CN116949025A - 一种点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体及其应用 - Google Patents
一种点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体及其应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了一种点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体，在氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的NpPAL的基础上进行以下至少一种突变：N末端5～10个氨基酸对应突变为ApPAL的N末端5～10个氨基酸、N2K突变、I3T突变和T4L突变。经大肠杆菌重组表达收集的重组表达的蛋白为突变体，与NpPAL相比，所述突变体在酶催化苯丙氨酸为肉桂酸活性方面具有极大的提高，同时可溶性表达的产量方面也有较大的提升，为制备治疗苯丙酮尿症的药物提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体及其应用。
背景技术
苯丙酮尿症(PKU)是一种常染色体隐性遗传疾病，由于苯丙氨酸羟化酶(PAH)的功能丧失，导致患者体内苯丙氨酸水平升高、引发严重的神经损伤和心理健康障碍。自从首次尝试用低苯丙氨酸饮食治疗PKU患者以来，PKU的治疗已经取得了许多进展。尽管已经尝试开发PAH作为一种酶替代疗法，但对四氢生物蝶呤辅因子的需要以及这种酶在肝细胞细胞质中的长期驻留使PAH成为一种不太可能的治疗方法。美国食品药品监督管理局(FDA)于2018年批准来自多变鱼腥藻(Anabaenavariabilis)(Palynziqs，BioMarinPharmaceuticalInc.)的聚乙二醇化重组苯丙氨酸解氨酶(PEGylated recombinatedphenylanineammonialyases)来治疗PKU。作为一种酶替代疗法，苯丙氨酸解氨酶(PAL)可以有效地将L-苯丙氨酸转化为无毒的反式肉桂酸，并降低PKU患者血液中升高的L-苯丙氨酸水平。此外，稳定的PAL可作为潜在的治疗酶用于癌症治疗，因为它对不同类型的细胞具有显著的细胞毒性作用。
到目前为止，已经报道了多变鱼腥草、点形念珠藻和一些其他来源的PAL的晶体结构。酵母、蓝藻和植物中最常见的具有同源四聚体活性的PAL结构的晶体学结构证实了亲电辅基4-亚甲基咪唑-5-酮(MIO)对催化活性至关重要。MIO是通过高度保守的Ala-Ser-Gly(丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸)基序的自发环化和脱水形成的，该基序攻击底物以促进氨的消除，而不需要外源辅因子。在同源四聚体中，四个相同的活性位点中的每一个都由三个不同的单体亚基形成。在结构上，PAL单体主要由α-螺旋组成，中心束有五个α-螺旋。一个长发夹环连接最后两个螺旋，在同源四聚体的核心形成亚单位间界面。
与真核PAL的现有结构相比，蓝藻来源的PAL，例如多变鱼腥藻来源的PAL(AvPAL)和点形念珠藻来源的PAL(NpPAL)中缺失两个片段，即长N端延伸和C端附近插入的屏蔽结构域。研究表明，长的N端延伸可以影响活性位点盖环的构象，影响PAL的稳定性和活性，并且插入的屏蔽结构域与PAL热稳定性有关。AvPAL和NpPAL的N末端基序构成了含有MIO假体基团的亚结构域的大部分。然而，蓝藻PAL的N-末端片段的功能仍然未知。尽管AvPAL和NpPAL具有高度的序列同一性和三级结构，但它们在大肠杆菌中的活性和可溶性异源表达产量存在显著差异。鉴于AvPAL作为治疗剂在治疗苯丙酮尿症中的巨大重要性，因此需要对NpPAL蛋白进行改造，以便生产可溶性和活性重组蛋白用于疾病的治疗中。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体，与原始NpPAL相比，在酶活性以及可溶性表达方面均有显著的提高。
本发明提供了一种点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体，在氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的NpPAL的基础上进行以下至少一个位点的突变：N2K突变、I3T突变、T4L突变、L6Q突变、Q7A突变和N9S突变。
优选的，当有三个位点同时发生突变时，苯丙氨酸解氨酶突变体为5-Av-NpPAL；10-Av-NpPAL；
所述5-Av-NpPAL的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
当有6个位点同时发生突变时，所述苯丙氨酸解氨酶突变体为10-Av-NpPAL；
所述10-Av-NpPAL的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
优选的，当仅有一个位点发生突变时，所述苯丙氨酸解氨酶突变体包括NpPAL-N2K、NpPAL-I3T和NpPAL-T4L；
