CN101838651A

CN101838651A - 表达纯化猪α-干扰素的基因工程菌株构建

Info

Publication number: CN101838651A
Application number: CN200910237292A
Authority: CN
Inventors: 周学章; 王玉炯; 宋振威; 许冠英
Original assignee: BEIJING JIUCAOTANG PHARMACEUTICAL RESEARCH INSTITUTE CO LTD
Current assignee: BEIJING JIUCAOTANG PHARMACEUTICAL RESEARCH INSTITUTE CO LTD
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2009-11-13
Publication date: 2010-09-22

Abstract

本发明涉及表达猪α-干扰素的基因工程菌株的构建方法。本发明利用蛋白phasin与PHB特异结合的特性，将phasin、内含肽和目的蛋白融合表达，融合蛋白表达后，在工程菌株体内与PHB特异性结合；由于PHB颗粒重力较大，通过简单离心即可携带融合蛋白与杂质分离，除去杂质后，通过改变PHB亲和体的悬浮液温度、pH值，促使已经突变了的内含肽N末端不发生自动切割，C末端发生自动切割，释放目的蛋白至溶液，达到纯化目的蛋白的目标。利用构建的体系，蛋白质表达和纯化同时进行，从而节约了时间，降低了成本，并且可以保证大部分蛋白质的活性结构，操作步骤简单适于工业生产。

Description

表达纯化猪α-干扰素的基因工程菌株构建

技术领域

本发明涉及表达猪α-干扰素的基因工程菌株的构建方法。更具体地说，本发明涉及采用内含肽介导的PHB系统在原核生物中表达和纯化得到猪α-干扰素的方法。

背景技术

干扰素具有广谱抗病毒作用，由多种氨基酸组成，在pH2～10时比较稳定，对热比较稳定，为干扰素制品的研制提供了良好的条件。在干扰素家族中，α-干扰素的抗病毒作用最为显著，是目前市场上的主流干扰素产品。利用基因工程技术研制重组干扰素是一条高效而经济的途径。随着动物保健的迫切需求和生物工程技术的不断发展，各种动物干扰素的研究成为近年来的研究热点。

目前，α-IFN常采用亲和纯化方式获得。

传统的亲和纯化方式是利用基因融合技术将亲和标签和目标蛋白进行融合表达质，再依靠亲和标签与固定化的配体之间的特异性吸附作用实现目标蛋白的分离纯化。通常情况下，通过亲和层析得到的融合蛋白，需再经过蛋白酶的水解作用移除亲和标签以得到纯化的目标蛋白质。在实验室规模的应用中，亲和纯化方式有着简单而方便的优点，但也存在着一些缺陷。一方面，为了消除亲和标签常常需要外加蛋白酶。尽管设计之初在融合标签与目的蛋白质之间引入了能够被蛋白酶特异性识别并切割的连接片段，但仍然存在着目标蛋白质被意外切割的情况；再者，后期对蛋白酶的清除过程以及蛋白酶本身较高的价格也增加了蛋白质纯化的成本。另一方面，亲和树脂及缓冲液的高制造成本也进一步加大了蛋白质纯化的代价，而在大规模的生产应用中，成本因素往往是必须考虑的一个重要方面。

因此，传统的亲和纯化技术由于受到上述两方面的限制，在大规模的工业生产中较难以发挥作用。如何降低蛋白质亲和纯化的成本也就成了人们研究的一个重要方向。而我们所采用的内含肽介导的新型蛋白质纯化方式正切合了这种需要。

内含肽是存在于前体蛋白中的一段序列，在前体蛋白转化为成熟蛋白质的过程中，依靠自我剪切作用从前体蛋白中释放出来，同时将两端的蛋白质外显肽(extein)连接在一起，该过程即蛋白质剪接过程。内含肽以其独特的蛋白质剪接功能而被广泛应用于蛋白质工程领域，比如蛋白质的纯化、连接、环化等。其中，在蛋白质纯化方面，修饰后的内含肽能介导N-端或C-端单侧肽键断裂，与蛋白质亲和纯化技术联合应用，为重组表达的活性蛋白提供了良好的分离纯化途径，使传统的亲和层析技术有了重大突破。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的可用于表达猪α-干扰素的基因工程菌株，该菌株的构建方法，该菌株生产猪α-干扰素的方法；并且利用该菌株表达目的蛋白能够有效地降低生产成本。

