CN102757950A - 超级细菌新德里金属依赖型β-内酰胺酶NDM-1的表达纯化及β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构，其中，所述β-内酰胺酶NDM-1为所述β-内酰胺酶NDM-1全长蛋白序列的从约40～50位氨基酸至约260～270位氨基酸的编码基因，其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐标，或者β-内酰胺酶NDM-1的晶体三维结构中至少40％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。本发明还涉及一种纯化β-内酰胺酶NDM-1的方法以及β-内酰胺酶NDM-1的晶体三维结构在药物筛选及药物设计方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及对超级细菌新德里金属依赖型β-内酰胺酶NDM-1进行基因工程改造以获得在大肠杆菌中的高效表达、纯化和结晶的方法，以及超级细菌新德里金属依赖型β-内酰胺酶NDM-1第47位到第270位氨基酸的三维晶体结构及其在药物筛选及药物设计方面的应用。
背景技术
超级细菌NDM-1在2010年8月经Lancet杂志特别报道后，引起了全世界广泛的关注，美国3个州和加拿大也出现感染个案；医学界表示，细菌正在蔓延，但未知蔓延速度有多快，呼吁各国设立监控系统，检测入院人士，合力追踪病菌蔓延情况，并呼吁民众注意个人卫生，不要滥用抗生素。至2010年9月，英国有超过70人感染这种NDM-1超级细菌，印度和巴基斯坦的感染人数则超过170人。比利时、荷兰、奥地利、法国、德国、肯尼亚、澳大利亚、日本等国都出现了感染个案。因此，解析NDM-1的三维结构不仅对揭示其复制机制具有重要的科学意义，而且对开发抗NDM-1药物具有重要价值。
NDM-1，指的是New Delhi metallo-β-lactamase 1(新德里金属-β-内酰胺酶)。这种酶可分解β-内酰胺环结构，因此可使任何含β-内酰胺环结构的蛋白质失效。由于目前为止临床最常用的抗生素，包括青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素，都含有β-内酰胺环结构，因此携带这种酶的细菌可以使几乎所有抗生素失效(即只要该抗生素含有β-内酰胺环结构)。超级细菌NDM-1则是指携带编码NDM-1酶的基因的细菌。至今已发现一些克雷伯氏肺炎菌、大肠杆菌和少数鲍曼不动杆菌的菌株携带有此能编码新德里 金属-β-内酰胺酶1的基因，而该基因存在于细菌的质粒(一种容易在细菌间发生基因信息交换的环状DNA)上，亦即此基因可以通过基因水平转移以从一个菌株转移到另一个菌株中，使原本对抗生素敏感(没有耐药性)的菌株获得耐药性。
最早报道的产NDM-1细菌为肺炎克雷伯菌，于2009年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中发现，对所有β-内酰胺类抗菌药物耐药，对环丙沙星也不敏感，仅对粘菌素敏感，深入研究发现这株细菌携带一种新型金属β-内酰胺酶，并根据患者可能感染地点命名这种酶为NDM-1，其后还在这名患者粪便中分离到产NDM-1的大肠埃希菌。
NDM-1属于B类金属β-内酰胺酶(MBL)家族，临床分离细菌大多能产生β-内酰胺酶，已经确定的β-内酰胺酶有数百种；各种酶分子结构和对β-内酰胺类水解能力存在较大差异，一般根据分子结构分为A、B、C、D四大类，其中，A类，C类和D类的β-内酰胺酶结构上与丝氨酸β-内酰胺酶类似，通常他们的活性位点具有一个狭窄的纵形沟状结构，在沟的底部形成了一个空腹(氧阴离子袋)，这种疏松的构造容易弯曲，便于结合底物。由于β-内酰胺环上的羰基碳在结合β-内酰胺酶活性部位的丝氨酸时发生了不可逆的反应，结果使其开环，进而引起β-内酰胺酶的分解。而B类金属β-内酰胺酶(MBL)在其活性部位大多含有锌离子，因此又称为金属β-内酰胺酶。其水解底物包括青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类等，表现为产酶细菌对这些药物广泛耐药。MBLs利用一个二价金属离子，分别与组氨酸或半胱氨酸结合，或同时与二者结合，并与β-内酰胺类抗生素的羰基碳的酰胺键相互作用，使其发生分解。MBLs主要对青霉素、头孢菌素、碳青霉稀类抗生素发挥作用，但对单内酰环类抗生素无效。MBLs最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小，其活性不被克拉维酸等β-内酰胺酶抑制剂所抑制，但可被乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制。
然而，尽管一些β-内酰胺酶抑制剂已经在临床上使用(如三唑巴坦)，但这些均被视为A类β-内酰胺酶抑制剂(如丝氨酸β-内酰胺酶)。因此，临床上仍然缺乏针对MBLs的抑制剂。而蛋白质结构的解析对揭示蛋白质 功能具有重大作用。这一结构的揭示也将对其功能研究具有重大意义。
发明内容
本发明的一个方面，提供了一种将超级细菌新德里金属依赖型β-内酰胺酶NDM-1进行基因工程改造，以提高其在大肠杆菌中能够得到高效表达、在常温(摄氏37±5℃)下可以较长时间稳定保持内酰胺酶活性的蛋白的方法。本发明优选使用大肠杆菌的原核细胞表达系统(但不排除其他的表达系统，如在其他细菌或者其他的真核生物细胞中进行表达)，对以上所述蛋白以GST(谷胱甘肽-S-转移酶)融合蛋白的方式进行表达，并用于蛋白质结晶的方法。本发明述及在大肠杆菌中高效获得β-内酰胺酶NDM-1的表达方法。
优选地，本发明将β-内酰胺酶NDM-1进行了基因工程改造，将β-内酰胺酶NDM-1全长基因进行了截短的研究，提供了一个可以在大肠杆菌中高效表达的方法，该方法包括了氨基端约40～50位氨基酸至约260～270位氨基酸的编码基因，更优选包括约47位至270位氨基酸。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种纯化β-内酰胺酶NDM-1的方法。将基因工程方法改造过以后的NDM-1基因连接于带有标签的表达性质粒载体中，转化进入大肠杆菌细胞中进行表达、纯化。