NpPAL-N2K的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
NpPAL-I3T的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
NpPAL-T4L的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
本发明提供了一种编码所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体的基因。
优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10和SEQ ID NO:12所示。
本发明提供了一种重组表达载体，包含有所述基因的表达载体。
本发明提供了一种重组工程菌株，包含所述基因或所述重组表达载体。
本发明提供了一种所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
将所述基因或所述重组表达载体导入宿主菌株中，经培养和诱导表达，分离重组蛋白。
本发明提供了一种治疗苯丙酮尿症的药物，包括所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体和辅料。
本发明提供了所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体、所述重组表达载体、所述重组工程菌株或所述制备方法制备得到的点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体在制备预防和/或治疗苯丙酮尿症的药物中的应用。
本发明提供了一种点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体，在氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的NpPAL的基础上进行以下至少一个位点的突变：N2K突变、I3T突变、T4L突变、L6Q突变、Q7A突变和N9S突变；所述ApPAL的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。实验证明经过上述突变改造后，本发明提供的突变体在酶催化活性方面较NpPAL有极大的提高，酶活提高了1.5～3倍；同时改造后的突变体的溶解性也有较大的提升，具体采用原核表达系统表达突变体，可溶性蛋白的产量较NpPAL有较大的提升，可溶性蛋白的产量提高了50％～300％。可见，本发明提供的突变体具有酶活性高、溶解性强的特点，可用于制备治疗苯丙酮尿症的替代药物。
附图说明
图1为NpPAL及其突变体酶活性测定结果；
图2为Bradford法蛋白标准曲线；
图3为NpPAL及其突变体的可溶性蛋白产量测定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体，在氨基酸序列如SEQ ID NO:1(MNITSLQQNITRSWQIPFTNSSDSIVTVGDRNLTIDE VVNVARHGTQVRLTDNADVIRGVQASCDYINNAVETAQPIYGVTSGFGGMADVVISREQAAELQTNLIWFLKSGAGNKLSLADVRAAMLLRANSHLYGASGIRLELIQRIETFLNAGVTPHVYEFGSIGASGDLVPLSYITGALIGLDPSFTVDFDGKEMDAVTALSRLGLPKLQLQPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDAKVLLALTMGVHALAIQGLYGTNQSFHPFIHQCKPHPGQLWTADQMFSLLKDSSLVREELDGKHEYRGKDLIQDRYSLRCLAQFIGPIVDGVSEITKQIEVEMNSVTDNPLIDVENQVSYHGGNFLGQYVGVTMDRLRYYIGLLAKHIDVQIALLVSPEFSNGLPPSLVGNSDRKVNMGLKGLQISGNSIMPLLSFYGNSLADRFPTHAEQFNQNINSQGYISANLTRRSVDIFQNYMAIALMFGVQAVDLRTYKMKGHYDARTCLSPNTVQLYTAVCEVVGKPLTSVRPYIWNDNEQCLDEHIARISADIAGGGLIVQAVEHIFSSLKST)所示的NpPAL的基础上进行以下至少一个位点的突变：N2K突变、I3T突变、T4L突变、L6Q突变、Q7A突变和N9S突变。