BR112020007974A2

BR112020007974A2 - variantes de beta- lactamase

Info

Publication number: BR112020007974A2
Application number: BR112020007974-0A
Authority: BR
Inventors: Jean De Gunzburg; Jean-Denis DOCQUIER
Original assignee: Da Volterra; Bioaster
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2018-10-24
Publication date: 2020-10-27
Also published as: IL273728A; KR20200074982A; WO2019081614A1; CA3077603A1; MX2020004319A; US11365403B2; EP3701022B1; JP7223015B2; US20200318094A1; CN111247246A; EP3701022A1; JP2021501603A; US20220356459A1

Abstract

  A presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado com atividade de beta-lactamase e sequências de ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo. O polipeptídeo isolado da invenção é uma variante de VIM-2 com propriedades aprimoradas, tais como estabilidade aprimorada de protease, estabilidade no meio intestinal, atividade aprimorada contra um ou mais antibióticos, atividade específica aprimorada e/ou produção aprimorada em uma célula hospedeira.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “VARIANTES DE BETA-LACTAMASE”

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado com atividade de beta-lactamase e sequências de ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo. O polipeptídeo isolado da invenção é uma metalo-beta-lactamase da subclasse B1 pertencente ao subgrupo do tipo VIM com propriedades aprimoradas, tais como estabilidade melhorada da protease, estabilidade intrínseca aprimorada, tal como estabilidade térmica, atividade aprimorada contra um ou mais compostos beta-lactâmicos, tais como antibióticos beta- lactâmicos e/ou melhor produção em uma célula hospedeira.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Muitos produtos antibacterianos, em particular antibióticos, podem ser utilizados no tratamento de infecções bacterianas. No entanto, os antibióticos não atacam apenas patógenos no local da infecção, mas também afetam a flora bacteriana normal que pode ser encontrada em indivíduos saudáveis e, em particular, no intestino. A alteração por antibióticos da flora comensal do cólon (também chamada de microbiota do cólon), composta por mais de dez trilhões de bactérias de mais de 500 espécies, pode levar a efeitos colaterais adversos, tal como a seleção de bactérias resistentes e potencial colonização por bactérias resistentes, interrupção de processos digestivos normais, colonização e infecção do intestino por patógenos intestinais oportunistas, tal como Clostridium difficile, diarreia associada a antibióticos ou outras doenças relacionadas à disbiose intestinal, tal como alteração da imunidade, distúrbios metabólicos ou alergias. Esses efeitos colaterais podem ser reduzidos através da administração de enzimas capazes de degradar antibióticos ativos residuais no intestino, mais particularmente no íleo tardio e no cólon.

Esta abordagem é descrita em particular nos documentos WO2004/016248 ou US20050249716.

[003] No entanto, as enzimas são macromoléculas frágeis cuja integridade e atividade catalítica são sensíveis a vários fatores físico-químicos, tais como a presença de proteases que levam à sua degradação, temperatura, força iônica, disponibilidade de cofatores metálicos ou presença de quelantes. Além disso, as enzimas com atividade específica melhorada seriam vantajosas para aumentar sua eficiência e/ou reduzir a quantidade necessária para obter uma degradação eficiente de antibióticos ativos residuais em um paciente com necessidade dos mesmos. Finalmente, seria vantajoso obter melhores rendimentos de produção para essas enzimas degradadoras de antibióticos.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[004] A presente invenção fornece novas variantes da metalo-beta-lactamase VIM-2. Especificamente, a presente invenção se refere a um polipeptídeo com atividade de beta-

lactamase, que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 (que é a sequência do

VIM-2 do tipo selvagem sem o seu peptídeo sinal natural). O polipeptídeo da invenção possui uma ou mais das seguintes propriedades em comparação com a enzima VIM-2 do tipo selvagem: (i) resistência melhorada à protease, em particular resistência digestiva à protease, (ii)

estabilidade melhorada, em particular estabilidade térmica e/ou estabilidade no meio intestinal, (iii) espectro de ação aprimorado em beta-lactamas (ou seja, a variante é capaz de hidrolisar um número maior de compostos beta-lactâmicos, em particular antibióticos beta-lactâmicos), (iv) atividade enzimática aprimorada em um ou mais compostos beta-

lactâmicos (por exemplo, em um ou mais antibióticos beta-

lactâmicos), traduzindo-se em particular em um menor tempo de inativação de antibióticos e (v) melhor rendimento da produção.

Mais especificamente, o polipeptídeo da invenção é uma variante do VIM-2 que compreende pelo menos uma substituição na posição 10, com referência à sequência da beta-lactamase VIM-2 da SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade,

o polipeptídeo da invenção é uma variante do VIM-2 que compreende substituições na posição 10 e em pelo menos uma posição selecionada das posições 22, 34 e 130, em que as posições correspondem às posições de aminoácidos da beta- lactamase VIM-2 de SEQ ID NO: 1.

[005] Em uma modalidade particular da invenção, o polipeptídeo compreende uma substituição nas posições 10 e 22, nas posições 10 e 34, nas posições 10 e 130, nas posições 10, 22 e 34; nas posições 10, 22 e 130; nas posições 10, 34 e 130 ou nas posições 10, 22, 34 e 130.

[006] Também é aqui divulgada uma variante de VIM-2 compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição selecionada das posições 10, 22, 34 e 130, em que as posições correspondem às posições de aminoácidos da beta-lactamase VIM-2 da SEQ ID NO: 1.

[007] Em uma modalidade particular da invenção, a substituição na posição 10 é V10A. Em outra modalidade, a substituição na posição 22 é Q22H ou Q22N. Em outra modalidade, a substituição na posição 34 é Q34R. Em outra modalidade, a substituição na posição 130 é E130D.

[008] As bactérias que produzem a variante de VIM-2 de acordo com a invenção podem apresentar uma propriedade aprimorada em relação a uma Concentração Inibitória Mínima (CIM) para pelo menos um antibiótico beta-lactâmico, tal como, mas não exclusivamente, ampicilina, piperacilina, ticarcilina, temocilina, cefalotina, cefoxitina, cefuroxima, cefotaxima, ceftazidima, cefepima, ceftriaxona, ceftarolina,

cefotetan, imipenem, meropenem e ertapenem, em comparação com uma CIM da mesma bactéria que produz o VIM-2 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 1, que pode ser determinada usando métodos padrão de teste de suscetibilidade in vitro, tal como o método do caldo de microdiluição (Clinical Laboratory Standard Institute, documento M07-A10: Métodos para diluição de testes de susceptibilidade antimicrobiana para bactérias que crescem aerobicamente; Padrão Aprovado - Décima Edição).

No contexto da presente invenção, a expressão "propriedade aprimorada em relação a uma Concentração Inibitória Mínima (CIM)" denota uma CIM aumentada para as bactérias que produzem a variante de VIM-2, por exemplo, uma CIM aumentada em 2 vezes ou mais, em comparação com as mesmas bactérias que produzem o VIM-2 do tipo selvagem.

[009] A variante de VIM-2 de acordo com a invenção também pode apresentar uma propriedade aprimorada em relação à resistência a proteases, em particular a proteases digestivas, em comparação com o VIM-2 do tipo selvagem da SEQ ID NO: 1, que pode ser determinado através do monitoramento da atividade enzimática (por meio de ensaios enzimáticos in vitro, como descrito abaixo) e/ou integridade (por exemplo, por meio de análise por espectrometria de massa) após a incubação com proteases purificadas, tal como tripsina, quimotripsina ou semelhante ou com meio intestinal de leitões, porcos, outros mamíferos (tal como o meio intestinal humano) ou outros animais.

