KR20180110032A - 베타-락타마제 변이체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 베타-락타마제 활성을 갖는 분리된 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 분리된 폴리펩타이드는 개선된 프로테아제 안정성, 장 매질 속에서의 안정성, 하나 이상의 항생제에 대한 개선된 활성, 개선된 비 활성(specific activity) 및/또는 숙주 세포내에서의 개선된 생산과 같은 개선된 특성을 지닌 VIM-2 변이체이다.
Description
발명의 분야
본 발명은 베타-락타마제 활성을 지닌 분리된(isolated) 폴리펩타이드 및 당해 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 분리된 폴리펩타이드는 개선된 프로테아제 안정성, 열 안정성과 같은 개선된 고유 안정성, 베타-락탐 항생제와 같은 하나 이상의 베타-락탐 화합물에 대한 개선된 활성, 및/또는 숙주 세포내에서 개선된 생산과 같은 개선된 특성을 지닌 VIM-유형 소집단에 속하는 하위 분류 B1 메탈로-베타-락타마제이다.
많은 항세균 제품, 특히 항생제는 세균 감염의 치료에 사용될 수 있다. 그러나, 항생제는 감염 부위에서 병원체를 공격할 뿐 아니라, 건강한 대상체, 및 특히 위(gut)에서 발견될 수 있는 정상의 세균 총(bacterial flora)에 영향을 미친다. 500개 이상의 종으로부터의 10조개 이상의 세균으로 구성된, 결장의 공생적 세균총(또한 결장 미생물총으로 불린다)의 항생제에 의한 변경은 내성 세균의 선택 및 내성 세균에 의한 잠재적인 콜로니화(colonization), 정상 소화 과정의 파괴, 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile)와 같은 기회감염 장 병원체에 의한 장의 콜로니화 및 감염, 항생제-관련 설사 또는 장 불균형과 관련된 다른 질환과 같은 불리한 부작용을 초래할 수 있다. 이들 부작용은 장, 보다 특히 말단 회장 및 결장에서 잔류 항생제를 분해시킬 수 있는 효소를 투여함으로써 감소시킬 수 있다. 이러한 시도는 특히 WO2004/016248 또는 US20050249716에 기술되어 있다.
그러나, 효소는 이들의 분해를 초래하는 프로테아제의 존재, 온도, 이온 강도, 금속 보조인자의 이용가능성 또는 킬레이터(chelator)의 존재와 같은, 다수의 생리화학적 인자에 대해 민감한 취약한 거대분자이다. 또한, 비 활성(specific activity)이 개선된 효소는 이들의 효능을 증가시키고/시키거나 이를 필요로 하는 환자에서 잔류 항생제의 효율적인 분해를 수득하는데 사용하기에 필수적인 양을 감소시키기 위하여 유리할 수 있다. 최종적으로, 이러한 항생제-분해 효소에 대한 개선된 생산 수율을 수득하는 것이 유리할 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 VIM-2 메탈로-베타 락타마제의 신규 변이체를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 서열 번호:1(이는 이의 천연 시그날 서열이 없는 야생형 VIM-2의 서열이다)에 나타낸 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 베타-락타마제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 야생형 VIM-2 효소와 비교하여 다음의 특성들 중 하나 이상을 갖는다: (i) 개선된 프로테아제 내성, 특히 소화성 프로테아제 내성, (ii) 개선된 안정성, 특히 열 안정성 및/또는 장 매질 속에서의 안정성, (iii) 베타-락탐에서의 개선된 작용 스펙트럼(즉, 변이체는 보다 큰 수의 베타-락탐 화합물, 특히 베타-락탐 항생제를 가수분해할 수 있다), (iv) 하나 이상의 베타-락탐 화합물(예컨대, 하나 이상의 베타-락탐 항생제)에 있어서, 특히 감소된 항생제 불활성화 시간내에 해독하는, 개선된 효소 활성, 및 (v) 개선된 생산 수율. 보다 구체적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 34번 위치에서의, 및 22번 및 130번 위치로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서의 치환을 포함하는 VIM-2 변이체이며, 여기서 상기 위치들은 서열 번호: 1의 VIM-2 베타-락타마제의 아미노산 위치에 상응한다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 폴리펩타이드는 22 및 34번 위치, 34 및 130번 위치, 또는 22, 34 및 130번 위치에서의 치환을 포함한다.
22, 34 및 130번 위치로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서의 치환을 포함하는 VIM-2 변이체가 또한 본원에 개시되어 있으며, 여기서 상기 위치는 서열 번호: 1의 VIM-2 베타-락타마제의 아미노산 위치에 상응한다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 22번 위치에서의 치환은 Q22H 또는 Q22N이다. 다른 구현예에서, 34번 위치에서의 치환은 Q34R이다. 다른 구현에에서, 130번 위치에서의 치환은 E130D이다.
본 발명에 따른 VIM-2 변이체를 생산하는 세균은 암피실린, 피페라실린, 티카르실린, 테모실린, 세팔로틴, 세폭시틴, 세푸록심, 세포탁심, 세프타지딤, 세페핌, 세프트리악손, 세프타롤린, 세포테탄, 이미페넴, 메로페넴 및 에르타페넴과 같은, 그러나 비 배타적으로, 적어도 하나의 베타-람탁 항생제에 대한 최소 억제 농도(Minimal Inhibitory conectration: MIC)와 관련하여, 서열 번호: 1의 야생형 VIM-2를 생산하는 동일한 세균의 MIC와 비교하여 개선된 특성을 나타낼 수 있으며, 상기 MIC는 미생물 브로쓰 방법(Clinical Laboratory Standard Institute, document M07-A10: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition)과 같은, 표준 시험관내(in vitro) 감수성 시험 방법(susceptibility testing method)을 사용하여 측정할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 표현 "최소 억제 농도(MIC)와 관련하여 개선된 특성"은 VIM-2 변이체를 생산하는 세균에 대해 증가된 MIC, 예를 들면, 야생형 VIM-2를 생산하는 동일한 세균과 비교하여, 2배 이상 증가된 MIC를 나타낸다.
본 발명에 따른 VIM-2 변이체는 또한 프로테아제, 특히 소화성 프로테아제와 관련하여, 서열 번호: 1의 야생형 VIM-2와 비교하여 개선된 특성을 나타낼 수 있으며, 이는 트립신, 키모트립신 등과 같은 정제된 프로테아제 또는 새끼돼지, 돼지, 다른 포유동물(예컨대, 사람 장 매질) 또는 다른 동물과 함께 항온처리한 후 효소 활성(하기 기술된 바와 같은 시험관내 효소 검정에 의해) 및/또는 통합성(예컨대, 질량 분광법에 의해)을 모니터링함으로써 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 VIM-2 변이체는 또한 안정성(특히 열 안정성)과 관련하여, 서열 번호: 1의 야생형 VIM-2와 비교하여 개선된 특성을 나타낼 수 있으며, 이는 45 내지 75℃ 범위의 온도에서 2시간 이하 동안, 및 특히 65℃에서 45분 동안 단백질 샘플(조 추출물 포함)의 항온처리 후 효소 잔류 활성을 모니터링함으로써 측정할 수 있다. 효소 잔류 활성을 모니터링하기 위한 대표적인 수단은 예를 들면, 하기 및 실시예 단락에 기술된 것들을 포함한다.
본 발명에 따른 VIM-2 변이체는 장 매질, 특히 공장, 회장 및 맹장 매질 속에서의 안정성과 관련하여, 서열 번호: 1의 야생형 VIM-2와 비교하여 개선된 특성을 또한 나타낼 수 있으며, 이는 단백질 샘플(정제된 효소 포함)을 장 매질, 예를 들면, 공장 매질 속에서 항온처리한 후 효소 잔류 활성을 모니터링함으로써 측정할 수 있다. 효소 잔류 활성을 모니터링하기 위한 대표적인 수단은 예를 들면, 하기 및 실시예 단락에 기술된 것들을 포함한다.
