ES2922009T3

ES2922009T3 - Variantes de beta-lactamasa

Info

Publication number: ES2922009T3
Application number: ES17706743T
Authority: ES
Inventors: Gunzburg Jean De; Jean-Denis Docquier
Original assignee: Da Volterra SAS; Bioaster
Current assignee: Da Volterra SAS; Bioaster
Priority date: 2016-02-23
Filing date: 2017-02-22
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2037-02-22
Also published as: PL3420078T3; US10982205B2; EP3420078B1; WO2017144496A1; CA3013166A1; CN108699545A; US20190062719A1; JP6845258B2; PT3420078T; BR112018016889A2; EP3420078A1; JP6845258B6; JP2019511926A; KR20180110032A

Abstract

La presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad beta-lactamasa y secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido. El polipéptido aislado de la invención es una variante de VIM-2 con propiedades mejoradas tales como estabilidad de proteasa mejorada, estabilidad en medio intestinal, actividad mejorada contra uno o más antibióticos, actividad específica mejorada y/o producción mejorada en una célula huésped. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de beta-lactamasa

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de beta-lactamasa y secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido. El polipéptido aislado de la invención es una metalo-beta-lactamasa de la subclase B1 que pertenece al subgrupo tipo VIM con propiedades mejoradas tales como estabilidad de proteasa mejorada, estabilidad intrínseca mejorada tal como estabilidad térmica, actividad mejorada contra uno o más compuestos de beta-lactama tales como antibióticos betalactámicos, y/o producción mejorada en una célula hospedante.

Antecedentes de la invención

Muchos productos antibacterianos, en particular antibióticos, pueden usarse en el tratamiento de infecciones bacterianas. Sin embargo, los antibióticos no solo atacan a los patógenos en el lugar de la infección, sino que también afectan a la flora bacteriana normal que se puede encontrar en sujetos sanos y, en particular, en el intestino. La alteración por antibióticos de la flora comensal del colon (también llamada microbiota del colon), que está compuesta por más de diez billones de bacterias de más de 500 especies, puede provocar efectos secundarios adversos tales como la selección de bacterias resistentes y la posible colonización por bacterias resistentes, alteración de los procesos digestivos normales, colonización e infección del intestino por patógenos intestinales oportunistas tales como Clostridium difficile, diarrea asociada a antibióticos u otras enfermedades relacionadas con la disbiosis intestinal. Estos efectos secundarios pueden reducirse mediante la administración de enzimas capaces de degradar los antibióticos residuales en el intestino, más particularmente en el íleon terminal y el colon. Este enfoque se describe en particular en los documentos WO2004/016248 o US20050249716.

Sin embargo, las enzimas son macromoléculas frágiles sensibles a una serie de factores físico-químicos, tales como la presencia de proteasas que conducen a su degradación, la temperatura, fuerza iónica, disponibilidad de cofactores metálicos o presencia de quelantes. Además, las enzimas con actividad específica mejorada serían ventajosas con el fin de aumentar su eficacia y/o reducir la cantidad necesaria para usar para obtener una degradación eficaz de los antibióticos residuales en un paciente que lo necesite. Finalmente, sería ventajoso obtener rendimientos de producción mejorados para tales enzimas degradadoras de antibióticos.

El documento US2015/0031063 se refiere a un método para detectar al menos un mecanismo de resistencia a los carbapenémicos mediante espectrometría de masas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona variantes novedosas de la metalo-beta-lactamasa VIM-2.

Específicamente, la presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Específicamente, la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene actividad de beta-lactamasa, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 (que es la secuencia de VIM-2 de tipo natural sin su péptido señal natural), comprendiendo dicho polipéptido sustituciones en las posiciones 22, 34 y 130, en donde las posiciones corresponden a las posiciones en la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1, y en donde las sustituciones consisten en Q22H, Q34R y E130D. El polipéptido de la invención tiene una o más de las siguientes propiedades en comparación con la enzima VIM-2 de tipo natural: (i) resistencia a proteasas mejorada, en particular resistencia a la proteasa digestiva, (ii) estabilidad mejorada, en particular estabilidad térmica y/ o estabilidad en medio intestinal, (iii) espectro de acción mejorado sobre compuestos betalactámicos (es decir, la variante es capaz de hidrolizar un mayor número de compuestos betalactámicos, en particular antibióticos betalactámicos), (iv) actividad enzimática mejorada en uno o más compuestos betalactámicos (p. ej., en uno o más antibióticos betalactámicos), traduciéndose en particular en un tiempo de inactivación del antibiótico reducido, y (v) rendimiento de producción mejorado.

Las bacterias productoras de la variante VIM-2 según la invención pueden presentar una propiedad mejorada con respecto a la concentración mínima inhibitoria (MIC) para al menos un antibiótico betalactámico tal como, pero no exclusivamente, ampicilina, piperacilina, ticarcilina, temocilina, cefalotina, cefoxitina, cefuroxima, cefotaxima, ceftazidima, cefepima, ceftriaxona, ceftarolina, cefotetán, imipenem, meropenem y ertapenem, en comparación con una MIC de la misma bacteria que produce VIM-2 de tipo natural de SEQ ID NO: 1, que puede determinarse usando métodos de ensayo de susceptibilidad in vitro convencionales, tales como el método de microdilución en caldo (Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio, documento M07-A10: Métodos para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de dilución para bacterias que crecen aeróbicamente; Estándar aprobado - Décima edición). En el contexto de la presente invención, la expresión "propiedad mejorada con respecto a una concentración inhibitoria mínima (MIC)" indica una MIC que es mayor para las bacterias que producen la variante de VIM-2, por ejemplo, una MIC aumentada 2 veces o más, en comparación con la misma bacteria que produce la VIM-2 de tipo natural.

La variante de VIM-2 según la invención también puede presentar una propiedad mejorada con respecto a la resistencia a proteasas, en particular a las proteasas digestivas, en comparación con la VIM-2 de tipo natural de SEQ ID NO: 1, que puede determinarse mediante el seguimiento de la actividad enzimática (mediante ensayos enzimáticos in vitro como se describe a continuación) y/o integridad (p. ej., mediante análisis de espectrometría de masas) después de incubación con proteasas purificadas tales como tripsina, quimotripsina o similares o con medio intestinal de lechones, cerdos, otros mamíferos (tal como medio intestinal humano ) u otros animales.

La variante de VIM-2 según la invención también puede presentar una propiedad mejorada con respecto a la estabilidad (en particular la estabilidad térmica), en comparación con la VIM-2 de tipo natural de SEQ ID NO: 1, que puede determinarse mediante el seguimiento de la actividad residual de la enzima después de incubación de la muestra de proteína (incluidos los extractos brutos) a temperaturas en el intervalo de 45 a 75°C durante hasta dos horas y, en particular, a 65°C durante 45 min. Los medios representativos para el seguimiento de la actividad residual de la enzima incluyen, por ejemplo, los que se describen a continuación y en la sección de ejemplos.

