CN101921330B - 重组人干扰素α1b突变体及其制备方法 - Google Patents
重组人干扰素α1b突变体及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101921330B CN101921330B CN 201010189352 CN201010189352A CN101921330B CN 101921330 B CN101921330 B CN 101921330B CN 201010189352 CN201010189352 CN 201010189352 CN 201010189352 A CN201010189352 A CN 201010189352A CN 101921330 B CN101921330 B CN 101921330B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ifn
- mutant
- interferon
- interferon alpha
- leu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及干扰素a1b突变体，它们的制备方法及在制备治疗和/或预防病毒感染性疾病药物中的用途。本发明的技术手段包括：通过序列分析，结合干扰素a1b与干扰素a2a、干扰素a2b的结构特点，对现有的干扰素a1b分子进行改造，把26位替换为一个Leu，27位替换为一个Phe和/或31位替换为一个Lys并使之高效表达，建立新分子的纯化方法，用WISH/VSV法测定其生物活性。最终得到更高活性的干扰素a1b突变体。
Description
技术领域
本发明一般的涉及重组人干扰素α突变体，它们的制备方法及在制备预防和/或治疗病毒性疾病药物中的用途。更具体地说，本发明涉及重组人干扰素α1b的突变体，它们的制备方法及在制备预防和/或治疗乙型肝炎和丙型肝炎等病毒性疾病药物中的用途。
背景技术
干扰素(interferon，IFN)是真核细胞对病毒感染和其他生物学诱导物反应时生成的天然存在的蛋白和糖蛋白家族。自干扰素被发现以来，大量临床研究发现，干扰素通过与细胞表面的特异性受体结合发挥其抗病毒、抗增殖和免疫调节的生物学作用。干扰素已用来治疗许多疾病，包括病毒感染(例如，丙型肝炎、乙型肝炎、尖锐湿疣)、炎性病症和疾病(例如，多发性硬化症、关节炎、哮喘、囊性纤维化症、间质性肺病)以及癌症(例如，骨髓瘤、淋巴癌、肝癌、乳房癌、黑素瘤、毛样细胞白血病)，并且还应用于其他治疗领域。
根据信号转导受体复合物、序列同源性、染色体定位及对酸的稳定性不同，干扰素家族可被分为2种类型：干扰素I型和干扰素II型。其中干扰素I型包括由病毒感染白细胞产生的干扰素(白细胞干扰素，即IFN-α)和由病毒感染成纤维细胞产生的干扰素(成纤维细胞干扰素，即IFN-β)两个家族。而IFN-α又可分为许多种亚型，如α1b，α1c，α2a，α2b，α2c等。同一种属IFN-α不同基因产物氨基酸同源性≥80％。
从1986年开始，美国食品及药物管理局(FDA)已批准多种干扰素药物，包括干扰素α2b和干扰素α2a，用于治疗慢性肝炎、慢性骨髓白血病、以及毛样细胞白血病。我国科学家在世界范围内首先研究开发的重组人干扰素α1b(IFNα1b)于1996年获准上市，是我国第一批被批准投产的国产生物技术新药。
IFNα1b已确定为由166个氨基酸组成的单链多肽，含有在氨基酸位置1、29、86、99、以及139的5个半胱氨酸残基。在其天然构象中，IFNα1b形成两对分子内二硫键(在Cys1-Cys99之间；在Cys29-Cys139之间)，在Cys86残基留下游离的巯基。IFNα1b的受体结合区是根据两个同源模型提出来的，包括受体结合区1(AB环、D螺旋及DE环)和受体结合区2(C螺旋和A螺旋)，其中29-35位(AB环)是共同的受体结合区。
根据文献报道与临床实际应用积累的数据，IFNα1b的临床治疗效果与IFNα2相当，毒副作用却明显更低。但IFNα1b的结构特点决定了通过改构还可进一步提高其活性，同时保持其原毒副作用低的特点或进一步降低毒副作用，以进一步提高IFNα1b在临床应用中相对于IFNα2的优势。
对蛋白质分子的改构需要考虑多种因素，还需要综合结构预测与实验证明的的方法去验证改构的可行性，但利用现有技术对蛋白质分子，包括对IFNα1b进行改构，却没有综合考虑这些因素，更没有进行科学的设计与系统的论证，因此改构得到的新分子的实际应用效果并不理想。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种IFNα1b突变体，以进一步提高IFNα1b的活性，提高其治疗效果。为实现此目的所采取的技术方案是利用定点突变技术分别将IFNα1b的氨基酸序列突变为如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。选择突变位点的原理是：
干扰素的抗病毒活性与其同受体的亲和力密切正相关，考虑到IFNα2的体外活性高于IFNα1b，因此通过计算机模拟IFNα1b的空间结构预测其最可能与受体结合的位点，进行挑选后通过体外定点突变技术突变为IFNα2在此位点上的氨基酸残基，以期获得兼具高活性和低毒性的IFNα1b突变体。
具体获得突变分子的方法是：
1)利用体外定点突变技术获得编码目的蛋白的重组基因；
