KR20200074982A - 베타-락타마아제 변이체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 베타-락타마아제 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 개선된 특성, 예컨대 개선된 프로테아제 안정성, 장 매질에서의 안정성, 하나 이상의 항생제에 대한 개선된 활성, 개선된 특이적 활성 및/또는 숙주 세포에서의 개선된 생성을 갖는 VIM-2 변이체이다.
Description
본 발명은 베타-락타마아제 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 개선된 프로테아제 안정성, 개선된 고유 안정성, 예컨대 열 안정성, 하나 이상의 베타-락탐 화합물, 예컨대 베타-락탐 항생제에 대한 개선된 활성, 및/또는 숙주 세포에서의 개선된 생산과 같은 개선된 특성을 갖는 VIM-타입 서브그룹에 속하는 서브클래스 B1 메탈로-베타-락타마아제이다.
많은 항생 제품, 특히 항생제는 박테리아 감염의 치료에 사용될 수 있다. 그러나, 항생제는 감염 부위에서 병원체를 공격할 뿐만 아니라, 건강한 대상, 특히 장에서 발견될 수 있는 정상적인 박테리아 총에도 영향을 미친다. 500 종이 넘는 10 조 개 이상의 박테리아로 구성된, 대장 공생 총 (대장 미생물총이라고도 함) 의 항생제에 의한 변경은, 내성 박테리아의 선별 및 내성 박테리아에 의한 잠재적 콜로니화, 정상 소화 과정의 붕괴, 기회 장내 병원체, 예컨대 클로스트리듐 디피실레 (Clostridium difficile) 에 의한 장의 콜로니화 및 감염, 항생제-연관 설사 또는 장내 세균불균형 (dysbiosis) 과 관련된 기타 질병, 예컨대 면역성의 변경, 대사 장애 또는 알레르기와 같은 부작용을 일으킬 수 있다. 이러한 부작용은 장, 더욱 특히 회장 및 결장에서 잔류 활성 항생제를 분해할 수 있는 효소를 투여함으로써 감소될 수 있다. 이 접근법은 특히 WO2004/016248 또는 US20050249716 에 기재되어 있다.
그러나, 효소는 완전성 및 촉매 활성이 다수의 물리 화학적 인자, 예컨대 분해를 초래하는 프로테아제의 존재, 온도, 이온 강도, 금속 보조인자의 이용가능성 또는 킬레이터의 존재에 민감한 취약한 거대분자이다. 또한, 개선된 특이적 활성을 갖는 효소는 이들의 효율을 증가시키고/거나 이를 필요로 하는 환자에서 잔류 활성 항생제의 효율적인 분해를 수득하는데 사용되는 양을 감소시키기 위해 유리할 것이다. 마지막으로, 이러한 항생제-분해 효소에 대한 개선된 생산 수율을 얻는 것이 유리할 것이다.
본 발명은 VIM-2 메탈로-베타-락타마아제의 새로운 변이체를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 SEQ ID NO:1 에 나타낸 아미노산 서열 (이것은 이의 자연 신호 펩티드가 없는 야생형 VIM-2 의 서열임) 과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 베타-락타마아제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 야생형 VIM-2 효소와 비교하여 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: (i) 개선된 프로테아제 저항성, 특히 소화 프로테아제 저항성, (ii) 개선된 안정성, 특히 열 안정성 및/또는 장 매질에서의 안정성, (iii) 베타-락탐에 대한 개선된 작용 스펙트럼 (즉, 변이체는 더 많은 수의 베타-락탐 화합물, 특히 베타-락탐 항생제를 가수분해할 수 있음), (iv) 하나 이상의 베타-락탐 화합물 (예를 들어, 하나 이상의 베타-락탐 항생제) 에 대한 개선된 효소 활성, 특히 감소된 항생제 비활성화 시간에서의 번역 및 (v) 개선된 생산 수율. 더욱 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 VIM-2 베타-락타마아제의 서열을 참조하여, 위치 10 에서 적어도 하나의 치환을 포함하는 VIM-2 변이체이다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 위치 10 및 위치 22, 34 및 130 에서 선택된 적어도 하나의 위치에서 치환을 포함하는 VIM-2 변이체이며, 여기서 위치는 SEQ ID NO:1 의 VIM-2 베타-락타마아제의 아미노산 위치에 상응한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 위치 10 및 22, 위치 10 및 34, 위치 10 및 130, 위치 10, 22 및 34; 위치 10, 22 및 130; 위치 10, 34 및 130 또는 위치 10, 22, 34 및 130 에서의 치환을 포함한다.
또한 본원에는 위치 10, 22, 34 및 130 에서 선택된 적어도 하나의 위치에서 치환을 포함하는 VIM-2 변이체가 기재되며, 여기서 위치는 SEQ ID NO:1 의 VIM-2 베타-락타마아제의 아미노산 위치에 상응한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 위치 10 에서의 치환은 V10A 이다. 또다른 구현예에서, 위치 22 에서의 치환은 Q22H 또는 Q22N 이다. 또다른 구현예에서, 위치 34 에서의 치환은 Q34R 이다. 또다른 구현예에서, 위치 130 에서의 치환은 E130D 이다.
본 발명에 따른 VIM-2 변이체를 생산하는 박테리아는 SEQ ID NO:1 의 야생형 VIM-2 를 생산하는 동일한 박테리아의 MIC 와 비교하여, 적어도 하나의 베타-락탐 항생제, 예컨대 그러나 제한 없이, 암피실린, 피페라실린, 티카실린, 테모실린, 세팔로틴, 세폭시틴, 세푸록심, 세포탁심, 세프타지딤, 세페핌, 세프트리악손, 세프타롤린, 세포테탄, 이미페넴, 메로페넴 및 에르타페넴에 대한 최소 억제 농도 (MIC) 에 대한 개선된 특성을 나타낼 수 있으며, 이것은 표준 시험관 내 감수성 검사 방법, 예컨대 미량희석 브로쓰 방법을 사용함으로써 결정될 수 있다 (Clinical Laboratory Standard Institute, document M07-A10: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition). 본 발명의 맥락에서, "최소 억제 농도 (MIC) 에 대한 개선된 특성" 이라는 표현은 야생형 VIM-2 를 생산하는 동일한 박테리아와 비교하여, VIM-2 변이체를 생성하는 박테리아에 대해 증가된 MIC, 예를 들어 MIC 가 2 배 이상 증가한 것을 의미한다.
본 발명에 따른 VIM-2 변이체는 또한 SEQ ID NO:1 의 야생형 VIM-2 와 비교하여, 프로테아제, 특히 소화 프로테아제에 대한 내성과 관련하여 개선된 특성을 나타낼 수 있으며, 이것은 트립신, 키모트립신 등과 같은 정제된 프로테아제 또는 새끼돼지, 돼지, 다른 포유동물 (예컨대, 인간 장 매질) 또는 다른 동물 유래의 장 매질과의 인큐베이션 후, 효소 활성 (하기 기재되는 시험관 내 효소 어세이에 의해) 및/또는 완전성 (예를 들어, 질량 분석법에 의해) 의 모니터링에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 VIM-2 변이체는 또한 SEQ ID NO:1 의 야생형 VIM-2 와 비교하여, 안정성 (특히 열 안정성) 에 대해 개선된 특성을 나타낼 수 있으며, 이것은 45 내지 75℃ 범위의 온도에서 최대 2 시간 동안, 특히 65℃ 에서 45 분 동안 단백질 샘플 (미정제 추출물 포함) 의 인큐베이션 후 효소 잔류 활성을 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로, 온도-유도 변성은 원형 이색성 측정을 사용하여 후속될 수 있다. 이 실험은 개선된 입체형태 안정성을 보이는 효소에 대해 더 높은 실험 용융 온도 (Tm) 를 산출한다.