[0010] A variante de VIM-2 de acordo com a invenção também pode apresentar uma propriedade aprimorada em relação à estabilidade (em particular a estabilidade térmica), em comparação com o VIM-2 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 1, que pode ser determinado pelo monitoramento da enzima atividade residual após a incubação da amostra de proteínas (incluindo extratos brutos) a temperaturas variando de 45 a 75 °C por até duas horas e, em particular, a 65 °C por 45 min.

Alternativamente, a desnaturação induzida pela temperatura pode ser seguida usando medidas circulares de dicroísmo.

Esta experiência produz uma temperatura de fusão experimental (Tm) que é mais alta para enzimas que mostram uma estabilidade conformacional melhorada.

[0011] A variante de VIM-2 de acordo com a invenção também pode apresentar uma propriedade aprimorada em relação à estabilidade no meio intestinal, particularmente meio jejunal, ileal e cecal, em comparação com o VIM-2 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 1, que pode ser determinado por monitorização da atividade residual da enzima após incubação da amostra de proteína (incluindo a enzima purificada) por diferentes durações no meio intestinal, por exemplo, meio ileal.

[0012] A variante de VIM-2 de acordo com a invenção também pode apresentar uma propriedade aprimorada em relação à sua atividade catalítica em um ou mais substratos beta- lactâmicos (tais como antibióticos beta-lactâmicos específicos), em comparação com a atividade mostrado pelo VIM-2 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 1, que pode ser determinado por ensaios enzimáticos in vitro, nos quais a variação dependente do tempo de uma concentração de substrato beta-lactâmico (taxa de hidrólise) é monitorada espectrofotometricamente na presença de amostras de proteínas contendo o VIM-2 do tipo selvagem ou a variante de VIM-2.

[0013] A variante de VIM-2 de acordo com a invenção também pode apresentar uma propriedade aprimorada em relação aos seus parâmetros catalíticos, como os valores de kcat e Km, em comparação com a atividade mostrada pelo VIM-2 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 1.

[0014] A variante de VIM-2 de acordo com a invenção também pode apresentar uma propriedade aprimorada em relação a um nível de produção aumentado em bactérias recombinantes ou outros hospedeiros adequados, em comparação com o nível de produção do VIM-2 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 1, que pode ser determinado por ensaios enzimáticos in vitro, por exemplo ensaios realizados como descrito acima com extratos obtidos de culturas bacterianas que produzem o VIM-2 do tipo selvagem ou suas variantes. Em uma modalidade particular, o extrato é obtido ou como um extrato bruto após a lise de células ou bactérias ou em um meio de cultura de células (procarióticas ou eucarióticas) (no caso de uma enzima secretada). Todos esses métodos também podem ser implementados em uma enzima purificada.

[0015] Em uma modalidade particular, o polipeptídeo da invenção é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 23.

VIM-2 V10A (SEQ ID NO: 3)

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AHTNRSVVE VIM-2 V10A Q34R Q22H (SEQ ID NO:4)

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AHTNRSVVE VIM-2 V10A Q34R Q22N (SEQ ID NO:5)

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VIM-2 V10A Q34R E130D (SEQ ID NO:6)

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AHTNRSVVE VIM-2 V10A Q34R E130D Q22N (SEQ ID NO:7)

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AHTNRSVVE VIM-2 V10A Q34R E130D Q22H (SEQ ID NO:8)

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AHTNRSVVE VIM-2 V10A Q34R Q22H DCT236 (SEQ ID NO:9)

AHTN VIM-2 V10A Q34R Q22N DCT236 (SEQ ID NO:10)

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AHTN VIM-2 V10A Q34R E130D DCT236 (SEQ ID NO:11)

AHTN VIM-2 V10A Q34R E130D Q22N DCT236 (SEQ ID NO:12)

AHTN VIM-2 V10A Q34R E130D Q22H DCT236 (SEQ ID NO:13)

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[0016] Em uma modalidade particular, o polipeptídeo da invenção é uma variante funcional da beta-lactamase VIM-2 de qualquer uma das SEQ ID NO: 3 a 13, compreendendo ainda uma substituição V1M. Por conseguinte, a invenção também se refere a um polipeptídeo compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14-23.

VIM-2 V10A V1M Q34R Q22H (SEQ ID NO:14)

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AHTNRSVVE VIM-2 V10A V1M Q34R Q22N (SEQ ID NO:15)

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AHTNRSVVE VIM-2 V10A V1M Q34R E130D (SEQ ID NO:16)

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AHTNRSVVE VIM-2 V10A V1M Q34R E130D Q22N (SEQ ID NO:17)

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AHTNRSVVE VIM-2 V10A V1M Q34R E130D Q22H (SEQ ID NO:18)

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AHTNRSVVE VIM-2 V10A V1M Q34R Q22H DCT236 (SEQ ID NO:19)

AHTN VIM-2 V10A V1M Q34R Q22N DCT236 (SEQ ID NO:20)

AHTN VIM-2 V10A V1M Q34R E130D DCT236 (SEQ ID NO:21)

AHTN VIM-2 V10A V1M Q34R E130D Q22N DCT236 (SEQ ID NO:22)

AHTN VIM-2 V10A V1M Q34R E130D Q22H DCT236 (SEQ ID NO:23)

MDSSGEYPTASEIPVGEVRLYHIADGVWSHIATRSFDGAVYPSNGLIVRDGDEL LLIDTAWGAKNTAALLAEIEKQIGLPVTRAVSTHFHDDRVGGVDVLRAAGVATYASPST RRLAEVEGNEIPTHSLDGLSSSGDAVRFGPVELFYPGAAHSTDNLVVYVPSASVLYGGC AIYELSRTSAGNVADADLAEWPTSIERIQQHYPEAQFVIPGHGLPGGLDLLKHTTNVVK AHTN

[0017] A presente invenção também se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica a variante polipeptídica VIM-2 da invenção, construtos de ácido nucleico compreendendo os mesmos vírus recombinantes ou células hospedeiras (procarióticas e eucarióticas) compreendendo a sequência de ácido nucleico ou o construto de ácido nucleico de acordo com a invenção e métodos para a sua produção.

[0018] A invenção se refere ainda a uma composição compreendendo a variante polipeptídica de acordo com a invenção. Em uma modalidade particular, a composição é administrável por via oral e é capaz de liberar o polipeptídeo em uma parte desejada do intestino de um indivíduo que necessite do mesmo. De preferência, a parte desejada é o jejuno, íleo, ceco ou cólon.

[0019] Em uma modalidade adicional, a invenção se refere a uma célula hospedeira recombinante, procariótica ou eucariótica ou organismo que produz o polipeptídeo que pode ser administrado a um indivíduo e libera o polipeptídeo na parte desejada do intestino do indivíduo em necessidade do mesmo. De preferência, o polipeptídeo é liberado no íleo, ceco ou cólon, de preferência no ceco ou cólon.

[0020] Um outro aspecto da invenção é um kit de partes para administração separada, sequencial ou simultânea do polipeptídeo de acordo com a invenção e um composto beta- lactâmico, por exemplo antibiótico beta-lactâmico, sensível ao referido polipeptídeo do kit de partes. Em uma modalidade particular, tanto o polipeptídeo quanto o antibiótico são administráveis por via oral. Em outra modalidade, o polipeptídeo e o antibiótico são administrados por diferentes vias, por exemplo, o polipeptídeo é administrável por via oral e o antibiótico é administrado por via parenteral, tal como por injeção como uma injeção intravenosa, intra-arterial, intramuscular, subcutânea ou intraperitoneal. Em uma modalidade particular, o polipeptídeo é administrado antes ou depois, em particular antes do antibiótico.

