CN115175995A - 工程化脂肪酶变体 - Google Patents

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CN115175995A CN202080076739.4A CN202080076739A CN115175995A CN 115175995 A CN115175995 A CN 115175995A CN 202080076739 A CN202080076739 A CN 202080076739A CN 115175995 A CN115175995 A CN 115175995A
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recombinant lipase
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威廉·凯西·哈洛斯
朱迪·维多利亚·安东尼奥·维杜雅
尼基·德拉斯
斯蒂芬妮·苏·加兰妮
克里斯汀·让·瓦利厄
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Societe des Produits Nestle SA
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Abstract

本发明提供了工程化脂肪酶多肽及其组合物。工程化脂肪酶多肽已被优化以提供改进的热稳定性、蛋白酶稳定性以及在一定范围的pH条件包括酸性(pH<7)和碱性(pH>7)条件下的稳定性。本发明还涉及包含工程化脂肪酶多肽的组合物用于治疗和/或营养目的的用途。本发明还提供了编码工程化脂肪酶多肽的多核苷酸，以及制备工程化多核苷酸和脂肪酶多肽的方法。

Description

工程化脂肪酶变体
本申请要求2019年8月30日提交的美国临时申请序号62/894,019的优先权，该美国临时申请在此通过引用以其整体并入以用于所有目的。
发明领域
本发明提供了工程化脂肪酶多肽及其组合物。工程化脂肪酶多肽已被优化以提供改进的热稳定性、蛋白酶稳定性以及在一定范围的pH条件包括酸性(pH<7)条件下的稳定性。本发明还涉及包含工程化脂肪酶多肽的组合物用于治疗和/或营养目的的用途。本发明还提供了编码工程化脂肪酶多肽的多核苷酸，以及制备工程化多核苷酸和脂肪酶多肽的方法。
对序列表、表格或计算机程序的引用
序列表的正式副本作为ASCII格式化文本文件经由EFS-Web与说明书同时提交，文件名为“CX7-187WO2_ST25.txt”，创建日期为2020年8月27日，且大小为4.30兆字节。经由EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。
发明背景
胰腺酶替代疗法(pancreatic enzyme replacement therapy,PERT)可用于治疗胰腺酶不足(pancreatic enzyme insufficiency,PEI)。各种疾病，包括胰腺炎、囊性纤维化、乳糜泻(celiac disease)、炎性肠病和胰腺癌，都可以导致PEI，作为进入十二指肠的胰腺酶分泌减少的结果。这导致食物消化不良、肠对脂肪、蛋白质、碳水化合物和维生素的吸收不足，其可以导致营养不良。尽管口服施用的PERT治疗目前是可用的，但在一些人中状况可能不会减轻，这是由于PERT在胃肠道中活性不足，和/或由于与当前治疗方案相关的显著药负担，患者对治疗的依从性不足。在一些情况下，脂肪吸收系数(CFA)和/或氮吸收系数(CNA)不如健康患者，导致体重减轻和其他健康问题。因此，本领域仍然需要改进的PERT治疗。
发明概述
本发明提供了工程化脂肪酶多肽及其组合物。工程化脂肪酶多肽已被优化以提供改进的热稳定性、蛋白酶稳定性以及在一定范围的pH条件包括酸性(pH<7)条件下的稳定性。本发明还涉及包含工程化脂肪酶多肽的组合物用于治疗和/或营养目的的用途。本发明还提供了编码工程化脂肪酶多肽的多核苷酸，以及制备工程化多核苷酸和脂肪酶多肽的方法。
本发明提供了重组脂肪酶和/或生物活性重组脂肪酶片段，其包含含有与SEQ IDNO:2的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组脂肪酶和/或生物活性重组脂肪酶片段包含与SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2、3、4、22、27/46/97/136/149/385、27/46/385、27/70/136/231/385、27/136/323/385、27/149、27/149/385、27/385、34、38、41、44、46/70、46/149/183/231/385、48、70、73、73/305、82、82/94/101/194/199、82/94/199、83、85、87、89、92、94、96、97/149/385、135、136/385、140、141、142、144、146、149、149/231/385、151、174、175、178、181、183/385、189、194、194/199、195、195/231/385、199、199/213、210、212、213、213/330、216、218、219、226、231/385、238、247、250、270、274、281、292、296、300、308、330、338、379和385，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ IDNO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：2H、2M、2T、3A、3G、3R、3S、4M、4W、4Y、22N、27V/46T/97A/136V/149E/385P、27V/46T/385P、27V/70N/136V/231E/385P、27V/136V/323I/385P、27V/149E、27V/149E/385P、27V/385P、34D、38A、38H、38L、41V、44E、46T/70N、46T/149E/183L/231E/385P、48V、70N、73C/305I、73I、73R、82C、82E、82E/94S/101S/194N/199L、82E/94S/199L、82F、82G、82L、83G、83K、85I、85W、87R、89A、89T、89V、89W、92A、94S、96E、96N、96S、97A/149E/385P、135G、135Q、135S、135T、135V、136V/385P、140T、141A、141F、141L、141S、142A、142F、142I、142L、144M、144R、144W、146A、146F、146S、146Y、149E、149E/231E/385P、149K、149R、151A、151I、151L、174H、174R、175G、175L、175R、178R、178T、181H、183L/385P、189A、189E、189W、194N、194N/199L、194T、195D/231E/385P、195V、199L、199L/213A、210A、210V、212C、212G、212R、212T、213A/330T、213H、216R、216T、216W、218D、218G、218I、218M、218T、219C、219G、219K、219R、226R、231E/385P、238S、247R、250T、270V、274D、281K、281R、292A、292C、292L、292V、296M、296R、300A、300D、300T、308A、330Y、338N、379T、385A、385C、385D、385P、385R和385T，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：E2H、E2M、E2T、T3A、T3G、T3R、T3S、S4M、S4W、S4Y、G22N、Y27V/R46T/Y97A/Y136V/T149E/F385P、Y27V/R46T/F385P、Y27V/K70N/Y136V/Q231E/F385P、Y27V/Y136V/K323I/F385P、Y27V/T149E、Y27V/T149E/F385P、Y27V/F385P、K34D、F38A、F38H、F38L、N41V、G44E、R46T/K70N、R46T/T149E/F183L/Q231E/F385P、Y48V、K70N、T73C/V305I、T73I、T73R、K82C、K82E、K82E/P94S/D101S/K194N/I199L、K82E/P94S/I199L、K82F、K82G、K82L、E83G、E83K、G85I、G85W、A87R、F89A、F89T、F89V、F89W、T92A、P94S、I96E、I96N、I96S、Y97A/T149E/F385P、Y135G、Y135Q、Y135S、Y135T、Y135V、Y136V/F385P、P140T、E141A、E141F、E141L、E141S、E142A、E142F、E142I、E142L、I144M、I144R、I144W、P146A、P146F、P146S、P146Y、T149E、T149E/Q231E/F385P、T149K、T149R、G151A、G151I、G151L、E174H、E174R、Q175G、Q175L、Q175R、S178R、S178T、K181H、F183L/F385P、S189A、S189E、S189W、K194N、K194N/I199L、K194T、Q195D/Q231E/F385P、Q195V、I199L、I199L/P213A、K210A、K210V、Q212C、Q212G、Q212R、Q212T、P213A/N330T、P213H、S216R、S216T、S216W、H218D、H218G、H218I、H218M、H218T、A219C、A219G、A219K、A219R、T226R、Q231E/F385P、Y238S、E247R、Q250T、R270V、T274D、G281K、G281R、M292A、M292C、M292L、M292V、S296M、S296R、Q300A、Q300D、Q300T、R308A、N330Y、K338N、N379T、F385A、F385C、F385D、F385P、F385R和F385T，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2编号。
在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:94具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：3/4/96/296/300、3/292/296、4、4/11/149/292/296/300、4/96/149/231/296/300、4/96/149/292/296/300、4/96/219/296、4/96/231/296/300、4/96/292/296/300、4/149/174、4/174/219/292/296、4/231/296/300、27、27/34/82、27/73/82/218、27/89、27/89/178、27/89/218、27/218、34/73/218、34/82、34/218、73/82、73/82/183、94/146/175、96/149/174/292/296、96/149/231/292/296、96/149/292/296、96/174/219/231/292/296、96/231/296、146/175/189/281、149/174/292/296、149/174/300、149/219/231/292/296/300、149/231/292/296、149/231/292/296/300、149/296、149/296/300、174/231、174/296、218、231、231/292/296、231/292/296/300、231/296、231/300、292/296、292/296/300、296和296/300，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:94编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ IDNO:94具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：3S/4W/96E/296R/300D、3S/292L/296R、4W、4W/11A/149E/292L/296R/300D、4W/96E/149E/231E/296R/300D、4W/96E/149E/292L/296R/300D、4W/96E/219K/296R、4W/96E/231E/296R/300D、4W/96E/292L/296R/300D、4W/149E/174R、4W/174H/219K/292L/296R、4W/231E/296R/300D、27V、27V/34D/82E、27V/73I/82L/218I、27V/73I/82L/218M、27V/89T、27V/89T/178P、27V/89T/218I、27V/218I、34D/73I/218I、34D/82C、34D/218M、73I/82C、73I/82L/183L、94S/146F/175G、96E/149E/174H/292L/296R、96E/149E/231E/292L/296R、96E/149E/292L/296R、96E/174H/219K/231E/292L/296R、96E/231E/296R、146F/175G/189A/281K、149E/174H/292L/296R、149E/174H/300D、149E/219K/231E/292L/296R/300D、149E/231E/292L/296R、149E/231E/292L/296R/300D、149E/296R、149E/296R/300D、174H/296R、174R/231E、218I、231E、231E/292L/296R、231E/292L/296R/300D、231E/296R、231E/300D、292L/296R、292L/296R/300D、296R和296R/300D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:94编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:94具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：T3S/S4W/I96E/S296R/Q300D、T3S/M292L/S296R、S4W、S4W/V11A/T149E/M292L/S296R/Q300D、S4W/I96E/T149E/Q231E/S296R/Q300D、S4W/I96E/T149E/M292L/S296R/Q300D、S4W/I96E/A219K/S296R、S4W/I96E/Q231E/S296R/Q300D、S4W/I96E/M292L/S296R/Q300D、S4W/T149E/E174R、S4W/E174H/A219K/M292L/S296R、S4W/Q231E/S296R/Q300D、Y27V、Y27V/K34D/K82E、Y27V/T73I/K82L/H218I、Y27V/T73I/K82L/H218M、Y27V/F89T、Y27V/F89T/S178P、Y27V/F89T/H218I、Y27V/H218I、K34D/T73I/H218I、K34D/K82C、K34D/H218M、T73I/K82C、T73I/K82L/F183L、P94S/P146F/Q175G、I96E/T149E/E174H/M292L/S296R、I96E/T149E/Q231E/M292L/S296R、I96E/T149E/M292L/S296R、I96E/E174H/A219K/Q231E/M292L/S296R、I96E/Q231E/S296R、P146F/Q175G/S189A/G281K、T149E/E174H/M292L/S296R、T149E/E174H/Q300D、T149E/A219K/Q231E/M292L/S296R/Q300D、T149E/Q231E/M292L/S296R、T149E/Q231E/M292L/S296R/Q300D、T149E/S296R、T149E/S296R/Q300D、E174H/S296R、E174R/Q231E、H218I、Q231E、Q231E/M292L/S296R、Q231E/M292L/S296R/Q300D、Q231E/S296R、Q231E/Q300D、M292L/S296R、M292L/S296R/Q300D、S296R和S296R/Q300D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:94编号。
在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:350具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：4、4/27/189/300、4/70、4/102、4/137、4/175/189/218、4/175/189/300、4/175/218/224、4/175/218/373、4/185、4/189/218/373、4/193、4/218/300/369/373、4/228、4/233、4/243、4/271、4/303、4/334、4/336、4/375、25、27/82/174/175/189/218/300/369/373、27/82/174/175/218/300/369、27/82/174/175/218/300/373/382、27/82/174/218/300/373、27/189/218/373、28、33、99、102、104、134、153、174/175/189、174/373、175/189/218/300/373、175/189/373、175/218、175/218/382、189/218/300/373、191、193、231、233、243、293、303、331、336、339、368和373，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:350编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:350具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：4W、4W/27V/189A/300D、4W/70H、4W/102T、4W/137R、4W/175G/189A/218M、4W/175G/189A/300D、4W/175G/218M/224A、4W/175G/218M/373F、4W/185L、4W/189A/218M/373F、4W/193T、4W/218M/300D/369N/373F、4W/228E、4W/233R、4W/243R、4W/271D、4W/303P、4W/334T、4W/336S、4W/336T、4W/375A、25V、27V/82C/174H/175G/189A/218M/300D/369N/373F、27V/82C/174H/175G/218M/300D/369N、27V/82C/174H/175G/218M/300D/373F/382M、27V/82C/174H/218M/300D/373F、27V/189A/218M/373F、28N、33Y、99D、102L、104H、134R、153G、174H/175L/189A、174H/373F、175G/189A/218M/300D/373F、175G/218M、175G/218M/382M、175L/189A/373F、189A/218M/300D/373F、191L、193L、231Q、233G、233S、233W、243R、293R、303P、331R、336R、339K、368A、368T和373F，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:350编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:350具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：S4W、S4W/Y27V/S189A/Q300D、S4W/K70H、S4W/E102T、S4W/S137R、S4W/Q175G/S189A/H218M、S4W/Q175G/S189A/Q300D、S4W/Q175G/H218M/V224A、S4W/Q175G/H218M/Y373F、S4W/I185L、S4W/S189A/H218M/Y373F、S4W/Q193T、S4W/H218M/Q300D/S369N/Y373F、S4W/P228E、S4W/N233R、S4W/L243R、S4W/G271D、S4W/A303P、S4W/D334T、S4W/A336S、S4W/A336T、S4W/N375A、L25V、Y27V/K82C/E174H/Q175G/S189A/H218M/Q300D/S369N/Y373F、Y27V/K82C/E174H/Q175G/H218M/Q300D/S369N、Y27V/K82C/E174H/Q175G/H218M/Q300D/Y373F/H382M、Y27V/K82C/E174H/H218M/Q300D/Y373F、Y27V/S189A/H218M/Y373F、R28N、L33Y、Q99D、E102L、N104H、E134R、N153G、E174H/Q175L/S189A、E174H/Y373F、Q175G/S189A/H218M/Q300D/Y373F、Q175G/H218M、Q175G/H218M/H382M、Q175L/S189A/Y373F、S189A/H218M/Q300D/Y373F、A191L、Q193L、E231Q、N233G、N233S、N233W、L243R、Q293R、A303P、S331R、A336R、Q339K、F368A、F368T和Y373F，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:350编号。
在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:442具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：26、33、33/174/193/243、33/174/334、33/175/218/303、33/175/218/334/339、33/193、34、38、46、48、70/271/293/334、144、174、174/175/193、174/175/218/339、174/193/303/375、174/193/375、174/218/233/271/293/303、174/218/271/303、175/193/218/233/243/375、175/193/218/243、175/218/375、181、189、193、193/218/243、193/271/303/334、193/293/303、194、195、199、210、218、218/243、218/243/303/334、218/303、225、238、274、281和330，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:442编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:442具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：26A、26R、26S、33Y、33Y/174H/193L/243R、33Y/174H/334T、33Y/175G/218M/303P、33Y/175G/218M/334T/339K、33Y/193L、34L、38A、38G、46P、48L、70H/271D/293R/334T、144L、174H、174H/175G/193L、174H/175G/218M/339K、174H/193L/303P/375A、174H/193L/375A、174H/218M/233R/271D/293R/303P、174H/218M/271D/303P、174R、175G/193L/218M/233R/243R/375A、175G/193L/218M/243R、175G/218M/375A、181Q、189H、193L、193L/218M/243R、193L/271D/303P/334T、193L/293R/303P、194T、195I、195L、195Y、199H、210V、218C、218D、218M、218M/243R、218M/243R/303P/334T、218M/303P、218P、225L、238W、274D、281K、281P、330F和330H，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:442编号。
在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:442具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：G26A、G26R、G26S、L33Y、L33Y/E174H/Q193L/L243R、L33Y/E174H/D334T、L33Y/L175G/H218M/A303P、L33Y/L175G/H218M/D334T/Q339K、L33Y/Q193L、K34L、F38A、F38G、R46P、Y48L、K70H/G271D/Q293R/D334T、I144L、E174H、E174H/L175G/Q193L、E174H/L175G/H218M/Q339K、E174H/Q193L/A303P/N375A、E174H/Q193L/N375A、E174H/H218M/N233R/G271D/Q293R/A303P、E174H/H218M/G271D/A303P、E174R、L175G/Q193L/H218M/N233R/L243R/N375A、L175G/Q193L/H218M/L243R、L175G/H218M/N375A、K181Q、A189H、Q193L、Q193L/H218M/L243R、Q193L/G271D/A303P/D334T、Q193L/Q293R/A303P、K194T、Q195I、Q195L、Q195Y、I199H、K210V、H218C、H218D、H218M、H218M/L243R、H218M/L243R/A303P/D334T、H218M/A303P、H218P、M225L、Y238W、T274D、G281K、G281P、N330F和N330H，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:442编号。