2)将此重组基因插入到表达载体中获得可编码重组蛋白的重组质粒。所述表达载体包括但不限于pET-23b；
3)将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞获得可稳定表达目的蛋白的工程菌，所述大肠杆菌感受态细胞包括但不限于BL21(DE3)；
4)发酵工程菌并分离纯化以可溶性蛋白或包涵体形式表达的目的蛋白。表达的IFNα1b 31位赖氨酸突变体(以下简称IFNα1b/31K)、IFNα1b 26位亮氨酸27位苯丙氨酸及31位赖氨酸突变体(以下简称IFNα1b/26L/27F/31K)可以以可溶性蛋白或包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30％以上。IFNα1b/31K的纯化依次采用二乙胺基乙基纤维素(DEAE)阴离子交换层析、羧甲基纤维素(CM)阳离子交换层析和单抗亲和层析三步纯化工艺，可以得到高纯度的IFNα1b/31K。IFNα1b/26L/27F/31K的纯化依次采用了DEAE阴离子交换层析、CM阳离子交换层析和金属螯合层析三步纯化工艺，可以得到高纯度的IFNα1b/26L/27F/31K。
本发明的另一个目的是提供IFNα1b/31K和IFNα1b/26L/27F/31K在制备治疗和/或预防病毒性感染疾病或肿瘤药物中的用途。
根据本领域技术人员的公知常识，可将治疗有效量的IFNα1b/31K和IFNα1b/26L/27F/31K与适宜量的可药用载体混合获得IFNα1b/31K和IFNα1b/26L/27F/31K的药剂，这样的药剂可用于病毒感染性疾病或肿瘤的治疗和/或预防。所述病毒感染性疾病包括但不局限于乙型肝炎、丙型肝炎、毛细胞白血病；所述肿瘤包括但不局限于肺癌、胃癌、肾癌。
附图说明
图1：表示“IFNα1b/31K的基因构建和扩增”中三轮PCR产物的琼脂糖电泳图谱。自左到右的泳道分别为100bp Ladder DNA marker，第一轮PCR产物，第二轮PCR产物和第三轮PCR产物。DNA marker的大小从上到下依次为1500，1000，900，800，700，600，500，400，300，200和100bp。
图2：表示“IFNα1b/26L/27F/31K的基因构建和扩增”中三轮PCR产物的琼脂糖电泳图谱。自左到右的泳道分别为100bp Ladder DNA marker，第一轮PCR产物，第二轮PCR产物和第三轮PCR产物。DNA marker的大小从上到下依次为1500，1000，900，800，700，600，500，400，300，200和100bp。
图3：表示IFNα1b/31K的重组工程菌菌体及其菌体破碎液、IFNα1b/26L/27F/31K的重组工程菌菌体与其包涵体和包涵体上清的SDS-PAGE图谱。泳道从左到右依次为蛋白marker，IFNα1b/31K菌体，IFNα1b/31K菌体破碎液，IFNα1b/26L/27F/31K菌体，IFNα1b/26L/27F/31K包涵体和IFNα1b/26L/27F/31K包涵体上清。蛋白marker大小从上到下依次为97.2、66.4、44.3、29.0、20.1和14.3kD。
图4：表示纯化的IFNα1b/26L/27F/31K和IFNα1b/31K的SDS-PAGE图谱。图中泳道从左到右依次为蛋白marker，纯化的IFNα1b/31K和IFNα1b/26L/27F/31K。蛋白marker大小从上到下依次为97.2、66.4、44.3、29.0、20.1和14.3kD。
图5：表示IFNα1b/31K的基质辅助激光解吸电离质谱谱图。
图6：表示IFNα1b/26L/27F/31K的基质辅助激光解吸电离质谱谱图。
具体实施方式
除非特殊定义，本文描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。例如：“干扰素α1b”与“IFNα1b”含义相同。
除非特殊指明，本文所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可以一般的按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或供应商提供的说明书进行。
本发明IFNα1b/26L/27F/31K和IFNα1b/31K两种蛋白的类似物可以通过氨基酸功能等效分子的取代、添加或缺失来获得，如在本技术领域公知，用性质类似的一个或多个氨基酸残基取代原序列内相应的氨基酸残基改变原蛋白质序列，形成沉默改变。
本发明中IFNα1b的工程菌来自申请人生产用工程菌株。
实施例1A IFNα1b/31K表达基因的构建和扩增
采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM)，以重叠延伸的手段进行定点突变。定点突变技术已经比较成熟，程序比较固定。可以根据具体试验调整的是引物的位置长度和PCR的反应条件，在实际操作中可以有多种组合，都可以达到定点突变的目的，均函盖在本发明的保护范围之内。本实施例所列为优选方案(同样原因，实施例2A所列也为优选方案)。
设计两对引物，一对引物P1为T7 promoter primer(cccgcgaaattaatacgactcacta)，P2序列为gtgacggtccttcaggcaggagg；另一对引物P3为T7 terminator primer(tttcagcaaaaaacccctcaagacc)，P4序列为cctcctgcctgaaggaccgtcac。突变位点包含在P2和P4之中。