[0021] A presente invenção também se refere a métodos de terapia que implementam o polipeptídeo da invenção. Assim, a invenção fornece o polipeptídeo da invenção, que é uma variante de VIM-2, para uso como medicamento. Mais especificamente, fornece o uso do referido polipeptídeo ou uma composição ou um kit de partes contendo o mesmo, em um método para inativar um antibiótico beta-lactâmico em um indivíduo que necessite do mesmo. A invenção também se refere ao uso do polipeptídeo, da composição ou do kit de partes da invenção, em um método para o tratamento de uma infecção bacteriana causada por bactérias suscetíveis a um antibiótico beta-lactâmico. Mais particularmente, a infecção bacteriana é tratada usando uma combinação do polipeptídeo da invenção e de um antibiótico beta-lactâmico que é sensível ao referido polipeptídeo, tendo assim a infecção tratada graças ao antibiótico beta-lactâmico, enquanto qualquer antibiótico ativo residual indesejado é eliminado do intestino e, em uma modalidade específica, especificamente do jejuno, íleo, ceco e cólon, graças ao polipeptídeo da invenção. Nesta modalidade específica, o polipeptídeo é preferencialmente formulado em uma composição que é capaz de liberar o polipeptídeo em uma parte desejada do intestino de um indivíduo necessitado desse tratamento de infecção bacteriana, em que a parte desejada do intestino é preferencialmente o jejuno, o íleo, o ceco ou o cólon, mais preferencialmente o íleo, o ceco ou o cólon. O polipeptídeo pode ser produzido por células hospedeiras recombinantes (procarióticas ou eucarióticas) ou organismos que são administrados por via oral ao indivíduo necessitado de tal tratamento de infecção bacteriana e liberam o polipeptídeo na parte desejada do intestino, em particular no íleo, ceco ou cólon.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0022] A presente invenção fornece novas variantes da metalo-beta-lactamase VIM-2. Portanto, a sequência do polipeptídeo da invenção não é idêntica à sequência do VIM- 2, que é mostrada na SEQ ID NO: 1, na medida em que difere do VIM-2 por pelo menos uma modificação de aminoácidos em comparação com a SEQ ID NO: 1.

[0023] A sequência mostrada na SEQ ID NO:1 é a sequência de aminoácido de VIM-2 do tipo selvagem que sofreu clivagem no peptídeo sinal N-terminal (isto é, a sequência de VIM-2 do tipo selvagem sem o seu peptídeo sinal).

SEQ ID NO:1:

VDSSGEYPTVSEIPVGEVRLYQIADGVWSHIATQSFDGAVYPSNGLIVRDGDEL LLIDTAWGAKNTAALLAEIEKQIGLPVTRAVSTHFHDDRVGGVDVLRAAGVATYASPST RRLAEVEGNEIPTHSLEGLSSSGDAVRFGPVELFYPGAAHSTDNLVVYVPSASVLYGGC AIYELSRTSAGNVADADLAEWPTSIERIQQHYPEAQFVIPGHGLPGGLDLLKHTTNVVK AHTNRSVVE

[0024] Esta sequência começa assim com um resíduo de valina na sua extremidade N-terminal. No entanto, em modalidades particulares da invenção, este primeiro resíduo de valina pode ser substituído por um resíduo de metionina.

Por exemplo, nos casos em que a proteína VIM-2 ou sua variante é produzida sem um peptídeo de sinal N-terminal de um cassete de expressão, um códon de iniciação que codifica um resíduo de metionina pode ser introduzido no gene de codificação da variante de VIM-2 ou VIM-2 em vez de um códon que codifica um resíduo de valina. Por conseguinte, em uma modalidade particular da invenção, o polipeptídeo da invenção compreende a substituição V1M.

[0025] O polipeptídeo da presente invenção compartilha pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, tendo o referido polipeptídeo uma ou mais das seguintes propriedades em comparação com a enzima VIM-2 do tipo selvagem: (i) resistência melhorada a proteases (em particular proteases digestivas), (ii) estabilidade melhorada (em particular estabilidade térmica e/ou estabilidade no meio intestinal), (iii) espectro de ação aprimorado em compostos beta- lactâmicos, em particular antibióticos beta-lactâmicos, (ou seja, o polipeptídeo da invenção é capaz de inativar um número maior de diferentes compostos beta-lactâmicos (tal como antibióticos) em comparação com a enzima VIM-2 de tipo selvagem, ou é capaz de inativar compostos beta-lactâmicos não suscetíveis à enzima VIM-2 de tipo selvagem), (iv) atividade enzimática melhorada (em particular tempo de inativação de antibióticos diminuído) e (v) aumento do rendimento da produção.

[0026] O polipeptídeo variante da invenção compreende uma substituição em pelo menos uma posição selecionada das posições 10, 22, 34 e 130, em que as posições correspondem às posições de aminoácidos mostradas na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo variante da invenção compreende uma substituição na posição 10. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo variante da invenção compreende uma substituição na posição 10 e em pelo menos uma posição selecionada das posições 22, 34 e 130. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo variante da invenção compreende uma modificação nas posições 10, 22, 34 e 130, em que as posições correspondem às posições de aminoácidos da beta-lactamase VIM-2 da SEQ ID NO: 1.

[0027] Em uma modalidade específica, o polipeptídeo variante compreende as seguintes substituições: V10A; e Q22H, N; e Q34R; e E130D.

[0028] No contexto da presente invenção, uma vírgula após uma posição numerada indica modificações alternativas na referida posição. Por exemplo, "22H, N" significa que o aminoácido na posição 22 na SEQ ID NO: 1 pode ser substituído por H ou N.

[0029] Em uma modalidade particular para melhorar a estabilidade intestinal e atividade específica contra uma variedade de antibióticos beta-lactâmicos, o polipeptídeo da invenção compreende as substituições 10A, 22N e 34R.

[0030] Em uma modalidade particular para melhorar a estabilidade intestinal e atividade específica contra uma variedade de antibióticos beta-lactâmicos, o polipeptídeo da invenção compreende as substituições 10A, 22H e 34R.

[0031] Em uma modalidade específica para melhorar a estabilidade intestinal e atividade específica contra uma variedade de antibióticos beta-lactâmicos, o polipeptídeo da invenção compreende as substituições 10A, 34R e 130D.

[0032] Em uma modalidade particular para melhorar a estabilidade intestinal e a atividade enzimática contra uma variedade de antibióticos beta-lactâmicos, o polipeptídeo da invenção compreende as substituições 10A, 22H, 34R e 130D.

[0033] Em uma modalidade específica para melhorar a estabilidade intestinal e atividade específica contra uma variedade de antibióticos beta-lactâmicos, o polipeptídeo da invenção compreende as substituições 10A, 22N, 34R e 130D.

[0034] Na presente invenção, os aminoácidos são representados usando o conhecido código de três letras ou um código de uma letra, como resumido na tabela abaixo.

Código de três Aminoácido Código de uma letra letras Alanina ala A Arginina arg R Asparagina asn N Ácido aspártico asp D Cisteína cys C Ácido glutâmico glu E Glutamina gln Q Glicina gly G Histidina his H Isoleucina ile I Leucina leu L Lisina lys K Metionina met M Fenilalanina phe F Prolina pro P Serina ser S Treonina thr T Triptofano trp W Tirosina tyr Y Valina val V

[0035] De acordo com a presente invenção, uma beta- lactamase é um polipeptídeo com atividade de beta-lactamase, isto é, uma enzima que catalisa a hidrólise irreversível da ligação amida do anel beta-lactâmico encontrada em compostos tais como antibióticos beta-lactâmicos (por exemplo, penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos, penam sulfonas) para criar uma molécula hidrolisada desprovida de sua atividade antibacteriana.