优选地，其中所述的标签选自GST、Flag-tag、Myc-tag、MBP-tag、His-tag、特异性抗体；所述载体含有选择性标记基因。所述与特异标签识别的方法是通过亲和层析柱进行，所述去掉标签的方法通过用蛋白酶酶解，所述分离纯化蛋白的方法是进一步用凝胶过滤和离子交换层析等方法分离纯化NDM-1蛋白；用凝胶电泳的方法确定蛋白质的纯度。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种结晶上述得到的NDM-1蛋白的方法，所述的方法包括：将NDM-1蛋白浓缩至5-10mg/ml，在4-30摄氏度下用气相扩散法筛选晶体生长条件。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了衍射性能良好的NDM-1蛋白质晶体。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了超级细菌新德里金属依赖型 β-内酰胺酶NDM-1的三维结构，该结构描述了NDM-1蛋白的二级结构组成、肽链走向、组织模式以及三维分子构造。其中针对NDM-1晶体进行X射线晶体衍射，得到NDM-1晶体的晶体衍射数据，用所述的蛋白质晶体的衍射数据进一步通过结构解析，构建内酰胺酶NDM-1的三维结构。
其中所述β-内酰胺酶NDM-1为所述β-内酰胺酶NDM-1全长蛋白序列的从约40～50位氨基酸至约260～270位氨基酸的编码基因，其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐标，或者β-内酰胺酶NDM-1的晶体三维结构中至少40％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
优选地，其中所述的母体晶体具有P3(1)空间群，晶胞参数为约：a＝40.7埃，b＝40.7埃，c＝215.3埃，α＝β＝90°，γ＝120°。
优选地，其中所述β-内酰胺酶NDM-1由β折叠1，即含Gly47-Ala55的氨基酸区段，β折叠2，即含Leu65-Ser75的氨基酸区段，β折叠3，即含Asp82-Arg85的氨基酸区段，β折叠4，即含Val86-Val89的氨基酸区段，α螺旋1，即含Thr98-Gln107的氨基酸区段，β折叠5，即含Leu115-Asp118的氨基酸区段，α螺旋2，即含Met119-Ala135的氨基酸区段，β折叠6，即含Ala138-Asn142的氨基酸区段，β折叠7，即含His159-Leu161的氨基酸区段，β折叠8，即含Leu180-Phe183的氨基酸区段，β折叠9，即含Thr195-Ile198的氨基酸区段，β折叠10，即含Ile203-Phe205的氨基酸区段，α螺旋3，即含Tyr229-Ala239的氨基酸区段，β折叠11，即含Met245-Val247的氨基酸区段，α螺旋4，即含Ala257-Lys268的氨基酸区段。其中，由所述的平行的β折叠1-7组成一个扭曲的平面，β折叠8-11组成另外一个扭曲的平面，所述的α螺旋1，2围绕在第一个平面外，α螺旋3，4围绕在另一平面周围。共同组成一个αββα的结构域。
优选地，其中所述β-内酰胺酶NDM-1中结合有两个选自锌、镁、锰、铜、钴、铁构成的组中的金属离子，其中一个金属离子位于由His120，His122，Asp124，His185构成的被称为“组氨酸位点”的活性中心，另一个金属离子位于由Asp124，Cys208，His250构成的被称为“半胱氨酸位点”的活性中心。更优选地，其中所述金属离子为锌离子。
优选地，其中所述超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1含有一个与其他金属β-内酰胺酶相似的HXHXD的序列区域，其中在新德里金属β-内酰胺酶NDM-1中，可以代表为H120X121H122X123D124。更优选的，新德里金属β-内酰胺酶NDM-1所含有的121位为Ala，123位为Gln。121Ala，123Gln对于新德里金属β-内酰胺酶NDM-1功能的发挥具有决定性的作用。
优选地，其中所述的β-内酰胺酶NDM-1的活性位点由四个活动卷曲构成，分别命名为L1，L2，L3，L4。其中，L1由Met67-Gly71构成，L2由Thr119-Met126构成，L3由Ser217-Asp225，L4由Met248-Ala252构成。以上四个卷曲分别通过其上的His120，His122，Asp124，His189，Cys208等氨基酸形成与底物、抑制剂构成的活性口袋，参与β-内酰胺酶NDM-1与底物、抑制剂、药物分子的相互作用。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种与β-内酰胺酶NDM-1中的至少二个，优选至少三个选自His120，His122，Asp124，His189，Cys208以及His250等构成的氨基酸组中的成员结合的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物。其中所述多肽或蛋白质、抗体或免疫结合物与His120，His122，Asp124，His189以及Cys208中至少二个，优选至少三个氨基酸残基的晶体三维结构坐标的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种与β-内酰胺酶NDM-1中的至少二个，优选至少三个选自Met67，Pro68，Gly69以及Phe70构成的氨基酸组中的成员结合的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物。其中所述多肽或蛋白质、抗体或免疫结合物与Met67，Pro68，Gly69以及Phe70中至少二个，优选至少三个氨基酸残基的晶体三维结构坐标的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种与β-内酰胺酶NDM-1中的至少二个，优选至少三个选自Thr119，His120，Ala121，His122，Gln123，Asp124以及Lys125构成的氨基酸组 中的成员结合的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物。