CN101191130B

CN101191130B - chIFNGR1基因、其编码的蛋白质及应用

Info

Publication number: CN101191130B
Application number: CN2007101187212A
Authority: CN
Inventors: 汪明; 韩雪
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2007-07-12
Filing date: 2007-07-12
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2027-07-12
Also published as: CN101191130A

Abstract

本发明提供了鸡IFN-γ受体α链(IFNGR1)基因，其具有SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列，或该序列经改变、添加和/或缺失一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列。本发明还提供了该基因编码的蛋白质鸡IFNGR1，该蛋白具有结合配体，传递IFN-γ刺激信号的作用。鸡IFNGR1胞外域融合蛋白其具有抗病毒活性，是一种潜在的抗病毒生物制剂。

Description

chIFNGR1基因、其编码的蛋白质及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及鸡干扰素-γ受体α链(chIFNGR1)基因及编码的氨基酸，还涉及其胞外域重组蛋白的抗病毒活性。

背景技术

干扰素-γ(IFN-γ)主要由活化的T细胞、NK细胞产生，是一种具有抗病毒，调节免疫和促进细胞凋亡等多种生物学活性的细胞因子。其功能的多效性是通过与几乎表达在所有细胞表面、高亲和力的受体以严格的种属特异性方式结合，诱导细胞表达多种蛋白质而实现的。

IFN-γ相关的诸多生物学功能早已被人们所认识，但对于IFN-γ细胞表面受体的结构与功能的认识，只是在近十来年才取得了有意义的进展。IFN-γ受体由配体结合链(IFN-γ受体α链，即IFNGR1)和信号转导链(IFN-γ受体β链，即IFNGR2)组成。IFNGR1蛋白结构域由胞外域(ECD)、跨膜区(TM)和胞内域(CYT)组成。胞外域与配体结合，一般由200个左右的氨基酸残墓组成，包含2个串连的纤连蛋白III型区(FNIII)。胞内域传递细胞内信号，含有保守的LPKS和YDKPH序列，这两个序列分别是JAK1和STAT1的结合位点。

1988年，Michel等人首先克隆了人II型干扰素受体IFNGR1的基因。1994年，Soh等人首先克隆了IFNGR2基因。目前已先后克隆出人、小鼠、大鼠和牛的IFNGR1基因，以及人、大鼠、小鼠和鸡的IFNGR2基因。其中，鸡的IFNGR2基因于2006年由本教研组的韩春来博士采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术成功获得并发表，该基因全长cDNA序列和其中编码区在GenBank上的序列号分别为AY957508和AY820753。而鸡的IFNGR1基因在国内外未见公开报道，仅可在GenBank上查到一段计算机分析预测序列XM_419722，该序列的正确性需要进一步的实验证明。本发明填补了鸡干扰素受体研究的空白，为开发应用奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供鸡IFNGR1基因及其编码蛋白。

本发明首次获得了鸡IFNGR1的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，该序列全长2123bp，编码442个氨墓酸，其序列如序列表SEQ ID No.2所示，是一种跨膜蛋白，信号肽、胞外域、跨膜区和胞内域分别由20、220、23和179个氨墓酸组成。

本发明无菌采集鸡抗凝血，分离淋巴细胞提取总RNA。并根据GenBank上登录的鸡IFNGR1基因计算机预测序列及IFNGR1基因的保守序列(IFNGR1蛋白胞内域的氨基酸序列LPKS和YDKPH序列在人、牛、小鼠和大鼠都是保守的)设计引物，用RACE和PCR方法获得了chIFNGR1 cDNA序列2123bp，序列包括该基因的部分5’端非编码区、编码区和3’端非编码区。该基因编码的蛋白为鸡IFN-γ受体α链，具有结合配体，传递IFN-γ刺激信号的作用。