[0036] No contexto da presente invenção, a beta-lactamase VIM-2 é o polipeptídeo que possui a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1. Essa enzima foi descrita em 2000 por Poirel et al. (Caracterização de VIM-2, uma metalo-beta-lactamase hidrolisante de carbapenêmicos e seu gene transmitido por plasmídeo e integron de um isolado clínico de Pseudomonas aeruginosa na França; Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44 (4): 891-7) e ainda caracterizado por Docquier et al. em 2003 (Sobre heterogeneidade funcional e estrutural de metalo-beta-lactamases do tipo VIM. J. Antimicrob.

Chemother. 2003; 51: 257-266).

[0037] A atividade da variante de VIM-2 da invenção pode ser testada por vários ensaios. Por exemplo, são implementados ensaios enzimáticos in vitro, nos quais a taxa de hidrólise de uma hidrólise de composto beta-lactâmico é determinada espectrofotometricamente na presença de amostras de proteínas contendo a variante de VIM-2 de tipo selvagem ou VIM-2. Especificamente, a concentração de um composto beta-lactâmico e/ou seu produto de hidrólise em solução (usando um tampão adequado, tal como tampão HEPES 50 mM, pH 7,5, suplementado com ZnSO4 50 μM) pode ser seguida em um espectrofotômetro de UV-Visível ou leitor de placas de microcavidade com comprimento de onda que corresponde à absorbância máxima do substrato e/ou produto. Na presença de uma beta-lactamase, a variação dependente do tempo da concentração do substrato beta-lactâmico e/ou do produto corresponderá, assim, à taxa de reação. Se a taxa inicial de hidrólise for medida ([S] t ≈ [S]0), essa taxa de reação (expressa em μM/min ou μM/s) é diretamente proporcional à concentração de enzima na amostra analisada. Além disso, a variação da taxa inicial na concentração inicial do substrato é caracterizada pela equação de Henri-Michaelis-Menten e permite calcular os parâmetros cinéticos (kcat e KM) da enzima para a hidrólise de compostos beta-lactâmicos específicos.

Assim, a medida das taxas iniciais de hidrólise, conforme determinado em tais ensaios enzimáticos, permite caracterizar as propriedades de amostras contendo variantes de VIM-2, como sua atividade preferencial em relação a um substrato específico ou sua abundância relativa na amostra.

[0038] Em uma modalidade particular, o polipeptídeo da presente invenção pode ser isolado. No contexto da presente invenção, o termo "isolado", conforme usados aqui, se refere a um polipeptídeo que é pelo menos 20% puro, preferencialmente pelo menos 40% puro, mais preferencialmente pelo menos 60% puro, ainda mais preferencialmente pelo menos 80% puro, mais preferencialmente pelo menos 90% puro, e ainda mais preferencialmente pelo menos 95% puro, conforme determinado por SDS-PAGE. Em particular, é preferido que os polipeptídeos estejam na "forma essencialmente pura", isto é, que a preparação de polipeptídeo esteja essencialmente livre de outros componentes bioquímicos, tais como polinucleotídeos, polissacarídeos e polipeptídeos, aos quais está associado nativamente. Isto pode ser conseguido, por exemplo, preparando o polipeptídeo por meio de métodos recombinantes bem conhecidos e por métodos de purificação clássicos.

[0039] A relação entre duas sequências de aminoácidos é descrita pelo parâmetro "identidade". Para os fins da presente invenção, o alinhamento de duas sequências de aminoácidos é determinado usando o programa Needle do pacote EMBOSS (http://emboss.org) versão 2.8.0. O programa Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito em Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453. A matriz de substituição usada é BLOSUM62, a penalidade de abertura de intervalo é 10 e a penalidade de extensão de intervalo é 0,5.

[0040] O grau de identidade entre uma sequência de aminoácidos da presente invenção e a sequência de aminoácidos referida nas reivindicações (SEQ ID NO: 1) é calculado como o número de correspondências exatas no alinhamento das duas sequências, dividido pelo comprimento da "sequência da invenção" ou o comprimento da SEQ ID NO: 1, o que for menor.

O resultado é expresso em percentual de identidade.

[0041] Uma correspondência exata ocorre quando a "sequência da invenção" e a SEQ ID NO: 1 têm resíduos de aminoácidos idênticos nas mesmas posições do alinhamento. O comprimento de uma sequência é o número de resíduos de aminoácidos na sequência (por exemplo, o comprimento dos aminoácidos 1-240 da SEQ ID NO: 1 é 240).

[0042] Em modalidades particulares da presente invenção, o grau de identidade desses peptídeos específicos para a SEQ ID NO: 1 é de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99%. Em ainda outras modalidades, seu grau de identidade com a SEQ ID NO: 1 é de pelo menos 88,7%, 89,1%, 89,5%, 89,8%, 90,2%, 90,6%, 91%, 91,4%, 91,7%, 92,1%, 92,5 %, 92,9%, 93,2%, 93,6%, 94%, 94,4%, 94,7%, 95,1%, 95,5%, 95,9%, 96,2%, 96,6%, 97%, 97,4%, 97,7%, 98,1%, 98,5%, 98,9%, 99,2% ou pelo menos 99,6%.

[0043] Obviamente, a variante de VIM-2 da presente invenção pode ainda compreender um número de modificações em relação à SEQ ID NO: 1 em posições diferentes das especificamente identificadas acima. Modificações adicionais podem incluir substituições, deleções ou inserções de aminoácidos, bem como combinações de qualquer número de tais modificações.

Em uma modalidade particular, essas modificações da variante de VIM-2 da presente invenção incluem deleções de aminoácidos na extremidade amino-

terminal ou carboxi-terminal da proteína, além daquelas especificamente identificadas acima.

Em uma modalidade ilustrativa e não limitativa, o polipeptídeo da invenção pode ser excluído de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidos localizados na extremidade carboxi- terminal da proteína, em comparação com a SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade preferida,

o polipeptídeo da invenção apresenta um truncamento carboxi-

terminal da posição 237 da SEQ ID NO: 1. No contexto da invenção, isto significa que os resíduos de aminoácidos 237 a 240 da SEQ ID NO: 1 estão ausentes no polipeptídeo resultante da invenção.

Em outra modalidade, o polipeptídeo da invenção apresenta um truncamento carboxi- terminal dos resíduos 236-240 da SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o polipeptídeo da invenção apresenta um truncamento C-terminal dos resíduos 235-240 da SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade ilustrativa e não limitativa, o polipeptídeo da invenção pode ser excluído de um ou mais de um (tal como 1, 2, 3, 4,

5, 6 ou 7 aminoácidos localizados na extremidade amino-

terminal da proteína, em comparação com a SEQ ID NO: 1, isto é, em comparação com uma sequência de VIM-2 de tipo selvagem que foi submetida à clivagem de peptídeos de sinal N-terminal (isto é, a sequência de VIM-2 de tipo selvagem sem seu peptídeo de sinal). Em uma variante específica desta modalidade, o polipeptídeo que é excluído (ou, de outra forma, afirma que possui um truncamento) de um ou mais de um aminoácido localizado na extremidade amino- terminal em comparação com a SEQ ID NO: 1 pode compreender ainda uma inserção ou extensão como definido abaixo, tal como um marcador ou um peptídeo sinal.