提取IFNα1b的质粒作为模板，首轮PCR反应体系引物为P1、P2，扩增突变位点及其上游的DNA序列。反应条件为95℃ 5min，然后95℃ 40sec，55.6℃ 1min、72℃ 1min共30个循环。
第二轮PCR反应体系引物为P3、P4，扩增突变位点及其下游的DNA序列。反应条件为95℃ 5min，然后95℃ 40sec，58.8℃ 1min、72℃ 1min共30个循环。
第三轮PCR为重叠延伸PCR，以首轮和第二轮PCR的产物为模板，以P1、P3为引物进行PCR扩增。反应条件为95℃ 5min，然后95℃ 40sec，57.6℃ 1min、72℃ 1min共30个循环。图1表示三轮PCR产物的琼脂糖电泳图谱。
第三轮PCR产物经琼脂糖电泳分析，选择775bp左右的DNA片段，用Nde I/EcoR I双酶切，电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。
实施例1B IFNα1b/31K重组质粒的构建、转化和鉴定
在重组质粒的构建和转化中，双酶往往可以有多种选择，连接反应的条件也可以有所变化，都可以完成重组质粒的构建：本实施例中宿主细胞选择了实验室常用的BL21(DE3)，并不排斥用其他宿主进行转化。本着科学、方便和快捷的原则，本实施例所列重组质粒的构建、转化和鉴定方案为优选方案(同样原因，实施例2B所列也为优选方案)。
将pET-23b质粒载体用Nde I/EcoR I双酶切，经琼脂糖电泳回收并和实施例1A中最后回收的目的DNA片段连接。连接反应条件为：10x T4 buffer 2μl，T4 DNA Ligase 1μl、目的片段5μl、载体12μl，16℃过夜连接。
使用BL21(DE3)感受态细胞，转化上述连接产物，涂布氨苄平板，37℃过夜培养。
挑取6个单菌落作为模板，摇菌培养后以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定。
实施例1C IFNα1b/31K的表达和纯化
将实施例1B中得到的重组工程菌培养发酵，诱导表达。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的IFNα-1b/31K约占菌体总蛋白的30％，主要以可溶性蛋白的形式存在。(SDS-PAGE图谱如图3所示)。
粗纯：将发酵收集的菌体以TE溶解，超声破菌后离心收集上清液，然后加入硫酸铵粉末，4℃放置2～3h，再离心收集沉淀。按沉淀∶去离子水＝1∶100比例加入去离子水溶解沉淀，置于25mM Tris-HCl(pH8.0)，4℃过夜透析。4℃离心取上清。即为粗纯的IFNα1b/31K。
精纯：依次采用了DEAE阴离子交换层析、CM阳离子交换层析和单抗亲和层析三步纯化工艺。具体步骤如下：
将上清液上样至用25mM Tris-HCl溶液(pH7.5)平衡好的DEAE SepharoseTM FF层析柱，上样后用3-5个柱体积的平衡液冲洗，用0.2M NaCl/25mM Tris-HCl溶液(pH7.5)洗脱，收集洗脱峰组分；
将DEAE SepharoseTM FF离子交换层析的洗脱峰组分与25mM醋酸钠(AAB)溶液(pH4.5)按1∶9稀释，上样至用25mM AAB溶液(pH4.5)平衡好的CM
FF层析柱，用3-5个柱体积的平衡液冲洗，用0.5M NaCl/25mM AAB溶液(pH4.5)洗脱，收集洗脱峰组分；
将CMFF离子交换层析的洗脱峰组分以pH7.0PBS缓冲液稀释到约1mg/ml后上样到用pH7.0PBS缓冲液平衡好的单抗亲和层析柱上，分别用PBS(pH7.0)、PBST(pH7.0)、PBS(pH7.0)缓冲液冲洗，用pH2.5的0.2M甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰组分，立即调pH至7.0。经以上纯化流程后，最后得到的IFNα-1b/31K纯度在95％以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。
实施例2A IFNα1b/26L/27F/31K表达基因的构建和扩增
设计两对引物，一对引物P1为T7promoter primer(cgatcccgcgaaattaatacgactc)，P2序列为tcaggcaggagaacagggagatacgg；另一对引物P3为T7 terminator primer(aagacccgtttagaggccccaagg)，P4序列为ccgtatctccctgttctcctgcctga。突变位点包含在P2和P4之中。
提取IFNα1b/31K的质粒作为模板，首轮PCR反应体系引物为P3、P4，扩增突变位点及其下游的DNA序列。反应条件为95℃ 5min，然后95℃ 40sec，59.8℃ 1min、72℃ 1min共30个循环。
第二轮PCR反应体系引物为P1、P2，扩增突变位点及其上游的DNA序列。反应条件为95℃ 5min，然后95℃ 40sec，56.4℃ 1min、72℃ 1min共30个循环。
第三轮PCR为重叠延伸PCR，以首轮和第二轮PCR的产物为模板，以P1、P3为引物进行PCR扩增。反应条件为95℃5 min，然后95℃ 40sec，58.6℃ 1min、72℃ 1min共30个循环。图2表示三轮PCR产物的琼脂糖电泳图谱。
