CN111172134B - 一种抗胰蛋白酶的胞外水解酶及其应用 - Google Patents

一种抗胰蛋白酶的胞外水解酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗胰蛋白酶的胞外水解酶，该酶命名为PslGK286A/K433S蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了所述酶在抑制细菌生物被膜形成中的应用和在瓦解已形成的细菌生物被膜中的应用。实验证实：与现有野生型PslG蛋白相比，本发明的酶对胰蛋白酶的耐受程度显著增强，IC50提升了近10倍；在相同实验条件下添加胰蛋白酶时，本发明所述的酶抑制微生物生物被膜形成的效果与野生型PslG相比显著提高，表现出了更强的胰蛋白酶耐受性。预示本发明所述的酶能更好地应用于复杂的临床环境，市场前景广阔。

Description

一种抗胰蛋白酶的胞外水解酶及其应用
技术领域
本发明属于微生物及基因工程技术领域，具体涉及一种抗胰蛋白酶的胞外水解酶及其在抗胰蛋白酶抑制/瓦解微生物生物被膜中的应用。
背景技术
生物被膜与人类密切相关，在临床上往往引起很难治愈的慢性感染。这主要是因为细菌一旦形成生物被膜，对抗菌药物的抗药性与游离状态相比会增加成百上千倍，并能够更容易地逃避宿主的免疫反应，因而大大增加了治疗的难度。细菌生物被膜引起的感染主要有两种：一种是生物医学材料相关感染，如导管、插管、生物材料移植物相关感染；另一种是细菌生物被膜疾病，如肺囊性纤维化、慢性骨髓炎等。而目前临床上还缺乏能够有效、稳定地抑制或瓦解铜绿假单胞菌等微生物的生物被膜的制剂和方法。
最近的临床实验表明铜绿假单胞菌自身产生的胞外水解酶PslG可以用来治疗猪和小鼠的伤口感染，大幅提高抗生素的疗效，预示将来可将PslG用于临床上治疗生物被膜引起的感染。然而，PslG可能使用的环境中存在大量的蛋白酶，尤其是胰蛋白酶类蛋白酶，这些酶的存在会严重抑制PslG的活性。研究表明人类基因组中有约2％的基因编码蛋白酶，其中一大部分是胰蛋白酶类。此外，铜绿假单胞菌自身也可以分泌多种胞外蛋白酶，其中也包括胰蛋白酶类蛋白酶，这些严重限制了PslG的应用。因此，迫切需要开发能抗胰蛋白酶的胞外水解酶。检索发现有关抗胰蛋白酶的胞外水解酶及其在抗胰蛋白酶抑制/瓦解微生物生物被膜中的应用的专利还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种抗胰蛋白酶的胞外水解酶及其在抗胰蛋白酶抑制/瓦解微生物生物被膜中的应用。
本发明所述的抗胰蛋白酶的胞外水解酶，其特征在于：所述酶的相应氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述的抗胰蛋白酶的胞外水解酶的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种制备上述抗胰蛋白酶的胞外水解酶蛋白的方法，其特征在于：将SEQ ID NO.2基因的核苷酸序列连接表达载体PGL01，然后转化E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达，用Ni-NTA亲和层析、Source 15Q阴离子交换层析及Superdex 200 10/300GL分子排阻层析方法纯化得到蛋白。
本发明所述抗胰蛋白酶的胞外水解酶在对胰蛋白酶的耐受程度研究中的应用。
本发明所述抗胰蛋白酶的胞外水解酶在抑制细菌生物被膜形成中的应用。
本发明所述抗胰蛋白酶的胞外水解酶在瓦解已形成的细菌生物被膜中的应用。
其中：所述细菌优选是铜绿假单胞菌。
本发明利用蛋白质三维结构分析与胰蛋白酶酶切串联质朴分析相结合设计突变位点，并对突变体蛋白进行抗胰蛋白酶酶切实验，筛选得到具有抗胰蛋白酶特性的胞外水解酶(命名为PslGK286A/K433S蛋白)。
实验证实：与现有PslG蛋白相比，新得到的抗胰蛋白酶胞外水解酶蛋白PslGK286A/K433S对胰蛋白酶的耐受程度显著增强。PslGK286A/K433S的IC50(在所用实验条件下37℃、30min水解50％起始PslG蛋白量所需的胰蛋白酶浓度)比已有的野生型PslG提升了10倍。
实验证实：在实验条件中不添加胰蛋白酶时，PslGK286A/K433S抑制/瓦解微生物生物被膜的效果与野生型PslG无明显差异，表明突变未影响胞外水解酶的底物结合以及其抑制/瓦解微生物生物被膜的活性。
实验证实：在实验条件中添加胰蛋白酶时，PslGK286A/K433S抑制微生物生物被膜的效果与野生型PslG相比显著提高，表明PslGK286A/K433S具有更强的胰蛋白酶耐受性。
与现有技术相比，本发明突出的效果为：新发现的胞外水解酶PslGK286A/K433S对胰蛋白酶的耐受程度显著增强，其抑制/瓦解微生物生物被膜的效果不受影响。
附图说明
图1为抗胰蛋白酶胞外水解酶PslGK286A/K433S在大肠杆菌中表达纯化结果。
其中：图1A为Ni-NTA及阴离子交换层析Source 15Q纯化结果，PM：ProteinMarker；Ce:Cell lysis；S:Supernatant；F:Flow through；E:Elution；图1B为分子排阻层析Superdex 200纯化结果。