在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:540具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：34/38/174/193/195/243/281/303/330、34/38/174/225/303、34/38/174/303/345、34/174、34/174/193/195/243/281、34/174/193/195/303/330、34/193/195/225/243、34/193/243/303/330、34/281/330、38、38/174/193/195/243/330、38/174/193/225/274/283/303/330、38/174/193/303、38/174/195/281/330、38/174/225/243/281/330、38/174/281、38/174/281/303、38/174/281/303/345、38/193/195/225/303/345、38/195/243/303、38/195/281/303/330、38/195/281/330、38/195/303、49、49/51/98/252/311、49/51/123/252/344、49/98/120/252/344、49/120/252/344、49/123/252/344、49/123/264/344、49/123/311、49/252/344、49/311/344、49/344、51、51/252/344、51/344、98、98/344、123/252/344、129、160、161、174/193/195/225、174/193/303/330、174/195/225/281/303/330/345、174/195/243/281/345、174/195/281/303、174/225/243/281/303/345、174/281/330、174/303、195/225/303/330、252、268和344，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:540编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:540具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：34L/38A/174G/193L/195L/243R/281P/303P/330F、34L/38A/174R/303P/345I、34L/38G/174R/225L/303P、34L/174G、34L/174G/193L/195L/243R/281P、34L/174H/193L/195I/303P/330F、34L/193L/195I/225L/243R、34L/193L/243R/303P/330F、34L/281P/330H、38A/174H/193L/225L/274D/283I/303P/330F、38A/174R/281K/303P/345I、38A/193L/195L/225L/303P/345I、38A/195I/303P、38A/195Y/281K/303P/330F、38G、38G/174G/193L/303P、38G/174G/281K/303P、38G/174H/195L/281P/330F、38G/174H/225L/243R/281K/330H、38G/174H/281K、38G/174R/193L/195L/243R/330H、38G/195I/281P/330F、38G/195Y/243R/303P、49S、49T、49T/51A/98P/252V/311W、49T/51A/123Q/252V/344H、49T/98P/120T/252V/344H、49T/120T/252V/344H、49T/123Q/252V/344H、49T/123Q/264S/344H、49T/123Q/311W、49T/252V/344H、49T/311W/344H、49T/344H、51A/252V/344H、51A/344H、51V、98P/344H、98R、123Q/252V/344H、129F、160T、161I、174G/195I/225L/281K/303P/330F/345I、174G/225L/243R/281P/303P/345I、174H/195I/243R/281K/345I、174H/281P/330H、174R/193L/195I/225L、174R/193L/303P/330H、174R/195I/281K/303P、174R/303P、195Y/225L/303P/330H、252V、268T、344I、344V和344W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:540编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:540具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：K34L/F38A/E174G/Q193L/Q195L/L243R/G281P/A303P/N330F、K34L/F38A/E174R/A303P/F345I、K34L/F38G/E174R/M225L/A303P、K34L/E174G、K34L/E174G/Q193L/Q195L/L243R/G281P、K34L/E174H/Q193L/Q195I/A303P/N330F、K34L/Q193L/Q195I/M225L/L243R、K34L/Q193L/L243R/A303P/N330F、K34L/G281P/N330H、F38A/E174H/Q193L/M225L/T274D/M283I/A303P/N330F、F38A/E174R/G281K/A303P/F345I、F38A/Q193L/Q195L/M225L/A303P/F345I、F38A/Q195I/A303P、F38A/Q195Y/G281K/A303P/N330F、F38G、F38G/E174G/Q193L/A303P、F38G/E174G/G281K/A303P、F38G/E174H/Q195L/G281P/N330F、F38G/E174H/M225L/L243R/G281K/N330H、F38G/E174H/G281K、F38G/E174R/Q193L/Q195L/L243R/N330H、F38G/Q195I/G281P/N330F、F38G/Q195Y/L243R/A303P、V49S、V49T、V49T/T51A/G98P/M252V/L311W、V49T/T51A/E123Q/M252V/S344H、V49T/G98P/M120T/M252V/S344H、V49T/M120T/M252V/S344H、V49T/E123Q/M252V/S344H、V49T/E123Q/T264S/S344H、V49T/E123Q/L311W、V49T/M252V/S344H、V49T/L311W/S344H、V49T/S344H、T51A/M252V/S344H、T51A/S344H、T51V、G98P/S344H、G98R、E123Q/M252V/S344H、S129F、S160T、L161I、E174G/Q195I/M225L/G281K/A303P/N330F/F345I、E174G/M225L/L243R/G281P/A303P/F345I、E174H/Q195I/L243R/G281K/F345I、E174H/G281P/N330H、E174R/Q193L/Q195I/M225L、E174R/Q193L/A303P/N330H、E174R/Q195I/G281K/A303P、E174R/A303P、Q195Y/M225L/A303P/N330H、M252V、S268T、S344I、S344V和S344W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:540编号。
在一些实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:646具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：11/16/67/168/180/287、11/16/237/241/287、11/67/168/287、16/67/154/168/237/241/287、16/67/237/287/291、16/168/177、24、24/278、34/49/161/193/243/344、34/49/161/193/344、34/49/161/243/344、34/49/161/252/268/344、34/49/193/243/252/344、34/49/193/344、34/49/243/252、34/49/252/268/344、34/161/193/243/252/268、34/161/193/243/268/344、34/161/193/243/344、34/161/193/252/268/344、34/161/193/252/344、34/161/193/268/344、34/161/243/281/344、34/161/344、34/193/243/252/344、34/193/252/268/344、34/193/268/281、34/252/268/281/344、34/252/344、49/161/193/243/252/344、49/161/193/252/281/344、49/161/243/252/344、49/193/197/243/252/281/344、49/193/243/252/344、49/193/243/344、49/243/344、67/154/237/287、67/168/237、67/168/237/287、67/177/237、154/237/286/287、154/286/287、161/193/252/344、161/193/344、161/344、168/237、186/187/278、193/243/281/344、193/252/268/344、193/252/281/344、237、237/287/291和281/344，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:646编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:646具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：11I/16F/67A/168T/180V/287L、11I/16F/237Q/241S/287L、11I/67A/168T/287L、16F/67A/154Y/168T/237Q/241S/287L、16F/67A/237Q/287L/291A、16F/168T/177L、24M、24M/278L、34K/49T/161I/193L/243R/344H、34K/49T/161I/193L/243R/344V、34K/49T/161I/193L/344W、34K/49T/161I/243R/344H、34K/49T/161I/252V/268T/344V、34K/49T/193L/243R/252V/344W、34K/49T/193L/344H、34K/49T/193L/344W、34K/49T/243R/252V、34K/49T/252V/268T/344V、34K/161I/193L/243R/252V/268T、34K/161I/193L/243R/268T/344V、34K/161I/193L/243R/344W、34K/161I/193L/252V/268T/344H、34K/161I/193L/252V/268T/344V、34K/161I/193L/252V/344H、34K/161I/193L/252V/344V、34K/161I/193L/252V/344W、34K/161I/193L/268T/344H、34K/161I/243R/281P/344V、34K/161I/344V、34K/161I/344W、34K/193L/243R/252V/344W、34K/193L/252V/268T/344H、34K/193L/268T/281P、34K/252V/268T/281P/344V、34K/252V/344V、49T/161I/193L/243R/252V/344W、49T/161I/193L/252V/281P/344H、49T/161I/243R/252V/344V、49T/193L/197G/243R/252V/281P/344H、49T/193L/243R/252V/344V、49T/193