第三轮PCR产物经琼脂糖电泳分离，选择760bp左右的DNA片段，用Nde 1/EcoR I双酶切，电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。
实施例2B IFNα1b/26L/27F/31K重组质粒的构建、转化和鉴定
将pET-23b质粒载体用Nde I/EcoR I双酶切，经琼脂糖电泳回收并和实施例2A中最后回收的目的DNA片段连接。连接反应条件为：10x T4 buffer 2μl，T4 DNA Ligase 1μl、目的片段0.9μl、载体1μl，ddH2O 4μl，16℃过夜连接。
使用BL21(DE3)感受态细胞，转化上述连接产物，涂布氨苄平板，37℃过夜培养。
挑取2个单菌落作为模板，摇菌培养后以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定。
实施例2C IFNα1b/26L/27F/31K的表达和纯化
将实施例2B中得到的重组工程菌培养发酵，诱导表达。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的IFNα1b/26L/27F/31K约占菌体总蛋白的30％，主要以包涵体的形式存在。(SDS-PAGE图谱如图3所示)。
粗纯：将发酵收集的菌体以TE溶解，超声破菌后离心收集包涵体，然后用7M的盐酸胍溶解，室温搅拌2～3h，再用浓度为0.15M、pH9.5的硼酸复性，复性液置4℃过夜。4℃离心取上清。即为粗纯的IFNα1b/31K。
精纯：依次采用了DEAE阴离子交换层析、CM阳离子交换层析和金属螯合层析三步纯化工艺。具体步骤如下：
将上清液于25mM Tris-HCl(pH8.0)中4℃过夜透析。4℃离心取上清。再上样至用25mMTris-HCl溶液(pH7.5)平衡好的DEAE SepharoseTM FF层析柱，上样后用3-5个柱体积的平衡液冲洗，用0.2M NaCl/25mM Tris-HCl溶液(pH7.5)洗脱，收集洗脱峰组分；
将DEAE SepharoseTM FF离子交换层析的洗脱峰组分与25mM AAB按1∶9稀释，上样至用25mM AAB溶液(pH4.5)平衡好的CM
FF层析柱，用3-5个柱体积的平衡液冲洗，用0.5M NaCl/25mM AAB溶液(pH4.5)洗脱，收集洗脱峰组分；
将CM
FF离子交换层析的洗脱峰组分与Buffer A(50mM Tris-HCl/50mMNaCl/0.1mM CuSO4 pH7.5)按1∶1稀释，上样到已结合好铜离子的Chelating SepharoseTM FF层析柱上，上样后依次以Buffer A、Buffer B(50mM Tris-HCl/0.5M NaCl pH7.5)冲洗，最后用Buffer C(50mM Gly/0.3M NaCl pH3.0)洗脱，收集洗脱峰组分，调pH至7.0。经以上纯化流程后，最后得到的IFNα-1b/31K纯度在95％以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。
实施例3 体外细胞药效学实验
采用细胞病变抑制法通过WISH-VSV系统对比测定IFNα1b、IFNα1b/31K与IFNα1b/26L/27F/31K的体外抗病毒活性，具体程序与要求参见2010版《中华人民共和国药典》三部附录XC“干扰素的生物活性测定”，测定结果如下表1所示。
表1：IFNα1b、IFNα1b/31K和IFNα1b/26L/27F/31K的体外抗病毒活性
| 名称 | 比活性(IU/mg) |
| IFNα1b | (0.89±0.07)×107 |
| IFNα1b/31K | (1.55±0.27)×107 |
| IFNα1b/26L/27F/31K | (4.61±0.33)×107 |
实施例4 IFNα1b/31K和IFNα1b/26L/27F/31K分子量测定
采用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱法测定蛋白的分子量，检测条件为：基质为芥子酸，光源为N2激光源，波长为337nm，飞行管长1.5M，加速电压20kV。测定结果显示，IFNα1b/31K的分子量为19336道尔顿，IFNα1b/26L/27F/31K的分子量为19411道尔顿，均与预期结果相符(质谱图谱如图5、图6所示)。
附序列表：
序列表1为IFNα1b/31K的核苷酸序列；
序列表2为IFNα1b/26L/27F/31K的核苷酸序列；
序列表3为IFNα1b/31K的氨基酸序列；
序列表4为IFNα1b/26L/27F/31K的氨基酸序列。
序列表1：
<110>北京三元基因工程有限公司北京毕艾欧科技发展有限责任公司
<120>重组人干扰素α1b突变体及其制备方法
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>507
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atgtgcgacc tgccggaaac ccactccctg gacaaccgtc gtaccctgat gctgctggct 60
