CN110079515A - 一种棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因的原核表达方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因的原核表达方法。一种棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因的原核表达方法，包括以下步骤：提取棉铃虫幼虫中肠的总RNA，克隆棉铃虫中肠蛋白酶基因片段；将棉铃虫中肠蛋白酶基因构建在带有His和Gst双标签的Pet41表达载体上；重组蛋白的表达、纯化、浓缩、标签切除及鉴定。本方法直接表达棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶的成熟肽，避免了表达酶原后对酶原进行体外激活步骤，提高了表达具有生物活性的中肠丝氨酸蛋白酶的成功率。

Description

一种棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因的原核表达方法
技术领域
本发明涉及生物技术，具体涉及一种适用于棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶原核表达的方法及其应用。
技术背景
丝氨酸蛋白酶(serine proteinases,SPs)是生物界中最大的水解酶家族，包括胰蛋白酶(trypsin)、凝血酶(thrombin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、弹性蛋白酶(elastase)等。它们都含有三个氨基酸关键残基构成的活性中心(Ser,His,Asp)，具有相同的水解作用机制，但底物结合口袋处残基的差异决定了各自对底物的选择性(Barrett等，Handbook of proteolytic enzymes.2003)。目前，约250个丝氨酸蛋白酶的三维结构已知。这些蛋白酶全为β蛋白，核心区域主要是两个β折叠桶构成(即N端域和C端域)，每一个β折叠桶又由多个β折叠片组成，活性区域则位于两个β折叠桶之间(孙之荣等，丝氨酸蛋白酶超家族分子结构进化研究.生物物理学报.1999；15:530-535.)。
丝氨酸蛋白酶结构活性区域大致相同，其催化机制也类似，现以胰凝乳蛋白酶为例介绍SPs的催化方式。首先，蛋白酶分子表面的疏水口袋即S1口袋与底物的疏水部位相结合。Ser的羟基失去一个质子，传递给His的咪唑基团，从而增大了Ser的羟基氧周围的电荷密度，进而容易和底物比较敏感的肽键羰基碳原子发生亲核反应，生成了共价键结合的中间物。另外，为了稳定过渡中间体，促进反应的顺利进行，His的咪唑基团再贡献一个质子传递给Asp的羧基。随后是产物亚胺的生成。释放出一个质子的His作为酸，去进攻底物肽键上的亚胺氮，断开肽键，发生蛋白酶的酰化作用。最后需要水分子贡献一个质子，代替胺的位置，并将质子传递给His，这时水分子的羟基对酰化的蛋白酶进行亲核攻击，再次形成一个过渡的中间体，His的咪唑基团又从碱变为酸，供出质子转到Ser中的氧原子上，底物分子中的酸部位得以释放，蛋白酶也恢复其原来的游离状态。
鳞翅目昆虫幼虫中肠是一个富含多种蛋白酶的复杂环境，主要包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶等(Srinivasan等，Structural and functionaldiversities in lepidopteran serine proteases.Cellular&Molecular BiologyLetters.2005；11:132-154.)。这些蛋白酶大部分属于丝氨酸蛋白酶，不仅在食物消化中起作用，对昆虫的生长代谢、组织重建、免疫防卫、血液凝固等生物过程也有诸多影响。
Bt杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)作为一种外源物，在被昆虫取食后，首先在昆虫中肠丝氨酸蛋白酶的水解作用下溶解形成活化毒素，活化毒素与中肠受体结合，再通过一系列作用最终导致昆虫死亡(Bravo等，How to cope with insectresistance to Bt toxins？American Journal of Public Health.2008；26:573-579)。在这一复杂过程中，昆虫中肠丝氨酸蛋白酶对Bt毒素的酶解活化是一个毒素发挥毒杀作用和害虫对毒素产生抗性的关键步骤，比如已有研究证明昆虫中肠丝氨酸蛋白酶对原毒素活化作用的降低、对活化毒素降解作用的增强可导致昆虫对Bt毒素抗性的产生。