其中所述多肽或蛋白质、抗体或免疫结合物与Thr119，His120，Ala121，His122，Gln123，Asp124以及Lys125中至少二个，优选至少三个氨基酸残基的晶体三维结构坐标的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种与β-内酰胺酶NDM-1中的至少二个，优选至少三个选自Ser217，leu218，Gly219，Gly220，Leu221，Gly222，Asp223以及Ala224构成的氨基酸组中的成员结合的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物。其中所述多肽或蛋白质、抗体或免疫结合物与Ser217，leu218，Gly219，Gly220，Leu221，Gly222，Asp223以及Ala224中至少二个，优选至少三个氨基酸残基的晶体三维结构坐标的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种与β-内酰胺酶NDM-1中的至少二个，优选至少三个选自Met248，Ser249，His250，Ser251以及Ala252构成的氨基酸组中的成员结合的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物。其中所述多肽或蛋白质、抗体或免疫结合物与Met248，Ser249，His250，Ser251以及Ala252中至少二个，优选至少三个氨基酸残基的晶体三维结构坐标的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了上述组合物在制备治疗由超级细菌β-内酰胺酶NDM-1引起的疾病的药物中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了上述超级细菌β-内酰胺酶NDM-1的晶体三维结构在设计和筛选用于治疗超级细菌感染引起的疾病的各种多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物中的应用，包括：
根据蛋白质三维结构坐标，通过计算机模拟来设计结合特定部位的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物分子；
根据蛋白质三维结构坐标，通过计算机模拟来寻找可能结合特定部位 的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物分子；
将根据蛋白质三维结构坐标，设计或寻找的多肽、蛋白质或无机或有机化合物、抗体或免疫结合物分子结合到含有与所述的β-内酰胺酶NDM-1序列含有至少50％相同序列的任一亚型的超级细菌中，进而分析结合情况；
根据蛋白质三维结构坐标，设计或寻找的多肽、蛋白质或无机或有机化合物、抗体或免疫结合物分子结合到含有与所述β-内酰胺酶序列含有至少50％相同序列的任一亚型的超级细菌中并结晶，从而通过晶体衍射分析三维结构的方法分析多肽及化合物分子与蛋白的结合情况；
其中与所述β-内酰胺酶NDM-1序列含有至少50％相同序列的任一亚型的超级细菌β-内酰胺酶结合的所述多肽、蛋白质或无机或有机化合物、抗体或免疫结合物分子即为候选化合物。
根据本发明的另一个方面，提供了一种多肽或者小分子，其特征在于与所述超级细菌β-内酰胺酶NDM-1上的任一氨基酸有相互作用。
根据本发明的另一个方面，提供了上述超级细菌β-内酰胺酶NDM-1的的晶体三维结构在药物筛选及药物设计方面的应用。
根据本发明的另一个方面，提供了基于超级细菌β-内酰胺酶NDM-1蛋白质三维结构筛选与蛋白质结合的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物的方法，包括：通过蛋白结晶方法获得含有超级细菌β-内酰胺酶NDM-1的晶体，或者获得含有NDM-1蛋白质晶体的三维结构坐标；其中所述三维结构包括任何与该坐标中至少含有40％氨基酸残基的主链碳骨架原子三维坐标的平均根方差小于等于1.5埃的结构。
根据本发明的另一个方面，提供了基于超级细菌β-内酰胺酶NDM-1蛋白质三维结构筛选与蛋白质结合的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物的方法，包括：使用的三维分子组合具有上述的超级细菌β-内酰胺酶NDM-1的晶体三维结构或与上述的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物结合的所述氨基酸残基的组中的至少3个具有主链碳骨架原子三维坐标的平均根方差小于等于1.5埃的结构在筛选多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物上的应用。
附图说明
图1为基于来自四种不同类型的β-内酰胺酶的序列对比。
其中，包括NDM-1、IMP-1、VIM-2、BlaB、CphA四种β-内酰胺酶。其中IMP-1来自美国国立卫生院数据库Accession：BAD26594.1，VIM-2来自美国国立卫生院数据库Accession：ACH43053.1，BlaB来自美国国立卫生院数据库AM286690.1，CphA来自美国国立卫生院数据库AAP97133.1
这一比对结果表明，NDM-1具有与其他β-内酰胺酶相类似的高度保守的氨基酸残基。图中用...表示在相对应区段的氨基酸缺失。在说明书及权利要求书中具体的氨基酸位置均是以NDM-1的序列说明的。
图2为超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的三维结构图。其中，(A)为NDM-1的结构飘带图的俯视、侧视图。该结构因二级结构特征不同而使用了不同的色彩，其中，α螺旋用红色表示，β折叠用黄色表示，loop环是用绿色，(除需特别标记的四个loop以外)。Loop环1简写为L1，用蓝色标记；Loop环2简写为L2，用紫色标记；Loop环3简写为L3，用粉色标记；Loop环4简写为L4，用灰色标记；(B)NDM-1活性位点的三维结构图，色彩对应于(A)中的二级结构色彩。左图分别表明了活性位点的两个金属离子，120位His，122位His，124位Asp，189位His，208位Cys，在整个蛋白结构中的相对位置。右图则放大了金属离子结合位置，表明了各个氨基酸与金属离子的精确作用。(C)新德里金属内酰胺酶NDM-1的表面电势分布图。色彩区间为从红(-10kbT/ec)到蓝(+10kbT/ec)，其中中间的红色区域为一空穴，蓝色为正电荷表面，红色为负电荷表面，白色为不带电荷表面相关部分氨基酸。其中用黑色标明的为NDM-1的活性口袋区域。