cagatgtccc gtatctcccc gtcctcctgc ctgaaggacc gtcacgactt cggtttcccg 120
caggaagaat ttgacggtaa ccagttccag aaagctccgg ctatctccgt tctgcacgaa 180
ctgatccagc agatcttcaa cctgttcacc accaaagact cctccgctgc ttgggacgaa 240
gacctgctgg acaaattctg caccgaactg taccagcagc tgaacgacct ggaagcttgc 300
gctatgcagg aagaacgtgt tggtgaaacc ccgctgatga acgctgactc catcctggct 360
gttaaaaaat acttccgtcg tatcaccctg tacctgaccg aaaaaaaata ctccccgtgc 420
gcttgggaag ttgttcgtgc tgaaatcatg cgttccctgt ccctgtccac caacctgcag 480
gaacgtctgc gtcgtaaaga ataatag 507
序列表2：
<110>北京三元基因工程有限公司 北京毕艾欧科技发展有限责任公司
<120>重组人干扰素α1b突变体及其制备方法
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>507
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atgtgcgacc tgccggaaac ccactccctg gacaaccgtc gtaccctgat gctgctggct 60
cagatgtccc gtatctccct gttctcctgc ctgaaggacc gtcacgactt cggtttcccg 120
caggaagaat ttgacggtaa ccagttccag aaagctccgg ctatctccgt tctgcacgaa 180
ctgatccagc agatcttcaa cctgttcacc accaaagact cctccgctgc ttgggacgaa 240
gacctgctgg acaaattctg caccgaactg taccagcagc tgaacgacct ggaagcttgc 300
gctatgcagg aagaacgtgt tggtgaaacc ccgctgatga acgctgactc catcctggct 360
gttaaaaaat acttccgtcg tatcaccctg tacctgaccg aaaaaaaata ctccccgtgc 420
gcttgggaag ttgttcgtgc tgaaatcatg cgttccctgt ccctgtccac caacctgcag 480
gaacgtctgc gtcgtaaaga ataatag 507
序列表3：
<110>北京三元基因工程有限公司 北京毕艾欧科技发展有限责任公司
<120>重组人干扰素α1b突变体及其制备方法
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp
65 70 75 80
Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Ala Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
165
序列表4：
<110>北京三元基因工程有限公司 北京毕艾欧科技发展有限责任公司
<120>重组人干扰素α1b突变体及其制备方法
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp
65 70 75 80
Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Ala Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
165
Claims (5)
1.一种干扰素α1b突变体，其特征在于：将干扰素α1b氨基酸序列中第31位的Met突变为Lys，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；或在将干扰素α1b氨基酸序列中第31位的Met突变为Lys的基础上进一步将第26位的Pro突变为Leu，第27位的Ser突变为Phe，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.编码权利要求1所述的干扰素α1b突变体的核酸分子。
3.一种制备权利要求1所述的干扰素α1b突变体的方法，包括以下步骤：
（1）权利要求1所述干扰素α1b突变体的重组工程菌构建、表达；
（2）前项构建表达的干扰素α1b突变体的纯化。
4.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1所述的干扰素α1b突变体和适宜量的可药用载体。