본 발명에 따른 VIM-2 변이체는 또한 SEQ ID NO:1 의 야생형 VIM-2 와 비교하여, 장 매질, 특히 공장, 회장 및 맹장 매질에서의 안정성에 대해 개선된 특성을 나타낼 수 있으며, 이것은 장 매질, 예를 들어, 회장 매질에서 상이한 기간 동안 단백질 샘플 (정제된 효소 포함) 의 인큐베이션 후 효소 잔류 활성을 모니터링함으로써 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 VIM-2 변이체는 또한 SEQ ID NO:1 의 야생형 VIM-2 에 의해 제시된 활성과 비교하여, 하나 이상의 베타-락탐 기질(들) (예컨대, 특정 베타-락탐 항생제(들)) 상의 촉매 활성에 대해 개선된 특성을 나타낼 수 있으며, 이것은 베타-락탐 기질 농도 (가수분해 속도) 의 시간-의존적 변화가 야생형 VIM-2 또는 VIM-2 변이체를 함유하는 단백질 샘플의 존재 하에서 분광광도적으로 모니터링되는 시험관 내 효소 어세이에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 VIM-2 변이체는 또한 SEQ ID NO:1 의 야생형 VIM-2 에 의해 제시된 활성과 비교하여, 촉매 파라미터, 예컨대 k cat 및 K m 값에 대해 개선된 특성을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 VIM-2 변이체는 또한 SEQ ID NO:1 의 야생형 VIM-2 의 생산 수준과 비교하여, 재조합 박테리아 또는 다른 적합한 숙주에서의 이의 증가된 생산 수준에 대해 개선된 특성을 나타낼 수 있으며, 이것은 시험관 내 효소 어세이, 예를 들어 야생형 VIM-2 또는 이의 변이체를 생산하는 박테리아 배양물로부터 수득된 추출물을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 수행된 어세이에 의해 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 추출물은 세포 또는 박테리아 용해 후 미정제 추출물로서 또는 세포 (원핵 또는 진핵) 배양 배지 (분비된 효소의 경우) 에서 수득된다. 이들 모든 방법은 또한 정제된 효소에 대해 실행될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:23 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
VIM-2 V10A (SEQ ID NO:3)
VIM-2 V10A Q34R Q22H (SEQ ID NO:4)
VIM-2 V10A Q34R Q22N (SEQ ID NO:5)
VIM-2 V10A Q34R E130D (SEQ ID NO:6)
VIM-2 V10A Q34R E130D Q22N (SEQ ID NO:7)
VIM-2 V10A Q34R E130D Q22H (SEQ ID NO:8)
VIM-2 V10A Q34R Q22H DCT236 (SEQ ID NO:9)
VIM-2 V10A Q34R Q22N DCT236 (SEQ ID NO:10)
VIM-2 V10A Q34R E130D DCT236 (SEQ ID NO:11)
VIM-2 V10A Q34R E130D Q22N DCT236 (SEQ ID NO:12)
VIM-2 V10A Q34R E130D Q22H DCT236 (SEQ ID NO:13)
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 V1M 치환을 추가로 포함하는, SEQ ID NO:3 내지 13 중 어느 하나의 VIM-2 베타-락타마아제의 기능적 변이체이다. 따라서, 본 발명은 또한 SEQ ID NO:14-23 에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드에 관한 것이다.
VIM-2 V10A V1M Q34R Q22H (SEQ ID NO:14)
VIM-2 V10A V1M Q34R Q22N (SEQ ID NO:15)
VIM-2 V10A V1M Q34R E130D (SEQ ID NO:16)
VIM-2 V10A V1M Q34R E130D Q22N (SEQ ID NO:17)
VIM-2 V10A V1M Q34R E130D Q22H (SEQ ID NO:18)
VIM-2 V10A V1M Q34R Q22H DCT236 (SEQ ID NO:19)
VIM-2 V10A V1M Q34R Q22N DCT236 (SEQ ID NO:20)
VIM-2 V10A V1M Q34R E130D DCT236 (SEQ ID NO:21)
VIM-2 V10A V1M Q34R E130D Q22N DCT236 (SEQ ID NO:22)
VIM-2 V10A V1M Q34R E130D Q22H DCT236 (SEQ ID NO:23)
본 발명은 또한 본 발명의 VIM-2 폴리펩티드 변이체를 인코딩하는 핵산 서열, 이를 포함하는 핵산 구성체, 본 발명에 따른 핵산 서열 또는 핵산 구성체를 포함하는 재조합 바이러스 또는 숙주 세포 (원핵 및 진핵) 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드 변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 조성물은 경구 투여가능하고, 이를 필요로 하는 대상의 장의 원하는 부분에서 폴리펩티드를 방출할 수 있다. 바람직하게는, 바람직한 부분은 공장, 회장, 맹장 또는 결장이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 대상에게 투여될 수 있는 폴리펩티드를 생산하는 재조합 숙주 세포, 원핵생물 또는 진핵생물, 또는 유기체에 관한 것이며, 이를 필요로하는 상기 대상의 장의 원하는 부분에서 폴리펩티드를 방출한다. 바람직하게는 폴리펩티드는 회장, 맹장 또는 결장, 바람직하게는 맹장 또는 결장에서 방출된다.
본 발명의 추가의 양상은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 개별적, 순차적 또는 동시 투여를 위한 부품 키트 및 부품 키트의 상기 폴리펩티드에 민감한 베타-락탐 화합물, 예를 들어 베타-락탐 항생제이다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 및 항생제 둘 다는 경구 투여가능하다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩티드 및 항생제는 상이한 경로에 의해 투여되며, 예를 들어 폴리펩티드는 경구 투여가능하고 항생제는 비경구 투여가능, 예컨대 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사와 같은 주사에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 항생제 전 또는 후에, 특히 전에 투여된다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 구현하는 요법 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, VIM-2 변이체인 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다. 보다 구체적으로, 이를 필요로 하는 대상에서 베타-락탐 항생제를 불활성화시키는 방법에서의, 상기 폴리펩티드 또는 이를 함유하는 조성물 또는 부품 키트의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 베타-락탐 항생제에 민감한 박테리아에 의해 야기되는 박테리아 감염의 치료 방법에서의, 본 발명의 폴리펩티드, 조성물 또는 부품 키트의 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 박테리아 감염은 본 발명의 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드에 민감한 베타-락탐 항생제의 조합을 사용하여 치료함으로써, 베타-락탐 항생제 덕분에 감염이 치료되는 반면, 임의의 원치않는 잔류 활성 항생제는 본 발명의 폴리펩티드 덕분에 장에서, 특정 구현예에서는 구체적으로 공장, 회장, 맹장 및 결장에서 제거된다. 이러한 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 바람직하게는 이러한 박테리아 감염 치료를 필요로 하는 대상의 장의 원하는 부분에서 폴리펩티드를 방출할 수 있는 조성물로 제형화되며, 여기서 장의 원하는 부분은 바람직하게는 공장, 회장, 맹장 또는 결장, 가장 바람직하게 회장, 맹장 또는 결장이다. 폴리펩티드는 이러한 박테리아 감염 치료를 필요로 하는 대상에게 경구 투여되는 재조합 숙주 세포 (원핵 또는 진핵) 또는 유기체에 의해 생성될 수 있고, 장의 원하는 부분, 특히 회장, 맹장 또는 결장에서 폴리펩티드를 방출한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 VIM-2 메탈로-베타-락타마아제의 새로운 변이체를 제공한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 서열은 SEQ ID NO:1 과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 VIM-2 와 상이하다는 점에서 SEQ ID NO:1 에 나타낸 VIM-2 의 서열과 동일하지 않다.