[0044] No contexto da presente invenção, o termo "inserção" pretende também abranger extensões amino- e/ou carboxi-terminais. Em uma modalidade particular, as extensões N-terminais podem incluir a adição de um peptídeo sinal ao polipeptídeo da invenção. Isso pode incluir o peptídeo sinal natural do VIM-2 de tipo selvagem com a sequência de aminoácidos MFKLLSKLLVYLTASIMAIASPLAFS (SEQ ID NO: 2) ou um peptídeo sinal modificado com as substituições L9S, L9F, L9W, V10I, L12C, A14V, I16T, M17L, I19M, I19T, F25C quando comparado com o de VIM-2 de tipo selvagem, ou qualquer combinação das substituições acima mencionadas, ou qualquer outro peptídeo sinal apropriado, ou ambos.

[0045] Extensões representativas do terminal N ou do terminal C podem incluir a adição de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, tais como peptídeos "marcadores" codificados por um fragmento de DNA clonado em fusão com o

VIM-2 do tipo selvagem ou qualquer variante do mesmo, o que permite facilitar a identificação e/ou purificação do polipeptídeo da invenção. Esse marcador apropriado pode incluir marcadores de histidina (6 x His) ou proteína de ligação à glutationa-S-transferase ou maltose, por exemplo, como é bem conhecido na técnica.

[0046] Um polipeptídeo de acordo com a invenção pode apresentar uma atividade específica para um determinado antibiótico beta-lactâmico melhorado em comparação com a atividade específica exibida pelo VIM-2 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 1 para o mesmo antibiótico. Em uma modalidade específica, a atividade específica, expressa em nmoles de substratos hidrolisados por unidade de tempo e por um mg de uma amostra de proteína contendo o polipeptídeo da presente invenção é de pelo menos 105%, em relação à atividade específica do VIM-2 do tipo selvagem da SEQ ID NO: 1 determinado usando o mesmo procedimento exposto na seção de exemplo. Em uma modalidade adicional, a atividade específica relativa do polipeptídeo da presente invenção é de pelo menos 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800 ou mesmo pelo menos 1600%, ainda em relação à atividade específica do VIM-2 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 1.

[0047] Em uma modalidade específica adicional, o polipeptídeo da invenção compreende, ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 3 a 23, ou um fragmento da mesma com atividade de beta-lactamase (tal como um fragmento sem 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 ou mais de 7 aminoácidos C- terminais em comparação com o polipeptídeo de qualquer uma das SEQ ID NO: 3 a 23), em particular um fragmento sem os aminoácidos 237-240, 236-240 ou 235-240 como descrito acima. Em uma variante desta modalidade, o polipeptídeo sem um peptídeo sinal pode compreender uma substituição adicional de aminoácidos. Em uma variante desta modalidade, o polipeptídeo compreende ainda um peptídeo sinal (como o peptídeo sinal mostrado na SEQ ID NO: 2 ou qualquer variante do mesmo como definido acima) na sua extremidade N-terminal.

[0048] Em uma modalidade específica, o polipeptídeo da invenção compreende: (i) um truncamento C-terminal dos resíduos 236-240 da SEQ ID NO: 1, e (ii) uma substituição em cada uma das posições 10 e 22; uma substituição em cada uma das posições 10 e 34; uma substituição em cada uma das posições 10 e 130; uma substituição em cada uma das posições 10, 22 e 34; uma substituição em cada uma das posições 10, 22 e 130; uma substituição em cada uma das posições 10, 34 e 130; ou uma substituição em cada uma das posições 10, 22, 34 e

130.

[0049] Em uma outra modalidade particular, o polipeptídeo da invenção compreende um truncamento C-terminal dos resíduos 236-240 da SEQ ID NO: 1 e uma substituição em cada uma das posições 10, 22, 34 e 130.

[0050] Em uma modalidade particular, o polipeptídeo da invenção compreende um truncamento C-terminal dos resíduos 236-240 e pelo menos uma modificação selecionada dentre V10A, Q22H ou Q22N, Q34R e E130D.

[0051] A presente invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma variante do polipeptídeo VIM-2 da invenção.

[0052] O termo "sequência isolada de ácido nucleico" se refere a uma sequência de ácido nucleico que é essencialmente livre de outras sequências de ácido nucleico, por exemplo, pelo menos cerca de 20% de pureza, preferencialmente pelo menos cerca de 40% de pureza, mais preferencialmente pelo menos cerca de 60% de pura, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 80% puro e mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% puro conforme determinado por eletroforese em gel de agarose ou qualquer outro método apropriado. Por exemplo, uma sequência isolada de ácido nucleico pode ser obtida por procedimentos de clonagem padrão usados na engenharia genética para realocar a sequência de ácido nucleico de sua localização natural para um local diferente onde será reproduzida. Os procedimentos de clonagem podem envolver excisão e isolamento de um fragmento de ácido nucleico desejado compreendendo a sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, inserção do fragmento em uma molécula de vetor e incorporação do vetor recombinante em uma célula hospedeira onde várias cópias ou clones da sequência de ácido nucleico será replicada. A sequência de ácido nucleico pode ser de origem genômica, cDNA, RNA, semissintética, sintética ou qualquer combinação das mesmas.

[0053] As sequências de ácido nucleico da invenção podem ser preparadas introduzindo pelo menos uma mutação em uma sequência modelo que codifica VIM-2 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência da mesma, em que a sequência de ácido nucleico mutante codifica um polipeptídeo VIM-2 variante. A introdução de uma mutação na sequência de ácido nucleico para trocar um nucleotídeo por outro nucleotídeo pode ser realizada por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por mutagênese direcionada ao local, por mutagênese aleatória ou por mutagênese aleatória dopada, perfurada ou localizada.

[0054] A mutagênese aleatória é adequadamente realizada como mutagênese aleatória localizada ou específica da região em pelo menos três partes da tradução do gene na sequência de aminoácidos mostrada em questão ou no gene inteiro. Quando a mutagênese é realizada pelo uso de um oligonucleotídeo, o oligonucleotídeo pode ser dopado ou perfurado com os três nucleotídeos não parentais durante a síntese do oligonucleotídeo nas posições a serem alteradas. A dopagem ou perfuração pode ser realizada de modo a evitar os códons para aminoácidos indesejados. O oligonucleotídeo dopado ou perfurado pode ser incorporado no DNA que codifica o polipeptídeo por qualquer técnica, utilizando, por exemplo, PCR, LCR ou qualquer polimerase e ligase de DNA, ou outra enzima de processamento/modificação de DNA, tal como uma topoisomerase, conforme apropriado.

[0055] De preferência, a dopagem (doping) é realizada usando "dopagem aleatória constante", na qual a porcentagem de tipo selvagem e mutação em cada posição é predefinida.

Além disso, a dopagem pode ser direcionada para uma preferência pela introdução de certos nucleotídeos e, assim, uma preferência pela introdução de um ou mais resíduos de aminoácidos específicos. A dopagem pode ser feita, por exemplo, de modo a permitir a introdução de 90% de tipo selvagem e 10% de mutações em cada posição. Uma consideração adicional na escolha de um esquema de dopagem se baseia em restrições genéticas e proteicas-estruturais.

[0056] A mutagênese aleatória pode ser vantajosamente localizada em uma parte da sequência VIM-2 de origem em questão. Isto pode, por exemplo, ser vantajoso quando determinadas regiões da enzima tiverem sido identificadas como sendo de particular importância para uma dada propriedade da enzima.

