CN107556376B - 一种干扰素α-2b突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干扰素α‑2b突变体及其制备方法和应用，天然的干扰素α‑2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为脂肪族类氨基酸，和/或，从N端计第110位的亮氨酸突变为杂环氨基酸，所述的脂肪族类氨基酸选自蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的一种，所述的杂环氨基酸选自脯氨酸、组氨酸和色氨酸中的一种。本发明提供的干扰素α‑2b突变体的比活性高、稳定性好、体内半衰期大大延长，可以提高患者使用干扰素药物的依从性，血药浓度波动小，也进一步提高了疗效。

Description

一种干扰素α-2b突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于干扰素领域，具体地说，涉及一种干扰素α-2b突变体及其制备方法。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是人和动物细胞受到病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等多种因素诱导后，由受体细胞分泌的一类细胞因子，具有广谱抗病毒及免疫调节等作用；1957年由Isaacs和JeanLindenmann首先发现。目前，根据干扰素的产生细胞、受体和活性等综合因素一般将干扰素分为Ⅰ型、Ⅱ型和III型三类，Ⅰ型干扰素主要包括IFN-α和IFN-β，Ⅱ型只包括IFN-γ，III型干扰素包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3。

自发现干扰素以来，由于其广谱抗病毒、抗肿瘤以及强大的免疫调节作用而成为免疫学、病毒学、细胞生物学、分子生物学、临床医学、肿瘤学等相关领域的研究热点。同时，干扰素作为生物体内基因自身稳定的一个系统，奠定了在生物学研究中的地位。目前已知除抗病毒活性外，IFN还具有免疫调节、抑制细胞增殖、抗肿瘤生长、与多种淋巴因子协同作用等多种重要的生物功能。

干扰素α2b(Interferonα2b，IFNα2b)作为一种具有广泛生物学活性的细胞因子，在抗病毒、抗细菌感染和抗肿瘤等治疗中被广泛应用。目前，在临床上IFNα2b已被广泛应用于HPV感染，慢性髓系白血病和肾癌等的治疗，并取得了显著的效果。

但是天然的干扰素α2b体内半衰期比较短，一般t1/2只有1.5-2.0个小时左右，因此临床应用需要反复给药，患者依从性比较差；而且因为半衰期短而导致血药浓度波动大，导致疗效不佳。

延长干扰素半衰期的方法主要有PEG修饰、白蛋白融合等技术。目前已开发上市的聚乙二醇干扰素α-2b制剂，半衰期可达40～65h。但是，PEG的修饰也存在扩散速度受限和生物活性低等问题。同样，白蛋白融合干扰素蛋白分子更大，也存在药物自血液向目标组织的输送速度受到限制的问题。因此，如何提高干扰素α-2b的稳定性，延长其半衰期是本领域急需解决、有重要意义的问题。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种干扰素α-2b突变体及其制备方法和应用，本发明提供的干扰素α-2b突变体的比活性高、稳定性好、体内半衰期大大延长，可以提高患者使用干扰素药物的依从性，血药浓度波动小，也进一步提高了疗效。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种干扰素α-2b突变体，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为其它的脂肪族类氨基酸，和/或，从N端计第110位的亮氨酸突变为杂环氨基酸。

天然干扰素α-2b体内半衰期比较短，临床应用需要反复给药，患者依从性比较差，而采用PEG修饰、白蛋白融合等技术延长其半衰期的方式又存在药物自血液向目标组织的输送速度受到限制的问题、生物活性较低等问题。

本发明的IFNα-2b突变体氨基酸序列的设计，是根据IFNα2b已知空间结构、受体结合位点及与受体结合原理，通过计算机模拟突变分子的空间结构及进化差异，保证空间结构变化不明显和进化差异较小的条件下，选择了第18位赖氨酸Lys和第110位亮氨酸Leu分别或同时替换为其它的氨基酸，来提高干扰素IFNα-2b的稳定性。