Rajagopal等通过半定量RT-PCR发现棉铃虫抗性品系中蛋白酶HaSP2的表达量显著下降，将HaSP2进行体外原核表达，用纯化得到的HaSP2孵育Cry1Ac原毒素，发现HaSP2能成功活化Cry1Ac原毒素，说明HaSP2的表达量下调是棉铃虫对Cry1Ac原毒素抗性产生的重要原因(Rajagopal等，Resistance of Helicoverpa armigera to Cry1Ac toxin from Bacillusthuringiensis is due to improper processing of the protoxin.BiochemicalJournal.2009；419:309-316.)。Shao等发现，对原毒素更敏感的家蚕，其中肠酶液在活化原毒素HD-1产生了较多的活化毒素，而棉铃虫中肠酶液则更多作用于活化毒素的降解，证实了中肠酶液对活化毒素的过度降解也会导致抗性的产生(Shao等，Processing of delta-endotoxin of Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki HD-1in Heliothis armigeramidgut juice and the effects of protease inhibitors.Journal of InvertebratePathology.1998；72:73-81)。
胰蛋白酶缺失以及中肠丝氨酸蛋白酶总活性降低使其对原毒素活化作用不充分，胰凝乳蛋白酶表达量上调后对活化毒素的过度降解，已经证实是昆虫对Bt毒素产生抗性的两个重要原因。但是，哪些丝氨酸蛋白酶参与原毒素的活化，哪些介导毒素的降解等尚不清楚。随着异源蛋白功能表达技术的日渐成熟，利用体外表达产物来直接进行蛋白酶与底物互作的研究将有助于解析蛋白酶对毒素的活化和降解过程，更直观了解在害虫抗性产生中的作用。
蛋白表达实际上是重组DNA技术的一种运用，是指人为地将目标蛋白基因合成后，插入病毒、质粒或其他载体，转入受体细胞，从而使外源蛋白在宿主细胞中进行正常复制，在新的遗传环境下完成功能表达(吴乃虎等，基因工程原理第二版上册.北京.1999:43-44)。目前蛋白表达系统主要有原核表达系统和真核表达系统，真核表达主要分为酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。与其他表达系统相比，大肠杆菌原核表达系统具有遗传背景清楚、培养操作简单、目的蛋白表达水平高等优点，是目前应用较广泛的蛋白质表达系统(Nuc等，Recombinant protein production in Escherichiacoli.Postepy Biochemii.2006；52:448-456)。大肠杆菌原核表达系统主要包括两个部分：表达载体和表达菌株。常用的表达载体有Novagen公司的pET系列、Qiagen公司的pQE系列和GE Healthcare公司的pGEX系列。常用的表达菌株有BL21、BL21(DE3)、Rosetta、Origami2、pLysS和pLysE等。而Novagen公司的pET系统由于其本底表达低、表达可控和表达效率高这些优点，因而逐渐成为原核表达的首选。由于pET系统含有噬菌体T7启动子，因此本文选择带有T7聚合酶基因的BL21(DE3)菌株来进行原核表达。
发明内容
本方法的目的是在已有的原核表达技术上，优化出一种适用于棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因的原核表达方法。
传统的原核表达系统一般采用大肠杆菌的最适生长温度37℃作为诱导温度，诱导时间为3—4h，最终目的蛋白以可溶形式或包涵体形式表达。棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶若以Pet30、Pet32等载体表达，通常会以包涵体的形式表达，导致表达蛋白的获取有一定的难度，获取过程也极易导致表达成功的蛋白失活，从而无法开展后续相关的研究。本方法中为使该类蛋白酶能够成功以可溶形式在大肠杆菌破碎后上清中表达，选取了带有组氨酸标签(His-Tag)和谷胱甘肽巯基转移酶标签(Gst-Tag)双标签的Pet41载体，表达的诱导温度降低到16℃，转速调整为120rpm，诱导时间为22h。这一方法不仅表达出足够量的蛋白，同时方便后期蛋白的鉴定与纯化，
hasp3、hasp6分别是棉铃虫体内两个具有代表性的胰凝乳蛋白酶基因、胰蛋白酶基因,对应的蛋白Hasp3、Hasp6均属于丝氨酸蛋白酶类，含有丝氨酸蛋白酶保守的催化三联体(His、Asp、Ser)结构，同时具有6个保守的半胱氨酸。利用本发明方法对Hasp3、Hasp6蛋白进行原核表达，成功检测到其对相应通用底物的活性。
本方法的目的可通过以下技术方案实现：
一种棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因的原核表达方法，包括以下步骤：