图3为超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的四个负责与底物相互作用的loop环的三维结构图。图A由Met67-Gly71构成的Loop1，其上的Met67，Pro68，Gly69，Phe70氨基酸单独用棍棒模型标明。图B为由Thr119-Met126构成的L2，其上的Thr119，His120，Ala121，His122，Gln123，Asp124，Lys125单独用棍棒模型标明。图C 为由Ser217-Asp225构成的L3，其上的 Ser217，leu218，Gly219，Gly220，Leu221，Gly222，Asp223，Ala224单独用棍棒模型标明。图D为由Met248-Ala252构成的L4，其上的Met248，Ser249，His250，Ser251，Ala252单独用棍棒模型标明。
图4为超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1几个活性位点突变体的β-内酰胺酶活性测定曲线及突变区域三维结构图。(A)为在相同温度、pH值、缓冲液成分、底物(imipenem)浓度条件下，不同突变体对底物的分解情况；(B)为参与突变研究的活性位点氨基酸His120，Ala121，His122，Gln123，Asp124的三维位置。
图5为利用超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的活性位点进行药物筛选的流程图。
具体实施方式
本发明人提供了一种将超级细菌新德里金属依赖型β-内酰胺酶NDM-1进行基因工程改造，以提高其在大肠杆菌中能够得到高效表达、在常温(摄氏37±5℃)下可以较长时间稳定保持内酰胺酶活性的蛋白的方法。通过X射线衍射晶体学方法解析了超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的分辨率达2.5埃的三维晶体结构。
超级细菌NDM-1蛋白的表达纯化方法：
来源于超级细菌的NDM-1基因，其编码的蛋白质序列为：
NDM-1蛋白质序列
MELPNIMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDLVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR
即：
Met Glu Leu Pro Asn Ile Met His Pro Val Ala Lys Leu Ser Thr Ala LeuAla Ala Ala Leu Met Leu Ser Gly Cys Met Pro Gly Glu Ile Arg pro Thr Ile Gly Gln Gln Met Glu Thr Gly Asp Leu Val Phe Arg Gln Leu Ala Pro Asn Val TrpGln His Thr Ser Tyr Leu Asp Met Pro Gly Phe Gly Ala Val Ala Ser Asn GlyLeu Ile Val Arg Asp Gly Gly Arg Val Leu Val Val Asp Thr Ala Trp Thr AspAsp Gln Thr Ala Gln Ile Leu Asn Trp Ile Lys Gln Glu Ile Asn Leu Pro Val AlaLeu Ala Val Val Thr His Ala His Gln Asp Lys Met Gly Gly Met Asp Ala LeuHis Ala Ala Gly Ile Ala Thr Tyr Ala Asn Ala Leu Ser Asn Gln Leu Ala Pro GlnGlu Gly Met Val Ala Ala Gln His Ser Leu Thr Phe Ala Ala Asn Gly Trp ValGlu Pro Ala Thr Ala Pro Asn Phe Gly Pro Leu Lys Val Phe Tyr Pro Gly ProGly His Thr Ser Asp Gln Ile Thr Val Gly Ile Gln Gly Thr Gln Ile Ala Phe GlyGly Cys Leu Ile Lys Asp ser Lys Ala Lys Ser Leu Gly Asn Leu Glu Asp AlaAsp Thr Glu His Tyr Ala Ala Ser Ala Arg Ala Phe Gly Ala Ala phe Pro lys AlaSer Met Ile Val Met Ser His Ser Ala Pro Asp Ser Arg Ala Ala Ile Thr His ThrAla Arg Met Ala Asp Lys Leu Arg
通过分子克隆技术将NDM-1基因进行克隆，克隆到pGEX-6P-1载体(GE)上，以便进一步表达蛋白。将改造后的NDM-1基因克隆到pGEX-6P-1载体(GE)上表达氨基末端融合GST的融合蛋白(GST-NDM-1)，将克隆的质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，在BL21(DE3)中使用浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导大肠杆菌表达蛋白，具体参见实施例1
实施例
实施例1
改造超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1，用于大肠杆菌表达的方法
