CN101948890A

CN101948890A - 一种鸡α干扰素的生产方法及构建的工程菌

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Publication number: CN101948890A
Application number: CN2010101877065A
Authority: CN
Inventors: 周学章; 宋振威; 贾芳; 王玉炯
Original assignee: Ningxia University
Current assignee: Ningxia University
Priority date: 2010-06-01
Filing date: 2010-06-01
Publication date: 2011-01-19

Abstract

本发明提供了一种鸡α干扰素的生产方法及其构建的工程菌，其工艺过程为：首先将获得细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶II基因序列插入携带鸡α干扰素成熟蛋白基因序列的pET-28a(+)载体中，得到能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌；再在LB培养液中，37℃，200rpm培养4～8h，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，180rpm继续培养2～6h；所得菌液经进一步分离处理得到鸡α干扰素产品。本发明还提供了一种能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌，其分泌表达的过程为：首先通过PCR获得编码鸡α干扰素成熟蛋白和细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶II的基因序列，连接在pET28a(+)的多克隆位点的下游，构建出表达质粒；再将其转化到基因工程大肠杆菌表达细菌中，在常规的培养液中诱导表达。

Description

一种鸡α干扰素的生产方法及构建的工程菌

技术领域：

本发明涉及基因工程菌株的构建方法；更具体地说，本发明涉及一种鸡α干扰素的生产方法及构建工程菌。

背景技术：

干扰素具有广谱抗病毒作用，由多种氨基酸组成，在pH2～10时比较稳定，对热比较稳定，为干扰素制品的研制提供了良好的条件。在干扰素家族中，α-干扰素的抗病毒作用最为显著，是目前市场上的主流干扰素产品。利用基因工程技术研制重组干扰素是一条高效而经济的途径。随着禽类保健的迫切需求和生物工程技术的不断发展，各种禽类干扰素的研究成为近年来的研究热点。

目前，实验室用于表达目的蛋白的质粒载体有pBS、pET系列和pMAL系列等载体，诱导方式有温度诱导、IPTG诱导和乳糖诱导等。在大肠杆菌(E.coli)表达系统中，许多外源蛋白的高水平表达都会导致形成包涵体，包涵体是细菌表达的蛋白在细胞内凝集，通过低速离心可以分离出这些包涵体。由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，必须对其进行变性和复性才能恢复其生物学活性。自1994年Sick等首先报道了鸡α干扰素基因(GGIFN-α)，并在大肠杆菌(E.coli)和COS细胞中表达后，鸡α干扰素(ChIFN-α)和鸡γ干扰素(ChIFN-γ)基因相继得到克隆，并在原核表达载体中获得表达，表达的产物为包涵体型。

外源基因在大肠杆菌宿主中的过量表达时，常常导致表达产物在胞内形成不溶性的聚集体，即包涵体形成。包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，需要进行变性和复性才能恢复其活性。防止形成包涵体的一个方法是用含有原核信号肽的载体进行表达。信号肽对蛋白质的定位有着非常重要的作用，根据研究报道，适当改造信号肽结构可提高外源蛋白的分泌效率。信号肽能够引导IFN-α通过细胞膜而分泌到细胞外，新合成的蛋白被转运到周质空间，在周质空间中新合成的蛋白是可溶的，然后信号肽通过蛋白分解，保留成熟的IFN蛋白，这种方法对真核分泌蛋白尤为有效。L-天(门)冬酰胺酶II(L-asparaginase，简称ASP)信号肽是一种外周胞质酶，分析编码这种酶的ansB基因显示该酶在它的氨基酸末端包含了一种典型的22个碱基的分泌型信号肽，当这种酶被分泌到细胞周质时，信号肽就被清除同时产生一种含N末端的成熟蛋白亮氨酸，这种特性表明ASP信号肽能够被用来直接分泌表达大肠杆菌中的活性干扰素。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一种鸡α干扰素的生产方法；

本发明的另一目的是提供一种能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌。

本发明的目的按照下述方案实现：

一种鸡α干扰素的生产方法，其工艺过程为：首先将获得细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶II基因序列插入携带鸡α干扰素成熟蛋白基因序列的pET-28a(+)载体中，得到能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌；再在LB培养液中，37℃，200rpm培养4～8h，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，180rpm继续在TEM培养液中培养2～6h；所得菌液经进一步分离处理得到鸡α干扰素产品；