5.权利要求4所述的药物组合物在制备治疗和/或预防病毒感染性疾病药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010189352 CN101921330B (zh) | 2010-06-02 | 2010-06-02 | 重组人干扰素α1b突变体及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010189352 CN101921330B (zh) | 2010-06-02 | 2010-06-02 | 重组人干扰素α1b突变体及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101921330A CN101921330A (zh) | 2010-12-22 |
| CN101921330B true CN101921330B (zh) | 2013-07-17 |
Family
ID=43336564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010189352 Active CN101921330B (zh) | 2010-06-02 | 2010-06-02 | 重组人干扰素α1b突变体及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101921330B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102219848B (zh) * | 2011-05-25 | 2014-01-22 | 浙江海正药业股份有限公司 | 重组人干扰素β-1a的纯化方法 |
| EP2527424A1 (en) * | 2011-05-26 | 2012-11-28 | Richter-Helm Bio Tec GmbH & Co. KG | Recombinant expression of soluble Interferon |
| CN102716469B (zh) * | 2012-07-07 | 2013-09-11 | 北京三元基因工程有限公司 | 干扰素α的干粉吸入剂 |
| CN103641905B (zh) * | 2013-12-12 | 2015-04-01 | 北京三元基因工程有限公司 | 干扰素α1b突变体及其与人血清白蛋白的融合蛋白 |
| CN105087626A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-11-25 | 苏州欧赛微科生物医药科技有限公司 | 表达和分泌人干扰素α2b的乳杆菌菌株及其用途 |
| CN107556376B (zh) * | 2017-09-08 | 2018-09-28 | 上海华新生物高技术有限公司 | 一种干扰素α-2b突变体及其制备方法和应用 |
| CN116251174B (zh) * | 2022-12-23 | 2023-09-29 | 北京三元基因药业股份有限公司 | 一种包含人干扰素α1b吸入溶液的药物组件 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007044083A2 (en) * | 2005-05-18 | 2007-04-19 | Maxygen, Inc. | Evolved interferon-alpha polypeptides |
| CN101547935A (zh) * | 2006-12-21 | 2009-09-30 | 北京三元基因工程有限公司 | 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物 |
-
2010
- 2010-06-02 CN CN 201010189352 patent/CN101921330B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007044083A2 (en) * | 2005-05-18 | 2007-04-19 | Maxygen, Inc. | Evolved interferon-alpha polypeptides |
| CN101547935A (zh) * | 2006-12-21 | 2009-09-30 | 北京三元基因工程有限公司 | 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101921330A (zh) | 2010-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101921330B (zh) | 重组人干扰素α1b突变体及其制备方法 | |
| CN101547935B (zh) | 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物 | |
| CN101921329B (zh) | α干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物 | |
| CN111607003B (zh) | 一种SARS-CoV-2 N/S1(RBD)重组蛋白及制备方法和应用 | |
| Shi et al. | A novel cytokine receptor-ligand pair: identification, molecular characterization, and in vivo immunomodulatory activity | |