经过多次尝试和大量的试验，申请人惊喜的发现IFNα2b氨基酸序列中从N端计的第18位赖氨酸突变为除了赖氨酸以外的一种或者几种脂肪族氨基酸，同时或者分别将110位的亮氨酸Leu突变为杂环氨基酸得到的IFNα2b突变体的安全性高，同时生物活性大大提高，体内的半衰期也大大延长，在临床治疗方面可以使血药浓度较为稳定，提高患者的依从性，提高治疗效果。

另外，需要说明的是，本发明的氨基酸序列不包括起始密码子编码的氨基酸。

进一步的方案，所述的脂肪族类氨基酸选自蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的一种，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.2-SEQ ID No.5所示。

天然的干扰素α-2b蛋白分子不稳定，18位的赖氨酸为碱性氨基酸，较容易分解，替换为其它非碱性的脂肪族氨基酸有利于提高蛋白质的稳定性。

进一步的方案，所述的杂环氨基酸选自脯氨酸、组氨酸和色氨酸中的一种，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.6-SEQ ID No.8所示。

本发明选择替换的杂环氨基酸较为稳定，也均为疏水性氨基酸，有利于提高其稳定性。

进一步的方案，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为蛋氨酸，干扰素α-2b突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

进一步的方案，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第110位的亮氨酸突变为脯氨酸，干扰素α-2b突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

进一步的方案，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为蛋氨酸，且从N端计第110位的亮氨酸突变为脯氨酸，干扰素α-2b突变体的氨基酸序列如SEQ IDNo.9所示，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

为实现发明目的本发明提供了3种较为优选的突变方案，天然氨基酸序列中的第18位和110位的氨基酸分别各自突变，或者同时替换：

本发明提供的优选的IFNα2b突变体，一是将天然IFNα2b氨基酸序列(天然氨基酸序列如Seq No.1所示)中，从N端计第18位赖氨酸Lys替换为蛋氨酸Met(18Lys→18Met，记为IFNα2bMet¹⁸)，氨基酸序列如Seq No.2；其二是将天然IFNα2b氨基酸序列Seq No.1中，从N端计第110位亮氨酸Leu替换为脯氨酸Pro(110Leu→110Pro,记为IFNα2bPro¹¹⁰)，如Seq No.6；其三是将天然IFNα2b氨基酸序列Seq No.1中，从N端计第18位赖氨酸Lys和第110位亮氨酸Leu分别替换为蛋氨酸Met和脯氨酸Pro(18Lys→18Met，110Leu→110Pro,记为IFNα2bMet¹⁸/Pro¹¹⁰)，如Seq No.9。

本发明的第二目的是提供一种表达载体，所述表达载体包括如上所述任意一一种干扰素α-2b突变体的核苷酸序列。

较为优选的，所述的表达载体含有SEQ ID No.10-SEQ ID No.12的核苷酸序列。

本发明的第三目的是提供一种如上所述的干扰素α-2b突变体的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建干扰素α-2b突变体的表达载体；

(2)构建含有步骤(1)的表达载体的基因工程菌，并进行培养；

(3)提取、纯化干扰素α-2b突变体蛋白。

下面提供较为具体的方案：

为得到IFNα2b突变体蛋白，首先需要选择表达系统，然后进一步进行基因工程载体、基因工程菌或细胞的构建，工程菌或细胞的发酵培养，发酵产物的提取与纯化等步骤。

目前，常用的重组表达系统有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统等。根据大肠杆菌表达系统具有表达量高、操作简便、成本低和遗传背景清楚等优点，本发明选择大肠杆菌作为IFNα2b突变的表达系统，优选E.coliBL21(DE3)菌株作为宿主菌。

大肠杆菌表达系统，有其专门的表达载体，这类表达载体的特点表现在具有较强的启动子，如T7启动子、PL启动子、tac启动子和tap启动子等；人们公认且常用的载体有PET系列、pGEX系列等，本发明选用含T7启动子的PET系列载体，优选但不限于pET21a载体。

构建目标表达质粒，首先要获取目的基因，目前突变目的基因的获取，有融合PCR法，全基因合成法等，本发明优选全基因合成法，根据大肠杆菌密码子偏爱性及RNA结构稳定性，设计突变体核酸分子；将突变体基因从头合成，并分别装载进入载体pET21a的NdeI和XhoI酶切位点之间；进一步分别转化到宿主E.coli BL21(DE3)细胞中，构建成基因工程菌。