本发明人初期尝试将NDM-1蛋白进行全长表达，历经在不同表达载体pGEX，pET等，以及不同表达菌株，如BL21(DE3)，BL21plys，C41等上的尝试，均不能得到可溶的蛋白。暗示着需要对NDM-1的基因进行基因水平上的改造。经过设计PCR扩增引物，构建了从NDM-1蛋白的氮基端第一位氨基酸开始，逐个删除氨基酸的50余个克隆，得到了一个能够大量表达， 并且能够长时间((摄氏37±5℃保持活性两周以上)保持内酰胺酶活性的构建，即为NDMGly47-Arg27。
NDM-1在大肠杆菌中的表达纯化
通过分子克隆技术将NDM-1蛋白(第47至270氨基酸)克隆到pGEX-6p-1载体(GE)上，其克隆位点是BamHI及XhoI。将克隆的含有NDM-1基因的表达质粒转化到大肠杆菌的BL21(DE3)中，进行蛋白的表达，从而使细菌可以表达蛋白N端(氨基端)连接有GST融合蛋白并且含有可以被Proscission蛋白酶切割的酶切位点，从而可以进一步将GST蛋白标签与目的蛋白分离。将克隆构建的融合蛋白表达质粒转化入BL21(DE3)中后，先在37度使用5mL的LB培养基过夜培养，大约12小时后，转接到800mL的LB培养基中扩大培养，再在37度下在摇瓶中培养至OD为0.4-0.6左右，大约为四小时，随后降低培养温度至25度，然后加入0.1mM的IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)进行诱导表达，大约16-20小时后通过离心收集细菌，用于纯化。将离心收集的表达菌用含有约50mMMes(pH6.5)，150mMNaCl，5％甘油的缓冲液中悬浮，使用低温超高压细胞破碎仪(广州聚能生物科技有限公司)裂解细胞，通过离心分离出不溶性沉淀，将高速离心(约18,000rmp)后获得的上清通过Glutathione-sepharose亲和柱(GE)来初步分离纯化GST-NDM-1蛋白。含有GST标签的蛋白可以结合到Glutathione-Sepharose亲和柱上以后，使用如上所述的缓冲液将杂蛋白洗净，使用ProScission蛋白酶酶解在亲和柱上的混合的GST融合蛋白，此过程大约20小时，然后将酶切下来的蛋白使用ResourceQ离子交换层析(GE)和凝胶排阻层析(GE)进一步纯化出NDM-1蛋白，纯度一般可以达到99％以上。通过以上步骤纯化的蛋白使用浓缩管浓缩至5mg/mL用于结晶实验。
实施例2
超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的结晶
将如上方法表达纯化好的新德里金属β-内酰胺酶NDM-1浓缩至浓度约为5-20mg/mL，用气相悬滴法使用结晶试剂(来自Hampton Research等公司的Screen Kit I/II、Index等试剂盒)筛选晶体生长条件。经过初步筛 选，本发明人在多种不同的结晶试剂条件下获得了初始晶体。通过进一步优化，其中，在使用20mM CdCl2，20mM NaCl，5％PEG mono ether 550，and25％(v/w)PEG 3350的条件下获得了外观良好的晶体。在pH 6.5的缓冲液中得到了较大的晶体，分辨率约为2.5埃左右的母体晶体，并进而收集相应的X射线衍射数据。
实施例3
超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构
使用Rigaku Micromax-HF007X射线衍射仪在波长为1.5418埃的X光下收集到一套最高分辨率达2.2埃的数据，经过数据处理发现衍射数据在长轴方向上的数据质量很差。然后使用位于上海同步光源BL17U1线站的同步辐射仪，在波长为1.0000埃的X光，探测器为ADSC Q315收集到一套衍射数据，与在日本高能同步辐射加速器机构的NW3E线站，波长1.0000埃，探测器为ADSC Q270下收集到一套衍射数据，将上海、日本两套数据进行整合(merge)，获得了一套完整度80％以上的数据。利用HK2000(Otwinowski 1997)处理数据，发现晶体具有P3(1)空间群，晶胞参数为约：a＝40.7埃，b＝40.7埃，c＝215.3埃，α＝β＝90°，γ＝120°。通过马修斯常数的计算发现其一个不对称蛋白中应该含有2个蛋白质分子，溶剂含量为41％。利用CCP4i软件对处理得到的sca文件进行处理，使用PHASER程序下的分子置换法进行相位的寻找，具体而言，本发明人使用了VIM-4的结构作为模板，(国际蛋白质结构数据库编号2WRS；与NDM-1有32％同源性)，从计算得到的电子密度图上能够清楚的观察到多个二级结构，搭出了初步的模型之后，交替使用CNS、phenix等软件进行数据的修正，最终获得结构的R因子为23.6％，自由R因子为26.7％。
实施例4
超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的三维结构
我们使用实施例3中的方法、软件，完成了对超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的结构解析工作，使用软件COOT、pymol，进一步分析NDM-1蛋白的二级结构组成、肽链走向、组织模式以及三维分子构造。我们发现，NDM-1蛋白呈现一种典型的αββα的三明治结构，可以明显的划 分成两个区域，一侧区域由α1、α2、β1-β7组成，另一侧区域由α3、α4，β8-β11组成。本领域的普通技术人员可知，与其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐标，或者β-内酰胺酶NDM-1的晶体三维结构中至少40％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃的原子坐标，均可被认为与NDM-1蛋白具有雷同结构。