1)提取棉铃虫幼虫中肠的总RNA，克隆棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因片段；
2)将棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因克隆到带有His、Gst双标签的表达载体上,得到含棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因的重组表达载体；
3)将构建的重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性克隆；
4)在含Kan的LB平板培养基上37℃、100rpm培养重组菌至OD为0.5～0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，于16～37℃100-120rpm诱导表达5～22h；
5)收集菌体，破碎、离心、取上清液后经纯化、浓缩、肠激酶切除标签得到表达成功的棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶。
其中，所述的带有His、Gst双标签的表达载体优选Pet41表达载体。
所述的原核表达方法中，优选将棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因克隆到Pet41表达载体的双酶切位点间。
所述的原核表达方法中，IPTG诱导温度优选16℃。
所述的原核表达方法中，IPTG诱导时间优选22h。
所述的纯化优选依次包括GST柱初步纯化和阴离子交换柱法纯化。
所述的原核表达方法中，优选用分子截留量为10kDa的超滤管在4℃进行浓缩。
所述的棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因选自胰凝乳蛋白酶基因hasp3和胰蛋白酶基因hasp6，其他棉铃虫胰凝乳蛋白酶基因hasp1、hasp14和胰蛋白酶基因hasp7、hasp11等丝氨酸蛋白酶基因等也可以运用该方法表达。
有益效果
通常情况下中肠丝氨酸蛋白酶在昆虫体内先形成酶原，酶原在一些蛋白酶的作用下，被切除掉N端的信号肽，重新折叠形成具有一定功能结构的蛋白。本方法直接表达棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶的成熟肽，避免了表达酶原后对酶原进行体外激活步骤，提高了表达具有生物活性的中肠丝氨酸蛋白酶的成功率。
因为大肠杆菌作为原核表达宿主，不能像真核生物一样对蛋白进行N端、C端的糖基化、磷酸化、脂肪酸酰化及二硫键形成等翻译后修饰，这些加工会影响到异源蛋白功能结构、溶解度及稳定性等。同时外源蛋白的高效表达容易形成无活性的包涵体，这也是原核表达体系用于外源蛋白规模化生产的限制因素因此。很多研究者通过优化表达条件或者对包涵体蛋白(inclusion body)进行变性后重新折叠等方法来解决这一难题，然而不同蛋白酶的复性条件不一，需要大量时间摸索复性条件，且复性效果不理想，成功的例子较少。与传统的原核表达条件相比，本方法采用带有His、Gst双标签的Pet41载体，将诱导温度降低到16℃，并将培养转速降低到120rpm，诱导表达22h，这些改进均会降低大肠杆菌合成蛋白的速度，从而有利于形成可溶的重组蛋白，包涵体蛋白减少，无需进行蛋白质复性这一过程。通过对Hasp3、Hasp6两种中肠丝氨酸蛋白酶的成功表达，证明该方法可以应用于棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因的表达，为昆虫体内蛋白酶的相关功能解析提供了基础。
附图说明
图1 rHaSP3蛋白酶在不同温度诱导下表达情况
载体为Pet41。1-3泳道依次为：37℃诱导下的空载体上清液、上清液、包涵体溶解液；4-6泳道依次为：28℃诱导下的空载体上清液、上清液、包涵体溶解液；7-9泳道依次为：16℃诱导下的空载体上清液、上清液、包涵体溶解液；方框所指为目的蛋白处。
图2时间梯度诱导表达的rHaSP3蛋白酶
载体为Pet41。1泳道为16℃诱导下的空载体上清；2-3泳道分别为：16℃诱导5h后的上清液、包涵体溶解液；4-5泳道分别为：16℃诱导10h后的上清液、包涵体溶解液；6-7泳道分别为：16℃诱导18h后的上清液、包涵体溶解液；8-9泳道分别为：16℃诱导22h后的上清液、包涵体溶解液；方框所指为目的蛋白处。
图3 rHaSP3蛋白表达、浓缩以及酶切的SDS-PAGE鉴定
载体为Pet41，rHaSP3蛋白在16℃诱导表达22h。1泳道为空载体上清，2泳道为未纯化的蛋白酶上清液，3泳道为通过GST柱和阴离子交换柱纯化过的蛋白酶上清液，4泳道为经过超滤管浓缩后的蛋白酶上清液，5泳道为通过肠激酶酶切后的蛋白酶上清液，方框所指处为目的蛋白。
图4 rHaSP3蛋白表达Western blot分析