基因工程菌的发酵需要在合适的条件下进行，本发明优选LB培养基、37℃作为菌体生长和诱导表达的发酵条件，并在发酵过程中优选氨水控制发酵PH在6.5-7.5之间，调节搅拌转速控制溶氧值在4-8％之间；加入诱导剂后，控制诱导时间4-6小时。

本发明的突变体IFNα2b，是以包涵体形式表达，要获得纯的并且具有生物学活性的蛋白，需要进行变性、复性及纯化等工作。目前，本领域常用高浓度强变性剂对包涵体进行溶解变性，如7M GuHCl，8MUrea等；本发明优选8M Urea作为变性剂，按包涵体：溶解液1:10(m/v)的比例溶解突变体IFNα2b包涵体，变性液中优选5mmDTT作为还原剂，使包涵体内二硫键得以打开。包涵体复性，本领域常用的方法有稀释复性法、超滤复性法、柱上复性法、透析复性法以及高静水压复性法等。本发明优选稀释复性法结合柱上复性法对突变体IFNα2b进行复性；复性液中优选1M Urea作为蛋白聚集抑制剂，优选1mM GSSG，1mM GSH作为氧化还原对；将变性液滴加到复性液中，控制蛋白终浓度在0.45-0.65mg/ml之间，完成初步复性；再次将蛋白复性液上样至Q柱，然后通过淋洗去除变性剂，使蛋白在层析柱上进一步得以复性。

将Q柱收集的蛋白，再次通过Phenyl柱层析，获得较纯的突变体IFNα2b。

通过本领域公知的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE电泳凝胶法和分子排阻高效液相色谱法，分别确定获得的突变体IFNα2b纯度；根据《中国药典》2015版规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”，分别测定获得的3种突变体IFNα2b的生物学活性。

在25℃的环境下将层析获得的突变体IFNα2b，存放3个月并定期取样，通过外观、纯度、活性等指标考察其稳定性。

上述获得的IFNα2b突变体进一步进行动物药代动力学试验评价。

本发明的第四目的是提供一种如上所述的干扰素α-2b突变体在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用。

本发明的第五目的是提供一种药物组合物，含有如上所述的干扰素α-2b突变体以及在药学上可接受的辅料。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明提供的干扰素α-2b突变体是将天然的干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计的第18位赖氨酸和/或从N端计第110位的亮氨酸进行突变，获得的干扰素α-2b突变体在保证安全性的基础上，其生物学活性大大提高，比活性大大提高。

2、本发明的干扰素α-2b突变体相对于天然干扰素的稳定性大大提高，体内半衰期延长，可以提高患者使用干扰素药物的依从性，血药浓度波动小，也进一步提高了疗效。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1是IFNα2b及IFNα2b突变体SDS-PAGE纯度分析电泳图；其中，1为IFNα2b，2为IFNα2bMet¹⁸，3为IFNα2bPro¹¹⁰，4为IFNα2bMet¹⁸/Pro¹¹⁰；

图2是IFNα2b及IFNα2b突变体活性检测曲线图；

图3是本发明干扰素突变体的血药活性-时间曲线；其中，T1：0h，T2：0.5h，T3：1h，T4：1.5h，T5：2h，T6：4h，T7：6h，T8：8h，T9：10h，T10：12h，T11：14h，T12：16h，T13：20h，T14：24h。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一

1、构建基因工程表达载体和基因工程菌

根据IFNα2bMet¹⁸、IFNα2bPro¹¹⁰和IFNα2bMet¹⁸/Pro¹⁰的核苷酸序列，分别如SeqNo.10，Seq No.11和Seq No.12所示，进行全序列合成；并构建到载体pET21a中，两端酶切位点分别为NdeI和XhoI；另外将未突变的IFNα2b基因序列同样构建到pET21a中，作为本实施例的对照组。