图2为抗胰蛋白酶的胞外水解酶蛋白PslGK286A/K433S与现有野生型PslG蛋白的胰蛋白酶水解图。
其中：图2A为野生型PslG与PslGK286A/K433S蛋白经不同浓度的胰蛋白酶在37度处理30min的酶切结果图；图2B为Image J软件对图2A进行定量、拟合分析的结果图。
图3为外加PslGK286A/K433S和野生型PslG蛋白抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成对比图。在不添加胰蛋白酶情况下，50nM PslGK286A/K433S蛋白可以抑制约80％生物被膜的形成，与WT PslG蛋白活性相比无明显差异。
图4为PslGK286A/K433S与野生型PslG蛋白对已形成的铜绿假单胞菌生物被膜的瓦解结果图。如图所示，50nM PslGK286A/K433S与WT PslG蛋白处理30min均可瓦解约75％的生物被膜。
图5为胰蛋白酶存在时，PslGK286A/K433S和野生型PslG蛋白的生物被膜抑制活性对比图。
结果显示，在添加胰蛋白酶情况下，PslGK286A/K433S蛋白抑制生物被膜活性较野生型PslG蛋白显著增加。当所添加PslG与胰蛋白酶摩尔比为32.4:1时，PslGK286A/K433S蛋白和WTPslG可分别抑制30％和10％的生物被膜形成；当所添加PslG蛋白与胰蛋白酶的摩尔比为0.6:1时，WT PslG彻底失活，而PslGK286A/K433S蛋白仍可抑制10％生物被膜的形成。
图6为将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中氨基酸K286和K433分别突变为其它氨基酸，所得到的蛋白对胰蛋白酶的耐受结果图。
结果显示，分别将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中氨基酸K286和K433突变为A、S、D，所得突变蛋白对胰蛋白酶的耐受程度均显著提高，表明氨基酸K286和K433为胰蛋白酶酶切位点。
图7为将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中氨基酸K286和K433分别突变为其它氨基酸，所得到的蛋白降解生物被膜活性图。
结果显示，分别将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中氨基酸K286和K433突变为A、S、D，所得突变蛋白对铜绿假单胞菌生物被膜降解活性与野生型相比无明显差异。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。
下述实施例中，所使用的材料、试剂、菌株、载体等，如无特殊说明，均从商业途径得到。其中，所述表达载体PGL01是由载体pET15b以常规方法改造制成，在N端His-tag后添加了PrePscission Protease(Ppase)酶的酶切位点用于切除融合蛋白N端的His-tag。
实施例1抗胰蛋白酶的胞外水解酶蛋白的制备
通过聚合酶链式反应(PCR)从铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1菌株的基因组DNA中扩增得到编码PslG蛋白第31-442氨基酸的基因序列，并将其连接入PGL01表达载体中，所得质粒为野生型PGL01-PslG。抗胰蛋白酶胞外水解酶蛋白的表达质粒以野生型PGL01-PslG质粒为模板，通过QuickChange方法引入氨基酸突变K286A和K433S，所得质粒为PGL01-PslGK286A/K433S。将PGL01-PslGK286A/K433S质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，并将转化后所得细胞接种于含有终浓度为100μg mL-1氨苄青霉素的LB培养基中。将细胞置于37度、200rpm培养直至OD600约为0.8，降温至16度1小时后向培养基中添加终浓度为0.12mM的isopropylβ-D-thiogalactopyranoside，200rpm培养过夜。
第二天，收集菌体(4200rpm，4℃，15min)，加入Lysis Buffer(25mM Tris pH 8.0,200mM NaCl)重悬菌液，并进行超声破碎。将破碎后所得菌液离心(14000rpm，4℃，45min)，上清液上样到Ni-NTA亲和层析柱上，用Lysis Buffer冲洗约10个柱体积，除去非特异性吸附的杂蛋白，然后加入2个柱体积Lysis Buffer，0.12mg mL-1PPase，4℃孵育过夜切去His-tag。
第三天，用Lysis Buffer洗脱Ni-NTA柱5-8个柱体积，所得蛋白溶液通过阴离子交换层析(Source 15Q HR 16/10,GE Healthcare)和分子排阻层析(Superdex 200 10/300GL,GE Healthcare)进一步进行纯化。阴离子交换层析所用梯度洗脱buffer为0-1MNaCl,25mM Tris pH 8.0，分子排阻层析所用buffer为100mM NaCl,10mM Tris pH 8.0。最后，通过SDS-PAGE对蛋白样品的浓度和纯度进行鉴定，确定得到抗胰蛋白酶的胞外水解酶蛋白(命名为PslGK286A/K433S蛋白)。采用该方法1L表达细胞可获得约20mg PslGK286A/K433S蛋白。图1所示为通过Ni-NTA、阴离子交换层析、分子排阻层析进行蛋白纯化的结果。