1泳道为16℃诱导下的空载体上清；2泳道为rHaSP3上清液；方框所指为目的蛋白处。
图5 HaSP3蛋白酶表达产物活性测定
本图为HaSP3蛋白酶表达产物活性测定(以SAAPFpNA为底物)。a曲线所指为目的蛋白的活性测定；b曲线所指为含肠激酶的200mM NaCl的活性测定；c曲线所指未酶切的蛋白产物活性测定。
图6 rHaSP6蛋白表达、浓缩以及酶切的SDS-PAGE鉴定
载体为Pet41，rHaSP6蛋白在16℃诱导表达22h。1泳道为未纯化的蛋白酶上清液，2泳道为通过GST柱和阴离子交换柱纯化过的蛋白酶上清液，3泳道为经过超滤管浓缩后的蛋白酶上清液，4泳道为通过肠激酶酶切后的蛋白酶上清液，方框所指处为目的蛋白。
图7 rHaSP6蛋白表达Western blot分析
1泳道为16℃诱导下的空载体上清；2泳道为rHaSP6上清液；方框所指为目的蛋白处。
图8 HaSP6蛋白酶表达产物活性测定
本图为HaSP6蛋白酶表达产物活性测定(以BApNA为底物)。a曲线所指为目的蛋白的活性测定；b曲线所指为含肠激酶的200mM NaCl的活性测定；c曲线所指未酶切的蛋白产物活性测定。
具体实施方式
实施例1以棉铃虫rHaSP3蛋白的表达为例
第一步：提取棉铃虫幼虫中肠的总RNA，克隆棉铃虫中肠蛋白酶基因片段
提取棉铃虫SCD品系幼虫(5龄第二天)中肠总RNA，合成cDNA第一条链。对hasp3基因的ORF进行分析，为使读码方式正确，C端能够正确终止，上下游引物5’端分别引入EcoRI和HindIII酶切位点。以棉铃虫中肠cDNA为模板，使用5’端特异性引物及3’端特异性引物，进行hasp3基因片段的PCR扩增。PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，72℃保温10min，4℃保存。
hasp3基因上游引物序列为：gaattcattgtcggtggctctatttcaagt(SEQ ID NO.1)
hasp3基因下游引物序列为：aagcttttaaagaagattgttgatccagct(SEQ ID NO.2)
第二步：将棉铃虫中肠蛋白酶基因hasp3构建在Pet41表达载体上
将PCR产物纯化后连接到pEasy-T3载体并转化Trans1-T1感受态，挑取阳性克隆验证后送测序。测序正确的阳性克隆扩大培养，提取pEasy-T3-hasp3质粒。质粒经酶切后连接到Pet41载体上，转化E.coli BL21(DE3)感受态，挑取阳性克隆备用。
第三步：rHaSP3重组蛋白的原核表达条件优化
(1)取阳性克隆菌接种于含Kan(100ug/ml)LB平板培养基上，37℃过夜培养；第2天挑取单菌落于3ml含Kan的LB液体培养基中，37℃，100rpm过夜培养；以1：20比例稀释于60ml含Kan的LB液体培养基中，37℃，100rpm培养至OD为0.5左右，将此菌液分装于3支50ml的离心管中；加入终浓度为0.1mM的IPTG，分别于37℃、28℃16℃(100rpm)诱导表达21h；空载体作对照；各取5ml诱导后的菌液，收集沉淀，加入1ml细胞破碎缓冲液，破碎后取上清和沉淀(加入1ml包涵体溶解缓冲液)，进行SDS-PAGE分析，结果见附图1,由图1可见,不同温度下，rHaSP3蛋白酶在16℃下在上清液中表达量最大。
(2)挑取单菌落于4ml含Kan的LB液体培养基中，37℃，100rpm过夜培养；以1：20比例稀释于80ml含Kan的LB液体培养基中，37℃，100rpm培养至OD为0.5左右，将此菌液分装于4支50ml的离心管中；加入终浓度为0.1mM的IPTG，分别于16℃(100rpm)诱导表达5h、15h、18h、22h；空载体作对照；各取5ml菌液收集沉淀，加入1ml细胞破碎缓冲液，破碎后取上清和沉淀(加入1ml包涵体溶解缓冲液)，进行SDS-PAGE分析，结果见附图2,由图2可见,在16℃表达时间不同时，rHaSP3蛋白酶表达22h时在上清液中表达量最大。
第四步：重组蛋白的表达、纯化、浓缩、标签切除及鉴定
(1)挑取单菌落于10ml含Kan的LB液体培养基中，37℃，100rpm过夜培养；以1：20比例稀释于200ml含Kan的LB液体培养基中，37℃，100rpm培养至OD为0.5左右；加入终浓度为0.1mM的IPTG，分别于16℃(100rpm)诱导表达22h；空载体作对照。
(2)收集诱导后的菌液，10000rpm，离心10min，去上清；用25ml的超声波破碎缓冲液重悬沉淀，冻于-20℃，待冰冻后取出放4℃解冻过夜；超声波破碎，破碎15min(破碎5s，停7s)，4℃，12000rpm离心30min，取上清备用。
(3)目的蛋白rHaSP3的GST柱初步纯化
纯化步骤：10倍体积的超纯水过GST柱(60r/min)，5倍体积的PBS平衡GST柱(35r/min)，上样(样品用0.22um的过滤器过滤，15r/min)，20倍体积的PBS清洗GST柱(35r/min)，5倍体积的Elution Buffer洗脱目的蛋白(25r/min)。