L/243R/344W、49T/243R/344V、67A/154Y/237Q/287L、67A/168T/237Q、67A/168T/237Q/287L、67A/177L/237Q、154Y/237Q/286V/287L、154Y/286V/287L、161I/193L/252V/344V、161I/193L/344W、161I/344W、168T/237Q、186T/187A/278L、193L/243R/281P/344W、193L/252V/268T/344V、193L/252V/281P/344H、237Q、237Q/287L/291A和281P/344W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:646编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:646具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：V11I/L16F/Y67A/S168T/I180V/F287L、V11I/L16F/A237Q/T241S/F287L、V11I/Y67A/S168T/F287L、L16F/Y67A/W154Y/S168T/A237Q/T241S/F287L、L16F/Y67A/A237Q/F287L/S291A、L16F/S168T/V177L、F24M、F24M/Y278L、L34K/V49T/L161I/Q193L/L243R/S344H、L34K/V49T/L161I/Q193L/L243R/S344V、L34K/V49T/L161I/Q193L/S344W、L34K/V49T/L161I/L243R/S344H、L34K/V49T/L161I/M252V/S268T/S344V、L34K/V49T/Q193L/L243R/M252V/S344W、L34K/V49T/Q193L/S344H、L34K/V49T/Q193L/S344W、L34K/V49T/L243R/M252V、L34K/V49T/M252V/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/L243R/M252V/S268T、L34K/L161I/Q193L/L243R/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/L243R/S344W、L34K/L161I/Q193L/M252V/S268T/S344H、L34K/L161I/Q193L/M252V/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344H、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344V、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344W、L34K/L161I/Q193L/S268T/S344H、L34K/L161I/L243R/G281P/S344V、L34K/L161I/S344V、L34K/L161I/S344W、L34K/Q193L/L243R/M252V/S344W、L34K/Q193L/M252V/S268T/S344H、L34K/Q193L/S268T/G281P、L34K/M252V/S268T/G281P/S344V、L34K/M252V/S344V、V49T/L161I/Q193L/L243R/M252V/S344W、V49T/L161I/Q193L/M252V/G281P/S344H、V49T/L161I/L243R/M252V/S344V、V49T/Q193L/S197G/L243R/M252V/G281P/S344H、V49T/Q193L/L243R/M252V/S344V、V49T/Q193L/L243R/S344W、V49T/L243R/S344V、Y67A/W154Y/A237Q/F287L、Y67A/S168T/A237Q、Y67A/S168T/A237Q/F287L、Y67A/V177L/A237Q、W154Y/A237Q/L286V/F287L、W154Y/L286V/F287L、L161I/Q193L/M252V/S344V、L161I/Q193L/S344W、L161I/S344W、S168T/A237Q、H186T/L187A/Y278L、Q193L/L243R/G281P/S344W、Q193L/M252V/S268T/S344V、Q193L/M252V/G281P/S344H、A237Q、A237Q/F287L/S291A和G281P/S344W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:646编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:758具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24/168/252/281、24/237/287/344、24/252、24/252/287、24/344、213/252/278/344、252/278/344、252/287/344和281，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:758编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:758具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：24M/168T/252V/281P、24M/237Q/287L/344S、24M/252V、24M/252V/287L、24M/344W、213S/252V/278L/344S、252V/278L/344W、252V/287L/344S和281P，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:758编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:758具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：F24M/S168T/M252V/G281P、F24M/A237Q/F287L/H344S、F24M/M252V、F24M/M252V/F287L、F24M/H344W、P213S/M252V/Y278L/H344S、M252V/Y278L/H344W、M252V/F287L/H344S和G281P，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:758编号。
在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:868具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24、24/38/49/70/149/161/174/175/189/193/225/231/243/252/271/287/292/293/296/303/334/344/373/385、38、49、70、149、161、174、175、189、193、225、231、243、252、271、287、292、293、296、303、334、344、373和385，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:868编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ IDNO:868具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：24A、24C、24D、24E、24F、24F/38F/49V/70K/149T/161L/174E/175Q/189S/193Q/225M/231Q/243L/252M/271G/287F/292M/293Q/296S/303A/334D/344S/373Y/385F、24G、24H、24I、24K、24L、24N、24P、24Q、24R、24S、24T、24V、24W、24Y、38A、38C、38D、38E、38F、38H、38I、38K、38L、38M、38N、38P、38Q、38R、38S、38T、38V、38W、38Y、49A、49C、49D、49E、49F、49G、49H、49I、49K、49L、49M、49N、49P、49Q、49R、49S、49V、49W、49Y、70A、70C、70D、70E、70F、70G、70I、70K、70L、70M、70N、70P、70Q、70R、70S、70T、70V、70W、70Y、149A、149C、149D、149F、149G、149H、149I、149K、149L、149M、149N、149P、149Q、149R、149S、149T、149V、149W、149Y、161A、161C、161D、161E、161F、161G、161H、161K、161L、161M、161N、161P、161Q、161R、161S、161T、161V、161W、161Y、174A、174C、174D、174E、174F、174G、174H、174I、174K、174L、174M、174N、174P、174Q、174S、174T、174V、174W、174Y、175A、175C、175D、175E、175F、175G、175H、175I、175K、175M、175N、175P、175Q、175R、175S、175T、175V、175W、175Y、189C、189D、189E、189F、189G、189H、189I、189K、189L、189M、189N、189P、189Q、189R、189S、189T、189V、189W、189Y、193A、193C、193D、193E、193F、193G、193H、193I、193K、193M、193N、193P、193Q、193R、193S、193T、193V、193W、193Y、225A、225C、225D、225E、225F、225G、225H、225I、225K、225M、225N、225P、225Q、225R、225S、225T、225V、225W、225Y、231A、231C、231D、231F、231G、231H、231I、231K、231L、231M、231N、231P、231Q、231R、231S、231T、231V、231W、231Y、243A、243C、243D、243E、243F、243G、243H、243I、243K、243L、243M、243N、243P、243Q、243S、243T、243V、243W、243Y、252A、252C、252D、252E、252F、252G、252H、252I、252K、252L、252M、252N、252P、252Q、252R、252S、252T、252W、252Y、271A、271C、271E、271F、271G、271H、271I、271K、271L、271M、271N、271P、271Q、271R、271S、271T、271V、271W、271Y、287A、287C、287D、287E、287F、287G、287H、287I、287K、287M、287N、287P、287Q、287R、287S、287T、287V、287W、287Y、292A、292C、292D、292E、292F、292G、292H、292I、292K、292M、292N、292P、292Q、292R、292S、292T、292V、292W、292Y、293A、293C、293D、293E、293F、293G、293H、293I、293K、293L、293M、293N、293P、293Q、293S、293T、293V、293W、293Y、296A、296C、296D、296E、296F、296G、296H、296I、296K、296L、296M、296N、296P、296Q、296S、296T、296V、296W、296Y、303A、303C、303D、303E、303F、303G、303H、303I、303K、303L、303M、303N、303Q、303R、303S、303T、303V、303W、303Y、334A、334C、334D、334E、334F、334G、334H、334I、334K、334L、334M、334N、334P、334Q、334R、334S、334V、334W、334Y、344A、344C、344D、344E、344F、344G、344I、344K、344L、344M、344N、344P、344Q、344R、344S、344T、344V、344W、344Y、373A、373C、373D、373E、373G、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373P、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、373Y、385A、385C、385D、385E、385F、385G、385H、385I、385K、385L、385M、385