所述菌液的分离处理过程为将菌液移到离心管中，在冰上低温超声破碎，2～8℃高速离心30min，收集沉淀；沉淀用含0.5％TritonX-100和10mM EDTA的PBS Buffer(pH7.0～7.4)洗涤1～3次；将沉淀悬浮于PBS buffer，加甘油冻存；

所述菌液的分离处理过程为：菌液进入冷冻干燥机，冷冻干燥20h以上；

一种能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌，该工程菌已提交到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC3800；

所述的能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌，其重组表达载体由以下元件构成：

1)鸡α干扰素成熟蛋白基因序列；

2)细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶II基因序列；

3)pET-28a(+)；

所述鸡α干扰素工程菌分泌表达的过程为：首先通过PCR获得编码鸡α干扰素成熟蛋白和细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶II的基因序列，连接在pET28a(+)的多克隆位点的下游，构建出表达载体；再将其转化到基因工程大肠杆菌表达细菌中，在TEM的培养液中诱导表达。

本发明提高了鸡α干扰素基因目的蛋白的表达效率，属国内首次采用在包涵体型重组表达质粒pET-28a-ChIFN-α前加入一段L-天(门)冬酰胺酶II(ASP)信号肽基因，重新改造构建成分泌型表达载体，使其得到改善，省去了pET-28a-ChIFN-α表达形成包涵体后的变性、复性提纯过程，并实现了诱导表达。ASP信号肽在重组表达载体中的考察结果表明，ASP信号肽可使重组质粒经人工改造后，由目的蛋白包涵体型表达转变为分泌型表达，并且提高了鸡α干扰素成熟蛋白基因的表达效果，这为筛选出鸡α干扰素成熟蛋白的高效表达菌株奠定了基础。

附图说明：

图1：构建的ASP-ChIFN-α基因工程菌株示意图。

图2：重组质粒pET-28a-ChIFN-α的酶切鉴定。

图中1，2：pET-28a-ChIFN-α digested by EcoR I and Sal I；M：DL2000 DNAMarker

图3：重组质粒pET-28a-ASP-ChIFN-α的酶切鉴定。

图中1，2：pET-28a-ASP-ChIFN-α by EcoR I and Nco I；M：DL2000 DNA Marker

图4：重组质粒pET-28a-ASP-ChIFN-α的SDS-PAGE和Western-blot结果。

图中1：induced BL21；2，6：induced pET-28a-ChIFN-α；3：non-inducedpET-28a；4：non-induced pET-28a-ChIFN-α；5：non-inducedpET-28a-ASP-ChIFN-α；7：induced 3h pET-28a/ASP-ChIFN-α；8：induced 6hpET-28a/ASP-ChIFN-α；9：western-blot result；M：protein marker。

具体实施方式：

1.材料

大肠杆菌JM109、BL21(DE3)、DH5α(pMD18T)、质粒pET-28a(+)为本实验室保藏；连接酶、限制性核酸内切酶EcoR I(15U/μL)、Nco I(10U/μL)、sal I(15U/μL)、Ex Taq DNA聚合酶(5U/μL)等购自takara有限公司；DNA回收试剂盒购自Promega公司；其余试剂均为国产纯；引物：

P1为5’-cttgaattctgcaaccaccttcgcc-3’，

P2为5’-caggtcgacctaagtgcgcgtgttgcct-3’；

P3为5’-cgccatggagtttttcaaaaag-3’，

P4为5’-ggaattctgccaatgctgcacc-3’；由上海生工公司合成。

2.步骤

第一步：PCR扩增pIFNα目的片断

利用引物P1、P2，采用25μL，以提取的鸡肝组织基因组DNA为模板，进行PCR反应；PCR仪程序设定为：94℃变性4min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，扩增32个循环；72℃延伸10min。

第二步：ChIFNα克隆载体的构建

采用EcoR I和Sal I双酶切PCR扩增的ChIFNα目的片断，按照Wizard SVGel and DNA PCR Clean-up System说明书回收ChIFNα酶切片断，将回收产物与相应酶切回收的pMD18-T载体按3∶1比例连接，4℃过夜，连接产物采用CaCl₂法转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，小提质粒酶切鉴定并测序。

第三步：PCR扩增ASP目的片断

利用引物P3、P4，采用25μL，以提取的大肠杆菌基因组DNA为模板，进行PCR反应；PCR仪程序设定为：94℃变性4min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸30sec，扩增30个循环；72℃延伸10min。