본 발명에 따른 VIM-2 변이체는 또한 하나 이상의 베타-락탐 물질(들)(예컨대, 구체적인(specific) 베타-락탐 항생제(들))에 있어서 이의 촉매 활성(catalytic activity)과 관련하여, 서열 번호: 1의 야생형 VIM-2에 의해 나타낸 활성과 비교하여 개선된 특성을 나타낼 수 있으며, 이는 시험관내 효소 검정으로 측정될 수 있고, 여기서 베타-락탐 기질 농도의 시간-의존적 변화(가수분해율)는 야생형 VIM-2 또는 VIM-2 변이체를 함유하는 단백질 샘플의 존재하에서 분광광도계적으로 모니터링된다.
본 발명에 따른 VIM-2 변이체는 재조합체 세균 또는 다른 적합한 숙주에서 이의 증가된 생산 수준과 관련하여, 서열 번호: 1의 야생형 VIM-2의 생산 수준과 비교하여, 개선된 특성을 나타낼 수 있으며, 이는 시험관내 효소 검정, 예를 들면, 야생형 VIM-2 또는 이의 변이체를 생산하는 세균 배양물로부터 수득된 추출물을 사용하여 위에서 기술된 바와 같이 수행된 검정으로 측정할 수 있다. 특수한 구현예에서, 추출물은 세포 또는 세균 분해 후 조 추출물로서 또는 세포(원핵 또는 진핵세포) 배양 배지(분비된 효소의 경우) 속에서 조 추출물로서 수득된다. 모든 이들 방법은 또한 정제된 효소에서 시행될 수 있다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 번호: 3 내지 서열 번호: 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
VIM-2 Q34R Q22H(서열 번호: 3)
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VIM-2 Q34R Q22N(서열 번호: 4)
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VIM- 2 Q34R E130D (서열 번호: 5)
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VIM-2 Q34R E130D Q22N (서열 번호: 6)
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VIM-2
Q34R
E130D
Q22H
(서열 번호: 7)
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VIM-2 Q34R Q22H DCT236 (서열 번호: 8)
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VIM-2 Q34R Q22N DCT236 (서열 번호: 9)
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VIM-2 Q34R E130D DCT236 (서열 번호: 10)
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VIM-2
Q34R
E130D
Q22N
DCT236
(서열 번호: 11)
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VIM-2 Q34R E130D Q22H DCT236 (서열 번호: 12)
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특수한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 V1M 치환을 추가로 포함하는, 서열 번호: 3 내지 12 중 어느 하나의 VIM-2 베타-락타마제의 기능성 변이체이다. 따라서, 본 발명은 또한 서열 번호; 13 내지 22에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드에 관한 것이다.
VIM-2 V1M Q34R Q22H(서열 번호: 13)
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VIM-2 V1M Q34R Q22N(서열 번호: 14)
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VIM-2 V1M Q34R E130D (서열 번호: 15)
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VIM-2 V1M Q34R E130D Q22N (서열 번호: 16)
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VIM-2 V1M Q34R E130D Q22H (서열 번호: 17)
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VIM-2 V1M Q34R Q22H DCT236 (서열 번호: 18)
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VIM-2 V1M Q34R Q22N DCT236 (서열 번호: 19)
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VIM-2 V1M Q34R E130D DCT236 (서열 번호: 20)
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VIM-2 V1M Q34R E130D Q22N DCT236 (서열 번호: 21)
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VIM-2 V1M Q34R E130D Q22H DCT236 (서열 번호: 22)
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본 발명은 또한 본 발명의 VIM-2 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 핵산 서열, 이를 포함하는 핵산 작제물(nucleic acid construct), 본 발명에 따른 핵산 서열 또는 핵산 작제물을 포함하는 재조합 바이러스 또는 숙주 세포(원핵 및 진핵 세포), 및 이들의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특수한 구현예에서, 조성물은 경구 투여가능하며 이를 필요로 하는 대상체의 장의 요구되는 부위에서 폴리펩타이드를 방출할 수 있다. 바람직하게는, 요구되는 부위는 공장(jejunum), 회장(ileum), 맹장(caecum) 또는 결장(colon)이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 투여되어 상기 대상체의 장의 바람직한 부위에서 폴리펩타이드를 방출할 수 있는 폴리펩타이드를 생산하는 재조합체 숙주 세포, 원핵 또는 진핵세포, 또는 유기체에 관한 것이다. 바람직하게는, 폴리펩타이드는 회장, 맹장 또는 결장, 바람직하게는 맹장 또는 결장에서 방출된다.
본 발명의 추가의 국면은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 베타-락탐 화합물, 예를 들면, 베타-락탐 항생제의 별개의, 순차적인 또는 동시 투여를 위한 부품의 키트(kit-of-parts)이며, 상기 항생제는 상기 부품의 키트의 폴리펩타이드에 대해 민감성이다. 특수한 구현예에서, 폴리펩타이드 및 항생제 둘 다는 경구 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 폴리펩타이드 및 항생제는 상이한 경로로 투여되는데, 예를 들면, 폴리펩타이드는 경구 투여될 수 있고 항생제는 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사와 같은 주사에 의해, 비경구적으로 투여될 수 있다. 특수한 구현예에서, 폴리펩타이드는 항생제 전 또는 후, 특히 전에 투여된다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 이식하는 치료요법의 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, VIM-2 변이체인, 본 발명의 폴리펩타이드를 제공한다. 보다 구체적으로 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 베타-락탐 항생제를 불활성화시키기 위한 방법에서, 상기 폴리펩타이드 또는 조성물 또는 이들을 함유하는 부품의 키트의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 베타-락탐 항생제에 대해 민감한 세균에 의해 유발된 세균 감염의 치료 방법에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 또는 부품의 키트의 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 세균 감염은 본 발명의 폴리펩타이드와 상기 폴리펩타이드에 대해 민감한 베타-락탐 항생제의 조합을 사용함으로써, 베타-락탐항생제 덕분에 상기 감염이 치료되는 한편 어떠한 원치않은 잔류 항생제도 장, 및 특수한 구현예에서 특히 공장, 회장, 맹장 및 결장으로부터 제거된다. 당해 특수한 구현예에서, 폴리펩타이드는 이러한 세균 감염 치료가 요구되는 대상체의 장의 바람직한 부위에서 폴리펩타이드를 방출할 수 있는 조성물로 바람직하게 제형화되며, 여기서 상기 장의 바람직한 부위는 바람직하게는 공장, 회장, 맹장 또는 결장이고, 가장 바람직하게는 회장, 맹장 또는 결장이다. 폴리펩타이드는 이러한 세균 감염 치료가 요구되는 대상체에게 경구 투여되어 장의 바람직한 부위, 특히, 회장, 맹장 또는 결장 내에서 폴리펩타이드를 방출하는 재조합체 숙주 세포(원핵 또는 진핵 세포) 또는 유기체에 의해 생산될 수 있다.
도면의 도해
도 1은 새끼 돼지 회장 매질 속에서 0, 30, 60, 90, 120 및 240분 후 야생형 VIM-2 및 VIM-2[ Q22H,Q34R,E130D ] 변이체의 비 활성(specific activity)을 나타내는 그래프이다.
도 1은 새끼 돼지 회장 매질 속에서 0, 30, 60, 90, 120 및 240분 후 야생형 VIM-2 및 VIM-2[ Q22H,Q34R,E130D ] 변이체의 비 활성(specific activity)을 나타내는 그래프이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 VIM-2 메탈로-베타-락타마제의 신규 변이체를 제공한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 1과 비교하여 VIM-2로부터 적어도 2개의 아미노산 변형이 상이하다는 점에서 서열 번호: 1에 나타낸 VIM-2의 서열과 동일하지 않다.
서열 번호: 1에 나타낸 서열은 N-말단 시그날 펩타이드(signal peptide) 절단된 야생형 VIM-2의 아미노산 서열(즉, 이의 시그날 펩타이드가 없는 야생형 VIM-2의 서열)이다.
