡好的Pheny CM柱上,流速为5ml/min;上样完毕,用H3PO4-H2O(pH3.5)平衡3个柱体积洗去杂蛋白;5ml/min流速0-100%洗脱液B,线性梯度洗脱(洗脱液A:H3PO4-H2O pH 3.5,洗脱液B:100mM PB,pH 7.0),收集洗脱峰。
纯化结果如图3所示,收集到的洗脱峰,经SDS-PAGE检测,如图4所示。结合图3可知,经CM柱纯化后,已去掉了大部分杂蛋白,目的蛋白纯度达到75.6%;通过Pheny柱进行第二步纯化,目的蛋白纯度可达99.5%。
实施例六重组人白细胞介素-2生物学活性分析
运用CTLL-2细胞/MTT比色法,根据2010版药典附录XD所述方法,对纯化后的rhIL-2进行生物学活性分析。生物学活性分析结果如图5所示。
采用IL-2依赖型细胞株CTLL-2,以标准品IL-2为阳性对照,对纯化后的rhIL-2进行了生物学活性测定。结果显示,rhIL-2和标准品IL-2一样,可以有效刺激CTLL-2细胞的增殖(如图5),说明本研究表达并纯化到的rhIL-2具有生物学活性。经计算,纯化后的rhIL-2比活性为2.1×107IU/mg。
对比例一
按照实施例二的方法,构建天然人白细胞介素-2的表达载体;按照实施例三的方法,获得天然人白细胞介素-2表达的工程菌,并在同条件下诱导培养;按照实施例四的方法,对天然人白细胞介素的表达的进行表达定位分析。SDS-PAGE检测结果如图6所示。
结合图2和图6,优化的重组人白细胞介素-2工程菌在37℃、25℃和15℃条件下诱导后可溶性rhIL-2表达量分别为5.4%、6.5%和9.4%,在低温诱导时目的蛋白有较大的可溶性表达量,经计算,纯化后的rhIL-2比活性为2.1×107IU/mg。
天然人白细胞介素-2的工程菌在37℃、25℃和15℃条件下诱导后可溶性rhIL-2表达量分别为1.8%、2.4%和2.7%,经计算,纯化后的rhIL-2比活性为0.9×107IU/mg。
因此,优化的重组人白细胞介素-2的可溶性蛋白表达量和纯化后rhIL-2比活性均高于天然人白细胞介素-2。可以说本发明的优化的重组人白细胞介素-2核苷酸序列大大提高了可溶性蛋白的表达量。
对比例二
本对比例与对比例一的区别在于构建的载体具有优化的重组人白细胞介素-2和烟草花叶病毒Ω前导序列,其余方法均相同。与实施例的工程菌同时培养,进行表达定位分析。
优化的重组人白细胞介素-2工程菌在37℃、25℃和15℃条件下诱导后可溶性rhIL-2表达量分别为5.4%、6.5%和9.4%,本对比例的工程菌在37℃、25℃和15℃条件下诱导后可溶性rhIL-2表达量分别为7.1%、8.3%和11.2%,因此,在含有本发明的优化的重组人白细胞介素-2核苷酸序列的载体基础上,再添加烟草花叶病毒Ω前导序列,可以进一步提高可溶性蛋白的表达量。
试验例一
按照实施例四方法诱导培养工程菌,在不同时期进行诱导,进行SDS-PAGE检测,可溶性表达量列于表1。
表1目的蛋白可溶性表达量结果
表1说明,总体而言,优化的重组人白细胞介素-2均有可溶性蛋白的表达。受培养条件和诱导条件的影响,可溶性蛋白的表达量会不同。如在不同时期的诱导会影响诱导蛋白的表达,过早时(OD600=0.4),对菌体生长产生毒害影响,目的蛋白的表达会稍受影响,过晚时(OD600=1.0),菌体活力降低,蛋白表达量相应降低。因此,本发明选择OD600=0.5-0.8范围内进行诱导。
试验例二
本试验例的重组人白细胞介素-2核苷酸序列也是在保证氨基酸序列不变的情况下,考虑mRNA二级结构自由能及稳定性、影响表达的基序等,替换并使用E.coli中偏爱密码子优化基因序列,然后进行全基因合成。
