CN115725552A - 重组表达具有明胶酶活性p37k蛋白酶的方法及其提高p37k蛋白酶性能的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组表达具有明胶酶活性p37k蛋白酶的方法及其提高p37k蛋白性能的方法，本发明通过Bac‑to‑Bac杆状病毒表达系统表达得到约40kD的重组蛋白，然后激活后获得分子量约为25kDa的p37k蛋白酶，25kDa的p37k蛋白酶具有明胶酶活性，但是重组表达的p37k蛋白酶的对热敏感，研究发现在p37k蛋白酶加入中肠提取物和金属离子能够提高重组表达的p37k蛋白酶的热稳定性，并且，加入E64能够提高重组表达的p37k明胶水解活性。因此，中肠提取物和金属离子能够作为p37k蛋白酶的热稳定性保护剂，E64能够作为p37k明胶水解活性的增强剂，为进一步拓展p37k蛋白酶条件提供了基础。

Description

重组表达具有明胶酶活性p37k蛋白酶的方法及其提高p37k蛋 白酶性能的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及重组表达具有明胶酶活性p37k蛋白酶的方法，还涉及提高p37k蛋白酶性能的方法。

背景技术

近几十年来，随着酶工程不断的技术性突破，使生物催化剂在工业、农业、医药卫生、能源开发及环境工程等方面的应用越来越广泛。酶作为一种生物催化剂，已发现4000种，其中蛋白酶作为酶的主要组成部分占全球工业酶总销量的70％。目前，蛋白酶的生产主要来源于微生物发酵。微生物蛋白酶的大规模生产存在一个缺点，即需要密集过滤才能获得无微生物制剂，成本高。此外，蛋白酶作为生物大分子对外界环境(如高温、极端pH等)十分敏感，大大增加了蛋白酶的生产、运输和保存成本。因此，获得性质稳定的蛋白酶对工业生产至关重要。昆虫肠道作为一个重要的消化器官，含有多种蛋白酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、组织蛋白酶、羧肽酶和丝氨酸蛋白酶等，使其成为天然的蛋白酶资源库。另外，肠道的碱性微环境使其具有分离工业重要特性蛋白酶的潜能。

昆虫体内蛋白酶因其独特的特性得到了越来越多的关注。在斜纹叶蛾和美洲大蠊肠道中的碱性蛋白酶表现出热稳定性，最适温度为50～70℃，东方黄蜂的胰蛋白酶样蛋白酶在60℃时活性最大。2017年Mani Kannan等人在家蚕中肠内鉴定到一种胰蛋白酶型的丝氨酸蛋白酶(称为：p37k蛋白酶)。p37k蛋白酶对明胶具有底物特异性，最佳pH值和温度分别为pH 9.0和60℃。肠道中的p37k蛋白酶对表面活性剂、氧化剂和商业洗涤剂具有显著的稳定性和相容性，将其加入1％的洗涤剂中，能够使带血的纱布变为完全脱色布，具有明显的血凝块溶解的活性，表明家蚕肠道p37k蛋白酶可作为洗涤工业的助剂。蛋白酶的热稳定性是阻碍蛋白酶适用场景的重要因素，p37k蛋白酶作为一种具有工业生产价值的蛋白酶，其在体外重组表达和如何提高热稳定性和活性是值得探究的问题。因此，解析中肠中p37k蛋白酶热稳定性机制、增强其活力是提高重组p37k效率的关键问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种重组表达具有明胶酶活性p37k蛋白酶的方法；本发明的目的之二在于提供提高p37k蛋白酶性能的方法，其中性能包括热稳定性和活性；本发明的目的之三在于提供中肠提取物或金属离子溶液在制备提高p37k蛋白酶热稳定性的保护剂中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、重组表达具有明胶酶活性p37k蛋白酶的方法，将p37k基因通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达，纯化后在0～10℃下激活处理，获得具有明胶酶活性p37k蛋白酶。

本发明优选的，所述p37k基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2、提高p37k蛋白酶性能的方法，所述性能为稳定性或活性；提高稳定性的方法为将重组p37k蛋白酶激活处理后与中肠提取物或金属离子溶液混合，得到热稳定性提高的p37k蛋白酶；提高活性的方法为将重组p37k蛋白酶激活处理后与E64蛋白酶抑制剂共混。