N、385Q、385R、385S、385T、385V、385W和385Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:868编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:868具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：M24A、M24C、M24D、M24E、M24F、M24F/G38F/T49V/H70K/E149T/I161L/R174E/L175Q/A189S/L193Q/L225M/E231Q/R243L/V252M/D271G/L287F/L292M/R293Q/R296S/P303A/T334D/H344S/F373Y/P385F、M24G、M24H、M24I、M24K、M24L、M24N、M24P、M24Q、M24R、M24S、M24T、M24V、M24W、M24Y、G38A、G38C、G38D、G38E、G38F、G38H、G38I、G38K、G38L、G38M、G38N、G38P、G38Q、G38R、G38S、G38T、G38V、G38W、G38Y、T49A、T49C、T49D、T49E、T49F、T49G、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49P、T49Q、T49R、T49S、T49V、T49W、T49Y、H70A、H70C、H70D、H70E、H70F、H70G、H70I、H70K、H70L、H70M、H70N、H70P、H70Q、H70R、H70S、H70T、H70V、H70W、H70Y、E149A、E149C、E149D、E149F、E149G、E149H、E149I、E149K、E149L、E149M、E149N、E149P、E149Q、E149R、E149S、E149T、E149V、E149W、E149Y、I161A、I161C、I161D、I161E、I161F、I161G、I161H、I161K、I161L、I161M、I161N、I161P、I161Q、I161R、I161S、I161T、I161V、I161W、I161Y、R174A、R174C、R174D、R174E、R174F、R174G、R174H、R174I、R174K、R174L、R174M、R174N、R174P、R174Q、R174S、R174T、R174V、R174W、R174Y、L175A、L175C、L175D、L175E、L175F、L175G、L175H、L175I、L175K、L175M、L175N、L175P、L175Q、L175R、L175S、L175T、L175V、L175W、L175Y、A189C、A189D、A189E、A189F、A189G、A189H、A189I、A189K、A189L、A189M、A189N、A189P、A189Q、A189R、A189S、A189T、A189V、A189W、A189Y、L193A、L193C、L193D、L193E、L193F、L193G、L193H、L193I、L193K、L193M、L193N、L193P、L193Q、L193R、L193S、L193T、L193V、L193W、L193Y、L225A、L225C、L225D、L225E、L225F、L225G、L225H、L225I、L225K、L225M、L225N、L225P、L225Q、L225R、L225S、L225T、L225V、L225W、L225Y、E231A、E231C、E231D、E231F、E231G、E231H、E231I、E231K、E231L、E231M、E231N、E231P、E231Q、E231R、E231S、E231T、E231V、E231W、E231Y、R243A、R243C、R243D、R243E、R243F、R243G、R243H、R243I、R243K、R243L、R243M、R243N、R243P、R243Q、R243S、R243T、R243V、R243W、R243Y、V252A、V252C、V252D、V252E、V252F、V252G、V252H、V252I、V252K、V252L、V252M、V252N、V252P、V252Q、V252R、V252S、V252T、V252W、V252Y、D271A、D271C、D271E、D271F、D271G、D271H、D271I、D271K、D271L、D271M、D271N、D271P、D271Q、D271R、D271S、D271T、D271V、D271W、D271Y、L287A、L287C、L287D、L287E、L287F、L287G、L287H、L287I、L287K、L287M、L287N、L287P、L287Q、L287R、L287S、L287T、L287V、L287W、L287Y、L292A、L292C、L292D、L292E、L292F、L292G、L292H、L292I、L292K、L292M、L292N、L292P、L292Q、L292R、L292S、L292T、L292V、L292W、L292Y、R293A、R293C、R293D、R293E、R293F、R293G、R293H、R293I、R293K、R293L、R293M、R293N、R293P、R293Q、R293S、R293T、R293V、R293W、R293Y、R296A、R296C、R296D、R296E、R296F、R296G、R296H、R296I、R296K、R296L、R296M、R296N、R296P、R296Q、R296S、R296T、R296V、R296W、R296Y、P303A、P303C、P303D、P303E、P303F、P303G、P303H、P303I、P303K、P303L、P303M、P303N、P303Q、P303R、P303S、P303T、P303V、P303W、P303Y、T334A、T334C、T334D、T334E、T334F、T334G、T334H、T334I、T334K、T334L、T334M、T334N、T334P、T334Q、T334R、T334S、T334V、T334W、T334Y、H344A、H344C、H344D、H344E、H344F、H344G、H344I、H344K、H344L、H344M、H344N、H344P、H344Q、H344R、H344S、H344T、H344V、H344W、H344Y、F373A、F373C、F373D、F373E、F373G、F373H、F373I、F373K、F373L、F373M、F373N、F373P、F373Q、F373R、F373S、F373T、F373V、F373W、F373Y、P385A、P385C、P385D、P385E、P385F、P385G、P385H、P385I、P385K、P385L、P385M、P385N、P385Q、P385R、P385S、P385T、P385V、P385W和P385Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:868编号。
在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶在表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和/或表5-1中提供的至少一个位置中包含至少一个突变，其中位置参考SEQ IDNO:2、94、350、442、540、646、758和/或868编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:14-1796中的偶数编号序列中列出的至少一种序列具有至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的多肽序列。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:14-1796中的偶数编号序列中列出的至少一种序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含SEQ ID NO:14-1796中的偶数编号序列中列出的至少一种序列。
在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:2的脂肪酶更具热稳定性。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶更具热稳定性。在一些实施方案中，重组脂肪酶在暴露于高温和/或低温后保留酶促活性。在一些另外的实施方案中，与参考序列相比，重组脂肪酶在暴露于高温和/或低温后保留更大的酶促活性。在一些实施方案中，参考序列是野生型脂肪酶，而在一些其他实施方案中，参考序列是另一种重组脂肪酶。
在一些实施方案中，重组脂肪酶在低pH环境中稳定和/或有活性，而在其他实施方案中，重组脂肪酶在高pH环境中稳定和/或有活性，并且在又另外的实施方案中，重组脂肪酶在中性pH环境中稳定和/或有活性。在一些实施方案中，重组脂肪酶在低pH环境和高pH环境中稳定和/或有活性，并且在一些另外的实施方案中，脂肪酶在低pH环境、中性pH环境和高pH环境中是稳定和/或有活性的。在一些实施方案中，重组脂肪酶在暴露于低、高和/或中性pH环境后保留酶促活性。在一些另外的实施方案中，与参考序列相比，重组脂肪酶在高pH环境、中性pH环境和/或低pH环境下更稳定和/或更具活性。在一些实施方案中，参考序列是野生型脂肪酶，而在其他实施方案中，参考序列是另一种工程化脂肪酶。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:2的脂肪酶在小于7的pH(即，在酸性pH条件或水平下)更稳定和/或更具活性。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶在小于pH7的pH(即，在酸性pH条件或水平下)更稳定和/或更具活性。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:2的脂肪酶在小于5的pH更稳定和/或更具活性。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:2的脂肪酶在pH5更稳定和/或更具活性。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或688的脂肪酶在pH 5更稳定和/或更具活性。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:2的脂肪酶在pH 3.5更稳定和/或更具活性。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶在pH 3.5更稳定和/或更具活性。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:2的脂肪酶在pH 3更稳定和/或更具活性。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶在pH 3更稳定和/或更具活性。在一些实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:2的脂肪酶更耐受蛋白水解。在一些实施方案中，重组脂肪酶比SEQ IDNO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶更耐受蛋白水解。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶耐受胰蛋白酶的蛋白水解。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ IDNO:2的脂肪酶更耐受胰蛋白酶的蛋白水解。在一些实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶更耐受胰蛋白酶的蛋白水解。在一些实施方案中，重组脂肪酶耐受胰凝乳蛋白酶的蛋白水解。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:2的脂肪酶更耐受胰凝乳蛋白酶的蛋白水解。在一些实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶更耐受胰凝乳蛋白酶的蛋白水解。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶耐受胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的蛋白水解。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:2的脂肪酶更耐受胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的蛋白水解。在一些实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶更耐受胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的蛋白水解。