ApPAL的氨基酸序列如SEQ ID NO:20(MK TLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGIQASCDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANVAISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAAMLLRANSHMRGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGVHALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLANSQLVRDELDGKHDYRDHELIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDHLRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLLGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGNSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYDARACLSPATERLYSAVRHVVGQKPTSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDILPCLH)所示。
在本发明中，所述N末端5～10个氨基酸对应突变优选为ApPAL的N末端5～10个氨基酸的突变体包括以下至少一种：5-Av-NpPAL、6-Av-NpPAL、7-Av-NpPAL、8-Av-NpPAL、9-Av-NpPAL和10-Av-NpPAL；所述5-Av-NpPAL的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(MKTLSLQQNITRSWQIPFTNSSDSIVTVGD RNLTIDEVVNVARHGTQVRLTDNADVIRGVQASCDYINNAVETAQPIYGVTSGFGGMADVVISREQAAELQTNLIWFLKSGAGNKLSLADVRAAMLLRANSHLYGASGIRLELIQRIETFLNAGVTPHVYEFGSIGASGDLVPLSYITGALIGLDPSFTVDFDGKEMDAVTALSRLGLPKLQLQPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDAKVLLALTMGVHALAIQGLYGTNQSFHPFIHQCKPHPGQLWTADQMFSLLKDSSLVREELDGKHEYRGKDLIQDRYSLRCLAQFIGPIVDGVSEITKQIEVEMNSVTDNPLIDVENQVSYHGGNFLGQYVGVTMDRLRYYIGLLAKHIDVQIALLVSPEFSNGLPPSLVGNSDRKVNMGLKGLQISGNSIMPLLSFYGNSLADRFPTHAEQFNQNINSQGYISANLTRRSVDIFQNYMAIALMFGVQAVDLRTYKMKGHYDARTCLSPNTVQLYTAVCEVVGKPLTSVRPYIWNDNEQCLDEHIARISADIAGGGLIVQAVEHIFSSLKST)所示；所述10-Av-NpPAL的氨基酸序列如SEQID NO:5(MKTLSQAQSKTRSWQIPFT NSSDSIVTVGDRNLTIDEVVNVARHGTQVRLTDNADVIRGVQASCDYINNAVETAQPIYGVTSGFGGMADVVISREQAAELQTNLIWFLKSGAGNKLSLADVRAAMLLRANSHLYGASGIRLELIQRIETFLNAGVTPHVYEFGSIGASGDLVPLSYITGALIGLDPSFTVDFDGKEMDAVTALSRLGLPKLQLQPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDAKVLLALTMGVHALAIQGLYGTNQSFHPFIHQCKPHPGQLWTADQMFSLLKDSSLVREELDGKHEYRGKDLIQDRYSLRCLAQFIGPIVDGVSEITKQIEVEMNSVTDNPLIDVENQVSYHGGNFLGQYVGVTMDRLRYYIGLLAKHIDVQIALLVSPEFSNGLPPSLVGNSDRKVNMGLKGLQISGNSIMPLLSFYGNSLADRFPTHAEQFNQNINSQGYISANLTRRSVDIFQNYMAIALMFGVQAVDLRTYKMKGHYDARTCLSPNTVQLYTAVCEVVGKPLTSVRPYIWNDNEQCLDEHIARISADIAGGGLIVQAVEHIFSSLKST)所示。