SEQ ID NO:1 에 나타낸 서열은 N-말단 신호 펩티드 절단을 거친 야생형 VIM-2 의 아미노산 서열이다 (즉, 그의 신호 펩티드가 없는 야생형 VIM-2 의 서열).
SEQ ID NO:1:
따라서 이 서열은 N-말단에서 발린 잔기로 시작한다. 그러나, 본 발명의 특정 구현예에서, 이 제 1 발린 잔기는 메티오닌 잔기로 대체될 수 있다. 예를 들어, VIM-2 단백질 또는 이의 변이체가 발현 카세트로부터 N-말단 신호 펩티드 없이 생성되는 경우, 발린 잔기를 인코딩하는 코돈 대신에 메티오닌 잔기를 인코딩하는 개시 코돈이 VIM-2 또는 VIM-2 변이체 코딩 유전자에 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 V1M 치환을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하며, 상기 폴리펩티드는 야생형 VIM-2 효소와 비교하여 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: (i) 프로테아제 (특히 소화 프로테아제) 에 대한 개선된 저항성, (ii) 개선된 안정성 (특히 열 안정성 및/또는 장 매질에서의 안정성), (iii) 베타-락탐 화합물, 특히 베타-락탐 항생제에 대한 개선된 작용 스펙트럼 (즉, 본 발명의 폴리펩티드는 야생형 VIM-2 효소와 비교해 더 많은 수의 상이한 베타-락탐 화합물 (예컨대, 항생제) 을 불활성화할 수 있거나, 또는 야생형 VIM-2 효소에 민감하지 않은 베타-락탐 화합물을 불활성화할 수 있음), (iv) 개선된 효소 활성 (특히 항생제 불활성화 시간 감소) 및 (v) 개선된 생산 수율.
본 발명의 변이체 폴리펩티드는 위치 10, 22, 34 및 130 에서 선택된 적어도 하나의 위치에서 치환을 포함하며, 여기서 위치는 SEQ ID NO:1 에 나타낸 아미노산 위치에 상응한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 위치 10 에서의 치환을 포함한다. 또다른 특정 구현예에서, 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 위치 10 에서의 치환 및 위치 22, 34 및 130 에서 선택된 적어도 하나의 위치에서의 치환을 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 위치 10, 22, 34 및 130 에서 개질을 포함하며, 여기서 위치는 SEQ ID NO:1 의 VIM-2 베타-락타마아제의 아미노산 위치에 상응한다.
특정 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 하기의 치환을 포함한다:
V10A; 및
Q22H, N; 및
Q34R; 및
E130D.
본 발명의 맥락에서, 번호가 매겨진 위치 뒤의 콤마는 상기 위치에서의 대안적인 개질을 나타낸다. 예를 들어, "22H, N" 은 SEQ ID NO:1 의 위치 22 에서 아미노산이 H 또는 N 으로 대체될 수 있음을 의미한다.
다양한 베타-락탐 항생제에 대한 장 안정성 및 특이적 활성을 개선하기 위한 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 10A, 22N 및 34R 치환을 포함한다.
다양한 베타-락탐 항생제에 대한 장 안정성 및 특이적 활성을 개선하기 위한 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 10A, 22H 및 34R 치환을 포함한다.
다양한 베타-락탐 항생제에 대한 장 안정성 및 특이적 활성을 개선하기 위한 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 10A, 34R 및 130D 치환을 포함한다.
다양한 베타-락탐 항생제에 대한 장 안정성 및 효소적 활성을 개선하기 위한 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 10A, 22H, 34R 및 130D 치환을 포함한다.
다양한 베타-락탐 항생제에 대한 장 안정성 및 특이적 활성을 개선하기 위한 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 10A, 22N, 34R 및 130D 치환을 포함한다.
본 발명에서, 아미노산은 아래 표에 요약된 바와 같이 잘 알려진 세글자 코드 또는 한글자 코드를 사용하여 표현된다.
본 발명에 따르면, 베타-락타마아제는 베타-락타마아제 활성을 갖는 폴리펩티드, 즉 베타-락탐 항생제와 같은 화합물 (예를 들어 페니실린, 세팔로스포린, 카르바페넴, 페남 설폰) 에서 발견되는 베타-락탐 고리의 아미드 결합의 비가역적인 가수분해를 촉매하여 항박테리아 활성이 없는 가수분해된 분자를 생성하는 효소이다.
본 발명의 맥락에서, VIM-2 베타-락타마아제는 SEQ ID NO:1 에 나타낸 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 이 효소는 Poirel et al. 에 의해 2000 년에 설명되었고 (Characterization of VIM-2, a carbapenem-hydrolyzing metallo-beta-lactamase and its plasmid- and integron-borne gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in France; Antimicrob. Agents Chemother. 2000 ; 44(4): 891-7), 추가로 Docquier et al. 에 의해 2003 년에 특징분석되었다 (On functional and structural heterogeneity of VIM-type metallo-beta-lactamases. J. Antimicrob. Chemother. 2003; 51 :257-266).