具体而言，β折叠1，即含Gly47-Ala55的氨基酸区段，β折叠2，即含Leu65-Ser75的氨基酸区段，β折叠3，即含Asp82-Arg85的氨基酸区段，β折叠4，即含Val86-Val89的氨基酸区段，α螺旋1，即含Thr98-Gln107的氨基酸区段，β折叠5，即含Leu115-Asp118的氨基酸区段，α螺旋2，即含Met119-Ala135的氨基酸区段，β折叠6，即含Ala138-Asn142的氨基酸区段，β折叠7，即含His159-Leu161的氨基酸区段，β折叠8，即含Leu180-Phe183的氨基酸区段，β折叠9，即含Thr195-Ile198的氨基酸区段，β折叠10，即含Ile203-Phe205的氨基酸区段，α螺旋3，即含Tyr229-Ala239的氨基酸区段，β折叠11，即含Met245-Val247的氨基酸区段，α螺旋4，即含Ala257-Lys268的氨基酸区段。其中，由所述的平行的β折叠1-7组成一个扭曲的平面，β折叠8-11组成另外一个扭曲的平面，所述的α螺旋1，2围绕在第一个平面外，α螺旋3，4围绕在另一平面周围。共同组成一个αββα的结构域。
实施例5
超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的金属离子
利用软件COOT，pymol对实施例3得到的NDM-1蛋白电子密度图进行分析，在由His120，His122，Asp124，His185的位点、以及由Asp124，Cys208，His250的另一个位点，都分别发现含有一团未经解释的电子密度。使用珀金埃尔默原子吸收光谱仪(PerkinElm AAnalyst 800)对NDM-1蛋白质进行原子吸收光谱的分析，发现NDM-1蛋白含有金属离子锌，本领域的一般技术人员经分析可知，这表明这两团电子密度应该分别是两个锌离子。我们对His120，His122，Asp124，His185的位点命名为“组氨酸位点”，对另一个由Asp124，Cys208，His250的位点命名为“半胱氨酸位点”。
实施例6
超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的活性位点
利用软件COOT，pymol对实施例3得到的NDM-1蛋白电子密度图进行分析，发现所述的β-内酰胺酶NDM-1的活性位点由四个活动卷曲构成，分别命名为L1，L2，L3，L4，其中，L 1由Met67-Gly71构成，L2由Thr119-Met126构成，L3由Ser217-Asp225，L4由Met248-Ala252构成。这四个卷曲分别通过其上的His120，His122，Asp124，His189，Cys208等氨基酸形成与底物、抑制剂构成的活性口袋，参与β-内酰胺酶NDM-1与底物、抑制剂、药物分子的相互作用。为了研究NDM-1活性中心的氨基酸重要性，我们利用实施例8所述的方法，对NDM-1蛋白的不同突变体进行了酶活性的测试(参见附图4A)，我们发现A121F，Q123D，以及A121F+Q123D双重突变体与NDM-1野生型蛋白相比，活性分别降低了98.4％，96.4％和99.7％。因此经分析可知，121Ala，123Gln对于新德里金属β-内酰胺酶NDM-1功能的发挥具有决定性的作用。
实施例7
利用超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的活性位点进行药物筛选。
我们利用实施例7所述的四个活动卷曲L1，L2，L3，L4，即由Met67-Gly71构成的L1，由Thr119-Met126构成的L2，由Ser217-Asp225，构成的L3，以及由Met248-Ala252构成的L4。进行能与NDM-1结合的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物的分析与筛选。
所用流程如图5所示。
首先，我们对由L1(Met67-Gly71)，L2(Thr119-Met126)，L3(Ser217-Asp225)，以及L4(Met248-Ala252)构成的活性口袋进行微秒级的分子动力学，并通过聚类分析找出有代表性的构象用于虚拟筛选。然后，对已有约7000万小分子的数据库先进行相关的成药性初筛，再同时对多个动力学构象进行高通量虚拟筛选。并应用已有约40万小分子碎片数据库对代表性构象进行虚拟筛选，并运用碎片重组、拼接找出约20个小分子进行酶活性的测试。所用分子筛选软件都来自Schrodiger LLC.分子动力学用AMBER11.0。
由计算机虚拟计算的结果证明，任意一种与β-内酰胺酶NDM-1中的至少二个，优选至少三个选自卷曲L1(Met67-Gly71)，L2(Thr119-Met126)，L3(Ser217-Asp225)，以及L4(Met248-Ala252)构成的氨基酸组中的成员结合的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物，其相互作用的氨基酸中，至少二个，优选至少三个氨基酸残基的晶体三维结构坐标的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
实施例8
筛选抑制超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1活性的各种多肽、蛋白质或无机或有机化合物的方法
新德里金属β-内酰胺酶NDM-1作为一种内酰胺酶，可以分解内酰胺类抗生素的内酰胺键，从而使抗生素失效。同时由于内酰胺键构成的四元环具有紫外吸收能力，被破坏后则会导致紫外吸收的减少，因此可以通过检测紫外吸收的变化来直接监测金属β-内酰胺酶NDM-1的活性。
NDM-1的酶活体系是通过分光光度法来测试的。以亚胺培南(来自sigma)作为反应底物，亚胺培南在300nm波长处有吸收峰，而NDM-1具有分解亚安培南的作用，因此可以通过检测亚胺培南在300nm波长处吸收值的降低来检测NDM-1蛋白的活性。
具体操作为将50mM HEPES(PH7.3)，10μg/mlBSA，500μM亚胺培南和3nM的NDM-1蛋白混合，反应终体积为1mL，在37度条件下孵育30 秒钟后，加入不同组成成分的肽、蛋白质或无机或有机化合物，立即使用GENE Quant 1300(GE)检测A300的变化。通过分析不同肽、蛋白质或无机或有机化合物对NDM-1活性的抑制情况，对其药效进行筛选。
实施例9
利用超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的晶体三维结构设计和筛选用于治疗超级细菌感染引起的疾病的各种多肽、蛋白质或无机或有机化合物的方法