实施例2抗胰蛋白酶的胞外水解酶蛋白对胰蛋白酶的耐受程度显著提高使用实施例1制得的抗胰蛋白酶的胞外水解酶蛋白PslGK286A/K433S，分组使其蛋白浓度均为2.7mg/ml，所用胰蛋白酶浓度依次为2,1,1/3,1/9,1/27,1/81,1/243,1/729,0mg/ml；同时设定PslGWT(野生型)对照组。将各组蛋白与胰蛋白酶等体积混匀后放置37℃反应30min，加入SDSLoading buffer终止反应，进行SDS-PAGE分析。
结果如图2所示，与PslG WT(野生型)相比，本发明的抗胰蛋白酶的胞外水解酶蛋白(PslGK286A/K433S蛋白)所能耐受的胰蛋白酶的浓度显著提高。WT PslG和抗胰蛋白酶的胞外水解酶蛋白的IC50(37℃ 30min内降解起始蛋白量的一半所需的胰酶浓度)分别为0.028mg/mL和0.283mg/mL，即与WT PslG相比，PslGK286A/K433S蛋白的IC50提高近10倍。
上述结果表明，本发明的抗胰蛋白酶的胞外水解酶(PslGK286A/K433S蛋白)稳定性较对照(野生型)大大提高，能更好地应用于各种环境。
实施例3外加抗胰蛋白酶的胞外水解酶(PslGK286A/K433S蛋白)抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成
接LBNS平板上新鲜单克隆铜绿假单胞菌PAO1于LBNS液体培养基中，在37℃、200rpm/min震荡培养12小时，然后以1％接种量接在Jensen培养基中。同时，分别添加终浓度为50nM的PslGK286A/K433S蛋白或WT PslG蛋白，不添加PslG样品为空白对照。菌液于96孔板中在30℃静止培养24小时后，采用结晶紫法检测生物被膜的生物量：弃去孔中游离的菌体后，水洗三次；接着用0.1％的结晶紫对生物被膜进行染色，水洗三次后，用30％的醋酸溶解结合在生物被膜上的结晶紫，利用分光光度计检测其OD560的吸收值。
结果如图3所示，在不添加胰蛋白酶情况下，50nM PslGK286A/K433S蛋白可以抑制约80％生物被膜的形成，与WT PslG蛋白活性相比无明显差异。
实施例4抗胰蛋白酶的胞外水解酶(PslGK286A/K433S蛋白)对已形成的铜绿假单胞菌生物被膜的瓦解
接LBNS平板上新鲜单克隆铜绿假单胞菌PAO1于LBNS液体培养基中，在37℃下200rpm/min震荡培养12小时，然后以1％接种量接在Jensen培养液中，于96孔板中30℃静止培养24小时。弃去游离的菌体，水洗3次后分别添加200μl含有50nM PslGK286A/K433S蛋白或WTPslG的新鲜Jensen培养液，并以空白培养液作为对照。30℃处理30min后，用结晶紫染色法检测处理后的生物被膜的生物量(结晶紫染色法具体操作步骤可参照实施例3)。
结果如图4所示，50nM PslGK286A/K433S蛋白处理30min可瓦解约75％的生物被膜，与WT PslG蛋白活性相比无明显差异。
实施例5胰蛋白酶存在时，抗胰蛋白酶的胞外水解酶(PslGK286A/K433S蛋白)的生物被膜抑制活性较WT PslG显著增加
接LBNS平板上新鲜单克隆铜绿假单胞菌PAO1于LBNS液体培养基中，在37℃、200rpm/min震荡培养12小时，然后以1％接种量接在Jensen培养基中。分别向培养基中添加终浓度为50nM的PslGK286A+K433S蛋白或WT PslG蛋白，并同时添加不同浓度的胰蛋白酶，不添加PslG样品为空白对照。菌液于96孔板中在30℃静止培养24小时后，采用结晶紫法检测生物被膜的生物量：弃去孔中游离的菌体后，水洗三次；接着用0.1％的结晶紫对生物被膜进行染色，水洗三次后，用30％的醋酸溶解结合在生物被膜上的结晶紫，利用分光光度计检测其OD560的吸收值。设置2个实验组，所添加PslG蛋白与胰蛋白酶的摩尔比分别设置为32.4:1和0.6:1。
结果如图5所示，在添加胰蛋白酶情况下，PslGK286A/K433S蛋白抑制生物被膜活性较野生型PslG蛋白显著增加。当所添加PslG与胰蛋白酶摩尔比为32.4:1时，PslGK286A/K433S蛋白和WT PslG可分别抑制30％和10％的生物被膜形成；当所添加PslG蛋白与胰蛋白酶的摩尔比为0.6:1时，WT PslG彻底失活，而PslGK286A/K433S蛋白仍可抑制10％生物被膜的形成。
实施例6将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中氨基酸K286和K433分别突变为其它氨基酸，胰蛋白酶耐受程度仍显著提高
实验方法同实施例1和实施例2。
结果如图6所示，分别将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中氨基酸K286和K433突变为A、S、D，所得突变蛋白对胰蛋白酶的耐受程度均显著提高，表明氨基酸K286和K433为胰蛋白酶酶切位点。