在本发明中，所述苯丙氨酸解氨酶突变体优选包括NpPAL-N2K、NpPAL-I3T和NpPAL-T4L；所述NpPAL-N2K的氨基酸序列如SEQ ID NO:7(MKITSLQQNITRSWQIPFTNSSDSIVTVGDRNLTIDEVVNVARHGTQVRL TDNADVIRGVQASCDYINNAVETAQPIYGVTSGFGGMADVVISREQAAELQTNLIWFLKSGAGNKLSLADVRAAMLLRANSHLYGASGIRLELIQRIETFLNAGVTPHVYEFGSIGASGDLVPLSYITGALIGLDPSFTVDFDGKEMDAVTALSRLGLPKLQLQPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDAKVLLALTMGVHALAIQGLYGTNQSFHPFIHQCKPHPGQLWTADQMFSLLKDSSLVREELDGKHEYRGKDLIQDRYSLRCLAQFIGPIVDGVSEITKQIEVEMNSVTDNPLIDVENQVSYHGGNFLGQYVGVTMDRLRYYIGLLAKHIDVQIALLVSPEFSNGLPPSLVGNSDRKVNMGLKGLQISGNSIMPLLSFYGNSLADRFPTHAEQFNQNINSQGYISANLTRRSVDIFQNYMAIALMFGVQAVDLRTYKMKGHYDARTCLSPNTVQLYTAVCEVVGKPLTSVRPYIWNDNEQCLDEHIARISADIAGGGLIVQAVEHIFSSLKST)所示；所述NpPAL-I3T的氨基酸序列如SEQ ID NO:9(MNTTSLQQNITRSWQIPFTNSSDSIVTVGDRNLTIDEVVNVARHGT QVRLTDNADVIRGVQASCDYINNAVETAQPIYGVTSGFGGMADVVISREQAAELQTNLIWFLKSGAGNKLSLADVRAAMLLRANSHLYGASGIRLELIQRIETFLNAGVTPHVYEFGSIGASGDLVPLSYITGALIGLDPSFTVDFDGKEMDAVTALSRLGLPKLQLQPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDAKVLLALTMGVHALAIQGLYGTNQSFHPFIHQCKPHPGQLWTADQMFSLLKDSSLVREELDGKHEYRGKDLIQDRYSLRCLAQFIGPIVDGVSEITKQIEVEMNSVTDNPLIDVENQVSYHGGNFLGQYVGVTMDRLRYYIGLLAKHIDVQIALLVSPEFSNGLPPSLVGNSDRKVNMGLKGLQISGNSIMPLLSFYGNSLADRFPTHAEQFNQNINSQGYISANLTRRSVDIFQNYMAIALMFGVQAVDLRTYKMKGHYDARTCLSPNTVQLYTAVCEVVGKPLTSVRPYIWNDNEQCLDEHIARISADIAGGGLIVQAVEHIFSSLKST)所示；所述NpPAL-T4L的氨基酸序列如SEQ ID NO:11(MNILSLQQNITRSWQIPFTNSSDSIVTVGDRNLTIDEV VNVARHGTQVRLTDNADVIRGVQASCDYINNAVETAQPIYGVTSGFGGMADVVISREQAAELQTNLIWFLKSGAGNKLSLADVRAAMLLRANSHLYGASGIRLELIQRIETFLNAGVTPHVYEFGSIGASGDLVPLSYITGALIGLDPSFT VDFDGKEMDAVTALSRLGLPKLQLQPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDAKVLLALTMGVHALAIQGLYGTNQSFHPFIHQCKPHPGQLWTADQMFSLLKDSSLVREELDGKHEYRGKDLIQDRYSLRCLAQFIGPIVDGVSEITKQIEVEMNSVTDNPLIDVENQVSYHGGNFLGQYVGVTMDRLRYYIGLLAKHIDVQIALLVSPEFSNGLPPSLVGNSDRKVNMGLKGLQISGNSIMPLLSFYGNSLADRFPTHAEQFNQNINSQGYISANLTRRSVDIFQNYMAIALMFGVQAVDLRTYKMKGHYDARTCLSPNTVQLYTAVCEVVGKPLTSVRPYIWNDNEQCLDEHIARISADIAGGGLIVQAVEHIFSSLKST)所示。
本发明提供了一种编码所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体的基因。
在本发明中，所述基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12所示。
本发明提供了一种重组表达载体，包含有所述基因的表达载体。
本发明对表达载体的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的表达载体即可，包括原核表达载体。在本发明实施例中，所述表达载体采用pET21a(+)。克隆位点优选为Nde I和Xho I。本发明对所述构建方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的构建方法即可，包括酶切和连接以及验证。
本发明提供了一种重组工程菌株，包含所述基因或所述重组表达载体。
在本发明中，所述重组工程菌株的宿主菌株优选包括原核表达系统。在本发明实施例中，采用大肠杆菌(Escherichia coli OverExpress C43(DE3))作为宿主菌株。本发明对所述重组工程菌株的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转化方法即可。