본 발명의 VIM-2 변이체의 활성은 다수의 어세이에 의해 시험될 수 있다. 예를 들어, 베타-락탐 화합물 가수분해의 가수분해 속도가 야생형 VIM-2 또는 VIM-2 변이체를 함유하는 단백질 샘플의 존재 하에 분광광도적으로 측정되는 시험관 내 효소 어세이가 실행된다. 구체적으로, 용액 (적절한 완충제 사용, 예컨대 50 μM ZnSO4 가 보충된, 50 mM HEPES 완충제 pH 7.5) 중 베타-락탐 화합물 및/또는 그의 가수분해 생성물의 농도는 기질 및/또는 생성물의 최대 흡광도에 해당하는 파장에서 UV-가시 분광광도계 또는 마이크로웰 플레이트 판독기에서 읽을 수 있다. 베타-락타마아제의 존재 하에서, 베타-락탐 기질 및/또는 생성물의 농도의 시간-의존적 변화는 반응 속도에 상응할 것이다. 초기 가수 분해 속도를 측정한 경우 ([S]t 
[S]0), 이 반응 속도 (μM/min 또는 μM/s 로 표현됨) 는 어세이된 샘플 중의 효소 농도에 정비례한다. 또한, 초기 기질 농도에 대한 초기 속도의 변화는 Henri-Michaelis-Menten 방정식에 의해 특징화되며 특정 베타-락탐 화합물의 가수분해를 위한 효소의 키네틱 파라미터 (k cat 및 K M ) 를 컴퓨터로 계산할 수 있다. 따라서, 이러한 효소 어세이에서 결정된 바와 같이 초기 가수분해 속도의 측정은 특정 기질에 대한 우선적인 활성 또는 샘플에서의 상대적 존재비와 같은 VIM-2 변이체를 함유하는 샘플의 특성을 특징화할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 단리될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 본원에 사용된 용어 "단리된" 은, SDS-PAGE 에 의해 결정된 바와 같이 적어도 20% 순수, 바람직하게는 적어도 40% 순수, 보다 바람직하게는 적어도 60% 순수, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80% 순수, 가장 바람직하게는 적어도 90% 순수, 좀더 가장 바람직하게는 적어도 95% 순수한 폴리펩티드를 말한다. 특히, 폴리펩티드는 "본질적으로 순수한 형태" 인, 즉, 폴리펩티드 제제는 본질적으로 이와 본래 연관된, 다른 생화학적 성분, 예컨대 폴리뉴클레오티드, 다당류 및 폴리펩티드가 본질적으로 결여되어 있는 것이 바람직하다. 이는 예를 들어 공지된 재조합 방법 및 고전적 정제 방법에 의해 폴리펩티드를 제조함으로써 달성될 수 있다.
두 아미노산 서열 사이의 관련성은 파라미터 "동일성" 에 의해 기술된다. 본 발명의 목적을 위해, 2 개의 아미노산 서열의 정렬은 EMBOSS 패키지 (http://emboss.org) 버전 2.8.0 의 Needle 프로그램을 사용하여 결정된다. Needle 프로그램은 Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453 에 기재된 글로벌 배열 알고리즘을 실행한다. 사용된 치환 매트릭스는 BLOSUM62 이고, 갭 오프닝 페널티는 10 이며, 갭 확장 페널티는 0.5 이다.
본 발명의 아미노산 서열과 청구 범위에 언급된 아미노산 서열 (SEQ ID NO:1) 사이의 동일성 정도는 "발명 서열" 의 길이 또는 SEQ ID NO:1 의 길이 중 더 짧은 것으로 나눈, 두 서열의 정렬에서 정확한 매치의 수로 계산된다. 결과는 동일성 백분율로 표현된다.
"발명 서열" 및 SEQ ID NO:1 이 동일한 정렬 위치에서 동일한 아미노산 잔기를 갖는 경우 정확한 매치가 발생한다. 서열의 길이는 서열 내 아미노산 잔기의 수이다 (예를 들어, SEQ ID NO:1 의 아미노산 1-240 의 길이는 240 임).
본 발명의 특정 구현예에서, SEQ ID NO:1 에 대한 이러한 특정 펩티드의 동일성 정도는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 이다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO:1 과의 동일성 정도는 적어도 88.7%, 89.1%, 89.5%, 89.8%, 90.2%, 90.6%, 91%, 91.4%, 91.7%, 92.1%, 92.5%, 92.9%, 93.2%, 93.6%, 94%, 94.4%, 94.7%, 95.1%, 95.5%, 95.9%, 96.2%, 96.6%, 97%, 97.4%, 97.7%, 98.1%, 98.5%, 98.9%, 99.2% 또는 적어도 99.6% 이다.
물론, 본 발명의 VIM-2 변이체는 상기 구체적으로 확인된 것과 상이한 위치에서 SEQ ID NO:1 에 대한 다수의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 변형은 아미노산 치환, 결실 또는 삽입, 및 임의의 수의 이러한 변형의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 VIM-2 변이체의 이러한 변형은 상기 특이적으로 확인된 것 이외에 단백질의 아미노-말단 또는 카르복시-말단에서 아미노산 결실을 포함한다. 예시적이고, 비-제한적인 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 과 비교하여 단백질의 카르복시-말단에 위치한 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 아미노산이 결실될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 237 에서 카르복시-말단 절단을 제시한다. 본 발명의 맥락에서, 이는 SEQ ID NO:1 의 아미노산 잔기 237 내지 240 이 본 발명의 생성된 폴리펩티드에 없음을 의미한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 잔기 236-240 의 카르복시-말단 절단을 제시한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 잔기 235-240 의 C-말단 절단을 제시한다. 또다른 예시적인, 비-제한적 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 과 비교하여, 즉, N-말단 신호 펩티드 절단을 겪은 야생형 VIM-2 의 서열 (즉, 그의 신호 펩티드가 없는 야생형 VIM-2 의 서열) 과 비교하여, 단백질의 아미노-말단에 위치한 하나 이상의 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 아미노산이 결실될 수 있다. 이 구현예의 특정 변이체에서, SEQ ID NO:1 과 비교하여 아미노-말단에 위치된 하나 이상의 아미노산의 결실된 (또는 달리 말하면 절단된) 폴리펩티드는 태그 또는 신호 펩티드와 같이 아래에 정의된 바와 같은 삽입 또는 연장을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "삽입" 은 또한 아미노- 및/또는 카르복시-말단 연장을 포함하도록 의도된다. 특정 구현예에서, N-말단 연장은 본 발명의 폴리펩티드에 신호 펩티드의 첨가를 포함할 수 있다. 이는 아미노산 서열 MFKLLSKLLVYLTASIMAIASPLAFS (SEQ ID NO:2) 를 갖는 야생형 VIM-2 의 천연 신호 펩티드 또는 야생형 VIM-2의 것과 비교시, 치환 L9S, L9F, L9W, V10I, L12C, A14V, I16T, M17L, I19M, I19T, F25C, 또는 상기 언급된 치환의 임의의 조합, 또는 임의의 다른 적절한 신호 펩티드, 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
대표적인 N-말단 또는 C-말단 연장은 야생형 VIM-2 또는 그의 임의의 변이체와 융합하여 클로닝된 DNA 단편에 의해 인코딩된 "태그" 펩티드와 같은 비-자연 발생 아미노산(들) 의 부가를 포함할 수 있으며, 이는 본 발명의 폴리펩티드의 확인 및/또는 정제를 용이하게 한다. 이러한 적절한 태그는 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같이 히스티딘 태그 (6 x His) 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 또는 말토오스-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 동일한 항생제에 대해 SEQ ID NO:1 의 야생형 VIM-2 에 의해 나타난 특이적 활성과 비교하여 개선된 주어진 베타-락탐 항생제에 대한 특이적 활성을 나타낼 수 있다. 특정 구현예에서, 단위 시간 당 및 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 단백질 샘플 1 mg 당 가수분해된 기질의 nmole 로 표현되는 특이적 활성은, 실시예 섹션에 노출된 동일한 절차를 사용하여 측정된 SEQ ID NO:1 의 야생형 VIM-2 의 특이적 활성에 대해 적어도 105% 이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드의 상대적인 특이적 활성은, 여전히 SEQ ID NO:1 의 야생형 VIM-2 의 특이적 활성에 대해, 적어도 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800 또는 심지어 적어도 1600% 이다.