具体的步骤如下：根据蛋白质三维结构坐标，通过计算机模拟来设计结合特定部位的多肽及化合物分子；根据蛋白质三维结构坐标，通过计算机模拟来寻找可能结合特定部位的多肽及化合物分子；根据蛋白质三维结构坐标，设计或寻找的多肽及化合物分子结合到含有与所述的新德里金属β-内酰胺酶NDM-1序列含有至少50％相同序列的任一亚型的流感病毒聚合酶蛋白中，进而分析结合情况的方法；根据蛋白质三维结构坐标，设计或寻找的多肽及化合物分子结合到含有与所述的新德里金属β-内酰胺酶NDM-1序列含有至少50％相同序列的新德里金属β-内酰胺酶NDM-1蛋白中并结晶，从而通过晶体衍射分析三维结构的方法分析多肽及化合物分子与蛋白的结合情况。
在一个优选的实施例中，新德里金属β-内酰胺酶NDM-1在设计和筛选用于治疗由超级细菌感染引起的疾病的多肽、蛋白质、化合物或药物中的应用。
在一个优选的实施例中，用于治疗由超级细菌感染引起的疾病的多肽，包括与如上所述的新德里金属β-内酰胺酶NDM-1、至少一种所述的α螺旋或β片层、至少一个氨基酸位点相互作用的多肽。
在一个优选的实施例中，用于治疗由超级细菌感染引起的疾病的蛋白质，包括与如上所述的新德里金属β-内酰胺酶NDM-1、至少一种所述的α螺旋或β片层、至少一个氨基酸位点相互作用的蛋白质。
在一个优选的实施例中，用于治疗由超级细菌感染引起的疾病的化合物，包括与如上所述的新德里金属β-内酰胺酶NDM-1、至少一种所述的α螺旋或β片层、至少一个氨基酸位点相互作用的化合物。
在一个优选的实施例中，药物组合物，包括如上所述的多肽、蛋白质或化合物。
本发明的药物组合物通常包括一种载体或赋形剂，抗体和/或免疫结合物溶解于一种药学可接受的载体，水性载体为优选。许多种水性载体可被应用，如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常无不良物质。这些组分可通过常规的、众所周知的消毒技术进行消毒。这些组分可包括药学可接受的近似生理条件所需要的辅助物质，比如调节pH的缓冲剂、毒性调节剂等等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些组分中融合蛋白的浓度变化很大，主要根据与所选的特定给药方式和病人需要相一致的液体量、粘度、体重等等进行选择。
实验结果
表1单分子的超级细菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1原子坐标群如下：
注释 坐标创建日期：2011年3月08日，编辑日期：2011年3月21日。
注释 高分辨率范围(埃)：2.5
注释 低分辨率范围(埃)：50
Claims (21)
1.一种β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构，其中，所述β-内酰胺酶NDM-1为所述β-内酰胺酶NDM-1全长蛋白序列的从约40～50位氨基酸至约260～270位氨基酸的编码基因，其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐标，或者β-内酰胺酶NDM-1的晶体三维结构中至少40％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
2.根据权利要求1所述的β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构，其中，所述β-内酰胺酶NDM-1为所述β-内酰胺酶NDM-1全长蛋白序列的从约47位氨基酸至约270位氨基酸的编码基因。
3.根据权利要求1所述的β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构，其中所述的母体晶体具有P3(1)空间群，晶胞参数为约：a＝40.7埃，b＝40.7埃，c＝215.3埃，α＝β＝90°，γ＝120°。
4.根据权利要求1或2所述的β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构，其中所述β-内酰胺酶NDM-1由β折叠1，即含Gly47-Ala55的氨基酸区段，β折叠2，即含Leu65-Ser75的氨基酸区段，β折叠3，即含Asp82-Arg85的氨基酸区段，β折叠4，即含Val86-Val89的氨基酸区段，α螺旋1，即含Thr98-Gln107的氨基酸区段，β折叠5，即含Leu115-Asp118的氨基酸区段，α螺旋2，即含Met119-Ala135的氨基酸区段，β折叠6，即含Ala138-Asn142的氨基酸区段，β折叠7，即含His159-Leu161的氨基酸区段，β折叠8，即含Leu180-Phe183的氨基酸区段，β折叠9，即含Thr195-Ile198的氨基酸区段，β折叠10，即含Ile203-Phe205的氨基酸区段，α螺旋3，即含Tyr229-Ala239的氨基酸区段，β折叠11，即含Met245-Val247的氨基酸区段，α螺旋4，即含Ala257-Lys268的氨基酸区段。其中，由所述的平行的β折叠1-7组成一个扭曲的平面，β折叠8-11组成另外一个扭曲的平面，所述的α螺旋1，2围绕在第一个平面外，α螺旋3，4围绕在另一平面周围。共同组成一个αββα的结构域。
5.根据权利要求1或2所述的β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构，其中所述β-内酰胺酶NDM-1中结合有两个选自锌、镁、锰、铜、钴、铁构成的组中的金属离子，其中一个金属离子位于由His120，His122，Asp124，His185构成的称为“组氨酸位点”的活性中心，另一个金属离子位于由Asp124，Cys208，His250构成的称为“半胱氨酸位点”的活性中心。
6.根据权利要求4所述的β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构，其中所述金属离子为锌离子。
7.根据权利要求4或5所述的β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构，其中所述金属β-内酰胺酶NDM-1含有一个与其他金属β-内酰胺酶相似的HXHXD的序列区域，其中在金属β-内酰胺酶NDM-1中，可以代表为H120X121H122X123D124。更优选的，β-内酰胺酶NDM-1所含有的121位为Ala，123位为Gln。