La variante de VIM-2 según la invención también puede presentar una propiedad mejorada con respecto a la estabilidad en medio intestinal, particularmente medio yeyunal, ileal y cecal, en comparación con la VIM-2 de tipo natural de SEQ ID NO: 1, que se puede determinar mediante el seguimiento de la actividad residual de la enzima después de la incubación de la muestra de proteína (incluida la enzima purificada) durante diferentes duraciones en medio intestinal, por ejemplo, medio ileal. Los medios representativos para el seguimiento de la actividad residual de la enzima incluyen, por ejemplo, los que se describen a continuación y en la sección de ejemplos.

La variante de VIM-2 según la invención también puede presentar una propiedad mejorada con respecto a su actividad catalítica en uno o más sustratos betalactámicos (tales como antibiótico(s) betalactámico(s) específico(s)), en comparación con la actividad mostrada por la VIM-2 de tipo natural de SEQ ID NO: 1, que puede determinarse por ensayos enzimáticos in vitro, en los que se sigue por espectrofotometría la variación dependiente del tiempo de una concentración de sustrato betalactámico (tasa de hidrólisis) en presencia de muestras de proteínas que contienen la VIM-2 de tipo natural o la variante de VIM-2.

La variante de VIM-2 según la invención también puede presentar una propiedad mejorada con respecto a un mayor nivel de producción de la misma en bacterias recombinantes u otros hospedantes adecuados, en comparación con el nivel de producción de VIM-2 de tipo natural de SEQ ID NO: 1, que se puede determinar por ensayos enzimáticos in vitro, por ejemplo, ensayos llevados a cabo como se ha descrito anteriormente con extractos obtenidos de cultivos bacterianos que producen la VIM-2 de tipo natural o sus variantes. En una realización particular, el extracto se obtiene bien como un extracto bruto tras la lisis celular o bacteriana o bien en un medio de cultivo celular (procariota o eucariota) (en el caso de una enzima secretada). Todos estos métodos también pueden implementarse en una enzima purificada.

En una realización particular, el polipéptido de la invención se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 22.

VIM-2 Q34R E130D Q22H (SEQ ID NO: 7)

VD S S GE YPT Y SEIP Y GE VRL YHIADGVW SHIATRSFD GA YYP SN GLIVRDGDELLLID T AW GAKNT AALL AEIEKQIGLP VTRA V S THFHDDRV GGVD VLRA AGV AT Y ASP S TRR L AEVEGNEIPTHSLDGL S S SGD AVRF GP VELF YPGAAHSTDNL VVYVP S AS YL Y GGC AIYELSRTSAGNVADADLAEWPTSIERIQQHYPEAQFVIPGHGLPGGLDLLKHTTNVV KAHTNRSVVE VIM-2 Q34R E130D Q22H DCT236 (SEQ ID NO: 12)

VD S S GE YPT Y SEIP Y GE VRL YHI ADGVW SHI ATRSFD GA YYP SN GLI VRDGDELLLID T AW GAKNT AALL AEIEKQIGLP VTRA V S THFHDDRV GGVD VLRA AGV AT Y ASP S TRR LAEVEGNEIPTHSLDGL S S SGD AVRF GP VELF YPGAAHSTDNL VVYVP S AS VL Y GGC AIYELSRTSAGNVADADLAEWPTSIERIQQHYPEAQFVIPGHGLPGGLDLLKHTTNVV KAHTN

En una realización particular, el polipéptido de la invención es una variante funcional de la betalactamasa VIM-2 de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 12, que comprende además una sustitución V1M. Por consiguiente, la invención también se refiere a un polipéptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 22.

VIM-2 V1M Q34R E130D Q22H (SEQ ID NO: 17)

MDSSGEYPTVSEIPVGEVRLYHIADGVWSHIATRSFDGAVYPSNGLIVRDGDELLLID

T AW GAKNT AALL AEIEKQIGLP VTRA V S THFHDDR V GGYD YLRA AGV AT Y ASP S TR

RLAEVEGNEIPTHSLDGL S S SGD AYRF GP VELF YPGAAHSTDNL VVYVP S AS VL Y GG

C AIYEL SRT S AGNY AD ADL AEWPT SIERIQQHYPE AQF YIPGHGLPGGLDLLKHTTNY

VKAHTNRSVVE

VIM-2 V1M Q34R E130D Q22H DCT236 (SEQ ID NO: 22)

MDSSGEYPTYSEIPYGEVRLYHIADGYWSHIATRSFDGAVYPSNGLIYRDGDELLLID

T AW GAKNT AALL AEIEKQIGLP VTRA V S THFHDDR V GGYD YLRA AGV AT Y ASP S TR

RLAEVEGNEIPTHSLDGL S S SGD AVRF GP VELF YPGAAHSTDNL VVYVP S AS VL Y GG

C AIYEL SRT SAGNVAD ADL AEWPT SIERIQQHYPE AQF VIPGHGLPGGLDLLKHTTNV

VKAHTN

La presente invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante del polipéptido VIM-2 de la invención, construcciones de ácido nucleico que comprenden la misma, virus recombinantes o células hospedantes (procariotas y eucariotas) que comprenden la secuencia de ácido nucleico o la construcción de ácido nucleico según la invención y métodos para su producción.

La invención se refiere además a una composición que comprende la variante de polipéptido según la invención. En una realización particular, la composición es administrable por vía oral y es capaz de liberar el polipéptido en una parte deseada del intestino de un sujeto que lo necesite. Preferiblemente, la parte deseada es el yeyuno, íleon, ciego o colon.

En una realización adicional, la invención se refiere a una célula hospedante recombinante, procariota o eucariota, u organismo que produce el polipéptido que puede administrarse a un sujeto y liberar el polipéptido en la parte deseada del intestino de dicho sujeto que lo necesite. Preferiblemente, el polipéptido se libera en el íleon, ciego o colon, preferiblemente en el ciego o colon.

Un aspecto adicional de la invención es un kit de partes para la administración separada, secuencial o simultánea del polipéptido según la invención y un compuesto betalactámico, por ejemplo antibiótico betalactámico, que es sensible a dicho polipéptido del kit de partes. En una realización particular, tanto el polipéptido como el antibiótico son administrables por vía oral. En otra realización, el polipéptido y el antibiótico se administran por diferentes vías, por ejemplo, el polipéptido se puede administrar por vía oral y el antibiótico se puede administrar por vía parenteral, tal como mediante inyección intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea o intraperitoneal. En una realización particular, el polipéptido se administra antes o después, en particular antes, del antibiótico.