所述E64酶制剂为半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

本发明优选的，所述激活处理是在温度为0～10℃下激活处理至少120小时。

本发明优选的，所述中肠提取物为取家蚕中肠组织，去除内容物后匀浆得到的匀浆液。

本发明优选的，所述金属离子溶液为含K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺中的一种或多种离子的溶液。

本发明优选的，所述金属离子溶液为CaCl₂或KCl、MgCl₂、CaCl₂与ZnCl₂的混合物溶液。

本发明优选的，所述p37k蛋白酶为p37k基因通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达，纯化后在激活处理得到有具有明胶酶活性的组分。

本发明优选的，所述中肠提取物为取家蚕中肠组织，去除内容物后匀浆得到的匀浆液。

本发明优选的，所述金属离子溶液为含K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺中的一种或多种离子的溶液。

本发明的有益效果在于：本发明克隆获得了家蚕p37k基因，该基因能够通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达后通过激活处理得到具有明胶酶活性的p37k蛋白酶，因此，该蛋白酶具有的明胶水解酶活性为蚕蛹的进一步开发利用拓展了思路，同时，赋予了昆虫肠道蛋白酶潜在的开发价值；本发明还发现中肠提取液和金属离子能够提高p37k蛋白酶的热稳定，并且找到了增强p37k明胶水解活性的方法，该发明为提高p37k蛋白酶热稳定性提供了新的策略；还提供了E64蛋白酶抑制剂能够提高重组表达的p37k明胶水解活性，为进一步拓展p37k蛋白酶的应用条件奠定了基础，对p37k蛋白酶的开发应用具有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为p37k杆状病毒表达载体的构建(A：p37k表达载体构建流程图；B：p37k表达载体双酶切验证图；M：标准蛋白质分子量；1：pfastBacDual-egfp-p37k重组质粒；2：p37k基因片段；3：经EcoR I和HinD III双酶切重组质粒)。

图2为p37k重组杆状病毒的获取(A：蓝白斑筛选；B：重组Bacmid PCR检测；M：标准蛋白质分子量；1：重组Bacmid；C：Bacmid-p37k重组杆状病毒荧光图)。

图3为p37k蛋白酶热稳定性分析(A：重组p37k亲和层析Western Blot检测；M：标准蛋白质分子量；1：原液；2：流穿液；3-9：0mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM和1M咪唑洗脱组分；B:40kDa的p37k蛋白酶在不同时间处理下的Western Blot检测；C：25kDa的p37k蛋白酶在时间不同处理下的Western Blot检测；M：标准蛋白质分子量)。

图4为CaCl₂对p37k蛋白酶稳定性的影响(A：不同浓度CaCl₂处理的p37k蛋白酶Western Blot检测；B：不同时间处理的p37k蛋白酶Western Blot检测；M：标准蛋白质分子量)。

图5为p37k蛋白酶的热稳定性差异分析(A：不同温度处理的重组p37k明胶活性分析；B：不同温度处理的中肠p37k明胶活性分析；C：中肠提取物对p37k的明胶蛋白酶活性的影响；D：金属离子对p37k的明胶蛋白酶活性的影响；M：标准蛋白质分子量)。

图6为蛋白酶抑制剂对p37k明胶水解活性的影响(A：不同蛋白酶抑制剂处理条件下，重组p37k明胶活性分析；B：在提高E64浓度的条件下，检测p37k明胶水解活性)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、家蚕p37k基因的获得

根据现有的家蚕全基因组芯片数据和家蚕基因组数据库(http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)，设计家蚕p37k基因上、下游引物对：

上游引物序列p37k-F(EcoRI)：5’-ccggaattcatgaaatggccagtgattatgatctgcctg-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物序列p37k-R(Hind III)：5’-cccaagcttttaatggtgatggtgatggtgttgacaattgcaggc-3’(SEQ ID NO.2)；

提取家蚕大造基因组DNA，然后以家蚕基因组为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2为引物进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；72℃延伸10分钟，14℃保存。扩增产物经回收并测序后获得家蚕p37k基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例2、构建p37k-pfastBacDual杆状病毒表达载体

将pFastBacDual表达载体质粒和p37k基因片段用EcoRI和Hind III进行双酶切，利用胶回收试剂盒对双酶切产物进行回收，通过T4 DNA连接酶将p37k基因片段和pFastBacDual载体进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞，经测序确认，获得含有家蚕p37k基因的杆状病毒重组表达载体，命名为p37k-pFastBacDual表达载体，双酶切验证载体构建成功，结果如图1所示。