本发明提供了一种所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
将所述基因或所述重组表达载体导入宿主菌株中，经培养和诱导表达，分离重组蛋白。
在本发明中，所述编码所述苯丙氨酸解氨酶突变体的基因优选是在苯丙氨酸解氨酶的编码基因为模板的基础上利用扩增引物进行点突变获得；
扩增编码5-Av-NpPAL的基因的正向引物是核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示的5-Av-NpPAL-F；
扩增编码10-Av-NpPAL的基因的正向引物是核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示的10-Av-NpPAL-F；
扩增编码NpPAL-N2K的基因的正向引物是核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示的NpPAL-N2K-F；
扩增编码NpPAL-I3T的基因的正向引物是核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示的NpPAL-I3T-F；
扩增编码NpPAL-T4L的基因的正向引物是核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示的NpPAL-T4L-F；
通用反向引物是核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示的NpPAL-R。
扩增编码NpPAL的基因的正向引物是核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的NpPAL-F。
在本发明中，所述导入的方法优选为热激法。所述培养的条件优选为200r·min-1，37℃培养至OD600值为0.4～0.6时进入诱导表达。所述培养时采用含Amp的LB培养基进行培养。所述诱导表达优选为加入终浓度为0.2mmol·L-1的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在16℃下继续振荡培养16h。
在本发明中，采用上述方法制备的突变体5Av-NpPAL、10Av-NpPAL、N2K、T3I和T4L的活性相较于NpPAL分别提高了2倍、2.9倍、2倍、1.7倍和2.2倍，可见经过改造后的突变体在催化苯丙氨酸为肉桂酸的活性方面具有极大的提高。同时，可溶性蛋白的产量也有实质性提高，具体为突变体5Av-NpPAL、10Av-NpPAL、N2K和T4L的可溶性蛋白表达产量相较于NpPAL分别提高了92％、190％、50％和69％。
本发明提供了一种治疗苯丙酮尿症的药物，包括所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体和辅料。
本发明对所述辅料的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的蛋白类药物的辅料即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的蛋白类药物的制备方法即可。
鉴于点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体具有良好的可溶性表达能力以及良好的酶催化活性，因此本发明提供了所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体、所述重组表达载体、所述重组工程菌株或所述制备方法制备得到的点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体在制备预防和/或治疗苯丙酮尿症的药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)蛋白NpPAL突变体序列的扩增
依据NpPAL的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和编码序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)设计定点突变，设计得到5种突变体，分别为5Av-NpPAL(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)、10Av-NpPAL(氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)、NpPAL-N2K(氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)、NpPAL-I3T(氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示)和NpPAL-T4L(氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示)。设计定点突变扩增用上游引物和下游引物，进行PCR扩增。具体引物序列如下：