La presente invención también se refiere a métodos de terapia que implementan el polipéptido de la invención. Así, la invención proporciona el polipéptido de la invención, que es una variante de VIM-2, para usar como un medicamento. Más específicamente proporciona el uso de dicho polipéptido o una composición o un kit de partes que contiene el mismo, en un método para inactivar un antibiótico betalactámico en un sujeto que lo necesite. La invención también se refiere al uso del polipéptido, la composición o el kit de partes de la invención, en un método para el tratamiento de una infección bacteriana que es causada por bacterias que son sensibles a un antibiótico betalactámico. Más particularmente, la infección bacteriana se trata utilizando una combinación del polipéptido de la invención y de un antibiótico betalactámico que es sensible a dicho polipéptido, de modo que la infección se trata gracias al antibiótico betalactámico mientras que cualquier antibiótico residual no deseado es eliminado del intestino, y en una realización específica específicamente del yeyuno, íleon, ciego y colon, gracias al polipéptido de la invención. En esta realización particular, el polipéptido se formula preferiblemente en una composición que es capaz de liberar el polipéptido en una parte deseada del intestino de un sujeto que necesita dicho tratamiento de infección bacteriana, en donde la parte deseada del intestino es preferiblemente el yeyuno, el íleon, el ciego o el colon, lo más preferiblemente el íleon, el ciego o el colon. El polipéptido puede ser producido por células hospedante recombinantes (procariotas o eucariotas) u organismos que se administran por vía oral al sujeto que necesita dicho tratamiento de infección bacteriana, y liberan el polipéptido en la parte deseada del intestino, en particular en el íleon, ciego o colón.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona variantes novedosas de la metalo-beta-lactamasa VIM-2. Por lo tanto, la secuencia del polipéptido de la invención no es idéntica a la secuencia de VIM-2 que se muestra en la SEQ ID NO: 1 en cuanto que difiere de VIM-2 en al menos dos modificaciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 1.

La secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de VIM-2 de tipo natural que ha sufrido la escisión del péptido señal N-terminal (es decir, la secuencia de VIM-2 de tipo natural sin su péptido señal). SEQ ID NO: 1:

VDSSGEYPTYSEIPYGEVRLYQIADGYWSHIATQSFDGAYYPSNGLIVRDGDELLLIDT AW GAKNT AALL AEIEKQIGLP VTRA V S THFHDDRV GGVD VLRA AGV AT Y ASP S TRR LAEVEGNEIPTHSLEGLS S SGD AVRF GP VELF YPGAAHSTDNL VVYVPS AS VLY GGC A IYELSRTSAGNVADADLAEWPTSIERIQQHYPEAQFVIPGHGLPGGLDLLKHTTNVVK AHTNRSVYE

Esta secuencia, por lo tanto, comienza con un resto de valina en su extremo N-terminal. Sin embargo, en realizaciones particulares de la invención, este primer resto de valina puede ser reemplazado por un resto de metionina. Por ejemplo, en los casos en que la proteína VIM-2 o su variante se producen sin un péptido señal N-terminal a partir de un casete de expresión, se puede introducir un codón de iniciación que codifica un resto de metionina en el gen que codifica VIM-2 o la variante de VIM-2, en lugar de un codón que codifica un resto de valina. En consecuencia, en una realización particular de la invención, el polipéptido de la invención comprende la sustitución V1M.

El polipéptido de la presente invención comparte al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1, teniendo dicho polipéptido una o más de las siguientes propiedades en comparación con la enzima VIM-2 de tipo natural: (i) resistencia mejorada a la proteasas (en particular proteasas digestivas), (ii) estabilidad mejorada (en particular estabilidad térmica y/o estabilidad en medio intestinal), (iii) espectro de acción mejorado sobre compuestos betalactámicos en particular antibióticos betalactámicos, (es decir, el polipéptido de la invención puede inactivar un mayor número de compuestos betalactámicos diferentes (tales como antibióticos) en comparación con la enzima VIM-2 de tipo natural, o puede inactivar compuestos betalactámicos que no son susceptibles a la enzima VIM-2 de tipo natural), (iv) actividad enzimática mejorada (en particular, disminución del tiempo de inactivación del antibiótico), y (v) rendimiento de producción mejorado.

El polipéptido variante de la invención comprende una modificación en las posiciones 22, 34 y 130, en donde las posiciones corresponden a las posiciones de aminoácidos de la betalactamasa VIM-2 de SEQ ID NO: 1.

La sustitución en la posición 22 es Q22H. La sustitución en la posición 34 es Q34R. La sustitución en la posición 130 es E130D.

Para mejorar la estabilidad intestinal y la actividad enzimática frente a una variedad de antibióticos betalactámicos, el polipéptido de la invención comprende las sustituciones 22H, 34R y 130D.

En la presente invención, los aminoácidos se representan utilizando el código de tres letras o el código de una letra conocidos, como se resume en la siguiente tabla.

De acuerdo con la presente invención, una beta-lactamasa es un polipéptido que tiene actividad de beta-lactamasa, es decir, una enzima que cataliza la hidrólisis irreversible del enlace amida del anillo betalactámico que se encuentra en compuestos tales como antibióticos betalactámicos (p. ej., penicilinas, cefalosporinas, carbapenems, penam sulfonas) para crear una molécula hidrolizada desprovista de su actividad antibacteriana.

En el contexto de la presente invención, la betalactamasa VIM-2 es el polipéptido que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 1. Esta enzima fue descrita en el año 2000 por Poirel et al. (“Characterization of VIM-2, a carbapenem-hydrolyzing metallo-beta-lactamase and its plasmid- and integron-borne gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in France”; Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44(4): 891-7) y además caracterizado por Docquier et al. en 2003 (“On functional and structural heterogeneity of VIM-type metallo-beta-lactamases”. J. Antimicrob. Chemother. 2003; 51 :257-266).

La actividad de la variante de VIM-2 de la invención se puede ensayar mediante una serie de ensayos. Por ejemplo, se implementan ensayos enzimáticos in vitro, en los que se determina la velocidad de hidrólisis de un compuesto betalactámico por espectrofotometría en presencia de muestras de proteína que contienen la VIM-2 de tipo natural o una variante de VIM-2. Específicamente, la concentración de un compuesto betalactámico y/o su producto de hidrólisis en solución (utilizando un tampón adecuado, tal como tampón HEPES 50 mM a pH 7,5, complementado con ZnSO4 50 |uM) podría seguirse en un espectrofotómetro UV-Visible o en un lector de placas de micropocillos a una longitud de onda que corresponda a la absorbancia máxima del sustrato y/o producto. En presencia de una beta-lactamasa, la variación dependiente del tiempo de la concentración del sustrato y/o producto beta-lactámico corresponderá así a la velocidad de reacción. Si se mide la velocidad inicial de hidrólisis ([S]t “ [S]ü), esta velocidad de reacción (expresada en qM/min o qM/s) es directamente proporcional a la concentración de enzima en la muestra analizada. Además, la variación de la velocidad inicial sobre la concentración inicial de sustrato se caracteriza por la ecuación de Henri-Michaelis-Menten y permite calcular los parámetros cinéticos (k^{ca t} y K^m) de la enzima para la hidrólisis de compuestos betalactámicos específicos. Por lo tanto, la medición de las velocidades iniciales de hidrólisis determinadas en dichos ensayos enzimáticos permite caracterizar las propiedades de las muestras que contienen variantes de VIM-2, tal como su actividad preferencial hacia un sustrato específico o su abundancia relativa en la muestra.

En una realización particular, se puede aislar el polipéptido de la presente invención. En el contexto de la presente invención, el término "aislado" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que es al menos 20% puro, preferiblemente al menos 40% puro, más preferiblemente al menos 60% puro, incluso más preferiblemente al menos 80% puro, lo más preferiblemente al menos 90% puro, e incluso lo más preferiblemente al menos 95% puro, según se determina por SDS-PAGE. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación de polipéptidos esté esencialmente exenta de otros componentes bioquímicos tales como polinucleótidos, polisacáridos y polipéptidos, con los que está asociado de forma nativa. Esto podría lograrse, por ejemplo, preparando el polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos y métodos de purificación clásicos.