[0057] Métodos alternativos para fornecer variantes da invenção incluem embaralhamento de genes, por exemplo, como descrito em WO 95/22625 ou em WO 96/00343, e o processo de derivação de consenso, como descrito em EP 897985.

[0058] A invenção se refere ainda a um construto de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico da presente invenção operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle que direcionam a expressão da sequência de codificação em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle. O termo "expressão" deve ser entendido como incluindo qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo, incluindo, mas não limitado a transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-traducional e secreção.

[0059] O termo "construto de ácido nucleico", conforme usado aqui, se refere a uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene que ocorre naturalmente ou que é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não seria existente na natureza. O termo construto de ácido nucleico é sinônimo do termo "cassete de expressão" quando o construto de ácido nucleico contém as sequências de controle necessárias para a expressão de uma sequência de codificação da presente invenção. Em uma modalidade particular, o construto de ácido nucleico ou o cassete de expressão está compreendido dentro de um plasmídeo (tal como um plasmídeo de expressão).

[0060] O termo "sequências de controle" é aqui definido para incluir todos os componentes que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a um líder, um operador, sequência de propeptídeo, promotor, sequência de iniciação de transcrição, sequência de iniciação de tradução, sequência de peptídeo sinal, sequência de terminação de tradução, sequência de poliadenilação e terminador de transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinal de terminação transcricional e sinais de iniciação e terminação de tradução. As sequências de controle podem ser fornecidas com ligantes com a finalidade de introduzir locais de restrição específicos, facilitando a ligação das sequências de controle com a região codificadora da sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo.

[0061] O termo "operacionalmente ligado" denota aqui uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência de codificação da sequência de polinucleotídeo, de modo que a sequência de controle direcione a expressão da sequência de codificação de um polipeptídeo.

[0062] Quando usado aqui, o termo "sequência de codificação" (CDS) significa uma sequência de nucleotídeos, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de seu produto proteico. Os limites da sequência de codificação são geralmente determinados por um quadro de leitura aberto, que geralmente começa com o códon de início ATG ou códons de início alternativos, como GTG e TTG, e geralmente termina com um códon de parada, como TAA, TGA ou TAG. A sequência de codificação pode consistir em um DNA, cDNA; pode ser natural, semissintético ou sintético; também pode conter nucleotídeos não naturais ou modificados.

[0063] O termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo, incluindo, mas não se limitando a transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-traducional e secreção.

[0064] O termo "vetor de expressão" é aqui definido como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção, o qual está operacionalmente ligado a nucleotídeos adicionais que proporcionam sua expressão.

[0065] Uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção pode ser expressa usando um vetor de expressão que tipicamente inclui sequências de controle que codificam um promotor, operador, local de ligação ao ribossomo, sinal de início da tradução e, opcionalmente, um gene repressor ou vários genes ativadores.

[0066] O vetor de expressão recombinante carregando a sequência de DNA que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser qualquer vetor que possa ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor dependerá frequentemente da célula hospedeira na qual ele será introduzido. O vetor pode ser aquele que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado ao genoma da célula hospedeira e replicado junto com o cromossomo (s) no qual foi integrado.

Também pode permanecer na célula como uma molécula de DNA extra cromossômico de replicação autônoma, tal como um plasmídeo.

[0067] A invenção se refere ainda a uma célula hospedeira compreendendo a sequência de ácido nucleico ou o construto de ácido nucleico da invenção. Uma "célula hospedeira", como aqui utilizada, inclui qualquer tipo de célula, procariótica ou eucariótica, suscetível a transformação, transfecção, transdução, infecção e afins com um construto de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção.

[0068] A presente invenção também se refere a células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, que é vantajosamente utilizado na produção recombinante dos polipeptídeos. Um vetor compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o vetor seja mantido como um integrador cromossômico ou como um vetor extra cromossômico autorreplicante. O termo "célula hospedeira" abrange qualquer progênie de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.

[0069] A célula hospedeira pode consistir ou originar-se de um organismo unicelular ou policelular e pode ser procariótica ou eucariótica.

[0070] Entre os microrganismos unicelulares úteis estão células bacterianas, tais como bactérias Gram-positivas, incluindo, mas não limitadas a, uma célula de Bacillus, por exemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis; ou uma célula de Streptomyces, por exemplo,

Streptomyces lividans e Streptomyces murinus, ou bactérias Gram-negativas, tais como Escherichia coli e Pseudomonas spp.

[0071] A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacteriana pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), por transformação de DNA usando células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221) usando qualquer método de transformação, incluindo mas não limitado a transformação química ou eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

[0072] A célula hospedeira também pode ser de um eucarioto, tal como um animal e, em particular, mamífero, um inseto, uma planta ou linhagens de células derivadas dos mesmos, ou um eucarioto unicelular ou célula de fungo. A proteína recombinante também pode ser produzida em um organismo multicelular, tal como um animal, em particular um mamífero ou uma planta.

[0073] Em uma modalidade particular, a célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. Em uma modalidade particular,

a célula hospedeira fúngica é Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris. Em uma modalidade particular, a célula hospedeira é uma linhagem celular originária das células do ovário de hamster chinês.

[0074] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve a formação de protoplastos, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, In Abelson, J. N. e Simon, M. I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology 194: 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings da National Academy of Sciences USA 75: 1920. As células fúngicas também podem ser transformadas por eletroporação ou por qualquer outro método adequado para introduzir moléculas de DNA em uma célula.

[0075] A presente invenção também se refere a métodos para a produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira em condições favoráveis à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[0076] Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco de agitação e fermentação em pequena ou larga escala (incluindo fermentações contínuas, em bateladas, de lote alimentado ou fermentações de estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizados em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis em fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Em alguns casos, as condições para o crescimento das células hospedeiras e a produção do polipeptídeo são distintas; em uma primeira fase, permite-se que as células hospedeiras se multipliquem sob condições apropriadas e, em uma segunda fase, as condições podem ser alteradas para permitir a produção ideal do polipeptídeo. Se o polipeptídeo é secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, ele poderá ser recuperado dos lisados celulares.

[0077] O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais, incluindo, entre outros, centrifugação, filtração, extração, adsorção, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

[0078] Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofoco e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, preparativos isoelétricos de foco, eletroforese em gel preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio) ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova York, 1989) ou uma combinação dos mesmos.

[0079] A presente invenção se refere ainda a uma composição compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. As composições apropriadas incluem um polipeptídeo como definido acima, em combinação com um carreador aceitável. As composições podem ser preparadas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica e estar na forma de composições líquidas ou secas. A composição pode ainda incluir componentes que estabilizam o polipeptídeo de acordo com a invenção, tal como glicerol.

[0080] Em uma modalidade particular, a composição é uma composição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição pode estar na forma de uma composição que é administrável por via oral e é capaz de liberar o polipeptídeo em uma parte desejada do trato gastrointestinal de um indivíduo em necessidade do mesmo. De preferência, a parte desejada é o estômago, duodeno, jejuno, íleo, ceco ou cólon. Em uma modalidade preferida, a parte desejada do intestino é o jejuno, o íleo, o ceco ou o cólon, mais preferencialmente o íleo, o ceco ou o cólon. No último caso, a composição pode incluir um ou mais compostos gastro resistentes que protegem o polipeptídeo da invenção do suco gástrico. Tais composições podem incluir os sistemas de administração de medicamentos descritos em WO93/13795, WO2004/016248 ou US20050249716, entre outros.