NpPAL-F：GAAGGAGATATACATATGAACATTACCAGCCTGCAGC
(SEQ ID NO:13)；
5Av-NpPAL-F：GAAGGAGATATACATATGAAAACCCTGAGCCTGCAG CAGAAC(SEQ ID NO:14)；
10Av-NpPAL-F：GAAGGAGATATACATATGAAAACCCTGAGCCAGGCGCAGAGCAAAACCCGCAGCTGG(SEQ ID NO:15)；
NpPAL-N2K-F：GAAGGAGATATACATATGAAAATTACCAGCCTGCAG CAG(SEQ ID NO:16)；
NpPAL-I3T-F：GAAGGAGATATACATATGAACACTACCAGCCTGCAG CAG(SEQ ID NO:17)；
NpPAL-T4L-F：GAAGGAGATATACATATGAACATTCTCAGCCTGCAG CAG(SEQ ID NO:18)；
NpPAL-R：GTGGTGGTGGTGCTCGAGGGTGCTTTTCAGGCTGCTA(SEQ ID NO:19)，其中NpPAL-R为通用下游引物分别与上述上游引物进行PCR扩增。
PCR扩增体系为：KOD FX Neo 1μL，2×PCR Buffer for KOD FX Neo25μL，ddH2O17μL dNTPs 4μL(浓度为2mM)，模板DNA 1μL(约50ng～200ng)，上、下游引物各1μL(浓度为20μM)。PCR反应条件为：94℃，预变性2min；94℃变性15s，58℃退火15s，68℃延伸30s，30个循环；最后68℃延伸7min；4℃下保存。
(2)NpPAL突变体重组质粒的构建
PCR扩增结束后，用0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测，电压设置120V，时间40min，在紫外灯下迅速切下目的条带放入离心管中，按胶回收试剂盒说明书(北京康为世纪生物科技有限公司)回收1700bp左右的目的DNA片段，用Nde I和Xho I进行双酶切，将所获得的DNA片段和载体pET21a(+)连接(安诺伦生物科技有限公司)，重组子用限制性内切酶Nde I和XhoI进行双酶切验证。酶切产物在此进行电压为120V的琼脂糖凝胶电泳，验证片段大小分别为1700bp左右和5400bp左右的载体。之后将连接产物转化入大肠杆菌TOP10感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司)，在含氨苄青霉素抗生素的LB平板上筛选。
转化后平板上分别挑取5个单菌落进行验证，同时将挑取的菌落转移至氨苄青霉素抗性平板培养基上进行培养，采用上述扩增引物进行PCR扩增，结束后用琼脂糖凝胶电泳进行结果检测，对有条带的菌株送测序公司测序，测序结果收到后与目的片段序列进行比对观察是否正确。
(3)NpPAL及其突变体的单克隆细胞株的获得
将测序正确的菌液用质粒提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)提取质粒，然后按常规方法转化入表达宿主E.coli OverExpress C43(DE3)
(Novagen公司)，即获得蛋白NpPAL及其突变体的大肠杆菌工程菌。
(4)NpPAL及其突变体的纯化与富集
挑取单菌落接种到培养基中，于200r·min-1，37℃下过夜培养，活化后的菌液转入50mL摇菌管中扩大培养，再按照1:100比例接种到1L含有Amp(100μg·mL-1)的LB液体培养基中，37℃下培养，待OD600值为0.4～0.6时加入终浓度为0.2mmol·L-1的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，调节摇床设置16℃，继续振荡培养16h后，将培养物于4℃、6000r·min-1下离心5min，收集好的菌体用高压均质仪破碎。将破碎后的菌体在4℃下离心30min，将离心后的上清液通过0.45μm的过滤膜后用Co2+柱纯化得到目的蛋白。
使用30kDa超滤浓缩管将含有AvPAL的组分汇集并浓缩至500～1000μL，加入10mL蛋白缓冲液(20mmol·L-1Tris-HCl，150mmol·L-1NaCl，pH8.0)，继续4000r·min-1离心，重复2～3次直至蛋白缓冲液被全部置换。
实施例2
NpPAL及其突变体酶活性测定
实验方法：酶催化反应体系为450μL，将5μg蛋白加入到含有10mmol·L-1苯丙氨酸，50mmol·L-1Tris-HCl(pH7.5)中40℃反应5min，加入50μL三氯乙酸(TCA)终止反应，12000r·min-1离心5min，于紫外分光光度计下290nm处测量吸光度，并通过标准曲线确定生成肉桂酸的量，计算PAL酶活。
结果如图1所示。
测定NpPAL及其突变体酶活性，其中突变体5Av-NpPAL、10Av-NpPAL、N2K、T3I和T4L的活性相较于NpPAL分别提高了2倍、2.9倍、2倍、1.7倍和2.2倍。
实施例3
NpPAL及其突变体可溶性蛋白表达产量测定