La relación entre dos secuencias de aminoácidos se describe por el parámetro de "identidad". Para los fines de la presente invención, la alineación de dos secuencias de aminoácidos se determina usando el programa Needle del paquete EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo de alineación global descrito en Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453. La matriz de sustitución utilizada es BLOSUM62, la penalización por apertura de hueco es 10 y la penalización por extensión de hueco es 0,5.

El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención y la secuencia de aminoácidos mencionada en las reivindicaciones (SEQ ID NO: 1) se calcula como el número de coincidencias exactas en un alineamiento de las dos secuencias, dividido entre la longitud de la "secuencia de la invención" o la longitud de la SEQ ID NO: 1, lo que sea más corto. El resultado se expresa en porcentaje de identidad.

Se produce una coincidencia exacta cuando la "secuencia de la invención" y la SEQ ID NO: 1 tienen restos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones del alineamiento. La longitud de una secuencia es el número de restos de aminoácidos en la secuencia (p. ej., la longitud de los aminoácidos 1-240 de la SEQ ID NO: 1 es 240).

En realizaciones particulares de la presente invención, el grado de identidad de esos péptidos particulares con la SEQ ID NO: 1 es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o al menos 99%. En otras realizaciones más, su grado de identidad con la S^eQ ID NO: 1 es de al menos 90,2%, 90,6%, 91%, 91,4%, 91,7%, 92,1%, 92,5%, 92,9%, 93,2%, 93,6%, 94%, 94,4%, 94,7%, 95,1%, 95,5%, 95,9%, 96,2%, 96,6%, 97%, 97,4%, 97,7%, 98,1%, 98,5%, 98,9%, 99,2% o al menos 99,6%.

Por supuesto, la variante de VIM-2 de la presente invención puede comprender además una serie de modificaciones en relación con la SEQ ID NO: 1 en posiciones diferentes de las específicamente identificadas anteriormente. Las modificaciones adicionales pueden incluir sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, así como combinaciones de cualquier número de dichas modificaciones. En una realización particular, dichas modificaciones de la variante de VIM-2 de la presente invención incluyen deleciones de aminoácidos en el extremo amino-terminal o carboxi-terminal de la proteína, además de las específicamente identificadas anteriormente. En una realización ilustrativa, no limitante, el polipéptido de la invención puede tener eliminados 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos ubicados en el extremo carboxi-terminal de la proteína, en comparación con la SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, el polipéptido de la invención presenta un truncamiento carboxi-terminal desde la posición 237 de la SEQ ID NO: 1. En el contexto de la invención, esto significa que los restos de aminoácidos 237 a 240 de la SEQ ID NO: 1 están ausentes del polipéptido resultante de la invención. En otra realización, el polipéptido de la invención presenta un truncamiento carboxi-terminal de los restos 236-240 de la SEQ ID NO: 1. En otra realización, el polipéptido de la invención presenta un truncamiento C-terminal de los restos 235-240 de la SEQ ID NO: 1. En otra realización ilustrativa, no limitante, el polipéptido de la invención puede tener eliminados uno o más de uno (tal como 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos ubicados en el extremo amino-terminal de la proteína, en comparación con la SEQ ID NO: 1, es decir, en comparación con una secuencia de VIM-2 de tipo natural que ha sufrido una escisión del péptido señal N-terminal (es decir, la secuencia de VIM-2 de tipo natural sin su péptido señal). En una variante específica de esta realización, el polipéptido que se elimina (o, dicho de otro modo, que tiene un truncamiento) de uno o más de un aminoácido ubicado en el extremo aminoterminal en comparación con la SEQ ID NO: 1 puede comprender además una inserción o extensión como se define a continuación, tal como un marcador o un péptido señal.

En el contexto de la presente invención, el término "inserción" pretende cubrir también extensiones amino- y/o carboxiterminales. En una realización particular, las extensiones N-terminales pueden incluir la adición de un péptido señal al polipéptido de la invención. Esto puede incluir el péptido señal natural de VIM-2 de tipo natural que tiene la secuencia de aminoácidos MFKLLSKLLVYLTASIMAIAS^pL^aFS (SEQ ID NO: 2) o un péptido señal modificado que tiene cualquiera de las sustituciones L9S, L9F, L9W, V10I, L12C, A14V, I16T, M17L, 119M, I19T, F25C en comparación con la de VIM-2 de tipo natural, o cualquier combinación de las sustituciones mencionadas anteriormente, o cualquier otro péptido señal apropiado, o ambos.

Las extensiones N-terminal o C-terminal representativas pueden incluir la adición de aminoácido(s) no natural(es), tales como péptidos "marcadores" codificados por un fragmento de ADN clonado en fusión con la VIM-2 de tipo natural o cualquier variante de la misma, lo que permite facilitar la identificación y/o purificación del polipéptido de la invención. Dicho marcador apropiado puede incluir marcadores de histidina (6 x His) o glutatión-S-transferasa o proteína de unión a maltosa, por ejemplo, como es bien conocido en la técnica.

Un polipéptido según la invención puede presentar una actividad específica para un antibiótico betalactámico dado mejorada en comparación con la actividad específica presentada por la VIM-2 de tipo natural de SEQ ID NO: 1 para el mismo antibiótico. En una realización particular, la actividad específica, expresada en nmoles de sustratos hidrolizados por unidad de tiempo y por un mg de muestra de una proteína que contiene el polipéptido de la presente invención, es de al menos 105%, con respecto a la actividad específica de la VIM-2 de tipo natural de SEQ ID NO: 1 determinada usando el mismo procedimiento expuesto en la sección de ejemplos. En otra realización, la actividad específica relativa del polipéptido de la presente invención es al menos 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800 o incluso al menos 1600%, aún en relación con la actividad específica de la VIM-2 de tipo natural de SEQ ID NO: 1.

En otra realización particular, el polipéptido de la invención comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 12, 17 o 22, o un fragmento de la misma que tiene actividad de beta-lactamasa (tal como un fragmento que carece de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7, o más de 7 aminoácidos C-terminales en comparación con el polipéptido de una cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 12, 17 o 22), en particular un fragmento que carece de los aminoácidos 237-240, 236-240 o 235-240 como se describe anteriormente. En una variante de esta realización, el polipéptido sin un péptido señal puede comprender una sustitución de aminoácido adicional. En una variante de esta realización, el polipéptido comprende además un péptido señal (tal como el péptido señal que se muestra en la SEQ ID NO: 2 o cualquier variante del mismo como se definió anteriormente) en su extremo N-terminal.

La presente invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante del polipéptido VIM-2 de la invención.