서열 번호: 1:
VDSSGEYPTVSEIPVGEVRLYQIADGVWSHIATQSFDGAVYPSNGLIVRDGDELLLIDTAWGAKNTAALLAEIEKQIGLPVTRAVSTHFHDDRVGGVDVLRAAGVATYASPSTRRLAEVEGNEIPTHSLEGLSSSGDAVRFGPVELFYPGAAHSTDNLVVYVPSASVLYGGCAIYELSRTSAGNVADADLAEWPTSIERIQQHYPEAQFVIPGHGLPGGLDLLKHTTNVVKAHTNRSVVE
따라서, 당해 서열은 이의 N-말단 끝에서 발린 잔기로 시작한다. 그러나, 본 발명의 특수한 구현예에서, 당해 첫번째 발린 잔기는 메티오닌 잔기로 대체될 수 있다. 예를 들면, VIM-2 단백질 또는 이의 변이체가 발현 카세트로부터 N-말단 시그날 펩타이드없이 생산되는 경우, 메티오닌 잔기를 암호화하는 개시 코돈은 발린 잔기를 암호화하는 코돈 대신에 VIM-2 또는 VIM-2 변이체 암호화 유전자에 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 특수한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 V1M 치환을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 공유하며, 상기 폴리펩타이드는 야생형 VIM-2 효소와 비교하여 다음의 특성들 중 하나 이상을 갖는다: (i) 프로테아제(특히 분해성 프로테아제)에 대한 개선된 내성, (ii) 증진된 안정성(특히 열 안정성 및/또는 장 매질 속에서의 안정성), (iii) 베타-락탐 화합물, 특히 베타-락탐 항생제에 있어서 개선된 작용 스펙트럼, (즉, 본 발명의 폴리펩타이드는 야생형 VIM-2 효소와 비교하여 보다 큰 수의 상이한 베타-락탐 화합물(예를 들면, 항생제)를 불활성화시킬 수 있거나, 이는 야생형 VIM-2 효소에 대해 민감하지 않은 베타-락탐 화합물을 불활성화시킬 수 있다), (iv) 개선된 효소 활성(특히 감소된 항생제 불활성화 시간), 및 (v) 개선된 생산 수율.
본 발명의 변이체 폴리펩타이드는 34번 위치 및, 22번 및 130번 위치들로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서의 치환을 포함하며, 여기서 상기 위치들은 서열 번호: 1에 나타낸 아미노산 위치에 상응한다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 폴리펩타이드는 22번 및 34번 위치 또는 34번 및 130번 위치에서의 치환을 포함하며, 여기서 상기 위치는 서열 번호: 1에 나타낸 아미노산 위치에 상응한다. 특수한 구현예에서, 본 발명의 변이체 폴리펩타이드는 22번, 34번 및 130번 위치로부터 선택된 적어도 2개의 위치에서의 치환을 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 변이체 폴리펩타이드는 22번, 34번 및 130번에서의 변형을 포함하며, 여기서 상기 위치는 서열 번호; 1의 VIM-2 베타-락타마제의 아미노산 위치에 상응한다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 22번 위치에서의 치환은 Q22H 또는 Q22N이다. 다른 구현예에서, 34번 위치에서의 치환은 Q34R이다. 다른 구현예에서, 130번 위치에서의 치환은 E130D이다.
특수한 구현예에서, 변이체 폴리펩타이드는 다음의 치환을 포함한다:
Q22H, N; 및
Q34R; 및
E130D.
본 발명의 맥락에서, 번호매긴 위치 다음의 쉼표(,)는 상기 위치에서 대안적 변형을 나타낸다. 예를 들어, "22H, N"은 서열 번호: 1에서 22번 위치의 아미노산이 H 또는 N으로 대체될 수 있음을 의미한다.
광범위한 베타-락탐 항생제에 대한 장 안정성 및 비 활성을 개선시키기 위한 특수한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 22N 및 34R 치환을 포함한다.
광범위한 베타-락탐 항생제에 대한 장 안정성 및 비 활성을 개선시키기 위한 특수한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 22H 및 34R 치환을 포함한다.
광범위한 베타-락탐 항생제에 대한 장 안정성 및 효소 활성을 개선시키기 위한 특수한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 34R 및 130D 치환을 포함한다.
광범위한 베타-락탐 항생제에 대한 장 안정성 및 비 활성을 개선시키기 위한 특수한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 22H, 34R 및 130D 치환을 포함한다.
광범위한 베타-락탐 항생제에 대한 장 안정성 및 비 활성을 개선시키기 위한 특수한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 22N, 34R 및 130D 치환을 포함한다.
본 발명에서, 아미노산은 하기 표에 요약한 바와 같이 잘-알려진 3문자 코드 또는 1문자 코드를 사용하여 나타낸다.
| 아미노산 | 3 문자 코드 | 1 문자 코드 |
| 알라닌 | ala | A |
| 아르기닌 | arg | R |
| 아스파라긴 | asn | N |
| 아스파라긴 | asp | D |
| 시스테인 | cys | C |
| 글루탐산 | glu | E |
| 글루타민 | gln | Q |
| 글리신 | gly | G |
| 히스티딘 | his | H |
| 이소루이신 | ile | I |
| 루이신 | leu | L |
| 라이신 | lys | K |
| 메티오닌 | met | M |
| 페닐알라닌 | phe | F |
| 프롤린 | pro | P |
| 세린 | ser | S |
| 트레오닌 | thr | T |
| 트립토판 | trp | W |
| 타이로신 | tyr | Y |
| 발린 | val | V |
본 발명에 따라서, 베타-락타마제는 베타-락타마제 활성을 갖는 폴리펩타이드, 즉, 베타-락탐 항생제(예컨대, 페니실린, 세팔로스포린, 카르바페넴, 페남 설폰)와 같은 화합물 속에서 발견된 베타-락탐 환의 아미드 결합의 비가역적인 가수분해를 촉매하여 이의 항세균 활성이 결여된 가수분해된 분자를 생성하는 효소이다.
본 발명의 맥락에서, VIM-2 베타-락타마제는 서열 번호: 1에 나타낸 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 당해 효소는 2000년도에 Poirel et al. 에 의해(Characterization of VIM-2, a carbapenem-hydrolyzing metallo-beta-lactamase and its plasmid- and integron-borne gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in France; Antimicrob. Agents Chemother. 2000 ; 44(4): 891-7)에 기술되어 있으며 Docquier et al. in 2003 (On functional and structural heterogeneity of VIM-type metallo-beta-lactamases. J. Antimicrob. Chemother. 2003; 51 :257-266)에 의해 추가로 특징화되어 있다.
본 발명의 VIM-2 변이체의 활성은 다수의 검정에 의해 시험될 수 있다. 예를 들면, 시험관내 효소 검정이 시행될 수 있으며, 여기서 베타-락타마제 화합물 가수분해의 가수분해율은 야생형 VIM-2 또는 VIM-2 변이체를 함유하는 단백질 샘플의 존재하에서 분광광도계적으로 측정된다. 구체적으로, 용액(50 μM ZnSO4이 보충된, 50 mM HEPES 완충액 pH 7.5와 같은 적합한 완충액 사용) 속에서 베타-락탐 화합물 및/또는 이의 가수분해 생성물의 농도는 기질 및/또는 생성물의 최대 흡광도에 상응하는 파장에서 UV-가시성 분광광도계 또는 마이크로웰 플레이트 판독기(microwell plate reader) 속에서 수반될 수 있다. 베타-락타마제의 존재하에서, 베타-락탐 기질 및/또는 생성물의 농도의 시간-의존적인 변화는 반응 속도에 상응할 것이다. 초기 가수분해율이 측정되는 경우([S]t 
[S]0), 당해 반응 속도(μM/분 또는 μM/s로 표시됨)는 검정된 샘플에서 효소 농도에 직접 비례한다. 또한, 초기 기질 농도에 대한 초기 속도의 변화는 헨리 미카엘리스-멘텐 방정식(Henri-Michaelis-Menten equation)으로 특징화되며 특수한 베타-락탐 화합물의 가수분해를 위한 효소의 역학적 매개변수(k cat 및 K M )를 계산하도록 한다. 따라서, 이러한 효소 분석에 측정된 초기 가수분해율의 측정은 샘플 속에서 특수한 기질 또는 이의 상대적인 흡광도에 대한 이의 우선적인 활성과 같은, VIM-2 변이체를 함유하는 샘플의 특징을 특성화하도록 한다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드가 분리될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 본원에 사용된 용어 "분리된(isolated)"은 SDS-PAGE에 의해 측정된 것으로서, 적어도 20% 순수한, 바람직하게는 적어도 40% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 60% 순수한, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 80% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 90% 순수한 및 심지어 가장 바람직하게는 적어도 95% 순수한 폴리펩타이드를 말한다. 특히, 폴리펩타이드가 "필수적으로 순수한 형태", 즉, 폴리펩타이드 제제가 이와 함께 천연적으로 관련되어 있는 폴리뉴클레오타이드, 폴리사카라이드 및 폴리펩타이드와 같은 다른 생화학적 성분을 필수적으로 함유하지 않는 것이 바람직하다. 이는 예를 들면, 폴리펩타이드를 잘 알려진 재조합 방법에 의해 및 전통적인 정제 방법에 의해 제조함으로써 달성될 수 있었다.