实验方法：使用Bradford法测定蛋白浓度，将5×标准溶液稀释至1×，过滤后备用，将BSA牛血清白蛋白用ddH2O分别稀释成4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg·mL-1，再分别取上述过滤好的溶液300μL和3μL稀释好的标准溶液加入96孔板中混匀，于波长595nm和450nm下测定吸光度值，绘制标准曲线，由此计算目标蛋白浓度。
结果如表1和图2所示。
表1Bradford法测定蛋白浓度标准曲线
测定NpPAL及其突变体可溶性蛋白表达产量，其中突变体5Av-NpPAL、10Av-NpPAL、N2K、T4L和I3T的可溶性蛋白表达产量相较于AvPAL分别提高了92％、190％、50％、69％和-30％。
实施例4
NpPAL及其突变体的酶动力学测定
实验方法：为评估酶的动力学参数Km和kcat，以溶于50mmol·L-1Tris-HCl(pH7.5)的10～20000μmol·L-1苯丙氨酸作为底物，分别与5μg蛋白反应，测定吸光度，利用GraphPadPrism8.0中Michaelis-Menten非线性拟合作图法计算Km和Vmax值，并通过测定的蛋白浓度，根据公式I计算出对应的Kcat值。
kcat＝Vmax/[E]total公式I
结果分析：酶动力学结果见表2。
表2NpPAL及其突变体的动力学参数
5Av-NpPAL和10Av-NpPAL突变体相较于野生型的NpPALkcat分别增加了2.5倍和3.5倍，对L-苯丙氨酸的催化常数(kcat/Km)分别增加了70％和1.6倍。同时突变体NpPAL-N2K、NpPAL-I3T和NpPAL-T4L的kcat分别增加了2.1倍、1.8倍和2.3倍。虽然大多数NpPAL突变体表现出不同程度的Km增加，表明突变体对L-苯丙氨酸的亲和力降低，但由于kcat增加更大，导致催化性能增强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体，其特征在于，在氨基酸序列如SEQID NO:1所示的NpPAL的基础上进行以下至少一个位点的突变：N2K突变、I3T突变、T4L突变、L6Q突变、Q7A突变和N9S突变。
2.根据权利要求1所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体，其特征在于，当有三个位点同时发生突变时，苯丙氨酸解氨酶突变体为5-Av-NpPAL；10-Av-NpPAL；
所述5-Av-NpPAL的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
当有6个位点同时发生突变时，所述苯丙氨酸解氨酶突变体为10-Av-NpPAL；
所述10-Av-NpPAL的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
3.根据权利要求1所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体，其特征在于，当仅有一个位点发生突变时，所述苯丙氨酸解氨酶突变体包括NpPAL-N2K、NpPAL-I3T和NpPAL-T4L；
NpPAL-N2K的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
NpPAL-I3T的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
NpPAL-T4L的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
4.一种编码权利要求1～3中任意一项所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体的基因。
5.根据权利要求4所述基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12所示。
6.一种重组表达载体，其特征在于，包含有权利要求4或5所述基因的表达载体。
7.一种重组工程菌株，其特征在于，包含权利要求4或5所述基因或权利要求6所述重组表达载体。
8.一种权利要求1～3中任意一项所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求4或5所述基因或权利要求6所述重组表达载体导入宿主菌株中，经培养和诱导表达，分离重组蛋白。
9.一种治疗苯丙酮尿症的药物，其特征在于，包括权利要求1～3中任意一项所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体和辅料。
10.权利要求1～3中任意一项所述点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体、权利要求6所述重组表达载体、权利要求7所述重组工程菌株或权利要求8所述制备方法制备得到的点形念珠藻来源的苯丙氨酸解氨酶突变体在制备预防和/或治疗苯丙酮尿症的药物中的应用。
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