8.根据权利要求1-6所述的β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构，其中所述的β-内酰胺酶NDM-1的活性位点由四个活动卷曲构成，分别命名为L1，L2，L3，L4，其中，L1由Met67-Gly71构成，L2由Thr119-Met126构成，L3由Ser217-Asp225，L4由Met248-Ala252构成。
9.根据权利要求7所述的β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构，所述四个卷曲分别通过其上的His120，His122，Asp124，His189，Cys208等氨基酸形成与底物、抑制剂构成的活性口袋，参与β-内酰胺酶NDM-1与底物、抑制剂、药物分子的相互作用。
10.一种与β-内酰胺酶NDM-1中的至少二个，优选至少三个选自Met67，Pro68，Gly69以及Phe70构成的氨基酸组中的成员结合的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物，其中所述多肽或蛋白质、抗体或免疫结合物与Met67，Pro68，Gly69以及Phe70中至少二个，优选至少三个氨基酸残基的晶体三维结构坐标的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
11.一种与β-内酰胺酶NDM-1中的至少二个，优选至少三个选自Thr119，His120，Ala121，His122，Gln123，Asp124以及Lys125构成的氨基酸组中的成员结合的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物，其中所述多肽或蛋白质、抗体或免疫结合物与Thr119，His120，Ala121，His122，Gln123，Asp124以及Lys125中至少二个，优选至少三个氨基酸残基的晶体三维结构坐标的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
12.一种与β-内酰胺酶NDM-1中的至少二个，优选至少三个选自Ser217，leu218，Gly219，Gly220，Leu221，Gly222，Asp223以及Ala224构成的氨基酸组中的成员结合的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物，其中所述多肽或蛋白质、抗体或免疫结合物与Ser217，leu218，Gly219，Gly220，Leu221，Gly222，Asp223以及Ala224中至少二个，优选至少三个氨基酸残基的晶体三维结构坐标的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
13.一种与β-内酰胺酶NDM-1中的至少二个，优选至少三个选自Met248，Ser249，His250，Ser251以及Ala252构成的氨基酸组中的成员结合的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物，其中所述多肽或蛋白质、抗体或免疫结合物与Met248，Ser249，His250，Ser251以及Ala252中至少二个，优选至少三个氨基酸残基的晶体三维结构坐标的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.5埃。
14.一种包括权利要求10-13中任一项所述的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物的组合物，可选的包括载体或赋形剂。
15.根据权利要求14所述的组合物在制备治疗由β-内酰胺酶NDM-1引起的疾病的药物中的应用。
16.根据权利要求1-9中任一项所述的超级细菌β-内酰胺酶NDM-1的晶体三维结构在设计和筛选用于治疗超级细菌感染引起的疾病的各种多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物中的应用，包括：
根据蛋白质三维结构坐标，通过计算机模拟来设计结合特定部位的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物分子；
根据蛋白质三维结构坐标，通过计算机模拟来寻找可能结合特定部位的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物分子；
将根据蛋白质三维结构坐标，设计或寻找的多肽、蛋白质或无机或有机化合物、抗体或免疫结合物分子结合到含有与所述的β-内酰胺酶NDM-1序列含有至少50％相同序列的任一亚型的超级细菌中，进而分析结合情况；
根据蛋白质三维结构坐标，设计或寻找的多肽、蛋白质或无机或有机化合物、抗体或免疫结合物分子结合到含有与所述β-内酰胺酶序列含有至少50％相同序列的任一亚型的超级细菌中并结晶，从而通过晶体衍射分析三维结构的方法分析多肽及化合物分子与蛋白的结合情况；
其中与所述β-内酰胺酶NDM-1序列含有至少50％相同序列的任一亚型的超级细菌β-内酰胺酶结合的所述多肽、蛋白质或无机或有机化合物、抗体或免疫结合物分子即为候选化合物。
17.根据权利要求1-9所述的β-内酰胺酶NDM-1的晶体三维结构在药物筛选及药物设计方面的应用。
18.一种纯化β-内酰胺酶NDM-1的方法，其中，将权利要求1所述的NDM-1基因连接于带有标签的表达型质粒载体中，转化进入大肠杆菌细胞中进行表达、纯化。
19.根据权利要求19所述的方法，其中所述的标签选自GST、Flag-tag、Myc-tag、MBP-tag、His-tag、特异性抗体，所述载体含有选择性标记基因
20.一种结晶前述权利要求中任一项所述的β-内酰胺酶NDM-1蛋白的方法，所述的方法包括：将NDM-1蛋白浓缩至5-10mg/ml，在4-30摄氏度下用气相扩散法筛选晶体生长条件。
21.一种衍射性能良好的根据前述权利要求中任一项所述的NDM-1蛋白质晶体
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121031 |