추가의 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는, SEQ ID NO: 3 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 베타-락타마아제 활성을 갖는 이의 단편 (예컨대, SEQ ID NO:3 내지 23 중 어느 하나의 폴리펩티드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7, 또는 7 개 초과의 C-말단 아미노산이 결여된 단편), 특히 상기한 바와 같이 아미노산 237-240, 236-240 또는 235-240 이 결여된 단편을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다. 본 구현예의 변형에서, 신호 펩티드가 없는 폴리펩티드는 추가의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이 구현예의 변이체에서, 폴리펩티드는 N-말단에 신호 펩티드 (예컨대, SEQ ID NO:2 에 나타낸 신호 펩티드 또는 상기 정의된 이의 임의의 변이체) 를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하기를 포함한다:
(i) SEQ ID NO:1 의 잔기 236-240 의 C-말단 절단, 및
(ii) 위치 10 및 22 각각에서의 치환;
위치 10 및 34 각각에서의 치환;
위치 10 및 130 각각에서의 치환;
위치 10, 22 및 34 각각에서의 치환;
위치 10, 22 및 130 각각에서의 치환;
위치 10, 34 및 130 각각에서의 치환; 또는
위치 10, 22, 34 및 130 각각에서의 치환.
추가의 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 잔기 236-240 의 C-말단 절단 및 각각의 위치 10, 22, 34 및 130 에서의 치환을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 잔기 236-240 의 C-말단 절단 및 V10A, Q22H 또는 Q22N, Q34R 및 E130D 로부터 선택된 적어도 하나의 변형을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 VIM-2 폴리펩티드 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
용어 "단리된 핵산 서열" 은 아가로스 겔 전기 영동 또는 임의의 다른 적절한 방법에 의해 측정되는 바와 같이, 다른 핵산 서열이 본질적으로 없는, 예를 들어 적어도 약 20% 순수, 바람직하게는 적어도 약 40% 순수, 보다 바람직하게는 적어도 약 60% 순수, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80% 순수, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 순수한 핵산 서열을 말한다. 예를 들어, 단리된 핵산 서열은 핵산 서열을 그의 자연적 위치로부터 그것이 재현될 상이한 부위로 재배치하는 유전 공학에서 사용되는 표준 클로닝 절차에 의해 수득될 수 있다. 클로닝 절차는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 원하는 핵산 단편의 절단 및 단리, 벡터 분자 내로의 단편의 삽입, 및 핵산 서열의 다중 카피 또는 클론이 복제될 숙주 세포 내로 재조합 벡터의 혼입을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 게놈, cDNA, RNA, 반합성, 합성 기원 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 SEQ ID NO:1 의 야생형 VIM-2 를 인코딩하는 주형 서열 또는 이의 서브서열 내에 적어도 하나의 돌연변이를 도입함으로써 제조될 수 있으며, 여기서 돌연변이 핵산 서열은 변이체 VIM-2 폴리펩티드를 인코딩한다. 하나의 뉴클레오티드를 또다른 뉴클레오티드와 교환하기 위한 핵산 서열 내의 돌연변이의 도입은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 도핑, 스파이킹 또는 국소화 무작위 돌연변이유발에 의해 달성될 수 있다.
무작위 돌연변이유발은 문제의 제시된 아미노산 서열로 번역되는 유전자의 적어도 3 개 부분에서 또는 전체 유전자 내에서 국소 또는 영역-특이적 무작위 돌연변이유발로서 적합하게 수행된다. 올리고뉴클레오티드의 사용에 의해 돌연변이유발이 수행되는 경우, 올리고뉴클레오티드는 변화될 위치에서 올리고뉴클레오티드의 합성 동안 3 개의 비-모체 뉴클레오티드로 도핑되거나 스파이킹될 수 있다. 도핑 또는 스파이킹은 원치않는 아미노산에 대한 코돈이 회피되도록 수행될 수 있다. 도핑 또는 스파이킹된 올리고뉴클레오티드는 임의의 기술, 예를 들어 PCR, LCR 또는 임의의 DNA 폴리머라아제 및 리가아제, 또는 적합한 것으로 간주되는 다른 DNA 프로세싱/변형 효소, 예컨대 토포이소머라아제를 사용하여 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 내에 혼입될 수 있다.
바람직하게는, 도핑은 "일정한 랜덤 도핑" 을 사용하여 수행되며, 여기서 각 위치에서의 야생형 및 돌연변이의 백분율이 미리 정의된다. 또한, 도핑은 특정 뉴클레오티드의 도입에 대한 선호, 및 이에 따라 하나 이상의 특정 아미노산 잔기의 도입에 대한 선호에 관한 것일 수 있다. 도핑은 예를 들어, 각 위치에서 90% 야생형 및 10% 돌연변이의 도입을 허용하도록 만들어질 수 있다. 도핑 방식을 선택할 때 추가의 고려사항은 단백질-구조적 제약뿐만 아니라 유전적 요인에 근거한다.
무작위 돌연변이유발은 유리하게는 해당 모체 VIM-2 서열의 일부에 국한될 수 있다. 이는 예를 들어, 효소의 특정 영역이 효소의 주어진 특성에 특히 중요한 것으로 확인된 경우에 유리할 수 있다.
본 발명의 변이체를 제공하기 위한 대안적인 방법은 예를 들어 WO 95/22625 또는 WO 96/00343 에 기재된 바와 같은 유전자 셔플링, 및 EP 897985 에 기재된 바와 같은 합의 유도 과정을 포함한다.
본 발명은 추가로 제어 서열과 호환되는 조건 하에서 적합한 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체에 관한 것이다. 용어 "발현" 은 전사, 전사-후 변형, 번역, 번역-후 변형 및 분비를 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리펩티드의 생산에 관련된 임의의 단계를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 용어 "핵산 구성체" 는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 분자를 지칭하며, 이는 자연 발생 유전자로부터 단리되거나 그렇지 않으면 자연에 존재하는 방식으로 핵산 분절을 함유하도록 변형된다. 핵산 구성체라는 용어는 핵산 구성체가 본 발명의 코딩 서열의 발현에 필요한 제어 서열을 함유할 때 용어 "발현 카세트" 와 동의어이다. 특정 구현예에서, 핵산 구성체 또는 발현 카세트는 플라스미드 (예컨대, 발현 플라스미드) 내에 포함된다.
용어 "제어 서열" 은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요하거나 유리한 모든 성분을 포함하도록 본원에서 정의된다. 각각의 대조군 서열은 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 고유하거나 외래의 것일 수 있다. 이러한 제어 서열은 리더, 오퍼레이터, 프로펩티드 서열, 프로모터, 전사 개시 서열, 번역 개시 서열, 신호 펩티드 서열, 번역 종결 서열, 폴리아데닐화 서열 및 전사 종결자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 최소한, 제어 서열은 프로모터, 및 전사 종결 신호 및 번역 개시 및 종결 신호를 포함한다. 제어 서열에는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역과의 제어 서열의 라이게이션을 용이하게 하는 특정 제한 부위를 도입할 목적으로 링커가 제공될 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된" 은 제어 서열이 폴리펩티드의 코딩 서열의 발현을 지시하는 방식으로 제어 서열이 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에 대해 적절한 위치에 위치하는 배열을 의미한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "코딩 서열" (CDS) 은 단백질 생성물의 아미노산 서열을 직접 지정하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로 ATG 시작 코돈 또는 대안적인 시작 코돈, 예컨대 GTG 및 TTG 로 시작하고, 일반적으로 중지 코돈, 예컨대 TAA, TGA 또는 TAG 로 종결되는 개방 판독 프레임에 의해 결정된다. 코딩 서열은 DNA, cDNA 로 이루어질 수 있으며; 이것은 천연, 반합성 또는 합성일 수 있고; 비천연 또는 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
용어 "발현" 은 전사, 전사-후 변형, 번역, 번역-후 변형 및 분비를 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리펩티드의 생산에 관련된 임의의 단계를 포함한다.