实施例3、p37k重组杆状病毒的制备

将测序正确的单克隆菌株接种于含有氨苄青霉素的2×YT液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养(大约12h)，使用Qiagen超纯质粒提取试剂盒提取过夜培养菌株的质粒；将提取的p37k-pFastBacDual表达载体质粒转化至DH10Bac感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、IPTG和X-gal的2×YT固体培养基平板上，37℃培养48小时后挑取白色单菌落，如图2中A所示；使用BAC/PAC提取试剂盒提取白色单菌落的Bacmid，命名为p37k-Bacmid。pUC-M13-F/pUC-M13-R作为验证引物：

上游引物序列pUC-M13-F：5′-cccagtcacgacgttgtaaaacg-3′(SEQ ID NO.4)；

下游引物序列pUC-M13-R：5′-agcggataacaatttcacacagg-3′(SEQ ID NO.5)；

然后以p37k-Bacmid为模板，以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为引物进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性10分钟；95℃变性30秒；62℃退火30秒；72℃延伸4分钟；反应30个循环；72℃终延伸10分钟；14℃保存。PCR程序结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2中B所示。

利用脂质体将2μg重组bacmid DNA导入Sf9细胞，每隔24小时在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白表达情况(图2中C)。感染72小时后，800rmp离心5分钟收取细胞培养基，上清即含有重组杆状病毒，利用TCID50检测方法对重组杆状病毒进行滴度测定。

实施例4、p37k蛋白酶的表达和纯化

SF9细胞使用含10％血清的Grace’s昆虫细胞培养液(3ml)培养在25cm²的细胞培养瓶中。当细胞覆盖在细胞培养瓶底部时，以感染复数为5的病毒量感染SF9细胞。感染72小时后，从含有重组蛋白的10个培养瓶中收集30ml培养基，使用0.5ml Ni-NTA柱对目标蛋白进行亲和层析纯化，使用含有咪唑梯度(20mM、50mM、100mM、200mM、500mM、1M)的20mM Tris-HCl、100mM NaCl、pH 8.0的缓冲液进行洗脱，然后对洗脱液进行Western Blotting分析，结果如图3中A所示，表明重组p37k蛋白酶表达成功，能够用50mM、100mM、200mM的咪唑纯化得到，其分子量为40kDa。

实施例5、重组p37k蛋白酶和中肠内p37k蛋白酶的热稳定性检测

重组p37k蛋白酶热稳定性检测：将重组p37k蛋白酶置于4℃环境中进行72小时激活处理，以获得25kDa的p37k蛋白酶；将不同分子量p37k蛋白酶(40kDa和25kDa)分别在37℃条件下孵育0小时、1小时、3小时、6小时、12小时或24小时，利用Western Blot检测其降解情况，结果如图3中B和C所示；将25kDa的p37k蛋白酶在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃进行10分钟热处理，4℃作为对照组，然后将热处理后的p37k蛋白酶进行明胶酶谱法分析，结果如图5中A所示。结果显示，随着温度升高，p37k蛋白酶逐渐降解，在温度高于50℃下已经完全降解，表明重组p37k蛋白酶对热敏感，稳定性差。

中肠中p37k蛋白酶的热稳定性检测：剖开化蛹第一天的整个中肠，用含0.15MNaCl的20mM Tris-HCl,pH 7.5，洗涤中肠上皮5次，去除中肠腔内容物，将中肠匀浆后制备中肠提取物；将中肠提取物在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃进行10分钟热处理，4℃作为对照组，利用明胶酶谱法检测对其残存活性进行检测，结果如图5中B所示。结果显示，加入中肠提取物后p37k蛋白酶稳定性提高，能够耐受75℃高温。

以上结果表明，重组p37k蛋白酶对热敏感，在高于40℃条件下具有不稳定性，而处于中肠环境中的p37k具有较高的热稳定性，表明内源和外源p37k蛋白酶的热稳定性存在差异。

实施例6、金属离子对p37k蛋白酶热稳定性的影响

由于昆虫中肠一般为碱性条件，推测可能金属离子发挥了热稳定性作用。为验证该推测，分别以中肠提取物、CaCl₂和混合金属离子对p37k蛋白酶处理进行验证。

中肠提取物对p37k蛋白酶稳定性的影响：将蛹一天中肠提取物煮沸处理，冷却至室温后与重组p37k混合，混合物在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃进行10分钟热处理，利用明胶酶谱法检测对其残存活性进行检测，结果如图5中C所示；结果显示，中肠提取物加热处理对p37k蛋白酶稳定性无影响，因此排除生物大分子对p37k蛋白酶热稳定性有作用。