在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶在至少一种胆盐的存在下比SEQ ID NO:2的脂肪酶更具活性。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶在至少一种胆盐的存在下比SEQID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶更具活性。在一些实施方案中，重组脂肪酶在暴露于胆盐后保留酶促活性。在一些另外的实施方案中，与参考序列相比，重组脂肪酶在暴露于胆盐后保留更大的酶促活性。在一些实施方案中，参考序列为SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶。在一些另外的实施方案中，胆盐是牛磺胆酸盐。
在又一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:2的脂肪酶在酸性pH更稳定和/或更具活性、更具热稳定性、更耐受蛋白水解和/或在至少一种胆盐的存在下更具活性。在又一些另外的实施方案中，脂肪酶在食品和/或饮料中是稳定的。在又一些另外的实施方案中，重组脂肪酶比SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶在酸性pH更稳定和/或更具活性、更具热稳定性、更耐受蛋白水解和/或在至少一种胆盐的存在下更具活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的脂肪酶相比，重组脂肪酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的耐受性和/或改进的在至少一种胆盐的存在下的活性。在一些实施方案中，与SEQID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶相比，重组脂肪酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的耐受性和/或改进的在至少一种胆盐的存在下的活性。在一些实施方案中，与SEQ IDNO:2的脂肪酶相比，重组脂肪酶表现出至少两种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的耐受性和/或改进的在至少一种胆盐的存在下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶相比，重组脂肪酶表现出至少两种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的蛋白水解的耐受性和/或改进的在至少一种胆盐的存在下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的脂肪酶相比，重组脂肪酶表现出至少三种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的耐受性和/或改进的在至少一种胆盐的存在下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶相比，重组脂肪酶表现出至少三种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的耐受性和/或改进的在至少一种胆盐的存在下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的脂肪酶相比，重组脂肪酶表现出以下改进的特性：改进的在酸性pH稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的耐受性和/或改进的在至少一种胆盐的存在下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶相比，重组脂肪酶表现出以下改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的耐受性和/或改进的在至少一种胆盐的存在下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的脂肪酶相比，重组脂肪酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的耐受性和/或改进的在至少一种胆盐的存在下的活性，以及至少一种另外的改进的特性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶相比，重组脂肪酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的耐受性和/或改进的在至少一种胆盐的存在下的活性，以及至少一种另外的改进的特性。在一些实施方案中，与参考序列相比，重组脂肪酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性；ii)增加的对酸性pH的耐受性；iii)增加的对pH 3.5的耐受性；iv)增加的对pH 3的耐受性；v)增加的对至少一种蛋白酶的耐受性；vi)增加的对至少一种胆盐的耐受性；vii)增加的热耐受性；或i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)和vii)的任何组合。在一些实施方案中，参考序列为SEQ ID NO:2，而在一些可选的实施方案中，参考序列选自SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和868。在一些实施方案中，与至少一种参考序列相比，重组脂肪酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性；ii)增加的对酸性pH的耐受性；iii)增加的对pH 3.5的耐受性；iv)增加的对pH3的耐受性；v)增加的对至少一种蛋白酶的耐受性；vi)增加的对至少一种胆盐的耐受性；vii)增加的热耐受性；或i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)和vii)的任何组合。在一些实施方案中，参考序列为SEQ ID NO:2，而在一些可选的实施方案中，参考序列选自SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和868。在一些实施方案中，与至少两种或更多种参考序列相比，重组脂肪酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性；ii)增加的对酸性pH的耐受性；iii)增加的对pH 3.5的耐受性；iv)增加的对pH 3的耐受性；v)增加的对至少一种蛋白酶的耐受性；vi)增加的对至少一种胆盐的耐受性；vii)增加的热耐受性；或i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)和vii)的任何组合。在一些实施方案中，蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶。在一些实施方案中，参考序列选自SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和868。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶是纯化的。
本发明还提供了编码至少一种本文提供的重组脂肪酶的多核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸序列是密码子优化的。在一些另外的实施方案中，重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:13-1795中的奇数编号序列中列出的至少一种序列具有至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的序列。在一些另外的实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO:13-1795中的奇数编号序列中列出的至少一种序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。在一些另外的实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO:13-1795中的奇数编号序列中列出的至少一种序列。在一些另外的实施方案中，重组多核苷酸序列包含选自SEQ IDNO:13-1795中的奇数编号序列的序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸序列包含选自SEQID NO:13-1795中的奇数编号序列的序列，其中所述序列编码本文提供的重组多肽。在一些实施方案中，重组多核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:13-1795中的奇数编号序列的序列，其中所述序列编码SEQ ID NO:14-1796中提供的偶数编号序列中提供的重组多肽。在一些另外的实施方案中，编码本文提供的重组脂肪酶的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:13-1795中的奇数编号序列中列出的至少一种序列具有至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的序列。在一些另外的实施方案中，编码本文提供的重组脂肪酶的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:13-1795中的奇数编号序列中列出的至少一种序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。在一些另外的实施方案中，编码本文提供的重组脂肪酶的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:13-1795中的奇数编号序列中列出的至少一种序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，其中重组脂肪酶包含含有SEQ ID NO:14-1796中提供的偶数编号序列的多肽序列。
本发明还提供了包含至少一种本文提供的重组多核苷酸序列的表达载体。本发明还提供了表达载体，所述表达载体包含编码至少一种本文提供的重组脂肪酶的至少一种重组多核苷酸序列。在一些另外的实施方案中，重组多核苷酸序列可操作地连接至控制序列。在一些实施方案中，控制序列是启动子。在一些另外的实施方案中，启动子是异源启动子。
本发明还提供了包含至少一种本文提供的表达载体的宿主细胞。本发明还提供包含至少一种表达载体的宿主细胞，所述至少一种表达载体包含至少一种编码至少一种本文提供的重组脂肪酶的重组多核苷酸序列。本发明还提供了包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含至少一种编码至少一种本文提供的重组脂肪酶的重组多核苷酸序列。本发明还提供包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含至少一种编码本文提供的重组脂肪酶的重组多核苷酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞是真核的，而在一些可选的实施方案中，宿主细胞是原核的。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。在一些可选的实施方案中，宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
本发明还提供了产生至少一种重组脂肪酶的方法，该方法包括在产生由重组多核苷酸编码的重组脂肪酶的条件下培养至少一种本文提供的宿主细胞。在一些实施方案中，方法还包括回收脂肪酶的步骤。在又一些另外的实施方案中，方法还包括纯化脂肪酶的步骤。
本发明还提供了包含至少一种本文提供的重组脂肪酶的组合物。在一些实施方案中，包含至少一种重组脂肪酶的组合物包括药物组合物。在一些另外的实施方案中，药物组合物适用于胰功能不全(pancreatic insufficiency)的治疗。在一些另外的实施方案中，药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物适用于肠胃外注射和/或输注至人类。在一些另外的实施方案中，药物组合物适用于口服施用至人类。在一些另外的实施方案中，药物组合物适用于以其他方式施用至人类。本发明还提供了包含至少一种本文提供的重组脂肪酶的组合物，其中该组合物适用于其他用途。
本发明还提供了用于治疗和/或预防受试者中胰功能不全的症状的方法，该方法包括提供具有胰功能不全的受试者，并向受试者提供本文提供的药物组合物。在一些实施方案中，在向受试者施用包含至少一种重组脂肪酶的组合物后，受试者的胰功能不全症状得到改善。在一些另外的实施方案中，药物组合物还包含至少一种蛋白酶。在一些另外的实施方案中，药物组合物还包含至少一种淀粉酶。在又一些另外的实施方案中，药物组合物还包含至少一种蛋白酶和至少一种淀粉酶。