将上述4个质粒分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养。

以单克隆菌落为模板，选用引物P1(5'ATGTGCGACCTGCCGCAG 3')和P2(5'TTATTCTTTAGAACGCAGAGATTC 3')进行PCR鉴定，阳性克隆于试管中培养，提取质粒，进行NdeI和XhoI双酶切鉴定；鉴定正确的克隆，进行测序再次确认。

2、基因工程菌发酵培养

上述4种工程菌株，分别进行发酵，过程如下：

工程菌按1％接种于50ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、220rpm摇床培养OD600至0.6-0.8；按5％接种于30L含氨苄青霉素的LB培养基中(PH7.0)，于50L发酵罐中37℃发酵培养；发酵过程，调节转速控制溶氧值在4-8％之间，用氨水控制pH在6.5-7.5之间；当OD600达到0.8后加入6gIPTG粉末，继续37℃诱导培养4小时，然后放罐；室温8000rpm管式离心收集菌体，菌体用纯水洗涤离心两次，除去发酵液中的杂质。

3、包涵体制备

收集的菌体按1：20(m/v)，悬浮于裂解液(50mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,0.1％Triton-x100,pH8.0)中，置于冰水混合物上，超声破碎(工作6秒，间歇3秒，共40分钟)；12000rpm离心30分钟，弃上清取沉淀；将沉淀用洗涤缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,0.1％Triton-x100,2M Ura，pH8.0)洗涤2次。

4、包涵体变性及复性

将菌体1：10(m/v)溶解于变性液(8MUrea，50mM Tris-HCl，5mM DTT，PH8.5)中，室温下在磁力搅拌器上缓慢搅拌，溶解变性包涵体两小时；12000rpm,30分钟离心包涵体变性液，收集上清。

收集到的上清缓慢加入复性液(50mM Tris-HCl，1M Urea，5％甘油，1mM GSSG，1mMGSH，pH 8.5)中，边滴加边在磁力搅拌器上缓慢搅拌(2-8℃)，使复性液中蛋白终浓度为0.45-0.65mg/ml。复性液用0.45μm微孔滤膜过滤。

5、层析纯化

蛋白复性液，上样到用平衡液(50mM Tris-HCl,pH 8.5)平衡好的Q柱，再用洗脱液A(20mM PB,pH 8.5)淋洗5个柱体积，洗脱液B(20mM PB，0.5MNaCl，pH 8.5)梯度洗脱，收集洗脱峰。

Q柱收集到的蛋白，加入终浓度2M NaCl，调PH至2.0；上样至平衡液(20mM PB，2MNaCl，pH 2.0)平衡好的Phenyl上，5个柱体积平衡液淋洗，洗脱液(20mM PB，pH 2.0)梯度洗脱，收集洗脱峰。将收集到蛋白调PH至3.0，保存。

6、分析检测

考马斯亮蓝染色SDS-PAGE电泳凝胶法和高效液相SEC法，分别检测上述色谱柱分离纯化得到的突变体干扰素α2b的纯度，结果均在98.5％以上，如图1所示。

用《中华人民共和国药典》2015版第三部规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”测定确定突变体干扰素α2b的生物学活性，其比活性的比较结果列于表1，如图2所示。

表1突变体干扰素α2b的生物学活性比较

由表1的结果可以知道，本发明获取的突变体IFNα2b较未突变IFNα2b，比活性均有提高。同时，IFNα2b Pro¹¹⁰比活性较IFNα2bMet¹⁸的比活性稍高，IFNα2bMet¹⁸/Pro¹¹⁰比活性为2.51×10⁸IU/mg，不仅显著高于未突变干扰素α2b的比活性1.56×10⁸IU/mg，相对于单个位点突变的比活性也有较大提高。

实施例二

本实施例参照Seq No.3-5，Seq No.7-8所述氨基酸序列，并参照天然干扰素α2b的核苷酸序列，根据氨基酸密码子原则设计各突变体的核苷酸序列，进行全序列合成；并构建到载体pET21a中，两端酶切位点分别为NdeI和XhoI；另外将未突变的IFNα2b基因序列同样构建到pET21a中，作为本实施例的对照组。