GST柱的清洗：70％的乙醇洗柱10min(30r/min)，PBS快速洗柱10min(60r/min)；6M的盐酸胍洗柱10min(30r/min)，PBS快速洗柱10min(60r/min)；5倍体积的20％乙醇洗柱，封柱，于4℃保存。
(4)阴离子交换柱法纯化目的蛋白
5倍体积的超纯水过柱(60r/min)，5倍体积的50mM NaCl平衡过柱(35r/min)，上样(25r/min)，依次用50mM NaCl、100mM NaCl、200mM NaCl、400mM NaCl、600mM NaCl、1000mMNaCl洗柱，收集流出液(必要时可每毫升收集1管)。
(5)目的蛋白rHaSP3的浓缩以及标签切除
纯化后的目的蛋白，通过Bradford法测蛋白质浓度，然后用分子截留量为10kDa的超滤管在4℃浓缩后加入肠激酶(按照肠激酶说明书)，于4℃酶切48h。取等体积的待测蛋白与2ⅹSDS上样缓冲液混合，95℃加热5min，取20ul上样，用于SDS-PAGE分析，结果见附图3,SDS-PAGE实验证明rHaSP3蛋白成功表达，超滤管浓缩后rHaSP3蛋白浓度提高，并被肠激酶成功酶切。随后进行Western Blot鉴定，结果见附图4，免疫印迹试验结果表明rHaSP3蛋白成功表达。
第五步：棉铃虫中肠蛋白的酶活性测定
按照以下方法测定HaSP3蛋白酶经酶切后和未被酶切的酶活。
底物配制：称取2mg SAAPFpNA溶解于1ml DMSO中。整个反应体系中依次加入45ul的底物、90ul的Tris-HCl缓冲液(pH8.0，含CaCl2)，最后加入200ul酶液，立即置于酶标仪中于405nm处开始读数，每30秒读取一个点，共计30分钟，结果见附图5,可见HaSP3蛋白酶经酶切后拥有酶活性，而未被酶切时则没有酶活性。
实施例2以棉铃虫rHaSP6蛋白的表达为例
第一步：提取棉铃虫幼虫中肠的总RNA，克隆棉铃虫中肠蛋白酶基因片段
提取棉铃虫SCD品系幼虫(5龄第二天)中肠总RNA，合成cDNA第一条链。对hasp6基因的ORF进行分析，为使读码方式正确，C端能够正确终止，上下游引物5’端分别引入EcoRI和XhoI酶切位点。以棉铃虫中肠cDNA为模板，使用5’端特异性引物及3’端特异性引物，进行hasp6基因片段的PCR扩增。PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，72℃保温10min，4℃保存。
Hasp6基因上游引物序列为：gaattcatcgtgggtggctcgctgaccact(SEQ ID NO.3)
Hasp6基因下游引物序列为：ctcgagttatgcgttggaggagatccaaga(SEQ ID NO.4)
第二步：将棉铃虫中肠蛋白酶基因hasp6构建在Pet41表达载体上
此步骤与基因hasp3一样。
第三步：rHaSP6重组蛋白的表达、纯化、浓缩、标签切除及鉴定
使用rHaSP3重组蛋白表达时优化好的条件进行rHaSP6重组蛋白的大量表达，过程如下：(1)挑取单菌落于10ml含Kan的LB液体培养基中，37℃，100rpm过夜培养；以1：20比例稀释于200ml含Kan的LB液体培养基中，37℃，100rpm培养至OD为0.5左右；加入终浓度为0.1mM的IPTG，分别于16℃(100rpm)诱导表达22h；空载体作对照。
(2)收集诱导后的菌液，10000rpm，离心10min，去上清；用25ml的超声波破碎缓冲液重悬沉淀，冻于-20℃，待冰冻后取出放4℃解冻过夜；超声波破碎，破碎15min(破碎5s，停7s)，4℃，12000rpm离心30min，取上清备用。
(3)目的蛋白rHaSP6的GST柱初步纯化
纯化步骤：10倍体积的超纯水过GST柱(60r/min)，5倍体积的PBS平衡GST柱(35r/min)，上样(样品用0.22um的过滤器过滤，15r/min)，20倍体积的PBS清洗GST柱(35r/min)，5倍体积的Elution Buffer洗脱目的蛋白(25r/min)。
GST柱的清洗：70％的乙醇洗柱10min(30r/min)，PBS快速洗柱10min(60r/min)；6M的盐酸胍洗柱10min(30r/min)，PBS快速洗柱10min(60r/min)；5倍体积的20％乙醇洗柱，封柱，于4℃保存。
(4)阴离子交换柱法纯化目的蛋白
5倍体积的超纯水过柱(60r/min)，5倍体积的50mM NaCl平衡过柱(35r/min)，上样(25r/min)，依次用50mM NaCl、100mM NaCl、200mM NaCl、400mM NaCl、600mM NaCl、1000mMNaCl洗柱，收集流出液(必要时可每毫升收集1管)。
(5)目的蛋白rHaSP6的浓缩以及标签切除