용어 "발현 벡터" 는 본원에서 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 선형 또는 환형 DNA 분자로서 정의되며, 이는 그의 발현을 제공하는 부가적인 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 전형적으로 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호, 및 임의로, 억제자 유전자 또는 다양한 활성자 유전자를 인코딩하는 제어 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하여 발현될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 보유하는 재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 절차를 편리하게 수행할 수 있는 임의의 벡터일 수 있으며, 벡터의 선택은 종종 도입될 숙주 세포에 의존할 것이다. 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 때, 숙주 세포 게놈으로 통합되고 이것이 통합된 염색체(들) 와 함께 복제되는 것일 수 있다. 그것은 또한 플라스미드와 같은 자발적으로 복제하는 염색체-외 DNA 분자로서 세포에 남아있을 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 구성체를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본원에 사용된 "숙주 세포" 는 임의의 세포 유형, 원핵생물 또는 진핵생물을 포함하며, 이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성체에 의한 형질전환, 형질감염, 형질도입, 감염 등에 영향을 받기 쉽다.
본 발명은 또한 폴리펩티드의 재조합 생산에 유리하게 사용되는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 벡터가 염색체 통합체 또는 자가-복제성 염색체-외 벡터로서 유지된다. 용어 "숙주 세포" 는 복제 동안 발생하는 돌연변이로 인해 모체 세포와 동일하지 않은 모체 세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포의 선택은 폴리펩티드 및 그의 공급원을 인코딩하는 유전자에 크게 좌우될 것이다.
숙주 세포는 단세포 또는 다세포 유기체로 이루어지거나 이로부터 유래될 수 있으며, 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다.
유용한 단세포 미생물 중에는 박테리아 세포로서, 예컨대 그램-양성 박테리아, 제한 없이, 바실러스 세포, 예를 들어, 바실러스 알칼로필루스 (Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis), 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans), 바실러스 클라우시 (Bacillus clausii), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 라우투스 (Bacillus lautus), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 스테아로테르모필루스 (Bacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 및 바실러스 투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis); 또는 스트렙토마이세스 세포, 예를 들어 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans) 및 스트렙토마이세스 뮤리누스 (Streptomyces murinus), 또는 그램-음성 박테리아, 예컨대 대장균 및 슈도모나스 아종을 포함한다.
박테리아 숙주 세포 내로의 벡터의 도입은 예를 들어, 원형질체 형질전환 (참조, 예를 들어, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), 적격 세포를 사용한 DNA 형질전환 (참조, 예를 들어, Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, 또는 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221) 에 의해 화학적 형질전환 또는 전기천공을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 형질전환 방법 (참조, 예를 들어, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) 또는 컨쥬게이션 (참조, 예를 들어, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278) 을 사용하여 수행될 수 있다.
숙주 세포는 또한 진핵생물, 예컨대 동물, 특히 포유동물, 곤충, 식물 또는 이로부터 유래된 세포주, 또는 단세포 진핵생물 또는 진균 세포로부터 유래될 수 있다. 재조합 단백질은 또한 다세포 유기체, 예컨대 동물, 특히 포유동물 또는 식물에서 생산될 수 있다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 진균 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 진균 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 이다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포로부터 유래된 세포주이다.
진균 세포는 단독으로 공지된 방식으로 원형질체 형성, 원형질체의 형질전환 및 세포벽의 재생을 포함하는 공정에 의해 형질전환될 수 있다. 효모는 하기에 기재된 절차를 사용하여 형질전환될 수 있다: Becker and Guarente, In Abelson, J. N. and Simon, M. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology 194: 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 및 Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920. 진균 세포는 또한 전기 천공, 또는 DNA 분자를 세포 내로 도입하기 위한 임의의 다른 적합한 방법에 의해 형질전환될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드의 제조를 위해 유도되는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조 방법에서, 세포는 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 폴리펩티드의 제조에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 폴리펩티드가 발현 및/또는 단리되게 하는 적합한 배지 및 조건 하에 수행되는 실험실 또는 산업 발효기에서 진탕 플라스크 배양 및 소규모 또는 대규모 발효 (연속, 배치식, 공급-배치식 또는 고상 발효 포함) 에 의해 배양될 수 있다. 배양은 당업계에 공지된 절차를 사용하여, 탄소 및 질소 공급원 및 무기 염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 수행된다. 적합한 배지는 상업적 공급 업체로부터 입수할 수 있거나 공개된 조성물에 따라 (예를 들어, American Type Culture Collection 의 카탈로그에서) 제조될 수 있다. 일부 경우에, 숙주 세포의 성장 및 폴리펩티드의 생산을 위한 조건은 별개이며; 제 1 상에서, 숙주 세포가 적절한 조건 하에서 증식될 수 있고, 제 2 상에서 폴리펩티드의 최적 생산을 허용하도록 조건이 변화될 수 있다. 폴리펩티드가 영양 배지로 분비되는 경우, 폴리펩티드는 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 폴리펩티드가 분비되지 않으면, 이것은 세포 용해물로부터 회수될 수 있다.
산출된 폴리펩티드는 당분야에 공지된 방법을 사용해 회수될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 원심분리, 여과, 추출, 흡착, 분무-건조, 증발 또는 침전을 포함하나 이에 제한되지 않는 통상적 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 배제), 전기영동 절차 (예를 들어, 분취 등전성 포커싱, 분취 젤 전기영동), 차별 용해도 (예를 들어, 암모늄 술페이트 침전) 또는 추출 (참조, 예를 들어, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 정제될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 적절한 조성물은 허용가능한 담체와 조합하여 상기 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 포함한다. 조성물은 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 제조될 수 있으며, 액체 또는 건조 조성물의 형태일 수 있다. 조성물은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 안정화시키는 성분, 예컨대 글리세롤을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이다. 조성물은 경구 투여가능하고 이를 필요로 하는 대상의 내장 소화관의 원하는 부분에서 폴리펩티드를 방출할 수 있는 조성물의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 원하는 부분은 위, 십지지장, 공장, 회장, 맹장 또는 결장이다. 바람직한 구현예에서, 장의 원하는 부분은 공장, 회장, 맹장 또는 결장, 보다 바람직하게 회장, 맹장 또는 결장이다. 후자의 경우에, 조성물은 위액으로부터 본 발명의 폴리펩티드를 보호하는 하나 이상의 위장 저항성 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 특히 WO93/13795, WO2004/016248 또는 US20050249716 에 기술된 약물 전달 시스템을 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 장의 원하는 부분으로 도입될 수 있고 상기 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상의 장의 원하는 부분으로 방출할 수 있는, 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는, 상기 기재된 바와 같은 숙주 세포 또는 유기체에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 장의 원하는 부분은 회장, 맹장 또는 결장, 보다 바람직하게 맹장 또는 결장이다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 치료 방법에 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포 또는 유기체에 관한 것이며, 여기서 상기 숙주 세포는 이를 필요로 하는 대상에게 투여된다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 VIM-2 폴리펩티드 변이체는 다수의 치료적 및 비-치료적 용도에 유용하다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 구현하는 요법 방법을 개시하며, 여기서 상기 폴리펩티드 또는 항생제와 조합으로 이를 함유하는 조성물 또는 부품 키트, 또는 상기 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포 또는 유기체는 베타-락탐 화합물, 예컨대 베타-락탐 항생제를 이를 필요로 하는 대상에서 불활성화시키기 위한 방법에서 사용된다. 이 방법은 항생제의 부작용, 예컨대 장내 세균불균형, 내성 박테리아의 선별, 정상 소화 과정의 붕괴, 기회 장내 병원체, 예컨대 클로스트리듐 디피실레 (Clostridium difficile) 에 의한 콜로니화, 항생제-연관 설사 또는 장내 세균불균형과 관련된 기타 질병, 예컨대 면역성의 변경, 대사 장애 또는 알레르기를 치료 또는 예방하기 위해 실행된다.