2개의 아미노산 서열 사이의 관련성은 매개변수 "동일성(identity)"에 의해 기술된다. 본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열의 정렬은 EMBOSS 패키지(http://emboss.org) 버젼 2.8.0으로부터 니들 프로그램(Needle program)을 사용하여 측정된다. 니들 프로그램은 Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453에 기술된 전세게적인 정렬 알고리즘을 시행한다. 사용된 치환 매트릭스는 BLOSUM62이고, 갭 개방 패널티(gap opening penalty)는 10이며, 갭 연장 패널티(gap extension penalty)는 0.5이다.
본 발명의 아미노산 서열과 청구범위에서 언급된 아미노산 서열(서열 번호: 1) 사이의 동일성 정도는 어느 것이든 가장 짧은, 본 "발명 서열"의 길이 또는 서열 번호: 1의 길이로 나눈, 2개 서열의 정렬내 정확한 일치의 수로서 계산된다. 당해 결과는 동일성 퍼센트로 나타낸다.
정확한 매치는 "본 발명 서열" 및 서열 번호: 1이 동일한 정렬의 위치에서 동일한 아미노산 잔기를 가지는 경우 일어난다. 서열의 길이는 서열 속의 아미노산 잔기의 수(예컨대, 서열 번호: 1의 1 내지 240번의 아미노산의 길이는 240개이다)이다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 서열 번호; 1에 대한 이들 특수한 펩타이드의 동일성 정도는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99%이다. 여전히 추가의 구현예에서, 서열 번호: 1에 대한 이들의 동일성 정도는 적어도 88.7%, 89.1%, 89.5%, 89.8%, 90.2%, 90.6%, 91%, 91.4%, 91.7%, 92.1%, 92.5%, 92.9%, 93.2%, 93.6%, 94%, 94.4%, 94.7%, 95.1%, 95.5%, 95.9%, 96.2%, 96.6%, 97%, 97.4%, 97.7%, 98.1%, 98.5%, 98.9%, 99.2% 또는 적어도 99.6%이다.
물론, 본 발명의 VIM-2 변이체는 또한 상기 구체적으로 확인된 것들과는 상이한 위치에서 서열 번호: 1에 대해 다수의 변형을 포함할 수 있다. 추가의 변형은 아미노산 치환, 결실 또는 삽입, 및 어떠한 수의 이러한 변형의 조합도 포함할 수 있다. 특수한 구현예에서, 본 발명의 VIM-2 변이체의 이러한 조합은 상기 구체적으로 확인된 것들 외에, 단백질의 아미노-말단 또는 카복시-말단 끝에 아미노산 결실을 포함한다. 예시적인, 비-제한적 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 번호: 1과 비교하여, 단백질의 카복시-말단 끝에 위치한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산이 결실될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명읜 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 237번 위치로부터의 카복시-말단 트렁케이션(truncation)을 나타낸다. 본 발명의 맥락에서, 이는, 서열 번호; 1의 아미노산 잔기 237 내지 240번이 본 발명의 수득되는 폴리펩타이드로부터 부재함을 의미한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 236 내지 240번 잔기의 카복시-말단 트렁케이션을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 235 내지 240번 잔기의 C-말단 트렁케이션을 나타낸다. 다른 예시적인, 비-제한적 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 번호: 1과 비교하여, 즉, N-말단 시그날 펩타이드 절단을 겪은 야생형 VIM-2의 서열(즉, 이의 시그날 펩타이드가 없는 야생형 VIM-2의 서열)과 비교하여, 단백질의 아미노 말단 끝에 위치한 1개 또는 1개 이상(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산)이 결실될 수 있다. 당해 구현예의 구체적인 변형에서, 서열 번호: 1과 비교하여 아미노-말단 끝에 위치한 1개 또는 1개 이상의 아미노산이 결실된(또는 달리 기술하여, 트렁케이트된) 폴리펩타이드는 태그(tag) 또는 시그날 펩타이드와 같은, 하기 정의된 바와 같은 삽입 또는 연장을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "삽입"은 아미노- 및/또는 카복시-말단 연장을 또한 포괄하는 것으로 의도된다. 특수한 구현예에서, N-말단 연장은 본 발명의 폴리펩타이드에 시그날 펩타이드의 첨가를 포함할 수 있다. 이는 아미노산 서열 MFKLLSKLLVYLTASIMAIASPLAFS(서열 번호: 2)를 갖는 야생형 VIM-2의 천연 시그날 펩타이드 또는 야생형 VIM-2의 것과 비교하는 경우 치환 L9S, L9F, L9W, V10I, L12C, A14V, I16T, M17L, I19M, I19T, F25C, 또는 상기 언급된 치환의 어떠한 조합을 갖는 변형된 시그날 펩타이드, 또는 어떠한 다른 적절한 시그날 펩타이드, 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
대표적인 N-말단 또는 C-말단 연장은 야생형 VIM-2 또는 이의 어떠한 변이체와의 융합체로 클로닝된 DNA 단편에 의해 암호화된 "태그(tag)" 펩타이드와 같은, 비-천연적으로 존재하는 아미노산(들)의 첨가를 포함할 수 있으며, 이는 본 발명의 폴리펩타이드의 확인 및/또는 정제를 촉진시키도록 한다. 이러한 적절한 태그는 예를 들면, 당해 분야에 공지된 바와 같은, 히스티딘 태그(6 x His) 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 또는 말토즈-결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 동일한 항생제에 대해 서열 번호: 1의 야생형 VIM-2에 의해 나타난 비 활성과 비교하여 개선된, 제공된 베타-락탐 항생제에 대해 비 활성을 나타낼 수 있다. 특수한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 함유하는 단백질 샘플의 1mg당 및 시간 단위당 가수분해된 기질의 nmole로 표시된 비활성은 실시예 단락에서 기술된 동일한 과정을 사용하여 측정된 서열 번호: 1의 야생형 VIM-2의 비 활성에 비해 적어도 105%이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 상대적인 비 활성은 여전히 서열 번호: 1의 야생형 VIM-2의 비 활성에 대해 적어도 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800 또는 심지어 적어도 1600%이다.