本试验例的重组人白细胞介素-2核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技公司合成,与实施例一的区别在于,优化重组的序列中替换并使用的密码子不同,本试验例的具体序列如SEQ IDNO:3所示;所合成的核苷酸序列全长405bp,构建在克隆载体中测序验证正确,与SEQ IDNO:1的同源性为88.64%。载体、工程菌的构建,工程菌的培养、诱导,重组人白细胞介素-2的纯化、生物学活性分析等方法,与实施例二到实施例六的方式相同。SDS-PAGE检测结果如图7所示。
将实施例一和试验例一优化的重组人白细胞介素-2进行表达定位分析和生物学活性分析,结果列于表2。
表2不同的优化重组人白细胞介素-2的可溶性表达量和酶活性分析
由表2,结合图2和图7可知,实施例一的优化重组人白细胞介素-2的可溶性表达量和酶活性均高于试验例一,说明尽管两条序列均按照E.coli中偏爱密码子进行优化,但效果大为不同,实施例一的序列SEQ ID NO:1的优化效果比SEQ ID NO:3更好。进一步说明本发明的优化重组人白细胞介素-2的优化效果良好,大大提高了目的蛋白的可溶性表达。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (10)
1.一种优化重组人白细胞介素-2的核苷酸序列,其特征在于,所述核苷酸序列为在不改变氨基酸编码序列的情况下进行密码子优化,所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,或其互补核苷酸序列;所述核苷酸序列在大肠杆菌中表达的重组人白细胞介素-2占总菌体蛋白的10%-30%,可溶性表达量占总表达量的3%-15%。
2.一种载体,其特征在于,所述载体包括权利要求1所述的核苷酸序列。
3.一种工程菌,其特征在于,所述工程菌为具有权利要求2所述的载体的大肠杆菌。
4.根据权利要求3所述的工程菌,其特征在于,所述大肠杆菌为BL21(DE3)菌株。
5.一种重组人白细胞介素-2在大肠杆菌中的表达方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)在合适的培养条件下,于培养基中培养如权利要求3或4所述的工程菌;
(2)从培养后的大肠杆菌和/或培养基中回收并纯化重组人白细胞介素-2。
6.根据权利要求5所述一种重组人白细胞介素-2在大肠杆菌中的表达方法,其特征在于,步骤(1)中将权利要求4或5中所述的工程菌的单菌落,接入LB培养液中过夜活化;然后转接含有抗生素的2YT培养液,37℃震荡培养至OD600=0.5-0.8;加入诱导剂,在合适的诱导蛋白条件下培养。
7.根据权利要求6所述一种重组人白细胞介素-2在大肠杆菌中的表达方法,其特征在于,所述合适的诱导蛋白条件包括:培养权利要求4或5中所述的工程菌时,用1.0mM的IPTG在15℃-37℃条件下诱导4-20h。
8.根据权利要求7所述一种重组人白细胞介素-2在大肠杆菌中的表达方法,其特征在于,用1.0mM的IPTG在15℃条件下诱导20h。
9.根据权利要求5所述一种重组人白细胞介素-2在大肠杆菌中的表达方法,其特征在于,步骤(2)中所述纯化重组人白细胞介素-2包括阳离子交换层析纯化和疏水层析纯化两步纯化。
10.根据权利要求9所述一种重组人白细胞介素-2在大肠杆菌中的表达方法,其特征在于,所述阳离子交换层析纯化包括:收集菌体后超声破碎,将上清用磷酸调至 pH6.0,0.45μm滤膜过滤,然后上样至CM柱上,上样完毕后,缓冲液洗去未结合蛋白,洗脱液线性梯度洗脱,收集洗脱峰;
所述疏水层析纯化包括:将经 CM 柱层析收集的样品,用 H3PO4调 pH3.5,上样至PhenyCM柱上,上样完毕,用pH3.5的H3PO4-H2O洗去杂蛋白,洗脱液线性梯度洗脱,收集洗脱峰,得到纯化后的重组人白细胞介素-2。
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