实施例7将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中氨基酸K286和K433突变不影响所述的胞外水解酶降解生物被膜活性
实验方法同实施例1和实施例3、实施例4。
结果如图7所示，分别将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中氨基酸K286和K433突变为A、S、D，所得突变蛋白对铜绿假单胞菌生物被膜降解活性与野生型相比无明显差异。
序列表
<110>山东大学
<120>一种抗胰蛋白酶的胞外水解酶及其应用
<141> 2020-02-10
<160> 2
<210> 1
<211> 442
<212> PRT
<213>铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）PAO1
<221>抗胰蛋白酶的胞外水解酶的氨基酸序列
<222>（1）…（442）
<400> 1
MARKGLYLGG SALLLAVVLL LVFWGRPADA EIQVLKAPRA VVWKDFLGVN AQFLWFSPER 60
YNKQIDRLQD LGLEWVRLDL HWDRLETAED QYQLASLDQL VKDLEARQLK SVFYLVGSAR 120
FITTAPFYSP FQDQYPPRDP EVFARRMAML SQRYPSVAAW QVWNEPNLIG FWRPKADPEG 180
YAKLLQASTI ALRMVDPEKP VVSAGMAFFS EMPDGRTMFD ALGHLGVESL GTIATYHPYT 240
QLPEGNYPWN LDFVSHANQI NRALRNAGVP AIWSTEWGWS AYKGPAELQD IIGVEGQADY 300
VLRRLALMSA LDYDRIFLFT LSDLDQRASV RDRDYGLLDL DANPKPVYLA LQRFLKVTGP 360
KLRPADPPVT EDLPDGSFSI GWTREDGRNV WLFWSARGGN VRLPKLKEAT LHDPLSGKVT 420
PLSGSDGLEV PVSSSLQMLV WE 442
<210> 2
<211> 1329
<212> DNA
<213>铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）PAO1
<221>抗胰蛋白酶的胞外水解酶基因的核苷酸序列
<222>（1）…（1329）
<400> 2
atggcacgta agggactcta tctgggcggc agcgcgctgc tgctcgccgt ggtactgctg 60
ctggtgttct gggggcgtcc cgccgacgcc gagatccagg tactgaaggc gcctcgcgcg 120
gtggtctgga aagacttcct cggggtcaac gcgcagttcc tctggttcag cccggagcgt 180
tacaacaagc agatcgaccg cctgcaggac ctggggctgg agtgggtgcg cctggacctg 240
cactgggacc gcctggaaac cgccgaggac cagtaccagc tggcctccct cgaccagttg 300
gtcaaagatc tcgaggcgcg ccagctgaag tcggtgttct acctggtcgg ctcggcccgc 360
ttcatcacca ccgcgccgtt ctactcgccc ttccaggacc agtatccgcc gcgcgacccg 420
gaagtcttcg cccggcgcat ggcgatgctc tcgcagcgct acccgagcgt ggccgcctgg 480
caggtatgga acgagcccaa cctgatcggc ttctggcggc ccaaggccga cccggaaggc 540
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gtggtttccg ccggcatggc cttcttcagc gagatgcccg acggccgcac catgttcgac 660
gccctcggcc acctgggcgt ggagagcctc ggcaccatcg ccacctacca cccctatacc 720
cagttgccgg aaggcaacta cccgtggaac ctggacttcg tctcccacgc caaccagatc 780
aaccgcgccc tgcgcaacgc cggcgtgccg gcgatctgga gcaccgagtg gggctggtcg 840
gcctacaagg ggccggcaga gttgcaggac atcattggcg tcgaaggcca ggccgactac 900
gtgctgcgtc gcctggcgct gatgagtgcg ctggactacg accggatctt cctcttcacc 960