추가의 특수 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 번호: 3 내지 22 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 베타-락타마제 활성을 갖는 이의 단편(예를 들면, 서열 번호: 3 내지 22 중 어느 하나의 폴리펩타이드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개, 또는 7개 이상의 이의 C-말단 아미노산을 결여한 단편), 특히 위에서 기술한 바와 같이 아미노산 237-240번, 236-240번 또는 235-240을 결여한 단편을 포함하거나, 이로 이루어진다. 당해 구현예의 변형에서, 시그날 펩타이드가 없는 폴리펩타이드는 추가의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 당해 구현예의 변형에서, 폴리펩타이드는 이의 N-말단 끝에 시그날 펩타이드(예를 들면, 서열 번호: 2에 나타낸 시그날 펩타이드 또는 위에서 정의한 바와 같은 이의 어떠한 변이체)를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 VIM-2 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
용어 "분리된 핵산 서열"은 다른 핵산 서열을 필수적으로 함유하지 않는, 예컨대, 아가로즈 겔 전기영동 또는 어떠한 다른 적절한 방법에 의해 측정된 것으로서 적어도 약 20% 순수하고, 바람직하게는 적어도 약 40% 순수하며, 보다 바람직하게는 적어도 약 60% 순수하고, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 순수하며, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 순수한 핵산 서열을 말한다. 예를 들면, 분리된 핵산 서열은 이의 천연 위치로부터 이것이 재생될 상이한 부위로 핵산 서열을 재위치시키는 유전 공학에 사용된 표준 클로닝 과정에 의해 수득될 수 있다. 당해 클로닝 과정은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 바람직한 핵산 단편의 절제 및 분리, 벡터 분자내로 단편의 삽입, 및 핵산 서열의 다중 카피 또는 클론이 복제될 숙주 세포내로의 재조합체 벡터의 혼입을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 게놈성, cDNA, RNA, 반합성, 합성 기원, 또는 이의 어떠한 조합일 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 적어도 하나의 돌연변이를 서열 번호: 1의 야생형 VIM-2를 암호화하는 주형 서열(template sequence) 또는 이의 소서열(subsequence) 내로 도입시킴으로써 제조할 수 있으며, 여기서 돌연변이체 핵산 서열은 변이체 VIM-2 폴리펩타이드를 암호화한다. 핵산 서열 내로 돌연변이를 도입하여 하나의 뉴클레오타이드를 다른 뉴클레오타이드로 교환하는 것은 당해 분야에 공지된 어떠한 방법, 예컨대, 부위-지시된 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 도핑되거나, 스파이크되거나, 국재화된 무작위 돌연변이유발에 의해 달성될 수 있다.
무작위 돌연변이유발은 문제의 아미노산 서열로 해독되는 유전자의 적어도 3개의 부분에서, 또는 전체 유전자 내에서 국재화되거나 영역-특이적인 무작위 돌연변이유발로서 적합하게 수행된다. 돌연변이유발이 올리고뉴클레오타이드의 사용에 의해 수행되는 경우, 올리고뉴클레오타이드는 변화될 위치에서 올리고뉴클레오타이드의 합성 동안 3개의 비-모체(non-parent) 뉴클레오타이드로 도핑되거나 스파이크될 수 있다. 도핑 또는 스파이킹은 원치않은 아미노산에 대한 코돈이 피해지도록 수행될 수 있다. 도핑되거나 스파이킹된 올리고뉴클레오타이드는 예컨대, PCR, LCR 또는 어떠한 DNA 폴리머라제 및 리가제, 또는 적절한 것으로 고려되는 토포이소머라제와 같은, 다른 DNA 프로세싱/변형 효소를 사용하는 어떠한 기술에 의해서도 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 내로 혼입될 수 있다.
바람직하게는, 도핑은 "불변 무작위 도핑(constant random doping)"을 사용하여 수행되며, 여기서 각각의 위치에서 야생형 및 돌연변이의 퍼센트가 예측된다. 또한, 도핑은 특정 뉴클레오타이드의 도입을 위한 선호도, 및 이에 의한 하나 이상의 특이적인 아미노산 잔기의 도입에 대한 선호도에 관한 것이다. 도핑은 예컨대, 각각의 위치에서 90% 야생형 및 10% 돌연변이가 도입되도록 이루어질 수 있다. 도핑 계획의 선택에서 추가의 고려사항은 유전적 및 단백질-구조적 구속을 기반으로 한다.
무작위 돌연변이유발은 유리하게는 문제의 모 VIM-2 서열의 일부에 유리하게 국재화될 수 있다. 이는, 예컨대, 효소의 특정 영역이 효소의 제공된 특성에 특히 중요한 것으로 확인된 경우 유리할 수 있다.
본 발명의 변이체를 제공하는 대안적 방법은 예컨대, WO 95/22625 또는 WO 96/00343에 기술된 바와 같은, 유전자 셔플링(gene shuffling) 및 EP 897985에 기술된 바와 같은 컨센서스 유도 공정(consensus derivation process)를 포함한다.
본 발명은 또한 대조군 서열과 혼용성인 조건 하에서 적합한 숙주세포 내에서 암호화 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물에 관한 것이다. 용어 "발현"은 전사, 전사-후 변형, 해독, 해독-후 변형, 및 분비를 포함하나, 이에 한정되지 않는 폴리펩타이드의 생산에 관여한 어떠한 단계도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "핵산 작제물"은 천연적으로 존재하는 유전자로부터 분리되거나 그렇지 않으면 천연에 존재하지 않을 수 있는 방식으로 핵산의 분절을 함유하도록 변형된, 일본쇄 또는 이본쇄의 핵산 분자를 말한다. 용어 핵산 작제물은 핵산 작제물이 본 발명의 암호화 서열의 발현에 요구되는 조절 서열을 함유하는 경우 용어 "발현 카세트"와 동의어이다. 특수한 구현예에서, 핵산 작제물 또는 발현 카세트는 플라스미드(예를 들면, 발현 플라스미드) 내에 포함된다.
용어 "조절 서열"은 본원에서 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현에 필수적이거나 유리한 모든 성분을 포함하는 것으로 정의된다. 각각의 조절 서열은 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 천연 또는 외부의 것일 수 있다. 이러한 조절 서열은 리더(leader), 오퍼레이터(operator), 프로펩타이드 서열, 프로모터, 전사 개시 서열, 해독 개시 서열, 시그날 펩타이드 서열, 해독 종결 서열, 폴리아데닐화 서열 및 전사 종결인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 최소한, 조절 서열은 프로모터, 및 전사 종결 시그날, 및 해독 개시 및 종결 시그날을 포함한다. 조절 서열은 조절 서열과 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 암호화 영역의 연결을 촉진하는 특이적인 제한 부위를 도입할 목적으로 링커(linker)와 함께 제공될 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된"은 본원에서 조절 서열이 폴리뉴클레오타이드 서열의 암호화 서열에 대해 적절한 위치에 위치함으로써 조절 서열이 폴리펩타이드의 암호화 서열의 발현을 지시하는 구조를 나타낸다.
본원에 사용되는 경우, 용어 "암호화 서열"(CDS)은 이의 단백질 생성물의 아미노산 서열을 직접 규정하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 암호화 서열의 경계는 일반적으로 개방 판독 프레임(open reading frame)에 의해 결정되며, 이는 일반적으로 ATG 출발 코돈 또는, GTG 및 TTG와 같은 대안적 출발 코돈으로 시작하며, 일반적으로 TAA, TGA 또는 TAG와 같은 종결 코돈(stop codon)으로 종결된다. 암호화 서열은 DNA, cDNA로 이루어질 수 있으며; 이는 천연, 반합성 또는 합성일 수 있고; 이는 또한 비천연 또는 변형된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다.
용어 "발현"은 전사, 전사후 변형, 해독, 해독 후 변형 및 분비를 포함하나, 이에 한정되지 않는 폴리펩타이드의 생산에 포함된 어떠한 단계도 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 본원에서 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 선형 또는 환형의 DNA 분자로서 정의되며, 이는 이의 발현을 위해 제공되는 추가의 뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 전형적으로 프로모터, 오퍼레이터, 리보소옴 결합 부위, 해독 개시 시그날, 및 임의로, 리프레서 유전자(repressor gene) 또는 다양한 활성인자 유전자를 암호화하는 조절 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하여 발현시킬 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 수반하는 재조합체 발현 벡터는 편리하게는 재조합 DNA 과정에 속할 수 있는 어떠한 벡터일 수 있으며, 벡터의 선택은 흔히 이것이 도입될 숙주 세포에 의존할 것이다. 벡터는 숙주 세포내로 도입되는 경우, 숙주 세포 게놈내로 통합되어 이것이 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다. 이는 또한 플라스미드와 같이, 자가 복제하는 염색체외 DNA 분자로서 세포 속에 남아있을 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, "숙주 세포"는 어떠한 세포 유형, 원핵 또는 진핵 세포도 포함하며, 이는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 작제물을 사용한 형질전환, 형질감염, 형질도입, 감염 등에 민감할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합체 숙주 세포에 관한 것이며, 이는 폴리펩타이드의 재조합 생산에 유리하게 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 숙주 세포내로 도입됨으로써 벡터가 염색체 구성 요소(integrant)로서 또는 자가-복제하는 염색체외 벡터로서 유지되도록 한다. 용어 "숙주 세포"는 복제 동안에 발생하는 돌연변이로 인하여 모 세포와 동일하지 않는 모 세포의 어떠한 자손도 포함한다. 숙주 세포의 선택은 폴리펩타이드 및 이의 공급원을 암호화하는 유전자에 큰 정도로 의존할 것이다.