본 발명은 또한 베타-락탐 항생제에 민감한 박테리아에 의해 야기되는 박테리아 감염의 치료 방법에서의, 본 발명의 폴리펩티드, 조성물, 숙주 세포 또는 유기체, 또는 부품 키트의 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 박테리아 감염은 본 발명의 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드에 민감한 베타-락탐 항생제의 조합을 사용하여 치료함으로써, 베타-락탐 항생제 덕분에 감염이 치료되는 반면, 임의의 원치않는 잔류 양의 활성 항생제는 본 발명의 폴리펩티드 덕분에 제거된다. 이러한 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 바람직하게는 이러한 박테리아 감염 치료를 필요로 하는 대상의 장의 원하는 부분에서 폴리펩티드를 방출할 수 있는 조성물로 제형화되며, 여기서 장의 원하는 부분은 바람직하게는 공장, 회장, 맹장 또는 결장, 가장 바람직하게 회장, 맹장 또는 결장이다. 폴리펩티드는 또한 상기 폴리펩티드를 생산하는 숙주 세포 또는 유기체에 의해 장의 원하는 부분에서 방출될 수 있으며, 여기서 장의 원하는 부분은 회장, 맹장 또는 결장, 바람직하게는 맹장 또는 결장이다. 특정 양상에서, 본 발명의 폴리펩티드, 조성물, 숙주 세포 또는 유기체 또는 부품 키트는, 상기 폴리펩티드 또는 그의 조성물의 투여 전, 후에 또는 이와 동시에 상기 폴리펩티드에 민감한 항생제를 대상에게 투여함으로써, 동물, 포유동물 또는 인간일 수 있는 대상에서의 박테리아 감염의 치료에 사용된다.
본 발명의 폴리펩티드의 다른 용도는 환경 또는 환경 설정에서 항생제의 치료를 위한 폴리펩티드의 용도와 같은 비-치료적 용도를 포함한다. 이러한 용도 및 방법은 예를 들어 환경에서 항생제의 치료를 위한 락카아제, 셀룰라아제 및 리파아제의 사용을 기술하는 WO 2012/007536 에 기술되어 발견될 수 있으며, 본원에서 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 환경으로부터 베타-락탐 항생제를 제거하기 위해 무타티스 무탄디스 (mutatis mutandis) 에 적용된다.
도 1 은 인간 회장 추출물에서 0, 60, 120 및 240 분 후 야생형 VIM-2, VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236 및 VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] DCT236 변이체의 특이적 활성을 나타내는 그래프이다.
실시예
실시예 1: VIM-2 변이체의 생산 및 정제
VIM-2 변이체는 T7 프로모터-기반 발현 시스템 (pET-9 발현 플라스미드 사용) 중 하나를 사용하여 대장균에서 생성되었다. 간단히 말해, 돌연변이체 bla VIM-2 유전자를 NdeI 및 BamHI 제한 부위를 사용하여 플라스미드 벡터 pET-9 에 클로닝하고, 생성된 플라스미드를 대장균 BL21 (DE3) 세포에 도입하였다. 생성된 숙주 세포를 24 시간 동안 ZnSO4 가 보충된 풍부한 자가-유도 세포 배양 배지 ZYP-5052 (Studier, F. W. 2005. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41:207-234.) 에서 성장시켰다. 박테리아 세포 및 배양 상청액을 원심분리에 의해 분리하였다. 이어서, 정화된 배양 상청액을 물리적 (예를 들어, 한외여과) 또는 화학적 (침전) 방법을 사용하여 농축시켰다. 대안적으로, 단백질은 박테리아 세포로부터 추출될 수 있으며, 이것을 세포 용해를 유도하기 위해 물리적 (초음파화, 프렌치 프레스) 또는 화학적 (리소자임, 세제) 작용제로의 처리 전에 100 내지 200 ml 의 20 mM 트리스 (pH 8.0) 에 재현탁하였다. 세포 추출물은 원심분리로 정화하였다. 이어서, 생성된 정화된 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 로딩하였다. 단백질을 20 mM Tris 완충액 (pH 8.0) 중의 NaCl 의 선형 구배를 사용하여 용리하고, 활성 분획을 모으고 농축하였다. 이어서 단백질 샘플을 제 2 음이온 교환 컬럼에 로딩하고 20 mM 트리에탄올아민 (pH 7.2) 중 NaCl 의 선형 구배를 사용하여 용리하였다. 생성된 샘플을 겔 여과 컬럼에 로딩하고 50 μM ZnSO4 및 150 mM NaCl 이 보충된 50 mM HEPES (pH 7.5) 로 단백질을 용리하였다. 이어서 정제된 단백질을 농축하고 저장하였다.
특히, 이 생산 프로토콜은 다음의 변이체 VIM-2 효소를 생산하는데 성공적으로 사용되었다: VIM-2[,Q22H,Q34R,E130D], VIM-2[,Q22H,Q34R,E130D] DCT236 및 VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] DCT236. 유사한 방법으로 생산될 수 있는 또 다른 변이체는 VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] 이다.
실시예 2: 장 매질 중의 VIM-2 변이체의 증가된 안정성 결정
VIM-2 변이체의 안정성을 측정하기 위해, 다음 절차가 적용된다: 정제된 단백질 샘플의 이미페넴-가수분해 활성은 인간 회장 추출물에서 인큐베이션 후 결정되었다. 변이체에 대한 특이적 활성 (Sp. Act.) 을 인큐베이션 동안 상이한 시점 (0, 60, 120 및 240 분) 에 측정하였다. 시각 t 에서의 특이적 활성을 시각 t = 0 에서의 특이적 활성과 비교하여 장 추출물에서 변이체의 활성 손실을 평가하였다. 시간에 따른 변화는 초기 활성 (t = 0) 과 시간 후 측정된 활성 사이의 비율 ((Sp. Act. Variant)t/(Sp. Act. Variant)t=0 로 표현되었다. 1 미만의 값은 장 추출물에서 인큐베이션될 때 활성의 손실을 나타낸다. 야생형 효소와 비교된 일부 변이체의 장 추출물에서 더 큰 안정성을 평가하기 위해 상이한 시점에서의 잔류 활성을 비교한다.