ctcagcgatc tcgaccagcg cgccagcgtg cgcgaccgcg actacggcct gctcgacctg 1020
gacgccaacc ccaagccggt ctacctggcc ctgcaacgct tcctcaaggt caccgggccg 1080
aagctgcgcc cggccgaccc gccggtcacc gaggacctgc ccgacggttc cttcagcatc 1140
ggctggaccc gcgaggacgg tcgcaacgtc tggctgttct ggtcggcccg cggcggcaac 1200
gtgcgcctgc cgaagctcaa ggaggccacc ctgcacgatc cgctcagcgg caaggtcacg 1260
cccttgagcg gcagcgacgg cctggaagtc ccggtgagtt ccagcctgca gatgctggtc 1320
tgggagtga 1329

Claims (4)

1.一种抗胰蛋白酶的胞外水解酶，其特征在于：所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种抗胰蛋白酶的胞外水解酶的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
3.一种制备权利要求1所述抗胰蛋白酶的胞外水解酶蛋白的方法，其特征在于；将如SEQ ID NO.2所示基因连接表达载体PGLO1，然后转化E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达，用Ni-NTA亲和层析、Source 15Q阴离子交换层析及Superdex 200 10/300 GL分子排阻层析方法纯化得到蛋白。
4.权利要求1所述抗胰蛋白酶的胞外水解酶在对胰蛋白酶的耐受程度研究中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114288393B (zh) * 2021-12-31 2023-08-22 安徽医科大学 两种生物酶联用在抑制铜绿假单胞菌生物膜形成上的应用
CN114686462B (zh) * 2022-04-01 2024-05-31 山东仕达思医疗科技有限公司 能瓦解细菌生物被膜和杀灭细菌的蛋白酶LasA及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101903511A (zh) * 2007-12-20 2010-12-01 丹尼斯科美国公司 生物膜的酶促防止和控制
CN105963680A (zh) * 2015-03-13 2016-09-28 中国科学院微生物研究所 用于抑制/瓦解生物被膜的抑制剂及其应用
CN106800923A (zh) * 2015-11-26 2017-06-06 中国科学院微生物研究所 PslG在石油开采中的应用
CN108660123A (zh) * 2018-02-22 2018-10-16 中国科学院微生物研究所 PslG蛋白或其编码序列在检测微生物数量方面的应用和方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2951152A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 The Hospital For Sick Children Soluble bacterial and fungal proteins and methods and uses thereof in inhibiting and dispersing biofilm

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101903511A (zh) * 2007-12-20 2010-12-01 丹尼斯科美国公司 生物膜的酶促防止和控制
CN105963680A (zh) * 2015-03-13 2016-09-28 中国科学院微生物研究所 用于抑制/瓦解生物被膜的抑制剂及其应用
CN106800923A (zh) * 2015-11-26 2017-06-06 中国科学院微生物研究所 PslG在石油开采中的应用
CN108660123A (zh) * 2018-02-22 2018-10-16 中国科学院微生物研究所 PslG蛋白或其编码序列在检测微生物数量方面的应用和方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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PslG, a self-produced glycosyl hydrolase, triggers biofilm disassembly by disrupting exopolysaccharide matrix;Shan Yu等;《Cell Research》;20151127;第25卷(第12期);第1352-1367页 *

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