利用Bradford法测定纯化后的目的蛋白浓度，然后用分子截留量为10kDa的超滤管在4℃浓缩后加入肠激酶(按照肠激酶说明书)4℃酶切48h。取等体积的待测蛋白与2ⅹSDS上样缓冲液混合，95℃加热5min，取20ul上样，用于SDS-PAGE分析，结果见附图6。SDS-PAGE实验证明rHaSP6蛋白成功表达，超滤管浓缩后rHaSP6蛋白浓度提高，并被肠激酶成功酶切。随后进行Western Blot鉴定，结果见附图7，免疫印迹试验结果表明rHaSP6蛋白成功表达。
第四步：棉铃虫中肠蛋白的酶活性测定
按照以下方法测定HaSP6蛋白酶经酶切后和未被酶切的酶活。
底物配制：称取2mg BApNA溶解于1ml DMSO中。整个反应体系中依次加入45ul的底物、90ul的Tris-HCl缓冲液(pH8.0，含CaCl2)，最后加入200ul酶液，立即置于酶标仪中于405nm处开始读数，每30秒读取一个点，共计30分钟，结果见附图8，可见HaSP6蛋白酶经酶切后拥有酶活性，而未被酶切时则没有酶活性。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因的原核表达方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcattg tcggtggctc tatttcaagt 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagcttttaa agaagattgt tgatccagct 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaattcatcg tgggtggctc gctgaccact 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcgagttat gcgttggagg agatccaaga 30

Claims (8)

1.一种棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因的原核表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取棉铃虫幼虫中肠的总RNA，克隆棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因片段；
2)将棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因克隆到带有His、Gst双标签的表达载体上，得到含棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因的重组表达载体；
3)将构建的重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态，挑取阳性克隆；
4)在含Kan的LB平板培养基上37℃，100rpm培养重组菌至OD为0.5～0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，于16～37℃ 100-120rpm诱导表达5～22h；
5)收集菌体，破碎、离心、取上清液后经纯化、浓缩、肠激酶切除标签得棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的原核表达方法，其特征在于，所述的带有His、Gst双标签的表达载体为Pet41表达载体。
3.根据权利要求2所述的原核表达方法，其特征在于，将棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因克隆到Pet41表达载体的EcoRI和HindIII酶切位点间。
4.根据权利要求1所述的原核表达方法，其特征在于，IPTG诱导温度为16℃。
5.根据权利要求1所述的原核表达方法，其特征在于，IPTG诱导时间为22h。
6.根据权利要求1所述的原核表达方法，其特征在于，所述的纯化依次包括GST柱初步纯化和阴离子交换柱法纯化。
7.根据权利要求1所述的原核表达方法，其特征在于，用分子截留量为10kDa的超滤管在4℃进行浓缩。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的原核表达方法，其特征在于，所述的棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因选自胰凝乳蛋白酶基因hasp3、胰蛋白酶基因hasp3，其他棉铃虫丝氨酸蛋白酶基因如胰凝乳蛋白酶基因hasp1、hasp14或胰蛋白酶基因hasp7、hasp11也能够运用权利要求1～7中任一项所述的原核表达方法表达。
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