在一些另外的实施方案中，受试者能够食用比由表现出胰功能不全的症状的受试者所需要的饮食在脂质含量方面的限制更少的饮食。在一些另外的实施方案中，受试者是婴儿，而在一些其他实施方案中，受试者是儿童。在又一些另外的实施方案中，受试者是成年人，而在一些可选的实施方案中，受试者是年轻人。本发明还提供包含至少一种本文提供的重组脂肪酶的药物。
在一些实施方案中，本发明提供了用于分解脂肪和/或脂质的方法，该方法包括提供至少一种脂肪和/或脂质和至少一种本发明的工程化脂肪酶，以及在脂肪和/或脂质被分解的条件下将脂肪和/或脂质暴露于至少一种工程化脂肪酶。在一些另外的实施方案中，本发明提供了用于分解脂肪和/或脂质的方法，该方法包括提供至少一种脂肪和/或脂质和包含至少一种本发明的工程化脂肪酶的组合物，以及在分解脂肪和/或脂质的条件下将脂肪和/或脂质暴露于包含至少一种工程化脂肪酶的组合物。本发明还提供了包含至少一种本文提供的重组脂肪酶的组合物的用途。本发明提供了用于脂肪和/或脂质水解的方法，该方法包括提供脂肪和/或脂质和至少一种本文提供的工程化脂肪酶；以及在使得所述脂肪和/或脂质被所述工程化脂肪酶水解的条件下将所述脂肪和/或脂质暴露于所述工程化脂肪酶。在一些另外的实施方案中，本发明提供了用于脂肪和/或脂质水解的方法，该方法包括提供脂肪和/或脂质和包含至少一种本文提供的工程化脂肪酶的组合物；以及在使得所述脂肪和/或脂质被所述组合物的所述工程化脂肪酶水解的条件下将所述脂肪和/或脂质暴露于所述组合物。
发明描述
本发明提供了工程化脂肪酶多肽及其组合物。工程化脂肪酶多肽已被优化以提供改进的热稳定性、蛋白酶稳定性以及在一定范围的pH条件包括酸性(pH<7)条件下的稳定性。本发明还涉及包含工程化脂肪酶多肽的组合物用于治疗目的的用途。在一些实施方案中，本发明的脂肪酶变体可用于PEI状况的PERT治疗。在一些另外的实施方案中，脂肪酶以不需要肠溶包衣和/或质子泵抑制剂(PPI)的形式施用。本发明还提供了编码工程化脂肪酶多肽的多核苷酸，以及制备工程化多核苷酸和脂肪酶多肽的方法。
缩写和定义：
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，本文使用的命名法和下文描述的细胞培养、分子遗传学、微生物学、有机化学、分析化学和核酸化学中的实验程序是本领域熟知的并且普遍地采用的那些。这样的技术是熟知的，并且在本领域技术人员熟知的许多教科书和参考著作中进行了描述。对于化学合成和化学分析使用了标准技术或其修改形式。本文(上文和下文两者)提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，在此通过引用明确并入本文。
尽管本发明的实践中可使用类似或等同于本文描述的那些的任何合适的方法和材料，本文描述了一些方法和材料。应理解，本发明不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以根据本领域技术人员使用它们的情况而改变。因此，以下紧接着定义的术语通过参考本申请整体被更充分地描述。本文(上文和下文两者)提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，在此通过引用明确并入本文。
如本文使用的，单数“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指示。
数值范围包括限定该范围的数字。因此，本文公开的每个数值范围意图包括落在这样的较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同这样的较窄数值范围在本文被全部清楚地写出。还意图本文公开的每个最大的(或最小的)数值限制包含每个较低(或较高)的数值限制，如同这样的较低(或较高)数值限制在本文被清楚地写出。
术语“约”意指特定值的可接受的误差。在一些实例中，“约”意指在给定值范围的0.05％、0.5％、1.0％或2.0％内。在一些实例中，“约”意指在给定值的1、2、3或4个标准差内。
此外，本文所提供的标题不是可通过参考本申请作为整体而被具有的本发明的各个方面或实施方案的限制。因此，下面即将定义的术语通过参考本申请作为整体而被更充分地描述。尽管如此，为了便于理解本发明，许多术语定义如下。
除非另外指示，核酸以5’至3’方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基方向从左至右书写。
如本文使用的，术语“包含(comprising)”及其同源词以其包含性含义被使用(即等同于术语“包括(including)”及其对应的同源词)。
如本文使用的，“EC”编号是指生物化学和分子生物学国际联合命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology)(NC-IUBMB)的酶命名法。该IUBMB生化分类是基于酶催化的化学反应的酶数字分类系统。
如本文使用的，“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，其生物保藏收集物包括基因和菌株。
如本文使用的，“NCBI”是指美国国家生物技术信息中心(National Center forBiological Information)和其中提供的序列数据库。
如本文使用的，“脂肪酶”是指任何通常称为“脂肪酶”的酶，其通过水解甘油三酯的酯键来催化脂肪的水解。胰脂肪酶在分解脂肪为脂肪酸、甘油和其他醇方面是重要的。脂肪酶是大多数生物体中膳食脂质的消化、运输和加工中必不可少的。
如本文使用的，术语“脂质”是指一类不溶于水的大分子，其包括脂肪酸及其酯、固醇、萜醇、某些难溶维生素和其他相关化合物。“脂肪”是由脂肪酸酯(例如，甘油三酯，其由甘油和三个脂肪酸组成)组成的脂质的子集。不意图本发明受限于任何特定的脂质和/或脂肪。考虑上下文，本文中术语“脂肪”和“脂质”可互换使用。
如本文使用的，“蛋白酶(protease)”(以及“蛋白酶(proteinase)”和“肽酶”)是指水解蛋白质的许多酶。有许多蛋白酶参与蛋白质分解成较小的多肽单元或单个氨基酸。蛋白酶对许多生物功能，包括摄入的蛋白质的消化、蛋白质分解代谢和细胞信号传导都很重要。
“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用，以表示无论长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)，通过酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物。
“氨基酸”通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号在本文被提及。同样地，核苷酸可以通过其通常可接受的单字母代码被提及。
当关于细胞、多核苷酸或多肽使用时，术语“工程化”、“重组”、“非天然存在的”和“变体”是指如下材料或与该材料的天然或自然形式对应的材料：已经以自然界中本来不存在的方式被修饰或与其相同但从合成材料产生或衍生和/或通过使用重组技术操作产生或衍生。
重组多肽可以使用本领域已知的任何合适的方法产生。编码感兴趣的野生型多肽的基因可以在载体例如质粒中克隆，并在期望的宿主中表达，例如大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(S.cerevisiae)等。重组多肽的变体可以通过本领域已知的各种方法产生。事实上，存在本领域技术人员熟知的各种各样不同的诱变技术。此外，诱变试剂盒还可从许多商业分子生物学供应商获得。产生确定的氨基酸(定点)处的特定取代、基因的局部区域中的特异性(区域特异性)或随机突变，或整个基因内的随机诱变(例如，饱和诱变)的方法是可得的。本领域的技术人员已知产生酶变体的许多合适的方法，包括但不限于，使用PCR对单链DNA或双链DNA定点诱变、盒式诱变、基因合成、易错PCR、改组，和化学饱和诱变，或本领域已知的任何其他合适的方法。用于DNA和蛋白工程化的方法的非限制性实例在以下专利中提供：美国专利第6,117,679号；美国专利第6,420,175号；美国专利第6,376,246号；美国专利第6,586,182号；美国专利第7,747,391号；美国专利第7,747,393号；美国专利第7,783,428号和美国专利第8,383,346号。产生变体后，可以对它们筛选任何期望的特性(例如，高或增加的活性、或者低或减少的活性、增加的热活性、增加的热稳定性和/或酸性pH稳定性等)。在一些实施方案中，可使用“重组脂肪酶多肽”(在本文中还称为“工程化脂肪酶多肽”、“变体脂肪酶”和“脂肪酶变体”)。
如本文使用的，“野生型”和“天然存在的”是指在自然界中发现的形式。例如，野生型多肽或多核苷酸序列为生物体中存在的序列，其可从天然来源分离且未通过人为操纵被有意地修饰。
如本文使用的，“编码序列”是指核酸(例如基因)编码蛋白质的氨基酸序列的部分。
术语“序列同一性百分比(％)”在本文中用于指多核苷酸或多肽之间的比较，并通过比较比较窗中两条最佳比对的序列确定，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗中的部分与参考序列相比可以包括添加或缺失(即，空位)，以用于两个序列的最佳比对。百分比可以通过如下计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。可选地，百分比可以通过如下计算：确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基或者核酸碱基或氨基酸残基与空位对齐的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。本领域技术人员理解，存在许多可用于比对两个序列的已建立的算法。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过以下进行：通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482[1981])，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443[1970])，通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444[1988])，通过这些算法的计算机化实现(例如，GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者通过目视检查，如本领域已知的。适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例包括但不限于BLAST和BLAST 2.0算法，由Altschul等人描述(分别参见Altschul等人,J.Mol.Biol.,215:403-410[1990]；和Altschul等人,Nucleic Acids Res.,3389-3402[1977])。公众可通过美国国家生物技术信息中心网站获得用于进行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某一正值的阀值评分T。T被称为邻近字评分阈值(参见，Altschul等人，上文)。这些最初的邻近字击中(word hit)充当启动搜索的种子以找到包含它们的更长HSP。然后字击中沿着每个序列的两个方向延伸直到累积比对评分不能增加的程度。对于核苷酸序列，累积评分使用参数M(用于匹配残基对的奖励评分；总是＞0)和N(用于错配残基的惩罚评分；总是＜0)计算。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积评分。在以下情况时，停止字击中在每一个方向的延伸：累积比对评分从其最大达到值下降了量X；由于累积了一个或更多个负评分残基比对，累积得分达到0或小于0；或到达任一序列末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下作为默认值：字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下作为默认值：字长(W)为3，期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见，Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915[1989])。序列比对与％序列同一性的示例性确定可以使用GCG Wisconsin软件包(Accelrys、Madison WI)中的BESTFIT或GAP程序，使用提供的默认参数。
如本文使用的，“参考序列”是指用作序列比较的基础的确定序列。参考序列可以是更大序列的子集，例如，全长基因或多肽序列的区段(segment)。通常，参考序列为至少20个核苷酸或氨基酸残基的长度、至少25个残基的长度、至少50个残基的长度、至少100个残基的长度或者核酸或多肽的全长。因为两个多核苷酸或多肽可以各自(1)包含两个序列之间相似的序列(即，完整序列的一部分)，和(2)还可以包含两个序列之间不同的(divergent)序列，所以两个(或更多个)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过比较两个多核苷酸或多肽在“比较窗”中的序列以鉴定和比较局部区域的序列相似性来进行。在一些实施方案中，“参考序列”可以基于一级氨基酸序列(primary amino acid sequence)，其中参考序列是可以在一级序列中具有一个或更多个变化的序列。“比较窗”是指至少约20个连续核苷酸位置或氨基酸残基的概念性区段，其中序列可以与至少20个连续核苷酸或氨基酸的参考序列进行比较，并且其中在比较窗口中序列的一部分与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，可包括20％或更少的添加或缺失(即，空位)。比较窗可以比20个连续残基更长，并任选地包括30、40、50、100或更长的窗。