参照实施例一的方法，获得各个突变体干扰素α2b蛋白，并检测其生物学活性，所得的结果类似于实施例一，各突变体IFNα2b较未突变IFNα2b，比活性均有提高。

实施例三

本实施例提供一种药物组合物，含有IFNα2bMet¹⁸、IFNα2bPro¹¹⁰和IFNα2bMet¹⁸/Pro¹¹⁰中的至少一种，以及在药学上可接受的辅料。

试验例一稳定性试验

将实施例一层析获得的3种突变体及对照IFNα2b在25℃的环境下，进行连续3个月的稳定性评价，通过外观、纯度、活性等指标考察其稳定性；结果在表2-5中显示：对照组在25℃，2周后蛋白开始降解，并且比活性也严重下降；而3种突变体IFNα2b，在25℃，3个月后还有较强的比活性，仅有轻微的降解；表明IFNα2bMet¹⁸，IFNα2bPro¹¹⁰及IFNα2bMet¹⁸/Pro¹¹⁰的稳定性较IFNα2b均有较大的改善。

表2突变体IFNα2bMet¹⁸25℃稳定性试验结果

表3突变体IFNα2bPro¹¹⁰25℃稳定性试验结果

表4突变体IFNα2bMet¹⁸/Pro¹¹⁰25℃稳定性试验结果

表5 IFNα2b25℃稳定性试验结果

试验例二 突变体干扰素α2b的药代动力学试验

将24只体重为290g左右的成年SD大鼠，雌雄各半每组6只，分为4组，分别为A、B、C、D组。

其中，A组皮下单次注射7.25×10⁶IU的IFNα2b，B组皮下单次注射等量的突变体IFNα2bMet¹⁸；C组皮下单次注射等量的突变体IFNα2bMet¹⁸；D组皮下单次注射等量的突变体IFNα2bMet¹⁸/Pro¹¹⁰。然后分别于0，0.1，0.2，0.5，1，1.5，2，4，6，8，12，24，48，72，96小时经鼠尾静脉取血，收集血清，检测血清中保留的干扰素生物学活性。根据结果绘制血药活性-时间曲线，如图3所示，采用软件进行数据拟合，分析药代动力学参数，结果列于表6。

表6 IFNα2b及IFNα2b突变体药代动力学参数

结果表明，天然IFNα2b的半衰期t1/2β为1.71h，IFNα2bMet¹⁸的t1/2β为2.02h，IFNα2bPro¹¹⁰的t1/2β为2.35h，IFNα2bMet¹⁸/Pro¹¹⁰的t1/2β为2.54h，说明突变体干扰素α2b半衰期较未突变干扰素α2b均有所延长，其中IFNα2bMet¹⁸/Pro¹¹⁰的半衰期是天然IFNα2b半衰期的1.5倍，这在药物的临床应用上有重要的作用，能够提高患者的依从性。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (8)

1.一种干扰素α-2b突变体，其特征在于，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为蛋氨酸，和/或，从N端计第110位的亮氨酸突变为脯氨酸；所述的干扰素α-2b的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种干扰素α-2b突变体，其特征在于，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为蛋氨酸，干扰素α-2b突变体的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

3.根据权利要求1所述的一种干扰素α-2b突变体，其特征在于，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第110位的亮氨酸突变为脯氨酸，干扰素α-2b突变体的氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示，核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

4.根据权利要求1所述的一种干扰素α-2b突变体，其特征在于，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为蛋氨酸，且从N端计第110位的亮氨酸突变为脯氨酸，干扰素α-2b突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求2-4任意一项所述的核苷酸序列。

6.一种如权利要求1-4任一所述的干扰素α-2b突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建干扰素α-2b突变体的表达载体；

（2）构建含有步骤（1）的表达载体的基因工程菌，并进行培养；

（3）提取、纯化干扰素α-2b突变体蛋白。

7.一种如权利要求1-4任意一项所述的干扰素α-2b突变体在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用。

8.一种药物组合物，其特征在于，含有如权利要求1-4任意一项所述的干扰素α-2b突变体以及在药学上可接受的辅料。