本发明利用蛋白phasin与PHB特异结合的特性，将phasin、内含肽和目的蛋白融合表达；融合蛋白三联体phasin-内含肽-目的蛋白表达后，在工程菌株体内与PHB特异性结合；由于PHB颗粒重力较大，通过简单离心即可携带融合蛋白与杂质分离，除去杂质后，通过改变PHB亲和体的悬浮液温度、pH值，促使已经突变了的内含肽N末端不发生自动切割，C末端发生自动切割，释放目的蛋白至溶液，达到纯化目的蛋白的目标。

本发明的表达猪α干扰素基因工程菌株的构建方法包括如下步骤：

1.通过定点突变PCR获得编码猪α干扰素成熟蛋白的基因序列；

2.将步骤1获得的基因序列连接在融合标签基因phasin和自切割蛋白基因intein的下游，构建表达质粒；

3.将表达质粒与编码亲和介质PHB的质粒共转化表达细菌BLR中。

4.将该菌株在改良的培养液(添加1.5～3.0％的乳酸钠的LB培养基，pH为6.8～7.5中培养16～24h，利用乳糖(终浓度0.1～10g/L)诱导基因工程菌株表达外源蛋白。在外源蛋白的表达过程中，诱导生成的三联体蛋白中phasin与PHB颗粒特异性地亲和，并且结合在一起。

5.冰浴中超声波破碎工程菌，离心分离PHB颗粒；大颗粒在一定浓度(20mM Tris-bispropane，50mM NaCl，1mM DTT，2mM EDTA)和pH值(6.0～6.5)的溶液中悬浮；逐步调节溶液的pH，并在一定温度下(20～25℃)诱导intein的C端特异断裂(时间为32h～72h)，释放猪α干扰素蛋白，达到同步表达和纯化。

本发明采用蛋白质自切割原件内含肽(intein)替代蛋白酶的作用，以细菌产生的内源性PHB颗粒替代亲和基质，从而有效的简化了纯化步骤、降低纯化蛋白的成本；是一种高效表达，自动切割，费用低廉的蛋白纯化体系，有利于蛋白大规模纯化。

生物材料保藏说明

基因工程菌株BLR(DE3)(pET-PPPIpIFNα+pJM9131)，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，编号：CGMCC3439，保藏日期：2009年11月12日。

附图说明

图1：构建的基因工程菌株结构示意图。为双质粒转化、表达系统，其中PET-3PIIFNα为主要的融合蛋白表达系统，并且能够执行子切割功能；质粒PJM9131主要是合成作为亲和介质的PHB颗粒。

图2：蛋白质聚合体电泳图，其中泳道1为菌株表达的融合蛋白，泳道2为蛋白质marker。

图3：纯化的蛋白质电泳图，其中泳道1为marker，泳道2为菌株纯化的干扰素蛋白。

具体实施方式

1.材料

大肠杆菌DH5α、BLR(DE3)、DH5α(pUC19)为本实验室保藏；质粒pET-PPPIM和pJM9131由普林斯顿大学D.Wood教授赠；限制性核酸内切酶、连接酶购自takara有限公司；BsrG I购自biolab有限公司；DNA回收试剂盒购自Promega公司；其余试剂均为国产纯；引物上游为5′TGTACACAACTGtGACCTGCCtCAaACCT3′；下游为5′cccaagcttctccttcttcctcagtctgt3′，由qiangen公司合成。

2.步骤

第一步：PCR扩增pIFNα目的片断

采用25μL，以本实验室构建的猪干扰素重组质粒为模板，进行PCR反应；PCR仪程序设定为：95℃变性5min；95℃变性45seconds，58℃退火50s，72℃延伸50s，扩增25个循环；72℃延伸10min。

第二步：pIFNα克隆载体的构建

采用BsrG I和HindIII双酶切PCR扩增的pIFNα目的片断，按照Wizard SV Gel and DNAPCR Clean-up System说明书回收pIFNα酶切片断，将回收产物与相应酶切回收的pUC19载体按3∶1比例连接，4℃过夜，连接产物采用CaCl₂法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，小提质粒酶切鉴定并测序。

第三步：猪干扰素原核表达载体的构建

采用BsrG I和Hind III双酶切克隆载体pMD18-T-pIFNα获取pIFNα酶切片断，按照Wizard SV Gel and DNA PCR Clean-up System说明书进行pIFNα酶切片断的回收，将酶切片断与BsrG I和Hind III双酶切处理的pET-PPPI(Ampr)回收片段按5∶1比例连接，4℃过夜，连接产物经CaCl₂法转化到大肠杆菌DH5α和表达菌BL21(DE3)感受态细胞中，提取质粒酶切鉴定，将酶切正确的表达载体命名为pET-PPPIpIFNα。