숙주 세포는 단세포 또는 다세포 유기체로 이루어지고 이로부터 기원할 수 있으며, 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다.
유용한 단세포 미생물 중에는 바실러스(Bacillus) 세포, 예컨대, 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 시르쿨란스( Bacillus circulans), 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 라우투스(Bacillus lautus), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 스테아로서모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 바실러스 투링지엔시스(Bacillus thuringiensis) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 세포, 예컨대, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 및 스트렙토마이세스 무리누스(Streptomyces murinus)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 그람-양성 세균, 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 슈도모나스 아종(Pseudomonas spp)과 같은 그람-음성 세균과 같은 세균 세포가 있다.
세균 숙주 세포내로의 벡터의 도입은 예를 들면, 원형질체 형질전환에 의해(참고: 예컨대, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), 화학적 형질전환 또는 전기천공(electroporation)(참고: 예컨대, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751)을 포함하나 이에 한정되지 않는 형질전환의 어떠한 방법도 사용하여, 수용성 세포(competent cell)를 사용한 DNA 형질전환에 의해(참고: 예컨대, Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, 또는 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), 또는 접합(참고: 예컨대, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278)에 의해 수행될 수 있다.
숙주 세포는 또한 동물, 및 특히 포유동물, 곤충, 식물, 또는 이의 유도된 세포주와 같은 진핵 세포, 또는 단세포 진핵세포 또는 진균 세포로부터 기원할 수 있다. 재조합체 단백질은 또한 동물, 특히 포유동물, 또는 식물과 같은 다세포 유기체에서 생산될 수 있다.
특수한 구현예에서, 숙주 세포는 진균 세포일 수 있다. 특수한 구현예에서, 진균 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)이다. 특수한 구현예에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary cell)로부터 기원한 세포주이다.
진균 세포는 그 자체로 공지된 방식으로 원형질체 형성, 원형질체의 형질전환, 및 세포 벽의 재생을 포함하는 공정으로 형질전환시킬 수 있다. 효모는 Becker and Guarente, In Abelson, J. N. and Simon, M. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology 194: 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 및 Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920에 기술된 과정을 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 진균 세포는 또한 전기천공, 또는 DNA 분자를 세포내로 도입시키는 어떠한 다른 적합한 방법에 의해 형질전환시킬 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 숙주 세포를 폴리펩타이드의 생산에 대해 유도성인 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 생산 방법에서, 세포는 당해 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 폴리펩타이드의 생산에 적합한 영양 배지 속에서 배양된다. 예를 들면, 세포는 진탕 플라스크 배양, 및 소 규모 또는 대 규모 발효(연속식, 배취식, 공급-배취식, 또는 고체 상태 발효 포함)에 의해 적합한 배지 및 폴리펩타이드가 발현되고/되거나 분리되도록 하는 조건 하에서 수행된 실험실 또는 산업적 발효기 속에서 배양될 수 있다. 배양은 탄소 및 질소 공급원 및 무기 염을 포함하는 적합한 영양 배지 속에서 당해 분야에 공지된 과정을 사용하여 일어난다. 적합한 배지는 상업적 공급업자로부터 이용가능하거나 발표된 조성(예컨대, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)의 카탈로그)에 따라 제조할 수 있다. 일부 경우에, 숙주 세포의 성장 조건, 및 폴리펩타이드의 생산은 명확하며; 제1 상에서 숙주 세포는 적절한 조건 하에서 크게 증가되도록 하며, 제2 상에서 조건들은 폴리펩타이드의 최적 생산을 허용하도록 변화될 수 있다. 폴리펩타이드가 영양 배지내로 분비되는 경우, 폴리펩타이드는 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 폴리펩타이드가 분비되지 않는 경우, 이는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다.
수득되는 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 회수할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 원심분리, 여과, 추출, 흡착, 분무-건조, 증발, 또는 침전을 포함하나, 이에 한정되지 않는 통상의 과정에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱(chromatofocusing), 및 크기 배제), 전기영동 과정(예컨대, 예비 등전점 포커싱(preparative isoelectric focusing), 예비 겔 전기영동), 차등적 가용성(예컨대, 황산암모늄 침전) 또는 추출(참고: 예컨대, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989), 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 당해 분야에 공지된 다양한 과정에 의해 정제할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 적절한 조성물은 허용되는 담체와 함께, 위에서 정의한 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 조성물은 당해 분야에 잘 공지된 방법에 따라 제조할 수 있으며, 액체 또는 무수 조성물의 형태일 수 있다. 조성물은 글리세롤과 같은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 안정화시키는 성분을 추가로 포함할 수 있다.
특수한 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 조성물은 경구 투여가능하고 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상체의 위장관의 요구되는 부위에 방출할 수 있는 조성물의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 요구되는 부위는 위, 십이지장, 공장, 회장, 맹장 또는 결장이다. 바람직한 구현예에서, 장의 요구되는 부위는 공장, 회장, 맹장 또는 결장이고, 보다 바람직하게는 회장, 맹장 또는 결장이다. 후자의 경우, 조성물은 위액으로부터 본 발명의 폴리펩타이드를 보호하는 하나 이상의 위 내성 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 다른 것들 중에서 WO93/13795, WO2004/016248 또는 US20050249716에 기술된 약물 전달 시스템을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 장의 요구되는 부위내로 도입될 수 있고 상기 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상체의 장의 요구되는 부위내로 방출할 수 있는, 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는, 상기 기술된 바와 같은 숙주 세포 또는 유기체에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 장의 요구되는 부위는 회장, 맹장 또는 결장이며, 보다 바람직하게는 맹장 또는 결장이다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 치료요법의 방법에서 사용하기 위한, 위에서 정의한 바와 같은 숙주 세포 또는 유기체에 관한 것이며, 여기서 상기 숙주 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
위에 언급된 바와 같이, 본 발명의 VIM-2 폴리펩타이드 변이체는 다수의 치료학적 및 비-치료학적 용도에서 유용하다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 실시하는 치료요법의 방법을 개시하며, 여기서 상기 폴리펩타이드 또는 항생제와 함께 이를 함유하는 조성물 또는 부품의 키트, 또는 상기 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포 또는 유기체가 이를 필요로 하는 대상체에서 베타-락탐 항생제와 같은 베타-락탐 화합물을 불활성화시키기 위한 방법에서 사용된다. 상기 방법은 장 불균형, 내성 세균의 선택, 정상 소화 공정의 파괴, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)과 같은 기회적 장 병원균에 의한 콜로니화, 항생제 관련 설사 또는, 장 불균형과 관련된 다른 질환과 같은 항생제의 부작용을 치료하거나 예방하기 위해 시행된다.
본 발명은 또한 베타-락탐 항생제에 민감한 세균에 의해 유발된 세균 감염의 치료를 위한 방법에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물, 숙주 세포 또는 유기체, 또는 부품의 키트의 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 세균 감염은 본 발명의 폴리펩타이드 및, 당해 폴리펩타이드에 대해 민감한 베타-락탐 항생제의 조합을 사용하여 치료함으로써, 베타-락탐 항생제 덕분에 상기 감염이 치료되는 한편, 어떠한 원치않는 잔류 항생제도 본 발명의 폴리펩타이드 덕분에 제거된다. 이러한 특수한 구현예에서, 폴리펩타이드는 바람직하게는 이러한 세균 감염 치료가 요구되는 대상체의 장의 요구되는 부위에서 폴리펩타이드를 방출할 수 있는 조성물로 제형화되며, 여기서 장의 요구되는 부위는 바람직하게는 공장, 회장, 맹장 또는 결장이고, 가장 바람직하게는 회장, 맹장 또는 결장이다. 폴리펩타이드는 또한 상기 폴리펩타이드를 생산하는 숙주 세포 또는 유기체에 의해 장의 요구되는 부위 속에서 방출될 수 있으며, 여기서, 장의 요구되는 부위는 회장, 맹장 또는 결장이고, 바람직하게는 맹장 또는 결장이다. 특수한 국면에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물, 숙주 세포 또는 유기체, 또는 부품의 키트는 동물, 포유동물 또는 사람일 수 있는 대상체 속에서 세균 감염의 치료에 사용되며, 이에 의해 상기 폴리펩타이드에 대해 민감한 항생제는 상기 폴리펩타이드 또는 이의 조성물의 투여 전, 후 또는 이와 동시에 대상체에게 투여된다.