La expresión "secuencia de ácido nucleico aislada" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está esencialmente exenta de otras secuencias de ácido nucleico, p. ej., al menos aproximadamente 20% pura, preferiblemente al menos aproximadamente 40% pura, más preferiblemente al menos aproximadamente 60% pura, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 80% pura, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 90% pura, determinado por electroforesis en gel de agarosa o cualquier otro método apropiado. Por ejemplo, se puede obtener una secuencia de ácido nucleico aislada mediante procedimientos de clonación convencionales utilizados en ingeniería genética para trasladar la secuencia de ácido nucleico desde su ubicación natural a un sitio diferente donde se reproducirá. Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y el aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula de vector y la incorporación del vector recombinante en una célula hospedante donde se replicarán múltiples copias o clones del ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético o cualquier combinación de los mismos.

Las secuencias de ácido nucleico de la invención se pueden preparar introduciendo al menos una mutación en una secuencia molde que codifica la VIM-2 de tipo natural de SEQ ID NO: 1 o una subsecuencia de la misma, en donde la secuencia de ácido nucleico mutante codifica una variante del polipéptido VIM-2. La introducción de una mutación en la secuencia de ácido nucleico para intercambiar un nucleótido por otro puede lograrse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, p. ej., por mutagénesis dirigida, por mutagénesis aleatoria, o mutagénesis aleatoria dopada, enriquecida o localizada.

La mutagénesis aleatoria se realiza adecuadamente como mutagénesis aleatoria localizada o específica de la región en al menos tres partes del gen que se traducen en la secuencia de aminoácidos que se muestra en cuestión, o dentro del gen completo. Cuando la mutagénesis se realiza mediante el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido se puede dopar o enriquecer con los tres nucleótidos no parentales durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que se van a cambiar. El dopado o el enriquecimiento pueden realizarse de modo que se eviten codones para aminoácidos no deseados. El oligonucleótido dopado o enriquecido se puede incorporar al ADN que codifica el polipéptido mediante cualquier técnica, usando, p. ej., PCR, LCR o cualquier ADN polimerasa y ligasa, u otra enzima de procesamiento/modificación del ADN, tal como una topoisomerasa, según se considere apropiado.

Preferiblemente, el dopado se lleva a cabo utilizando "dopado aleatorio constante", en el que se predefine el porcentaje de tipo natural y de mutación en cada posición. Además, el dopado se puede dirigir hacia una preferencia por la introducción de ciertos nucleótidos y, por lo tanto, una preferencia por la introducción de uno o más restos de aminoácidos específicos. El dopado se puede realizar, p. ej., para así permitir la introducción del 90% de tipo natural y 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de dopado se basa en restricciones genéticas así como estructurales de la proteína.

La mutagénesis aleatoria puede localizarse ventajosamente en una parte de la secuencia original de VIM-2 en cuestión. Esto puede, p. ej., ser ventajoso cuando se ha identificado que ciertas regiones de la enzima son de particular importancia para una propiedad dada de la enzima.

Los métodos alternativos para proporcionar variantes de la invención incluyen el barajado de genes, p. ej., como se describe en el documento WO 95/22625 o en WO 96/00343, y el procedimiento de derivación de consenso como se describe en el documento EP 897985.

La invención se refiere además a una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedante adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control. Se entenderá que el término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción del polipéptido que incluye, pero no se limita a transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

La expresión "construcción de ácido nucleico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea de cadena simple o doble, que se aísla de un gen natural o que se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otro modo no existirían en la naturaleza. La expresión construcción de ácido nucleico es sinónimo de la expresión "casete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención. En una realización particular, la construcción de ácido nucleico o casete de expresión está comprendida dentro de un plásmido (tal como un plásmido de expresión).

La expresión "secuencias de control" se define en el presente documento para incluir todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña para la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, un líder, un operador, secuencia propeptídica, promotor, secuencia de inicio de la transcripción, secuencia de inicio de la traducción, secuencia de péptido señal, secuencia de terminación de la traducción, secuencia de poliadenilación y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señal de terminación de la transcripción y señales de iniciación y terminación de la traducción. Las secuencias de control se pueden proporcionar con conectores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido.

La expresión "unido operativamente" indica en el presente documento una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con respecto a la secuencia codificante de la secuencia de polinucleótidos de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido.

Cuando se usa en el presente documento, la expresión "secuencia codificante" (CDS) significa una secuencia de nucleótidos, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteico. Los límites de la secuencia codificante generalmente están determinados por un marco de lectura abierto, que generalmente comienza con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG, y generalmente termina con un codón de terminación tal como TAA, TGA o TAG. La secuencia codificante puede consistir en un ADN, ADNc; puede ser natural, semisintética o sintética; también puede contener nucleótidos no naturales o modificados.

El término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción del polipéptido, incluyendo, pero no limitadas a la transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

La expresión "vector de expresión" se define en el presente documento como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención, que se une operativamente a nucleótidos adicionales que proporcionan su expresión.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención se puede expresar usando un vector de expresión que normalmente incluye secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma, señal de inicio de la traducción y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica un polipéptido según la invención puede ser cualquier vector que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula hospedante en la que se va a introducir. El vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula hospedante, se integra en el genoma de la célula hospedante y se replica junto con el o los cromosomas en los que se ha integrado. También puede permanecer en la célula como una molécula de ADN extracromosómica que se replica de forma autónoma, tal como un plásmido.

La invención se refiere además a una célula hospedante que comprende la secuencia de ácido nucleico o la construcción de ácido nucleico de la invención. Una “célula hospedante”, tal como se usa en el presente documento, incluye cualquier tipo de célula, procariota o eucariota, que sea susceptible de transformación, transfección, transducción, infección y similares con una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la presente invención.

La presente invención también se refiere a células hospedantes recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención, que se usan ventajosamente en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula hospedante de modo que el vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante. La expresión “célula hospedante” abarca cualquier progenie de una célula parental que no sea idéntica a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula hospedante dependerá en gran medida del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

La célula hospedante puede consistir en u originarse a partir de un organismo unicelular o policelular, y puede ser procariota o eucariota.

Entre los microorganismos unicelulares útiles se encuentran las células bacterianas tales como las bacterias Gram positivas que incluyen, pero no se limitan a, una célula de Bacillus , p. ej., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus turingiensico; o una célula de Streptomyces, p. ej., Streptomyces lividans y Streptomyces murinus, o bacterias Gram negativas tales como Escherichia coli y Pseudomonas spp.

La introducción de un vector en una célula hospedante bacteriana se puede hacer, por ejemplo, mediante transformación de protoplastos (véase, p. ej., Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), por transformación de ADN usando células competentes (véase, p. ej., Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221) utilizando cualquier método de transformación, incluidos, pero no limitados a transformación química o electroporación (véase, p. ej., Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (véase, p. ej., Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

La célula hospedante también puede ser de un eucariota, tal como un animal, y en particular un mamífero, un insecto, una planta o líneas celulares derivadas de los mismos, o un eucariota unicelular o célula fúngica. La proteína recombinante también se puede producir en un organismo multicelular, tal como un animal, en particular un mamífero o una planta.

En una realización particular, la célula hospedante puede ser una célula fúngica. En una realización particular, la célula hospedante fúngica es Saccharomyces cerevisiaeo Pichia pastoris. En una realización particular, la célula hospedante es una línea celular procedente de células de ovario de hámster chino.