CaCl₂对p37k蛋白酶稳定性的影响：在25kDa的重组p37k蛋白酶中加入终浓度分别为0mM、1mM、5mM和10mM的CaCl₂，将混合物在37℃条件下孵育6小时，然后进行Western Blot检测，结果如图4中A所示；在重组p37k蛋白酶中加入CaCl₂，使其终浓度为10mM，在37℃孵育0、1、3、6、12小时，然后进行Western Blot检测，结果如图4中B所示。结果显示，p37k蛋白酶在37℃条件下具有不稳定性，当加入CaCl₂以后，p37k的稳定性得到提升，并且CaCl₂浓度越高，p37k的稳定性提升越明显。因此，Ca²⁺能够提升p37k的稳定性。

另外，在重组p37k蛋白酶中加入终浓度为5mM混合金属离子(KCl、MgCl₂、CaCl₂、ZnCl₂)，进行相同温度和时间的处理，利用明胶酶谱法检测对其残存活性进行检测，结果如图5中D所示。结果表明，加入中肠提取物会使重组p37k的热稳定性得到提高；与对照组相比，当混合金属离子加入到重组p37k蛋白酶中会使其热稳定性得到提升。因此证明，造成内源和外源p37k热稳定性差异的原因是由于内源p37k处于较高的离子环境中，中肠中的金属离子对其具有一定的稳定作用，说明金属离子对p37k蛋白酶的热稳定性具有较好的保护作用。

实施例7、E64蛋白酶抑制剂可提高p37k水解明胶的活性

为了探讨蛋白酶抑制剂对p37k明胶酶活性的影响，将cocktail、E64、AEBSF几种蛋白酶抑制剂与p37k进行了共混，然后进行明胶水解活性电泳检测，如图6中A所示。结果表明，几种蛋白酶抑制剂都不会抑制p37k明胶酶的活性，其中cocktail(含E64成分)和E64会使明胶活性条带的分子量发生改变，从40kD左右变为35kD左右，值得关注的是，在加入E64以后明胶消化的条带明显增强。为了进一步证实E64的作用，提高了E64的浓度，并重复了该实验，结果如图6中B所示：在只有p37k和有DMSO存在的情况下，p37k的明胶活性条带在40kD左右，在加入E64以后，明胶的条带出现在35kD左右，与前两个条带相比，明胶活性条带变得更加明显。该结果说明，E64可以显著提高p37k水解明胶的活性。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.重组表达具有明胶酶活性p37k蛋白酶的方法，其特征在于：将p37k基因通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达，纯化后在0～10℃下激活处理，获得具有明胶酶活性p37k蛋白酶。

2.根据权利要求1所述重组表达具有明胶酶活性p37k蛋白酶的方法，其特征在于：所述p37k基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.提高p37k蛋白酶性能的方法，其特征在于：所述性能为稳定性或活性；提高稳定性的方法为将重组p37k蛋白酶激活处理后与中肠提取物或金属离子溶液混合，得到热稳定性提高的p37k蛋白酶；提高活性的方法为将重组p37k蛋白酶激活处理后与E64蛋白酶抑制剂共混。

4.根据权利要求3所述提高p37k蛋白酶热稳定性的方法，其特征在于：所述激活处理是在温度为0～10℃下激活处理至少120小时。

5.根据权利要求3所述提高p37k蛋白酶稳定性的方法，其特征在于：所述中肠提取物为取家蚕中肠组织，去除内容物后匀浆得到的匀浆液。

6.根据权利要求3所述提高p37k蛋白酶稳定性的方法，其特征在于：所述金属离子溶液为含K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺中的一种或多种离子的溶液。

7.根据权利要求3所述提高p37k蛋白酶稳定性的方法，其特征在于：所述金属离子溶液为CaCl₂或KCl、MgCl₂、CaCl₂与ZnCl₂的混合物溶液。

8.中肠提取物或金属离子溶液在制备提高p37k蛋白酶热稳定性的保护剂中的应用，其特征在于：所述p37k蛋白酶为p37k基因通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达，纯化后在激活处理得到有具有明胶酶活性的组分。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述中肠提取物为取家蚕中肠组织，去除内容物后匀浆得到的匀浆液。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述金属离子溶液为含K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺中的一种或多种离子的溶液。

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