[0081] A presente invenção se refere ainda a uma célula ou organismo hospedeiro como descrito acima, produzindo o polipeptídeo da presente invenção, que pode ser introduzido na parte desejada do intestino e é capaz de liberar o referido polipeptídeo na parte desejada do intestino de um indivíduo em necessidade do mesmo. Em uma modalidade preferida, a parte desejada do intestino é o íleo, ceco ou cólon, mais preferencialmente o ceco ou cólon. Portanto, a presente invenção também se refere a uma célula ou organismo hospedeiro como definido acima, para uso em um método de terapia como aqui divulgado, em que a referida célula hospedeira é administrada a um indivíduo em necessidade da mesma.

[0082] Como mencionado acima, a variante polipeptídica VIM-2 da presente invenção é útil em várias utilizações terapêuticas e não terapêuticas.

[0083] A presente invenção descreve métodos de terapia que implementam o polipeptídeo da invenção, em que o referido polipeptídeo ou uma composição ou um kit de partes contendo o mesmo em combinação com um antibiótico, ou uma célula ou organismo hospedeiro que expressa o referido polipeptídeo é usado em um método para inativar um composto beta-lactâmico, tal como um antibiótico beta-lactâmico, em um indivíduo em necessidade do mesmo. O método é implementado para tratar ou prevenir os efeitos adversos de antibióticos, tal como disbiose intestinal, seleção de bactérias resistentes, interrupção dos processos digestivos normais, colonização por patógenos intestinais oportunistas, tal como Clostridium difficile, diarreia associada a antibióticos ou outras doenças relacionadas à disbiose intestinal, como alteração da imunidade, distúrbios metabólicos ou alergias.

[0084] A invenção também se refere ao uso do polipeptídeo, da composição, da célula ou organismo hospedeiro ou do kit de partes da invenção, em um método para o tratamento de uma infecção bacteriana causada por bactérias suscetíveis a um antibiótico beta-lactâmico. Mais particularmente, a infecção bacteriana é tratada usando uma combinação do polipeptídeo da invenção e um antibiótico beta-lactâmico que é sensível ao referido polipeptídeo, tendo assim a infecção tratada graças ao antibiótico beta-lactâmico, enquanto qualquer quantidade residual indesejada do antibiótico é eliminado graças ao polipeptídeo da invenção. Nesta modalidade específica, o polipeptídeo é preferencialmente formulado em uma composição que é capaz de liberar o polipeptídeo em uma parte desejada do intestino de um indivíduo necessitado desse tratamento de infecção bacteriana, em que a parte desejada do intestino é preferencialmente o jejuno, o íleo, o ceco ou o cólon, mais preferencialmente o íleo, o ceco ou o cólon.

O polipeptídeo também pode ser liberado na parte desejada do intestino por uma célula ou organismo hospedeiro que produz o referido polipeptídeo, em que a parte desejada do intestino é o íleo, ceco ou cólon, de preferência o ceco ou cólon. Em um aspecto particular, o polipeptídeo, a composição, a célula ou organismo hospedeiro ou o kit de partes da invenção é usado para o tratamento de uma infecção bacteriana em um indivíduo que pode ser um animal, um mamífero ou um ser humano sendo pelo qual um antibiótico sensível ao referido polipeptídeo é administrado ao indivíduo antes, depois ou concomitantemente com a administração do referido polipeptídeo ou composição do mesmo.

[0085] Outras utilizações do polipeptídeo da invenção incluem usos não terapêuticos, tal como o uso do polipeptídeo para a remediação de antibióticos no ambiente ou em um ambiente ambiental. Tais usos e métodos podem ser encontrados descritos, por exemplo, no documento WO 2012/007536, que descreve o uso de lacases, celulases e lipases para a remediação de antibióticos no ambiente, e são aqui aplicados mutatis mutandis para a eliminação de antibióticos beta- lactâmicos do ambiente usando o polipeptídeo da invenção.

LEGENDA DAS FIGURAS

[0086] A Figura 1 é um gráfico que representa a atividade específica das variantes de VIM-2, VIM-2[Q22H, Q34R, E130D] DCT236 e VIM-2[V10A, Q22H, Q34R, E130D] DCT236 do tipo selvagem após 0, 60, 120 e 240 minutos em extrato ileal humano.

EXEMPLOS Exemplo 1: produção e purificação de variantes de VIM- 2

[0087] A variante de VIM-2 foi produzida em Escherichia coli usando um sistema de expressão baseado em promotor de T7 (usando o plasmídeo de expressão pET-9). Resumidamente, o gene mutante blaVIM-2 foi clonado no vetor plasmídeo pET- 9 usando os locais de restrição NdeI e BamHI e o plasmídeo resultante introduzido nas células E. coli BL21 (DE3). A célula hospedeira resultante foi cultivada no rico meio de cultura de células auto indutoras ZYP-5052 (Studier, FW 2005.

Produção de proteínas por autoindução em culturas agitadas de alta densidade. Protein Expr. Purif. 41: 207–234.) Suplementado com ZnSO 4 por 24 h. As células bacterianas e o sobrenadante da cultura foram separados por centrifugação.

O sobrenadante da cultura clarificada foi então concentrado usando métodos físicos (por exemplo, ultrafiltração) ou químicos (precipitação). Alternativamente, a proteína pode ser extraída das células bacterianas, que foram ressuspensas em 100 a 200 ml de Tris 20 mM (pH 8,0) antes do tratamento com agentes físicos (ultrassonografia, prensa francesa) ou químicos (lisozima, detergentes) para induzir a lise celular. O extrato celular foi clarificado por centrifugação. A amostra clarificada resultante foi então carregada em uma coluna de cromatografia de troca aniônica.

As proteínas foram eluidas usando um gradiente linear de NaCl em tampão Tris 20 mM (pH 8,0) e as frações ativas reunidas e concentradas. A amostra de proteína foi então carregada em uma segunda coluna de troca aniônica e eluida usando um gradiente linear de NaCl em trietanolamina 20 mM (pH 7,2). A amostra resultante foi carregada em uma coluna de filtração em gel e as proteínas eluidas com HEPES 50 mM (pH 7,5) suplementadas com ZnSO 4 50 μM e NaCl 150 mM. A proteína purificada foi então concentrada e armazenada.

[0088] Em particular, este protocolo de produção foi usado com sucesso para produzir as seguintes enzimas variantes de VIM-2: VIM-2 [,Q22H, Q34R, E130D], VIM-2 [,Q22H, Q34R, E130D]

DCT236 e VIM-2 [V10A, Q22H, Q34R, E130D] DCT236. Outra variante que pode ser produzida graças a um método semelhante é o VIM-2 [V10A, Q22H, Q34R, E130D].

Exemplo 2: determinação do aumento da estabilidade de uma variante do VIM-2 no meio intestinal

[0089] Para medir a estabilidade das variantes de VIM-2, é aplicado o seguinte procedimento: a atividade de hidrólise de imipenem de amostras de proteína purificada foi determinada após incubação em extrato ileal humano. A atividade específica (Sp. Act.) para as variantes foi medida em diferentes momentos (0, 60, 120 e 240 min) durante a incubação. A atividade específica no tempo t foi comparada com a atividade específica no tempo t = 0 para avaliar a perda de atividade da variante no extrato intestinal. A mudança ao longo do tempo foi expressa como a razão entre a atividade inicial (em t = 0) e a atividade medida posteriormente no tempo ((Sp. Act. Variante) t/(Sp. Act.

Variante) t=0. Um valor menor do que um indica perda de atividade quando incubado no extrato intestinal. A atividade residual em diferentes momentos é comparada para avaliar a maior estabilidade no extrato intestinal de algumas variantes em comparação à enzima do tipo selvagem.