Las células fúngicas pueden transformarse por un procedimiento que implica formación de protoplastos, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. La levadura puede transformarse utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J. N. y Simon, M. I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology 194: 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920. Las células fúngicas también pueden transformarse por electroporación o cualquier otro método adecuado para introducir moléculas de ADN en una célula.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprenden (a) cultivar una célula hospedante en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción del polipéptido utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante cultivo en matraz de agitación y fermentación a pequeña escala o gran escala (incluidas fermentaciones continuas, discontinuas, semicontinuas o en estado sólido) en fermentadores industriales o de laboratorio realizadas en un medio adecuado y en condiciones que permiten que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con las composiciones publicadas (p. ej., en los catálogos de la American Type Culture Collection). En algunos casos, las condiciones para el crecimiento de las células hospedantes y la producción del polipéptido son distintas; en una primera fase se permite que las células hospedante se multipliquen en condiciones apropiadas, y en una segunda fase pueden cambiarse las condiciones para permitir la producción óptima del polipéptido. Si el polipéptido es secretado en el medio nutriente, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, se puede recuperar de lisados celulares.

El polipéptido resultante puede recuperarse utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede recuperarse del medio nutriente por procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a centrifugación, filtración, extracción, adsorción, secado por atomización, evaporación o precipitación.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparativo, electroforesis en gel preparativa), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación con sulfato de amonio) o extracción (véase, p. ej., Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989), o una combinación de los mismos.

La presente invención se refiere además a una composición que comprende un polipéptido de la presente invención. Las composiciones apropiadas incluyen un polipéptido como se define anteriormente, en combinación con un vehículo aceptable. Las composiciones se pueden preparar según métodos bien conocidos en la técnica y estar en forma de composiciones líquidas o secas. La composición puede incluir además componentes que estabilizan el polipéptido según la invención, tales como el glicerol.

En una realización particular, la composición es una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede estar en forma de una composición que se puede administrar por vía oral y es capaz de liberar el polipéptido en una parte deseada del tracto gastrointestinal de un sujeto que lo necesite. Preferiblemente, la parte deseada es el estómago, duodeno, yeyuno, íleon, ciego o colon. En una realización preferida, la parte deseada del intestino es el yeyuno, el íleon, el ciego o el colon, más preferiblemente el íleon, el ciego o el colon. En este último caso, la composición puede incluir uno o más compuestos gastrorresistentes que protegen al polipéptido de la invención del jugo gástrico. Tales composiciones pueden incluir los sistemas de administración de fármacos descritos en los documentos WO93/13795, WO2004/016248 o US20050249716, entre otros.

La presente invención se refiere además a una célula u organismo hospedante como se describe anteriormente, que produce el polipéptido de la presente invención, que se puede introducir en la parte deseada del intestino y es capaz de liberar dicho polipéptido en la parte deseada del intestino de un sujeto que lo necesite. En una realización preferida, la parte deseada del intestino es el íleon, ciego o colon, más preferiblemente el ciego o el colon. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a una célula u organismo hospedante como se definió anteriormente, para usar en un método de terapia como se describe en el presente documento, en donde dicha célula hospedante se administra a un sujeto que lo necesita.

Como se mencionó anteriormente, la variante del polipéptido VIM-2 de la presente invención es útil en una serie de usos terapéuticos y no terapéuticos.

La presente invención describe métodos de terapia que implementan el polipéptido de la invención, en donde dicho polipéptido o una composición o un kit de partes que contiene el mismo en combinación con un antibiótico, o una célula u organismo hospedante que expresa dicho polipéptido se usa en un método para inactivar un compuesto betalactámico tal como un antibiótico betalactámico en un sujeto que lo necesite. El método se implementa para tratar o prevenir los efectos adversos de los antibióticos tales como la disbiosis intestinal, la selección de bacterias resistentes, alteración de los procesos digestivos normales, colonización por patógenos intestinales oportunistas tales como Clostridium difficile, diarrea asociada a antibióticos u otras enfermedades relacionadas con la disbiosis intestinal.

La invención también se refiere al uso del polipéptido, la composición, la célula u organismo hospedante, o el kit de partes de la invención, en un método para el tratamiento de una infección bacteriana causada por bacterias que son susceptibles a un antibiótico betalactámico. Más particularmente, la infección bacteriana se trata mediante el uso de una combinación del polipéptido de la invención y un antibiótico betalactámico que es sensible a dicho polipéptido, de modo que se trata la infección gracias al antibiótico betalactámico mientras que se elimina cualquier antibiótico residual no deseado gracias al polipéptido de la invención. En esta realización particular, el polipéptido se formula preferiblemente en una composición que es capaz de liberar el polipéptido en una parte deseada del intestino de un sujeto que necesita dicho tratamiento de infección bacteriana, en donde la parte deseada del intestino es preferiblemente el yeyuno, el íleon, el ciego o el colon, lo más preferiblemente el íleon, el ciego o el colon. El polipéptido también puede ser liberado en la parte deseada del intestino por una célula u organismo hospedante que produce dicho polipéptido, en donde la parte deseada del intestino es el íleon, ciego o colon, preferiblemente el ciego o el colon. En un aspecto particular, el polipéptido, la composición, la célula u organismo hospedante o el kit de partes de la invención se usan para el tratamiento de una infección bacteriana en un sujeto que puede ser un animal, un mamífero o un ser humano, mediante el cual se administra al sujeto un antibiótico sensible a dicho polipéptido antes, después o concomitantemente con la administración de dicho polipéptido o composición del mismo.

Otros usos del polipéptido de la invención incluyen usos no terapéuticos tales como el uso del polipéptido para la remediación de antibióticos en el medio ambiente o en un contexto medioambiental. Dichos usos y métodos se pueden encontrar descritos, por ejemplo, en el documento WO 2012/007536 que describe el uso de lacasas, celulasas y lipasas para la remediación de antibióticos en el medio ambiente, y se aplican en el presente documento mutatis mutandis para la eliminación de antibióticos betalactámicos del medio ambiente utilizando el polipéptido de la invención.

Leyendas de las figuras

La Figura 1 es un gráfico que representa la actividad específica de VIM-2 de tipo natural y la variante VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] a los 0, 30, 60, 90, 120 y 240 minutos en medio ileal de lechones.

Ejemplos

Ejemplo 1: determinación de las posiciones de interés en la secuencia de la enzima VIM-2

Con el fin de identificar la posición de aminoácido relevante para la actividad enzimática, su perfil de sustrato, su estabilidad o su nivel de producción en la célula hospedante, se utilizó mutagénesis aleatoria para crear una biblioteca de genes b/aVIM-2 portadores de hasta 12 mutaciones. Para este fin, los mutantes blaVIM-2 se introdujeron usando una reacción en cadena de la polimerasa propensa a errores, en presencia de análogos de nucleótidos. A continuación, las secuencias de nucleótidos derivadas de b/aVIM-2 se clonaron en un vector plasmídico de Escherichia coli y las propiedades de la enzima portadora de varias sustituciones (derivadas de la introducción de mutaciones en la secuencia de nucleótidos de b/aVIM-2) se analizaron utilizando la determinación de la MIC de compuestos betalactámicos para las cepas productoras de las variantes, la determinación de la actividad hidrolizante específica para la degradación de varios compuestos betalactámicos y la estabilidad de la enzima variante.