应当理解，考虑到密码子的简并性和将用于具体表达本发明鸡IFNFR1基因的动物或微生物的优选密码子，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响鸡IFNFR1表达的条件下，对SEQ ID No.1所示的序列进行修改。因此，本发明的范围还包含对SEQ ID No.1所示序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与本发明基因具有相同功能的核苷酸序列。

并且，本发明还包括对表达自本发明基因的蛋白质(SEQ IDNo.2)进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

此外，应当理解，本领域的技术人员还可以具体利用本发明基因的某个片段，例如下面所要说的鸡IFNGR1基因的胞外域核苷酸序列。本领域技术人员还可以利用本发明蛋白质的某个部分，如该基因的胞外域蛋白。

本发明的基因或蛋白质可来自鸡的各种活组织或通过DNA或肽合成的方法来获得。

此外，可以将本发明的基因或其片段插入到克隆载体或表达载体中，进而可以将表达载体引入适宣的宿主中表达，如大肠杆菌，酵母和动物细胞等，从而可以进行大规模的生产本发明的DNA或蛋白质。上述得到的克隆载体或表达载体，以及含有所述表达载体的宿主，均属于本发明的范围。

本发明的另一个目的在于提供具有抗病毒活性的鸡IFNGR1胞外域重组蛋白。

本发明应用PCR方法扩增chIFNGR1基因的胞外域核苷酸序列，并构建chIFNGR1胞外域的表达载体pMAL-p2x/IFNGR1EC。将上述表达载体转化大肠杆菌TB1感受态细胞，诱导获得了chIFNGR1胞外域蛋白rchIFNGR1EC。为了便于构建表达载体，该重组蛋白缺失chIFNGR1胞外域N端的ASLQ四个氨基酸残基和C端的WST三个氨基酸残基，但不会影响蛋白质的结构和功能，其抗病毒活性为4.58×10³U/mg。

本发明基因编码的蛋白为鸡IFN-γ受体α链，具有结合配体，传递IFN-γ刺激信号的作用。本发明体外获得的鸡IFNGR1胞外域融合蛋白其具有抗病毒活性，是一种潜在的抗病毒生物制剂。

附图说明

图1.chIFNGR1EC重组蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析.(A)大肠杆菌表达的chIFNGR1EC的SDS-PAGE(12％)分析(B)Westernblot分析M(左)，低分子量蛋白标准：分子量分别为97kDa，66kDa，43kDa，31kDa和20kDa。M(右)，低分子量蛋白标准：分子量分别为97kDa，66kDa，43kDa和31kDa；

图2.鸡IFNGR1胞外域(EC)重组蛋白与鸡IFN-γ的相互作用.1，SDS-PAGE(15％)分析rchIFNGR1EC(66kDa)+rchIFN-γ(43kDa)；M，低分子量蛋白标准。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1、鸡IFNγ受体α链(chIFNGR1)的获得

一、采用cDNA末端快速扩增(RACE)法获得鸡chIFNGR1的cDNA序列

提取鸡外周血淋巴细胞总RNA，将总RNA用100U MMLV-RT(Promega公司产品)，100ng的上下游引物5’-AACATATGCGGCCGCATTATGGCCGGG-3’和5’-GATCTTCCACGCGTCGAC(T)30MN-3’(M＝A，G，C；N＝A，G，C，T)在42℃条件下进行反转录。获得的cDNA进行3’RACE，根据GenBank上登录的红色原鸡IFNGR1计算机预测序列XM_419722的保守区设计RACE引物，第一轮PCR的引物为特异的上游引物GSP1(5’-CAGAAGCAAAAGGCATTTGTGCCGTC-3’)和通用的下游引物UP(5’-GATCTTCCACGCGTCGACT-3’)，第二轮PCR的引物为巢式上游引物GSP2(5’-TGTGAGTGTCCCATTGACAGTGAAT-3’)和UP，第三轮PCR的引物为巢式上游引物GSP3(5’-TATGACAAGCCTCATGTGCCACTA-3’)和UP。采用Touch-Down PCR程序进行：第一轮PCR：92℃，30s，68℃，3min，5个循环；94℃，1min，60℃，1min，72℃，1min，6个循环；94℃，1min，58℃，1min，72℃，1min，10个循环；94℃，1min，56℃，1min，72℃，1min，7个循环；72℃，10min。第二轮PCR：92℃，30s，68℃，3min，5个循环；94℃，1min，64℃，1min，72℃，1min，6个循环；94℃，1min，62℃，1min，72℃，1min，10个循环；94℃，1min，60℃，1min，72℃，1min，7个循环；72℃，10min。第三轮PCR反应程序与第二轮相同。