第四步：内含肽介导PHB纯化猪干扰素体系的构建

按照CaCl₂法制备大肠杆菌BLR(DE3)感受态细胞，将pET-PPPIpIFNα和pJM9131同时转入BLR(DE3)感受态细胞，同时进行对照质粒的转化和抗性(Kan，Amp，Tet)筛选，利用试剂盒提取质粒酶切鉴定。鉴定正确菌体命名为BLR(DE3)(pET-PPPIpIFNα+pJM9131)。

第五步：pIFNα融合蛋白的诱导表达

无菌状态下，LB培养液添加1.5～3.0％的乳酸钠，调整pH为7.0～7.2，添加Kan、Amp、Tet等抗生素至终浓度为10μg/mL，37℃，200rpm培养BLR(DE3)(pET-PPPIpIFNα+pJM9131)16h，加IPTG至终浓度为0.1～1.5mmol/L，37℃，180rpm继续培养4～10h。

第六步：纯化目的蛋白pIFNα

将第五步的菌液100mL转移到离心管中，4℃，5000rmp，离心10min，弃去上清；沉淀加入45mL的Lysis buffer(20mM Tris-bis propane，50mM NaCl 1mM DTT，2mM EDTA，0.25mg/100mL Lyzozyme)悬浮，4℃超声破碎(200W，50％振幅，间歇5s，破碎2s，共20min)，4℃，12000rpm高速离心30min，收集沉淀；将沉淀悬浮于Wash buffer(20mM Tris-bis propane，50mMNaCl，1mM DTT，2mM EDTA)，4℃，12000rpm高速离心30min，收集沉淀，重复2次；将不溶物悬浮于Cleavage buffer(20mM Tris-bis propane，50mM NaCl，1mM DTT，2mM EDTA)，4℃，12000rpm高速离心30min，收集沉淀；将不溶物悬浮于Cleavage buffer，调整pH为6.0～7.0，20±2℃开始裂解，48h后，4℃，12000rpm高速离心30min，收集上清；上清以三氯乙酸沉淀(终浓度为20％)沉淀。

第七步：上清的工厂化处理

裂解的上清，进入冷冻干燥机，冷冻干燥20h以上。

Claims

1.一种在原核生物中表达猪α干扰素的方法，其特征在于构建的基因工程菌中同时实现猪α干扰素蛋白的表达和纯化。首先是通过定点突变PCR获得编码猪α干扰素成熟蛋白的基因序列，连接在融合标签基因phasin和自切割蛋白基因intein的下游，构建了表达质粒；将其与编码并累积的亲和介质PHB的质粒共转化表达细菌中；在改良的培养液中诱导表达，并诱导phasin蛋白与PHB颗粒亲和；分离亲和后的PHB颗粒并在一定条件下诱导内含肽intein的C端特异断裂，释放目标蛋白，从而达到表达和纯化同步。

2.根据权利要求1构建的一种工程菌株BLR(DE3)(pET-PPPIpIFN α+pJM9131)，该工程菌已提交到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC3439。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于：这种菌株含有猪α干扰素蛋白基因，并能在原核生物中表达和纯化。

4.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于所含的重组表达载体是由以下元件构成：

1)猪α干扰素重组质粒；

2)质粒pET-PPPI；

3)质粒pJM9131。

5.一种用权利要求1-4所述的工程菌株生产猪α干扰素的方法，其特征在于：将获得的携带猪α干扰素的工程菌在改良LB培养液中，37℃，200rpm培养16h，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，180rpm继续培养8h。将菌液移到离心管中，2～8℃，离心10min，弃去上清；沉淀加入Lysis buffer悬浮，低温超声破碎，2～8℃高速离心30min，收集沉淀；将沉淀悬浮于Wash buffer，低温高速离心30min，收集沉淀，重复2次；将不溶物悬浮于Cleavage buffer，低温高速离心30min，收集沉淀；将不溶物悬浮于Cleavage buffer，调整pH为6.5，20±2℃开始裂解，48h后，低温高速离心30min，收集上清；上清以三氯乙酸沉淀沉淀。所得上清液中含纯化后的猪α干扰素。

6.根据权利要求5所述的改良LB培养液，其特征在于：培养液中添加1.5～3.0％的乳酸钠，调整pH为6.8～7.5，添加Kan、Amp、Tet等抗生素至终浓度为1～50μg/mL。