본 발명의 폴리펩타이드의 다른 용도는 환경 또는 환경 설정에서 항생제의 개선을 위한 폴리펩타이드의 용도와 같은 비-치료학적 용도를 포함한다. 이러한 용도 및 방법은 예를 들면, 환경 속에서 항생제의 개선을 위한 락카제, 셀룰라제 및 리파제의 용도를 기술하는 WO 2012/007536에서 찾을 수 있으며, 본원에서 본 발명의 폴리펩타이드를 사용하는 환경으로부터 베타-락탐 항생제의 제거를 위해 무타티스 무탄디스(mutatis mutandis)에 적용된다.
실시예
실시예 1: VIM-2 효소의 서열에서 목적한 위치의 측정
숙주 세포내에서 효소 활성, 이의 기질 프로파일, 이의 안정성 또는 이의 생산 수준과 관련된 아미노산 위치를 확인하기 위하여, 무작위 돌연변이유발을 사용하여 12개 이하의 돌연변이를 수반하는 bla VIM-2 유전자의 라이브러리를 생성시켰다. 이러한 목적을 위해, bla VIM-2 돌연변이체를 뉴클레오타이드 유사체의 존재하에서, 오류-경향이 있는 폴리머라제 쇄 반응(error-prone polymerase chain reaction)을 사용하여 도입하였다. 이후에, bla VIM-2-유도된 뉴클레오타이드 서열을 적합한 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 플라스미드 벡터내로 클로닝하고 다양한 치환(bla VIM-2 뉴클레오타이드 서열내 돌연변이의 도입으로부터 유도됨)을 수반하는 효소의 특성을 변이체를 생산하는 균주에 대해 베타-락탐의 MIC의 측정, 다양한 베타-락탐의 분해에 대한 비-가수분해 활성 및 변이체 효소의 안정성의 측정을 사용하여 분석하였다.
야생형 VIM-2에서 수행된 상기 기술된 실험으로부터, 다음의 위치가 VIM-2 서열에서 목적하는 위치로서 발견되었으며, 여기서 상기 위치들은 서열 번호: 1의 22, 34 및 130번 위치에 나타낸 베타-락타마제의 위치에 상응한다. 추가의 가능한 변형은 서열 번호: 1의 235번 위치에서의 잔기로 말단화되는 변이체를 생성하는, 236번 위치로부터 출발하고, 이를 포함하는 VIM-2의 C-말단 트렁케이션을 포함한다.
실시예 2: 하나의 VIM-2 변이체의 생산 및 정제
VIM-2 변이체를 에스케리키아 콜라이내에서 P lac-프로모터-계 시스템(pLB-II 고 카피 수 플라스미드 사용, Borgianni et al., Antimicrob. Agents Chemother.; 2010; 54:3197-3204에 기술된 바와 같음) 또는 T7 프로모터-계 발현 시스템(pET-9a 발현 플라스미드 사용)을 사용하여 생산하였다. 요약하면, 돌연변이체 bla VIM-2 유전자를 플라스미드 벡터 pLB-II 또는 pET-9a 내로 NdeI 및 BamHI 제한 부위를 사용하여 클로닝하고, 수득되는 플라스미드를 전기영동에 의해 이. 콜라이 DH5α 또는 BL21(DE3) 세포 내로 도입하였다. 수득되는 숙주 세포를 루리아-버타니 배지(Luria-Bertani medium) 또는 풍부한 자가-유도 세포 배양 배지 ZYP-5052(Studier, F. W. 2005. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41:207-234.)에서 24시간 동안 성장시키고, 배양 상층액을 원심분리로 정화하였다. 이후에, 수득되는 샘플을 원심분리로 농축시키고 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 위에 로딩하였다. 단백질을 선형 NaCl 구배를 사용하여 용출시키고, 활성 분획을 혼주(pooling)시키고 농축시켰다. 이후에, 단백질 샘플을 겔 여과 컬럼 위에 로딩하고 단백질을 50 μM ZnSO4이 보충된 50 mM HEPES(pH 7.5)로 용출시켰다. 이후에, 정제된 단백질을 1-2 mg/mL로 농축시키고 -20℃에서 저장하였다.
다음 실시예에서 특성화된 모든 변이체를 유사한 방법을 사용하여 생산하였다. 특히, 당해 생산 프로토콜은 다음의 변이체 VIM-2 효소를 생산하는데 성공적으로 사용되었다: VIM-2[Q34R], VIM-2[Q22H,Q34R,E130D].
유사한 방법 덕분에 생산될 수 있는 다른 변이체는 DCT236(236번 위치로부터 C-말단 결실됨), 및 VIM-2[Q34R] DCT236 및 VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236과 같은 이의 변이체이다.
실시예 3: 장 매질 속에서 VIM-2의 변이체의 증가된 안정성의 측정
VIM-2 변이체의 안정성을 측정하기 위하여, 다음의 과정을 적용한다; 정제된 단백질 샘플의 이미페넴-가수분해 활성을 새끼 돼지 또는 성체 돼지로부터 수집한 회장, 공장 및 맹장 매질 속에서 항온처리한 후 측정하였다. 변이체에 대한 비 활성(Sp. Act.)은 항온처리 동안 상이한 시점(0, 30, 60, 90, 120 및 240분)에서 측정하였다. 시간 t에서의 비 활성을 시간 t=0에서의 비 활성과 비교하여 장 매질 속에서 변이체의 활성의 손실을 평가하였다. 시간에 따른 변화는 초기 활성(t=0에서)과 후에 시간((Sp. Act. 변이체)t/(Sp. Act. 변이체)t=0에서 측정된 활성 사이의 비로 표시하였다. 1보다 더 작은 값은 장 매질 속에서 항온처리한 경우 활성의 손실로 나타낸다. 상이한 시점에서의 잔류 활성을 야생형 효소와 비교하여 일부 변이체의 장 매질 속에서 보다 큰 안정성을 평가하기 위해 비교한다.
회장 매질 속에서 항온처리된 경우 시간에 따른 야생형 VIM-2 효소 및 VIM-2 변이체 VIM-2[Q22H,Q34R,E130D]의 비 활성을 도 1에 나타낸다.
시간에 따른 활성의 손실은 또한 다음 표에서 요약한다:
| 회장 매질 속에서 x분 후의 잔류 활성 | 0 | 30 | 60 | 90 | 120 | 240 |
| 야생형 VIM-2 | 100% | 66% | 46% | 33% | 23% | 13% |
| VIM-2[Q22H,Q34R, E130D] 변이체 | 100% | 88% | 80% | 73% | 60% | 56% |
상기 표 또는 도 1에 나타낸 바와 같이, 야생형 효소는 회장 매질 속에서 240분 항온처리 후 이의 활성의 87%를 상실하였다. VIM-2[ Q22H,Q34R,E130D ] 변이체는 동일한 조건에서 이의 활성을 단지 44% 만 상실하였다.
치환 Q22G, Q34D, E130D 및 236번 아미노산 위치로부터 출발하여 C-말단 끝에서의 트렁케이션의 조합은 또한 산업적 관점에서 현저하게 개선된 특성을 지닌 변이체를 생성한다.