| EP0293793A2 (en) | Polypeptide and production thereof | |
| JP7097434B2 (ja) | ヒトｆｇｆ２１変異体、その製造方法、及びその使用 | |
| Wingender et al. | Expression of human parathyroid hormone in Escherichia coli | |
| JP2003511031A (ja) | ＩＦＮ−αホモログ | |
| CN101942026B (zh) | 长效干扰素融合蛋白及其用途 | |
| Edge et al. | Chemical synthesis of a human interferon-α2, gene and its expression in Escherichia coli | |
| CN103923209A (zh) | 一种Lambda干扰素突变体及聚乙二醇衍生物 | |
| CN103717614A (zh) | 重组蛋白质的衍生物、粒细胞集落刺激因子的同多聚体及其制备方法 | |
| JP2653061B2 (ja) | 新規ポリペプチドおよびその製造法 | |
| CN114045276B (zh) | 一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体 | |
| CN1663962A (zh) | 重组人粒细胞集落刺激因子及其化学修饰物的一步纯化工艺 | |
| CN108484749A (zh) | 一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其制备方法 | |
| CN102260697A (zh) | 融合表达重组制备人β干扰素 | |
| JP2515975B2 (ja) | 抗腫瘍作用を有するポリペプチド | |
| CN113845599B (zh) | 一种重组猪干扰素融合蛋白及其应用 | |
| CN101191130B (zh) | chIFNGR1基因、其编码的蛋白质及应用 | |
| CN114957398A (zh) | 一种α株2019-nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法 | |
| CN102367441B (zh) | 一种去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b的制备方法 | |
| CN103554246B (zh) | 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物 | |
| CN114957397A (zh) | 一种δ株2019-nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Free format text: FORMER OWNER: BEIJING BIO-TECH DEVELOPMENT CO., LTD. Effective date: 20130828 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20130828 Address after: 102600, Beijing, Daxing District, North Village, Beijing biological engineering and pharmaceutical industry base, nine Fu Tian Street Patentee after: Beijing Sanyuan Gene Engineering Co., Ltd. Address before: 102600, Beijing, Daxing District, North Village, Beijing biological engineering and pharmaceutical industry base, nine Fu Tian Street Patentee before: Beijing Sanyuan Gene Engineering Co., Ltd. Patentee before: Beijing Bio-Tech Development Co., Ltd. |
|
| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 102600 Beijing Jinyuan Industrial Development Zone Daxing District Road No. 1 Building No. 4 Patentee after: BEIJING TRI-PRIME GENE PHARMACEUTICAL CO., LTD. Address before: 102600, Beijing, Daxing District, North Village, Beijing biological engineering and pharmaceutical industry base, nine Fu Tian Street Patentee before: Beijing Sanyuan Gene Engineering Co., Ltd. |