회장 추출물에서 인큐베이션되었을 때 시간에 따른 야생형 VIM-2 효소, VIM-2 변이체 VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236 및 VIM-2 변이체 VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] DCT236 의 특이적 활성을 도 1 에 제시한다.
시간 경과에 따른 활성 손실도 하기 표에 요약되어 있다:
표 또는 도 1 에 도시된 바와 같이, 야생형 효소는 회장 추출물에서 240 분 동안 인큐베이션 후 그의 활성의 94.4% 를 상실하였다. VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236 및 VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] DCT236 변이체는 동일한 조건에서, 각각 그의 활성의 오직 72.5% 및 51.2% 만을 상실하였다.
치환 Q22H, Q34R, E130D 의 조합은 산업적 관점에서 획기적으로 개선된 특성을 갖는 변이체를 초래한다. 치환 V10A 의 추가는 인간 회장 추출물에서 효소의 안정성을 더욱 향상시킨다.
실시예 3: 다양한 베타-락탐에 대한 주어진 VIM-2 변이체의 특이적 효소 및 또는 촉매 활성의 결정
실시예 1 에 언급된 바와 같이 생성된 변이체 효소의 경우, 베타-락탐 항생제와 같은 특이적 베타-락탐 화합물에 대한 특이적 활성 및 촉매 특성을 측정할 수 있다.
변이체 VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] DCT236 은 기질로서 이미페넴을 고려할 때 완충액에서 개선된 촉매 특성을 나타낸다:
상기 결과는 VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] DCT236 이 카르바페넴 항생제에 대해 강하게 개선된 활성을 나타 냈으며, 이는 예상치 못했으며 산업적으로 관심이 크다.
실시예 4: 장 매질에서 4 시간 인큐베이션 후 다양한 베타-락탐에 대한 주어진 VIM-2 변이체의 효소 활성의 결정
효소 활성 평가는 하기에 기술된 바와 같이 수행된다: 인간 회장 추출물에서 VIM-2 변이체의 4 시간 인큐베이션 후, 베타-락탐의 가수분해는 적합한 파장에서 분광광도계로 모니터링되었다. 효소 활성은 샘플에서 분 당 및 총 단백질 mg 당 가수분해된 베타-락탐 기질의 nmol 로 표현될 수 있다.
이하에서, 모든 효소 활성은 동일한 조건에서 측정된 야생형 효소의 효소 활성에 대해 상대적으로 표현될 것이다.
VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236 및 VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] DCT236 변이체의 경우, 측정된 효소 활성은 다음과 같다:
상기 결과는 VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] DCT236 이, 동일한 베타-락탐에 대한 활성이 야생형 효소와 비교하여 크게 개선된 VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236 돌연변이체와 비교하여 관심의 여러 베타-락탐에 대해 인간 장 매질에서 4 시간 인큐베이션 후 강하게 개선된 활성을 나타내었음을 설명한다.
따라서 치환 V10A, Q22H, Q34R, E130D 의 조합은 산업적 관점에서 획기적으로 개선된 특성을 갖는 변이체를 초래한다.
<110> DA VOLTERRA et al.
<120> BETA-LACTAMASE VARIANTS
<130> B2616PC00
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> wild-type VIM-2
<400> 1
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Gln Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Gln Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu
225 230 235 240
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VIM-2 signal peptide
<400> 2
Met Phe Lys Leu Leu Ser Lys Leu Leu Val Tyr Leu Thr Ala Ser Ile
1 5 10 15
Met Ala Ile Ala Ser Pro Leu Ala Phe Ser
20 25
<210> 3
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 3
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Gln Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Gln Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu
225 230 235 240
<210> 4
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 4
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr His Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu
225 230 235 240
<210> 5
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 5
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Asn Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
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35 40 45
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Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
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100 105 110
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Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
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<210> 21
<211> 235
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Gln Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
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145 150 155 160
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180 185 190
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195 200 205
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Claims (16)
- SEQ ID NO:1 과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 베타-락타마아제 활성을 갖는 폴리펩티드로서:
- 위치 10 및 22 각각에서의 치환;
- 위치 10 및 34 각각에서의 치환;
- 위치 10 및 130 각각에서의 치환;
- 위치 10, 22 및 34 각각에서의 치환;
- 위치 10, 22 및 130 각각에서의 치환;
- 위치 10, 34 및 130 각각에서의 치환; 또는
- 위치 10, 22, 34 및 130 각각에서의 치환
을 포함하며,
위치는 SEQ ID NO:1 로 나타내는 서열에서의 위치에 상응하고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 야생형 VIM-2 와 비교하여 안정성에 대해 개선된 특성을 갖는 폴리펩티드. - 제 1 항에 있어서, 하기로부터 선택된 적어도 하나의 변형을 포함하는, 폴리펩티드:
V10A;
Q22H 또는 Q22N;
Q34R; 및
E130D. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, SEQ ID NO:1 의 첫 번째 잔기에 해당하는 잔기가 메티오닌 잔기로 대체된 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 그의 N-말단에 신호 펩티드를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:1 에 나타낸 서열과 비교하여 그의 N-말단 또는 C-말단에 절단을 포함하는 폴리펩티드.
- 제 5 항에 있어서,
- SEQ ID NO:1 의 잔기 237-240 의 C-말단 절단;
- SEQ ID NO:1 의 잔기 236-240 의 C-말단 절단; 또는
- SEQ ID NO:1 의 잔기 235-240 의 C-말단 절단
을 포함하는 폴리펩티드. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:4 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 베타-락타마아제 활성을 갖는 이의 단편을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열.
- 적합한 발현 숙주에서 폴리펩티드의 발현을 지시하는 하나 이상의 제어 서열에 작동 가능하게 연결된, 제 8 항의 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체.
- 제 9 항의 핵산 구성체를 포함하는, 재조합 숙주 세포.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
- 제 11 항에 있어서, 경구 투여가능하고 장의 원하는 부분, 특히 공장, 회장, 맹장 또는 결장에서 폴리펩티드를 방출할 수 있는 조성물.
- 개별적, 순차적 또는 동시 투여 용의,
(a) 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제 11 항 또는 제 12 항의 조성물; 및
(b) (a) 의, 또는 (a) 의 조성물에 함유된 상기 폴리펩티드에 민감한 베타-락탐 항생제
를 포함하는 부품 키트. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 폴리펩티드.
- 베타-락탐 항생제의 비활성화를 필요로 하는 대상에서 베타-락탐 항생제의 비활성화 방법에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제 11 항 또는 제 12 항의 조성물, 제 13 항의 부품 키트 또는 제 10 항의 재조합 숙주 세포.
- 박테리아 감염의 치료 방법에 사용하기 위한 것으로서, 폴리펩티드 또는 조성물 또는 숙주 세포가 상기 폴리펩티드에 민감한 베타-락탐 항생제와 조합으로 사용하기 위한 것인, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제 11 항 또는 제 12 항의 조성물, 제 13 항의 부품 키트 또는 제 10 항의 재조합 숙주 세포.
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