第四步：ASP克隆载体的构建

采用Nco I和EcoR I双酶切PCR扩增的ASP目的片断，按照Wizard SV Gel andDNA PCR Clean-up System说明书回收ChIFNα酶切片断，将回收产物与相应酶切回收的pMD18-T载体按3∶1比例连接，4℃过夜，连接产物采用CaCl₂法转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，小提质粒酶切鉴定并测序。

第五步：鸡干扰素原核表达载体的构建

分别用EcoR I和Sal I双酶切克隆载体pMD18-T-ChIFNα获取ChIFNα酶切片断，按照Wizard SV Gel and DNA PCR Clean-up System说明书进行ChIFNα酶切片断的回收，将酶切片断与EcoR I和Sal I双酶切处理的pET-28a(+)回收片段按4∶1比例连接，4℃过夜，连接产物经CaCl₂法转化到大肠杆菌DH5α和表达菌BL21(DE3)感受态细胞中，提取质粒酶切鉴定，将酶切正确的表达载体命名为pET-28a-ChIFNα。

第六步：重组ASP-ChIFN-α表达体系的构建

分别用Nco I和EcoR I双酶切表达质粒pMD18-T-ASP获取ASP酶切片断，按照Wizard SV Gel and DNA PCR Clean-up System说明书进行ASP酶切片断的回收，将酶切片断与Nco I和EcoR I双酶切处理的pET-28a-ChIFNα回收片段按4∶1比例连接，4℃过夜，连接产物经CaCl₂法转化到大肠杆菌DH5α和表达菌BL21(DE3)感受态细胞中，提取质粒酶切鉴定，将酶切正确的表达载体命名为pET-28a-ASP-ChIFNα。按照CaCl₂法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将pET-28a-ASP-ChIFNα转入BL21(DE3)感受态细胞，同时进行对照质粒的转化、抗性(Kan)筛选，挑选菌落利用试剂盒提取质粒进行酶切鉴定、PCR检测等。将正确构建的菌株命名为BL21(DE3)(pET-28a-ASP-ChIFN-α)。

第七步：ASP-ChIFNα融合蛋白的诱导表达

无菌状态下，LB培养液添加Kan至终浓度为10μg/mL，调整pH为7.0～7.2，37℃，200rpm培养BL21(DE3)(pET-28a-ASP-ChIFN-α)，4～8h，加IPTG至终浓度为0.1～1.5mmol/L，37℃，180rpm继续培养2～8h。

第八步：重组ChIFNα蛋白的粗提

将诱导表达后的菌液100mL转移到离心管中，4℃超声破碎(200W，50％振幅，间歇5s，破碎2s，共20min)，4℃，12000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀；沉淀用含0.5％TritonX-100和10mM EDTA的PBS Buffer(pH7.0～7.4)洗涤1～3次；将沉淀悬浮于PBS buffer，加甘油冻存。或者将裂解的上清，进入冷冻干燥机，冷冻干燥20h以上。

Claims

1.一种鸡α干扰素的生产方法，其工艺过程为：首先将获得细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶Ⅱ基因序列插入携带鸡α干扰素成熟蛋白基因序列的pET-28a(+)载体中，得到能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌；再在LB培养液中，37℃，200rpm培养4～8h，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，180rpm继续培养2～6h；所得菌液经进一步分离处理得到鸡α干扰素产品。

2.如权利要求1所述的鸡α干扰素的生产方法，其特征在于所述菌液的分离处理过程为将菌液移到离心管中，2～8℃，低温超声破碎，2～8℃高速离心30min，收集沉淀；沉淀用含0.5％ TritonX-100和10mM EDTA的PBS Buffer(pH7.0～7.4)洗涤1～3次；将沉淀悬浮于PBS buffer，加甘油冻存。

3.如权利要求1所述的鸡α干扰素的生产方法，其特征在于所述菌液的分离处理过程为：菌液进入冷冻干燥机，冷冻干燥20h以上。

4.一种能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌，该工程菌已提交到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC3800。

5.如权利要求4所述的能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌，其特征在于其重组表达载体由以下元件构成：

1)鸡α干扰素成熟蛋白基因序列；

2)细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶Ⅱ基因序列；

3)pET-28a(+)。

6.如权利要求4所述的能够分泌表达鸡α干扰素的工程菌，其特征在于其分泌表达的过程为：首先通过PCR获得编码鸡α干扰素成熟蛋白和细菌信号肽L-天(门)冬酰胺酶Ⅱ的基因序列，连接在pET28a(+)的多克隆位点的下游，构建出表达载体；再将其转化到基因工程大肠杆菌表达细菌中，在TEM的培养液中诱导表达。