另外，根据XM_419722，设计引物扩增IFNGR1基因。引物序列分别为chIFNGR1-F(5＇-CTCGGCTCGCTGTGGTCTT-3＇)和chIFNGR1-R(5’-TGTATGCAATCACAGGCTGTT CTTC-3＇)扩出约1400bp的产物。PCR反应程序为：95℃，5min；95℃，1min，58℃，1min，72℃，1.5min，30个循环；72℃，10min。纯化获得的PCR产物，并连接到pGEM-T-easy载体(Promega公司产品)上，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α并测序。

将3’RACE获得的825bp序列和PCR扩增得到的1368bp序列拼接。分别进行BLASTN和BLASTX的分析，获得鸡IFNGR1基因。该基因编码的蛋白为鸡IFN-γ受体α链，具有结合配体，传递IFN-γ刺激信号的作用。

二、鸡IFNGR1核苷酸序列和氨基酸序列特征分析

通过SignaIP3.0、TMpred、Motif scan和Domain Linker Prediction(http://www.expasy.org)分析鸡IFNGR1的信号肽、跨膜区和保守性motif，通过基因组BLAST，确定该基因在鸡基因组中的定位，通过与其他物种该基因的比对，确定它们之间的同源性，分析遗传进化的规律。最后我们获得了如下信息：克隆得到的序列包括部分5’端非编码区、编码区和3’端含Poly(A)尾巴的cDNA序列，全长2123bp。chIFNGR1编码442个氨基酸(SEQ ID No.2)，是一种跨膜蛋白，信号肽、胞外域、跨膜区和胞内域分别由20、220、23和179个氨基酸组成(自氨基端第1-20位(Met1-Ala20)为鸡IFNGR1蛋白的信号肽序列，自氨基端第21-240位(Ala21-Gln240)为鸡IFNGR1蛋白的胞外域序列，自氨基端第241-263位为鸡IFNGR1蛋白的跨膜区序列，自氨基端第264-442位为鸡IFNGR1蛋白的胞内域序列)。基因组BLAST表明该基因位于鸡的第3号染色体上，由7个外显子编码，基因大小约18.4kb。第1个外显子编码5’非编码区和信号肽；第2，3，4，5和外显子编码胞外域，第6个外显子编码跨膜区和一部分胞内域，第7个外显子编码剩余的胞内域和3’非编码区。

与人、小鼠、大鼠和牛的IFNGR1相比，鸡IFNGR1胞外域也由两个纤连蛋白III结构域组成，分别命名为D1区和D2区，两个结构域之间也存在一对高度保守的脯氨酸残基PP。在鸡IFNGR1的胞内域含有LPKS和YDKPH序列，这两个序列分别是JAK1和STAT1的结合位点，这在各物种中是保守的。鸡IFNGR1与人和其它哺乳动物IFNGR1之间的同源性为25-29％，序列相似性为53-55％，其中，D1区的相似性最高，可达到62-65％。因此将获得的序列命名为鸡IFNGR1基因。