A partir de los experimentos descritos anteriormente realizados en VIM-2 de tipo natural, se descubrieron las siguientes posiciones como posiciones de interés en la secuencia de VIM-2 en donde las posiciones corresponden a las posiciones de la betalactamasa representada en las SEQ ID NO: 1: 22, 34 y 130. Otra posible modificación incluye el truncamiento de la parte C-terminal de VIM-2 comenzando desde, e incluyendo, la posición 236, que da como resultado una variante que termina con el resto en la posición 235 de la SEQ ID NO: 1.

Ejemplo 2: producción y purificación de una variante de VIM-2

La variante de VIM-2 se produjo en Escherichia coli usando un sistema basado en promotores Plac (usando el plásmido de alto número de copias pLB-II, como se describe en Borgianni et al., Antimicrob. Agents Chemother.; 2010; 54:3197-3204) o un sistema de expresión basado en el promotor T7 (usando el plásmido de expresión pET-9a). Brevemente, el gen b/aVIM-2 mutante se clonó en el vector plasmídico pLB-II o pET-9a usando los sitios de restricción NdeI y BamHI, y el plásmido resultante se introdujo en células de E. coli DH5a o BL21 (DE3) por electroporación. La célula hospedante resultante se cultivó en medio Luria-Bertani o en el medio de cultivo celular rico autoinductor ZYP-5052 (Studier, F. W.

2005. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41:207-234) durante 24 h, y el líquido sobrenadante del cultivo se clarificó por centrifugación. A continuación, la muestra resultante se concentró por ultrafiltración y se cargó en una columna de cromatografía de intercambio aniónico. Las proteínas se eluyeron usando un gradiente lineal de NaCl y las fracciones activas se agruparon y concentraron. Luego, la muestra de proteína se cargó en una columna de filtración de gel y las proteínas se eluyeron con HEPES 50 mM (pH 7,5) complementado con ZnSO450 pM. A continuación, la proteína purificada se concentró a 1-2 mg/ml y se almacenó a -20°C. Todas las variantes caracterizadas en los siguientes ejemplos se han producido con un método similar. En particular, este protocolo de producción se utilizó con éxito para producir las siguientes enzimas variantes de VIM-2: VIM-2[Q34R], VIM-2[Q22H,Q34R,E130D].

Otra variante que se puede producir gracias a un método similar es DCT236 (con una eliminación C-terminal de la posición 236), y variantes de la misma tales como VIM-2[Q34R] DCT236 y VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236.

Ejemplo 3: determinación de la estabilidad aumentada de una variante de VIM-2 en medio intestinal

Para medir la estabilidad de las variantes de VIM-2, se aplica el siguiente procedimiento: la actividad hidrolizante de imipenem de muestras de proteínas purificadas se determinó después de la incubación en medios ileal, yeyunal y cecal recogidos de lechones o cerdos adultos. La actividad específica (Act. Esp.) para las variantes se midió en diferentes puntos de tiempo (0, 30, 60, 90, 120 y 240 min) durante la incubación. Se comparó la actividad específica en el tiempo t con la actividad específica en el tiempo t=0 para evaluar la pérdida de actividad de la variante en el medio intestinal. El cambio a lo largo del tiempo se expresó como la relación entre la actividad inicial (en t=0) y la actividad medida más tarde en el tiempo ((Act. Esp. Variante)t/(Act. Esp. Variante)t=0. Un valor inferior a uno indica una pérdida de actividad cuando se incuba en el medio intestinal. Se compara la actividad residual en diferentes puntos de tiempo para evaluar la mayor estabilidad en medio intestinal de algunas variantes en comparación con la enzima de tipo natural.

La actividad específica de la enzima VIM-2 de tipo natural y la variante de VIM-2 VIM-2[Q22h,q34r,ei30D] con el tiempo cuando se incubaron en medio ileal se presentan en la Figura 1.

La pérdida de actividad a lo largo del tiempo también se resume en la siguiente tabla:

Como se muestra en la tabla o la Figura 1, la enzima de tipo natural perdió 87% de su actividad después de 240 minutos de incubación en medio ileal. La variante VIM-2[Q22h,Q34r,e130D] perdió sólo 44% de su actividad en las mismas condiciones.

La combinación de sustituciones Q22G, Q34D, E130D y truncamiento en el extremo C-terminal a partir de la posición de aminoácido 236 también da como resultado variantes con propiedades notablemente mejoradas desde una perspectiva industrial.

Ejemplo 4: determinación de la actividad enzimática y/o catalítica específica de determinadas variantes de VIM-2 frente a varios compuestos betalactámicos

Para las enzimas variantes producidas como se menciona en el ejemplo 3, se puede medir la actividad específica frente a compuestos betalactámicos específicos tales como antibióticos betalactámicos. La evaluación de la actividad específica se realiza como se describe a continuación: la hidrólisis de compuestos betalactámicos en presencia de extractos brutos, preparados a partir de cultivos bacterianos en la fase de crecimiento logarítmico o estacionario como se describe anteriormente (Docquier J.-D. et al., J. Antimicrob. Chemother.; 2003; 51:257-266), que contenían una variante de VIM-2 y/o variantes de VIM-2 purificadas, se controló por espectrofotometría a una longitud de onda adecuada. La actividad específica puede expresarse en nmol de sustrato betalactámico hidrolizado por min y por mg de proteína total en la muestra.

A continuación, todas las actividades específicas se expresarán en relación con la actividad específica de la enzima de tipo natural medida en las mismas condiciones.

Para la variante VIM-2[Q22^h,Q34^r,^e130D] , las actividades específicas medidas son:

Los resultados anteriores ilustran que los extractos brutos que contienen la VIM-2[Q22^h,Q34^r,^e130D] presentaban una actividad fuertemente mejorada contra varios compuestos betalactámicos de interés en comparación con la enzima de tipo natural.

Además, las variantes con un extremo C-terminal truncado a partir de la posición del aminoácido 236 presentan características mejoradas. Por lo tanto, la combinación de sustituciones Q22G, Q34D, E130D y dicho truncamiento dan como resultado una variante con propiedades notablemente mejoradas desde una perspectiva industrial.

En particular, la variante VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236 presenta propiedades catalíticas mejoradas cuando se considera el imipenem como sustrato:

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> DA VOLTERRA et al.