[0090] A atividade específica da enzima VIM-2 de tipo selvagem, variante de VIM-2, VIM-2 [Q22H, Q34R, E130D] DCT236 e variante de VIM-2, VIM-2 [V10A, Q22H, Q34R, E130D] DCT236 ao longo do tempo quando incubada em extrato ileal são apresentados na Figura 1.

[0091] A perda de atividade ao longo do tempo também é resumida na tabela a seguir: Atividade residual após 0 60 120 240 x minutos no extrato ileal VIM-2 do tipo selvagem 100,0% 58,5% 17,8% 5,6% VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236 100,0% 82,1% 69,0% 27,5% VIM- 100,0% 83,1% 62,6% 48,8% 2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] DCT236

[0092] Como mostrado na tabela ou na Figura 1, a enzima do tipo selvagem perdeu 94,4% de sua atividade após 240 minutos de incubação no extrato ileal. As variantes VIM-2 [Q22H, Q34R, E130D] DCT236 e VIM-2 [V10A, Q22H, Q34R, E130D] DCT236 perderam apenas 72,5% e 51,2% de sua atividade nas mesmas condições, respectivamente.

[0093] A combinação das substituições Q22H, Q34R, E130D resulta em variantes com propriedades dramaticamente aprimoradas em uma perspectiva industrial. A adição da substituição V10A melhora ainda mais a estabilidade da enzima no extrato ileal humano.

Exemplo 3: determinação da atividade enzimática e/ou catalítica específica de determinadas variantes de VIM-2 em relação a vários beta-lactâmicos

[0094] Para as enzimas variantes produzidas como mencionado no exemplo 1, é possível medir a atividade específica e as propriedades catalíticas em relação a compostos beta-lactâmicos específicos, tal como antibióticos beta-lactâmicos.

[0095] A variante de VIM-2[V10A, Q22H, Q34R, E130D] DCT236 exibe propriedades catalíticas aprimoradas no tampão ao considerar o imipenem como substrato: Enzima kcat (s-1) KM (µM) kcat/KM (µM-1s-1) VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] 77 9 8,5 DCT236 VIM- 2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] 130 14 9,4 DCT236

[0096] Os resultados acima ilustram que o VIM-2 [V10A, Q22H, Q34R, E130D] DCT236 exibiu uma atividade fortemente aprimorada contra um antibiótico carbapenêmico que era inesperado e tem forte interesse industrial.

Exemplo 4: determinação da atividade enzimática de determinadas variantes de VIM-2 em relação a vários beta- lactâmicos após 4 horas de incubação em meio intestinal

[0097] A avaliação da atividade enzimática é realizada como descrito a seguir: após 4 horas de incubação das variantes de VIM-2 no extrato ileal humano, a hidrólise de beta-lactâmicos foi monitorada espectrofotometricamente a um comprimento de onda adequado. A atividade enzimática pode ser expressa em nmol de substrato beta-lactâmico hidrolisado por min e por mg de proteína total na amostra.

[0098] A seguir, todas as atividades enzimáticas serão expressas relativamente à atividade enzimática da enzima do tipo selvagem medida nas mesmas condições.

[0099] Para as variantes VIM-2 [Q22H, Q34R, E130D] DCT236 e VIM-2 [V10A, Q22H, Q34R, E130D] DCT236, as atividades enzimáticas medidas são: (Atividade enzimática residual da enzima/Atividade enzimática Enzima residual da enzima de tipo selvagem) da Piperacilina VIM-2[WT] 1 VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236 51,44 VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] DCT236 198,16 (Atividade enzimática residual da enzima/Atividade enzimática Enzima residual da enzima de tipo selvagem) para Imipenem VIM-2[WT] 1 VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236 20,94 VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] DCT236 51,55

(Atividade enzimática residual da enzima/Atividade enzimática Enzima residual da enzima de tipo selvagem) para Meropenem VIM-2[WT] 1 VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236 10,52 VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] DCT236 26,55 (Atividade enzimática residual da enzima/Atividade enzimática Enzima residual da enzima de tipo selvagem) da Ceftriaxona VIM-2[WT] 1 VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236 11,66 VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D] DCT236 18,59

[00100] Os resultados acima ilustram que o VIM-2 [V10A, Q22H, Q34R, E130D] DCT236 exibiu uma atividade fortemente aprimorada após 4 horas de incubação em meio intestinal humano contra vários beta-lactâmicos de interesse em comparação com o VIM-2 [Q22H, Q34R, E130D] DCT236 mutante cuja atividade contra os mesmos beta- lactâmicos foi altamente melhorada em comparação com a enzima do tipo selvagem.

[00101] A combinação das substituições V10A, Q22H, Q34R, E130D resulta, portanto, em uma variante com propriedades dramaticamente aprimoradas em uma perspectiva industrial.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo com atividade de beta-lactamase, que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, o referido polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende: - uma substituição em cada uma das posições 10 e 22; - uma substituição em cada uma das posições 10 e 34; - uma substituição em cada uma das posições 10 e 130; - uma substituição em cada uma das posições 10, 22 e 34; - uma substituição em cada uma das posições 10, 22 e 130; - uma substituição em cada uma das posições 10, 34 e 130; ou - uma substituição em cada uma das posições 10, 22, 34 e 130, em que as posições correspondem às posições na sequência representada na SEQ ID NO: 1 e em que o referido polipeptídeo tem uma propriedade aprimorada em relação à estabilidade em comparação com o VIM-2 do tipo selvagem da SEQ ID NO: 1.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma modificação selecionada dentre as seguintes: V10A; Q22H ou Q22N;

Q34R; e E130D.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o resíduo correspondente ao primeiro resíduo da SEQ ID NO: 1 é substituído por um resíduo de metionina.

4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um peptídeo sinal na sua extremidade N- terminal.

5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende um truncamento em sua extremidade N-terminal ou C-terminal, em comparação com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1.

6. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende: - um truncamento C-terminal dos resíduos 237 a 240 da SEQ ID NO: 1; - um truncamento C-terminal dos resíduos 236 a 240 da SEQ ID NO: 1; ou - um truncamento C-terminal dos resíduos 235 a 240 da SEQ ID NO: 1.

7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 4 a 23 ou um fragmento do mesmo com atividade de beta-lactamase.

8. Sequência de ácido nucleico isolada caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Construto de ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 8, ligado operacionalmente a uma ou mais sequências de controle que direcionam a expressão do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão adequado.

10. Célula hospedeira recombinante caracterizada pelo fato de que compreende o construto de ácido nucleico conforme definido na reivindicação 9.

11. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo conforme definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 7.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é administrável por via oral e é capaz de liberar o polipeptídeo em uma parte desejada do intestino, em particular no jejuno, íleo, ceco ou cólon.

13. Kit de partes caracterizado pelo fato de que compreende (a) o polipeptídeo conforme definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 12; e (b) um antibiótico beta-lactâmico que é sensível ao referido polipeptídeo de (a) ou contido na composição de (a); para administração separada, sequencial ou simultânea.

14. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.

15. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, kit de partes de acordo com a reivindicação 13 ou célula hospedeira recombinante de acordo com a reivindicação 10, caracterizado(a) pelo fato de que é para uso em um método para inativar um antibiótico beta- lactâmico em um indivíduo em necessidade do mesmo.

16. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, kit de partes de acordo com a reivindicação 13 ou célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10, caracterizado(a) pelo fato de que é para uso em um método para o tratamento de uma infecção bacteriana em que o referido polipeptídeo ou a referida composição ou a referida célula hospedeira é para uso em combinação com um antibiótico beta-lactâmico que é sensível ao referido polipeptídeo.