实施例2、鸡IFNGR1胞外域(EC)重组蛋白的表达

一、鸡IFNGR1EC重组表达载体的构建

用常规PCR方法扩增鸡IFNGR1胞外域，所用的引物为chIFNGR1EC-F(5＇-TAGGATCCGAGCGTCTTCCCGCAGT-3＇)和chIFNGR1EC-R(5＇-GCTCTAGATCAAGCCTGCGTGATAGGAACC-3＇)，PCR反应条件为：94℃5分钟，94℃1分钟，60C1分钟，72℃1分钟，30个循环；72C10分钟。反应结束后，将扩增获得的PCR产物用BamHI和Xba I双酶切，并插入到pMAL-p2x(New EnglandBiolabs公司产品)载体中，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α并测序。得到含有IFNGR1EC的重组质粒，命名为pMAL-p2x/IFNGR1EC。

二、将步骤一的重组质粒转化大肠杆菌TB1感受态细胞，37℃摇菌培养至OD₆₀₀＝0.5-0.8后用0.4mM IPTG在30℃诱导3h，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。融合蛋白用Amylose亲和层析柱(New England Biolabs公司产品)纯化，具体方法为：离心收集rIFNGR1EC表达菌，将细菌重悬于上柱缓冲液中(20mM Tris-HCl(pH7.4)，200mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)，超声破碎细胞后离心，保存上清(粗提物)。将Amylose介质填充于柱子中，用上柱缓冲液洗柱。将粗提物上样，之后用上柱缓冲液洗柱。最后用上柱缓冲液+10mM麦芽糖洗脱融合蛋白质。将获得的纯化蛋白进行SDS-PAGE，并用兔抗MBP血清为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行Western blot分析。SDS-PAGE和Western blot分析显示在66-kDa处出现带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的目的蛋白rchIFNGR1EC。见图1。

实施例3、鸡IFNGR1胞外域(EC)重组蛋白抗病毒活性的测定

纯化的rIFNGR1EC蛋白测定浓度后进行病变抑制效应试验。将带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的rIFNGR1EC进行系列稀释(1：4)，接种到鸡CEF细胞单层上，培养24h后，每孔加入100TCID₅₀马水疱状口炎病毒)(VSV)，当病毒对照孔完全病变时，采用干扰素效价的计算方法，计算rIFNGR1EC的抗病毒活性。rIFNGR1EC具有较高的抗病毒活性，能有效抑制VSV对成纤维细胞的破坏作用。rIFNGR1EC的抗病毒活性为4.58×10³U/mg。

实施例4、鸡IFNGR1胞外域与鸡IFN-γ的相互作用

将纯化的鸡IFN-γ融合蛋白(带有GST标签)与rIFNGR1EC(不带GST标签)等摩尔混合，室温作用1小时，而后加入适量经PBS平衡的Sepharose4B亲和填料，轻轻振荡混匀，室温作用半小时，其间不断振荡以防止填料沉淀；300g离心15min，弃上清，填料用适量PBS至少洗涤三次，最后用二倍填料体积的还原型谷胱甘肽溶液洗涤填料，500g离心15min，上清用3K超滤管浓缩后进行15％SDS-PAGE分析。如图2所示，rchIFNGR1EC可以与rchIFN-γ结合，说明鸡IFNGR1胞外域具有结合配体的作用。

序列表

<110>中国农业大学

<120>chIFNGR1基因、其编码的蛋白及应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>2123

<212>DNA

<213>鸡

<220>

<222>(1)..(53)

<220>

<221>CDS

<222>(54)..(1382)

<220>

<221>3’UTR

<222>(1383)..(2123)

<400>1

<210>2

<211>442

<212>PRT

<213>鸡

<400>2

<210>3

<211>642

<212>DNA

<213>鸡

<400>3

<210>4

<211>213

<212>PRT

<213>鸡

<400>4

Claims

1.一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.含有权利要求2所述基因的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主。

5.如权利要求4所述的宿主，其为大肠杆菌TB1。

6.权利要求1所述的蛋白质在制备抗病毒制剂中的应用，所述病毒为马水疱状口炎病毒。