<120> VARIANTES DE BETA-LACTAMASA

<130> B2185PC00

<160> 22

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211 > 240

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> VIM-2 de tipo natural

<400> 1

Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu lie Pro Val Gly 1 5 10 15

Glu Val Arg Leu Tyr Gln lie Ala Asp Gly Val Trp Ser His lie Ala 20 25 30

Thr Gln Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu lie Val 35 40 45

Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu lie Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys 50 55 60

Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu lie Glu Lys Gln lie Gly Leu Pro 65 70 75 80

Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly 85 90 95

Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser 100 105 110

Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu lie Pro Thr His Ser 115 120 125

Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val 130 135 140

Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val 145 150 155 160

Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala lie Tyr Glu 165 170 175

Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu 180 185 190

Trp Pro Thr Ser lie Glu Arg lie Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln i J r - J t e U r¿ t rO t rU t o r t e

Phe Val lie Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys 210 215 220

His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu 225 230 235 240 <210>2

<211> 26

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Péptido señal VIM-2

<400>2

Met Phe Lys Leu Leu Ser Lys Leu Leu Val Tyr Leu Thr Ala Ser lie 1 5 10 15

Met Ala lie Ala Ser Pro Leu Ala Phe Ser

20 25

<210>3

<211 > 240

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<400>3

Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu lie Pro Val Gly 1 5 10 15

Glu Val Arg Leu Tyr His lie Ala Asp Gly Val Trp Ser His lie Ala 20 25 30

Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu lie Val 35 40 45

Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu lie Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys 50 55 60

Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu lie Glu Lys Gln lie Gly Leu Pro 65 70 75 80

Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly 85 90 95

Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser 100 105 110

Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu lie Pro Thr His Ser 115 120 125

Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val 130 135 140

Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala lie Tyr Glu 165 170 175

Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu 180 185 190

Trp Pro Thr Ser lie Glu Arg lie Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln 195 200 205

Phe Val lie Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys 210 215 220

His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu 225 230 235 240 <210>4

<211 > 240

5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<400>4

Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu lie Pro Val Gly 1 5 10 15

Glu Val Arg Leu Tyr Asn lie Ala Asp Gly Val Trp Ser His lie Ala 20 25 30

*| q Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu lie Val 35 40 45

Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu lie Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys 50 55 60

Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu lie Glu Lys Gln lie Gly Leu Pro 65 70 75 80

Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly 85 90 95

Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser 100 105 110

Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu lie Pro Thr His Ser 115 120 125

Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val 130 135 140

Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala lie Tyr Glu 165 170 175

Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu 180 185 190

Trp Pro Thr Ser lie Glu Arg lie Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln 195 200 205

Phe Val lie Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys 210 215 220

His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu 225 230 235 240 <210>5

<211 > 240

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<400>5

Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu lie Pro Val Gly 1 5 10 15 Glu Val Arg Leu Tyr Gln lie Ala Asp Gly Val Trp Ser His lie Ala 20 25 30

Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu lie Val 35 40 45

Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu lie Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys 50 55 60

Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu lie Glu Lys Gln lie Gly Leu Pro 65 70 75 80

Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly 85 90 95

Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser 100 105 110

Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu lie Pro Thr His Ser 115 120 125

Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val 130 135 140

Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala lie Tyr Glu 165 170 175

Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu 180 185 190

Trp Pro Thr Ser lie Glu Arg lie Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln 195 200 205

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<210>6

<211 > 240

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<210>7

<211 > 240

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<400>7

Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu lie Pro Val Gly 1 5 10 15

Glu Val Arg Leu Tyr His lie Ala Asp Gly Val Trp Ser His lie Ala 20 25 30

Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu lie Val 35 40 45

Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu lie Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys 50 55 60

Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu lie Glu Lys Gln lie Gly Leu Pro 65 70 75 80

Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly 85 90 95

Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser 100 105 110

Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu lie Pro Thr His Ser 115 120 125

Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val 130 135 140

Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala lie Tyr Glu 165 170 175

Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu 180 185 190

Trp Pro Thr Ser lie Glu Arg lie Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln 195 200 205

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<211 > 235

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu 180 185 190

Trp Pro Thr Ser lie Glu Arg lie Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln 195 200 205

Phe Val lie Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys 210 215 220

His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn

225 230 235

<210>9

<211 > 235

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<210> 10

<211 > 235

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<210> 11

<211 > 235

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<210> 12

<211 > 235

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<210> 13

<211 > 240

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<210> 14

<211 > 240

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<400> 14

Met Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu lie Pro Val Gly 1 5 10 15

<210> 15

<211 > 240

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<210> 16

<211 > 240

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<210> 17

<211 > 240

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<210> 18

<211 > 235

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<210> 19

<211 > 235

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<210> 20

<211 > 235

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<210> 21

<211 > 235

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<210> 22

<211 > 235

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante VIM-2

<400> 22

Met Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu lie Pro Val Gly 1 5 10 15

Glu Val Arg Leu Tyr His lie Ala Asp Gly Val Trp Ser His lie Ala 20 25 30

Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu lie Val 35 40 45

Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu lie Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys 50 55 60

Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu lie Glu Lys Gln lie Gly Leu Pro 65 70 75 80

Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly 85 90 95

Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser 100 105 110

Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu lie Pro Thr His Ser 115 120 125

Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val 130 135 140

Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala lie Tyr Glu 165 170 175

Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu 180 185 190

Trp Pro Thr Ser lie Glu Arg lie Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln 195 200 205

Phe Val lie Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys 210 215 220

His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn

225 230 235

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que tiene actividad de beta-lactamasa, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, comprendiendo dicho polipéptido sustituciones en las posiciones 22, 34 y 130, en donde las posiciones corresponden a las posiciones en la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1, y en donde las sustituciones consisten en Q22H, Q34R y E130D.

2. El polipéptido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.

3. El polipéptido según la reivindicación 1 o 2, en donde el primer resto de la SEQ ID NO: 1 se reemplaza por un resto de metionina.

4. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además un péptido señal en su extremo N-terminal.

5. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un truncamiento en su extremo N-terminal o C-terminal en comparación con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1.

6. El polipéptido según la reivindicación 5, que comprende:

- un truncamiento C-terminal de los restos 237-240 de

la SEQ ID NO: 1;

- un truncamiento C-terminal de los restos 236-240 de

la SEQ ID NO: 1; o

- un truncamiento C-terminal de los restos 235-240 de

la SEQ ID NO: 1.

7. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 22 o un fragmento de la misma que tiene actividad de betalactamasa.

8. Una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 8, unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la expresión del polipéptido en un hospedante de expresión adecuado.

10. Una célula hospedante recombinante, que comprende la construcción de ácido nucleico de la reivindicación 9.

11. Una composición que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

12. La composición de la reivindicación 11, que es administrable por vía oral y es capaz de liberar el polipéptido en una parte deseada del intestino, en particular en el yeyuno, el íleon, el ciego o el colon.

13. Un kit de piezas que comprende

(a) el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12; y

(b) un antibiótico betalactámico que es sensible a dicho polipéptido de (a) o está contenido en la composición de (a); para administración separada, secuencial o simultánea.

14. El polipéptido de la reivindicación 1 a 7, para uso como un medicamento.

15. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, el kit de partes de la reivindicación 13 o la célula hospedante recombinante de la reivindicación 10, para usar en un método para inactivar un antibiótico beta-lactámico en un sujeto que lo necesite o para usar en un método para el tratamiento de una infección bacteriana que está causada por una bacteria que es sensible a un antibiótico betalactámico.

16. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, el kit de partes de la reivindicación 13 o la célula hospedante de la reivindicación 10, para usar en un método para tratar una infección bacteriana en donde dicho polipéptido o dicha composición o dicha célula hospedante es para usar en combinación con un antibiótico betalactámico que es sensible a dicho polipéptido.