실시예
4: 다양한 베타-
락탐에 대한 제공된 VIM
-2
변이체의
비
효소적
활성 및/또는 촉매 활성의 측정
실시예 3에서 언급된 바와 같이 생산된 변이체 효소의 경우, 베타-락탐 항생제와 같은 특이적(specific) 베타-락탐 화합물에 대한 비(specific) 활성을 측정하는 것이 가능하다. 비 활성 측정은 이후 기술된 바와 같이 수행된다: VIM-2 변이체 및/또는 정제된 VIM-2 변이체를 함유하는, 앞서 기술된 바와 같은(Docquier J.-D. et al., J. Antimicrob. Chemother.; 2003; 51:257-266) 대수(log) 또는 정지 성장 상의 세균 배양물로부터 제조된, 조 추출물의 존재하에서 베타-락탐의 가수분해를 적합한 파장에서 분광광도계적으로 모니터링하였다. 비 활성은 샘플 속에서 총 단백질의 분 및 mg 당 가수분해된 베타-락탐 기질의 nmol로 표시될 수 있다.
다음에서, 모든 비 활성은 동일한 조건에서 측정된 야생형 효소의 비 활성에 대해 상대적으로 표시할 것이다.
VIM-2[ Q22H,Q34R,E130D ] 변이체의 경우, 측정된 비 활성은 다음과 같다:
| 효소 | 암피실린에 대한 (효소의 비활성/ 야생형 효소의 비 활성) |
| VIM-2 [WT] | 1 |
| VIM-2 [Q22H,Q34R,E130D] | 8.57 |
| 효소 | 피페라실린에 대한 (효소의 비활성/ 야생형 효소의 비활성) |
| VIM-2 [WT] | 1 |
| VIM-2 [Q22H,Q34R,E130D] | 5.86 |
| 효소 | 세프타지디메에 대한 (효소의 비활성/ 야생형 효소의 비활성) |
| VIM-2 [WT] | 1 |
| VIM-2 [Q22H,Q34R,E130D] | 9.97 |
|
|
이미페넴에 대한 (효소의 비활성/ 야생형 효소의 비활성) |
| VIM-2 [WT] | 1 |
| VIM-2 [Q22H,Q34R,E130D] | 6.15 |
| 효소 | 메로페넴에 대한 (효소의 비활성/ 야생형 효소의 비활성) |
| VIM-2 [WT] | 1 |
| VIM-2 [Q22H,Q34R,E130D] | 5.98 |
상기 결과는 VIM-2[Q22H,Q34R,E130D]를 함유하는 조 추출물이 야생형 효소와 비교하여 목적한 수개의 베타-락탐에 대해 강력하게 개선된 활성을 나타내었음을 나타낸다.
또한, 236번 아미노산 위치로부터 출발하는 트렁케이트된 C-말단 끝을 지닌 변이체는 개선된 특징을 나타낸다. 치환 Q22G, Q34D, E130D 및 상기 트렁케이션의 조합은 따라서 산업적 관점에서 현저하게 개선된 특성을 지닌 변이체를 생성한다.
특히, 변이체 VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236은 기질로서 이미페넴을 고려하는 경우 개선된 촉매 특성을 나타낸다:
| kcat | KM | kcat / KM | |
| VIM-2 WT | 34 | 9 | 3.8 |
| VIM-2[Q22H,Q34R,E130D] DCT236 | 85 | 13.5 | 6.3 |
SEQUENCE LISTING
<110> DA VOLTERRA
BIOASTER
<120> BETA-LACTAMASE VARIANTS
<130> IP20183465FR
<160> 22
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 240
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> wild-type VIM-2
<400> 1
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Gln Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Gln Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu
225 230 235 240
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VIM-2 signal peptide
<400> 2
Met Phe Lys Leu Leu Ser Lys Leu Leu Val Tyr Leu Thr Ala Ser Ile
1 5 10 15
Met Ala Ile Ala Ser Pro Leu Ala Phe Ser
20 25
<210> 3
<211> 240
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 3
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr His Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu
225 230 235 240
<210> 4
<211> 240
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 4
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Asn Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu
225 230 235 240
<210> 5
<211> 240
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 5
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Gln Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu
225 230 235 240
<210> 6
<211> 240
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 6
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Asn Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu
225 230 235 240
<210> 7
<211> 240
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 7
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr His Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu
225 230 235 240
<210> 8
<211> 235
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 8
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr His Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn
225 230 235
<210> 9
<211> 235
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 9
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Asn Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn
225 230 235
<210> 10
<211> 235
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 10
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Gln Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
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Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
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210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn
225 230 235
<210> 11
<211> 235
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 11
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Asn Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn
225 230 235
<210> 12
<211> 235
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 12
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr His Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn
225 230 235
<210> 13
<211> 240
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 13
Met Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr His Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu
225 230 235 240
<210> 14
<211> 240
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VIM-2 variant
<400> 14
Met Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Val Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Asn Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
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Claims (17)
- 서열 번호: 1에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 베타-락타마제 활성을 갖는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 34번 위치내에서의 및 22번 및 130번 위치로부터 선택된 적어도 하나의 위치내에서의 치환을 포함하고, 여기서 상기 위치가 서열 번호: 1이 나타내는 서열 내의 위치에 상응하는, 폴리펩타이드.
- 청구항 1에 있어서,
상기 폴리펩타이드가:
- 22번 및 34번 위치 각각에서의 치환;
- 34번 및 130번 위치 각각에서의 치환; 또는
- 22번, 34번 및 130번 위치 각각에서의 치환을 포함하는 폴리펩타이드. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
Q22H 또는 Q22N; Q34R; 및 E130D로부터 선택된 적어도 하나의 변형(modification)을 포함하는 폴리펩타이드. - 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호: 1의 제1 잔기가 메티오닌 잔기로 대체되는 폴리펩타이드. - 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
이의 N-말단 끝에서 시그날 펩타이드를 추가로 포함하는 폴리펩타이드. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호: 1에 나타낸 서열과 비교하여 이의 N-말단 또는 C-말단 끝에서 트렁케이션을 포함하는 폴리펩타이드. - 청구항 6에 있어서,
- 서열 번호: 1의 237 내지 240번 잔기의 C-말단 트렁케이션;
- 서열 번호: 1의 236 내지 240번 잔기의 C-말단 트렁케이션; 또는
- 서열 번호: 1의 235 내지 240번 잔기의 C-말단 트렁케이션을 포함하는 폴리펩타이드. - 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호: 3 내지 22 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 베타-락타마제 활성을 갖는 이의 단편을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드. - 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열.
- 적합한 발현 숙주 내에서 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결된, 청구항 9에 따른 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물(nucleic acid construct).
- 청구항 10에 따른 핵산 작제물을 포함하는 재조합체 숙주 세포.
- 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 조성물.
- 청구항 12에 있어서, 경구적으로 투여될 수 있고, 장의 요구되는 부위, 특히, 공장, 회장, 맹장 또는 결장에서 폴리펩타이드를 방출할 수 있는 조성물.
- (a) 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 청구항 12 또는 청구항 13에 따른 조성물; 및
(b) 상기 (a)의 폴리펩타이드에 대해 민감(sensitive)하거나 (a)의 조성물 속에 함유된 베타-락탐 항생제를 포함하는, 별개의, 순차적인 또는 동시 투여용의 부품의 키트(kit-of-parts). - 청구항 1 내지 청구항 8에 있어서,
의약으로서 사용하기 위한 폴리펩타이드. - 베타-락탐 항생제를 불활성화시키기 위한 방법에서 이를 필요로 하는 대상체에게 사용하기 위한, 또는 베타-락탐 항생제에 대해 민감한 세균에 의해 유발되는 세균 감염의 치료 방법에서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 청구항 12 또는 청구항 13의 조성물, 청구항 14의 부품의 키트 또는 청구항 11의 재조합체 숙주 세포.
- 세균 감염의 치료 방법에서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 청구항 12 또는 청구항 13의 조성물, 청구항 14의 부품의 키트 또는 청구항 11의 재조합 숙주 세포로, 상기 폴리펩타이드 또는 상기 조성물 또는 상기 숙주 세포가 상기 폴리펩타이드에 대해 민감한 베타-락탐 항생제와 함께 사용되기 위한, 폴리펩타이드, 조성물, 부품의 키트 또는 재조합 숙주 세포.
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