在用于指定的氨基酸或多核苷酸序列的编号的情况下，“对应于”、“参考于”或“相对于”指当指定的氨基酸或多核苷酸序列与参考序列相比较时指定的参考序列残基的编号。换言之，给定聚合物的残基编号或残基位置关于参考序列被指定，而不是通过给定氨基酸或多核苷酸序列内残基的实际数字位置被指定。例如，给定氨基酸序列，诸如工程化脂肪酶的氨基酸序列可以通过引入空位以与参考序列对齐，来优化两个序列之间的残基匹配。在这些情况中，尽管存在空位，给定氨基酸或多核苷酸序列中残基的编号是关于与其比对的参考序列进行的。
如本文使用的，“突变”是指多肽或多核苷酸序列的任何变化。意图包括序列中存在的任何数量(即，一个或更多个)的取代、插入、缺失和/或重排(即，与起始或参考序列相比)。因此，序列中的突变导致变体多肽(例如，变体或重组脂肪酶)的产生，如本文所提供的。
如本文使用的，“氨基酸差异”或“残基差异”是指多肽序列的一个位置处的氨基酸残基相对于参考序列中对应位置处的氨基酸残基的差异。本文中氨基酸差异的位置通常被称为“Xn”，其中n指的是残基差异所基于的参考序列中的对应位置。例如，“与SEQ ID NO:2相比位置X92处的残基差异”是指对应于SEQ ID NO:2的位置92的多肽位置处的氨基酸残基的差异。因此，如果SEQ ID NO:2的参考多肽在位置92处具有苏氨酸，那么“与SEQ ID NO:2相比在位置X92处的残基差异”意指在对应于SEQ ID NO:2的位置92的多肽位置处的除了苏氨酸之外的氨基酸残基(例如，T92A)。在本文的大多数情况下，在一个位置处的特定氨基酸残基差异指示为“XnY”，其中“Xn”指定如上文描述的对应位置，并且“Y”是在工程化多肽中发现的氨基酸(即，与参考多肽中的不同的残基)的单字母标识符。在一些情况下(例如，如表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和/或表5-1中)，本公开内容还提供由常规符号“AnB”表示的特定氨基酸差异，其中A是参考序列中的残基的单字母标识符，“n”是在参考序列中的残基位置的编号，并且B是工程化多肽的序列中残基取代的单字母标识符。在一些情况下，本公开内容的多肽可以包含相对于参考序列的一个或更多个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异由相对于参考序列存在残基差异的指定位置的列表指示。在一些实施方案中，在多于一个氨基酸可以用于多肽的具体残基位置中时，可以使用的各种氨基酸残基由“/”分开(例如，X2H/X2M/X2T或X2H/M/T或E2H/M/T)。在一些实施方案中，酶变体包含多于一个取代。为了便于阅读，这些取代由斜线分开(例如，Y27V/F385P)。本申请包括包含一个或更多个氨基酸差异的工程化多肽序列，所述一个或更多个氨基酸差异包括保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代的任一种/或两者。
如本文使用的，“保守氨基酸取代”是指用具有相似侧链的不同残基取代残基，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。例如但不限于，具有脂肪族侧链的氨基酸可以被另一种脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)取代；具有羟基侧链的氨基酸被另一种具有羟基侧链的氨基酸(例如，丝氨酸和苏氨酸)取代；具有芳香族侧链的氨基酸被另一种具有芳香族侧链的氨基酸(例如，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸)取代；具有碱性侧链的氨基酸被另一种具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸和精氨酸)取代；具有酸性侧链的氨基酸被另一种具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)取代；和/或疏水氨基酸或亲水氨基酸分别被另一种疏水氨基酸或亲水氨基酸取代。
如本文使用的，“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸取代多肽中的氨基酸。非保守取代可以使用定义的组之间而不是之内的氨基酸，并且影响：(a)取代区域中的肽骨架的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)，(b)电荷或疏水性，或(c)侧链体积。例如但不限于，示例性非保守取代可以是用碱性或脂肪族氨基酸取代酸性氨基酸；用小氨基酸取代芳族氨基酸；和用疏水氨基酸取代亲水氨基酸。
如本文使用的，“缺失”是指通过从参考多肽去除一个或更多个氨基酸对多肽进行的修饰。缺失可以包括去除1个或更多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸或者20个或更多个氨基酸、多达组成参考酶的氨基酸总数的10％或多达氨基酸总数的20％，同时保留酶促活性和/或保留工程化酶的改进的性质。缺失可以涉及多肽的内部部分和/或末端部分。在各种实施方案中，缺失可以包括连续的区段或可以是不连续的。
如本文使用的，“插入”是指通过向参考多肽添加一个或更多个氨基酸对多肽进行的修饰。插入可以处于多肽的内部部分或者到羧基或氨基末端。如本文使用的插入包括如本领域已知的融合蛋白。插入可以是氨基酸的连续区段，或被天然存在的多肽中的一个或更多个氨基酸分开。
如本文使用的，在多核苷酸序列上下文中使用的星号(*)指示多核苷酸序列中终止密码子的存在。在一些实施方案中，由于终止密码子的存在，与起始或参考序列相比，变体蛋白酶是截短的。
在本文中可互换使用的“功能片段”和“生物活性片段”是指这样的多肽：所述多肽具有氨基末端缺失和/或羧基末端缺失和/或内部缺失(例如，序列是截短的)，但其中剩余的氨基酸序列与和它进行比较的序列(例如，本发明的全长工程化脂肪酶)中的对应位置相同，并且保留全长多肽的基本上全部活性。
如本文使用的，“分离的多肽”是指与天然伴随其的其他污染物(例如蛋白质、脂质和多核苷酸)基本上分开的多肽。该术语包括已经从其天然存在的环境或表达系统(例如，宿主细胞或体外合成)中取出或纯化的多肽。重组脂肪酶多肽可以存在于细胞内、存在于细胞培养基中，或以各种形式(诸如裂解物或分离的制品)制备。因此，在一些实施方案中，重组脂肪酶多肽可以是分离的多肽。
术语“分离的”和“纯化的”用于指分子(例如，分离的核酸、多肽等)或其他组分从与其天然缔合的至少一种其他组分中取出。术语“纯化的”不要求绝对纯度，而是意在作为相对定义。
如本文使用的，“基本上纯的多肽”是指如下组合物，在所述组合物中多肽物质是存在的主要物质(即，在摩尔或重量基础上，它比该组合物中的任何其他单独的大分子物质更丰富)，并且当目标物质构成存在的大分子物质的按摩尔或％重量计至少约50％时，通常是基本上纯化的组合物。通常，基本上纯的脂肪酶组合物构成该组合物中存在的所有大分子物质的按摩尔或％重量计约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约95％或更多以及约98％或更多。在一些实施方案中，将目标物质从起始制品纯化至基本同质(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测出污染物物质)，其中该组合物基本上由单一大分子物质组成。溶剂物质、小分子(<500道尔顿)和元素离子物质不被认为是大分子物质。在一些实施方案中，分离的重组脂肪酶多肽是基本上纯的多肽组合物。在一些实施方案中，分离的重组脂肪酶多肽是基本上纯的多肽组合物。在一些实施方案中，基本上纯的重组脂肪酶多肽制品被添加到适用于本发明的制剂中(例如，多糖、表面活性剂等)。
如本文使用的，术语“改进的酶特性”和“改进的特性”是指与参考脂肪酶多肽和/或野生型脂肪酶多肽或另一种工程化脂肪酶多肽相比，工程化脂肪酶多肽的特性包括任何酶特性的改进。改进的特性包括但不限于诸如以下的特性：增加的蛋白表达、增加的热活性(thermoactivity)、增加的热稳定性、增加的pH活性、增加的稳定性、增加的酶促活性、增加的底物特异性或亲和力、增加的比活性、增加的对底物或终产物抑制的耐受性、增加的化学稳定性、改进的化学选择性、改进的溶剂稳定性、增加的对酸性或碱性pH的耐受性、增加的对蛋白水解活性的耐受性(即，降低的对蛋白水解的敏感性)、降低的聚集、增加的溶解度、降低的免疫原性、改进的翻译后修饰(例如，糖基化)和改变的温度谱(temperatureprofile)。
如本文使用的，“增加的酶促活性”或“增强的催化活性”是指工程化脂肪酶多肽的改进的特性，其可以被表示为与参考脂肪酶相比，比活性(例如，产生的产物/时间/重量蛋白)的增加或底物向产物的转化百分比(例如，使用指定量的脂肪酶，在指定的时间段内，起始量的底物向产物的转化百分比)的增加。在实施例中提供了确定酶活性的示例性方法。与酶活性相关的任何特性都可以被影响，包括经典的酶特性Km、Vmax或kcat，其改变可以导致酶促活性的增加。酶活性的改进可以是从对应野生型酶的酶促活性的约1.1倍至多达天然存在的脂肪酶或从其衍生脂肪酶多肽的另一种工程化脂肪酶的2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍或更多的酶活性。
脂肪酶活性可以通过本领域已知的任何合适的方法来测量(例如，标准测定，诸如监测反应物或产物的分光光度特性的变化)。在一些实施方案中，可以通过组合UV吸光度的高效液相色谱(HPLC)分离来测量产生的产物的量。在一些实施方案中，可以使用
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质谱仪来测量产生的产物的量，而在一些其他实施方案中，可以使用本领域已知的可选的方法来测量产物。酶活性的比较使用定义的酶制品、在设定条件下的定义的测定和一种或更多种定义的底物进行，如本文进一步详细描述的。
如本文使用的，术语“蛋白酶稳定的”和“对蛋白水解的稳定性”是指蛋白质(例如，本发明的重组脂肪酶)发挥作用和承受由任何蛋白水解酶或其他蛋白水解化合物或因子介导的蛋白水解，并在暴露于蛋白酶后保留其功能的能力。不意图该术语受限于使用任何特定的蛋白酶来评估蛋白质的稳定性。实际上，本发明的工程化脂肪酶是稳定的，并且在各种蛋白酶存在下或暴露于各种蛋白酶后保留酶促活性。在一些实施方案中，工程化脂肪酶在胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和/或胃蛋白酶存在下是稳定的。然而，不意图本发明受限于任何特定的蛋白酶或任何特定的评估蛋白水解稳定性的方法。
如本文使用的，术语“pH稳定性”是指蛋白质(例如，本发明的重组脂肪酶)在特定pH孵育后发挥作用的能力。在一些实施方案中，本发明提供在一定范围的pH(包括但不限于pH2至pH7的范围)稳定的重组脂肪酶。在一些实施方案中，重组脂肪酶在不同的pH范围是稳定的，如本文提供的实施例中所示。不意图本发明受限于任何pH稳定性水平或pH范围。
如本文使用的，术语“改进的对酸性pH的耐受性”意指与参考脂肪酶或另一种酶相比，根据本发明的重组脂肪酶将具有增加的稳定性(在暴露于酸性pH指定的时间段[例如，1小时，最多24小时，等]后，在约pH 7、6、5、4、3、2或甚至更低pH保留更高的活性)。
如本文使用的“生理pH”意指通常在受试者(例如，人类)的血液内发现的pH范围(例如，pH 7.2-7.4)。
术语“碱性pH”(例如，提及改进的对碱性pH条件的稳定性或增加的对碱性pH的耐受性使用的)意指约7至11的pH范围，或者在一些实施方案中，大于pH 11。
术语“酸性pH”(例如，提及改进的对酸性pH条件的稳定性或增加的对酸性pH的耐受性使用的)意指包括任何pH值小于7的pH范围。在一些实施方案中，酸性pH小于7，而在一些其他实施方案中，pH小于约6、5、4、3、2或更低。在一些可选的实施方案中，本发明的重组脂肪酶在2至4的pH水平是稳定的。然而，不意图本发明受限于任何特定的pH值或值范围。
如本文使用的，措辞“胃挑战(gastric challenge)”是指将本发明的重组脂肪酶暴露于低pH环境和至少一种酶(例如胃蛋白酶)的存在，使得重组脂肪酶暴露于胃(例如，人类的胃)中可能遇到的条件。
如本文使用的，措辞“肠挑战”是指将本发明的重组脂肪酶暴露于中性pH环境和肠蛋白酶(诸如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)的存在，以及至少一种胆盐(例如，牛磺胆酸钠)，使得重组脂肪酶暴露于肠(例如，人类的肠)中可能遇到的条件。
如本文使用的，措辞“多个顺序挑战”是指将本发明的重组脂肪酶暴露于一系列挑战条件。例如，在一些实施方案中，一小时的热挑战之后是一小时的胃挑战，并且然后是一小时的肠挑战。不意图本发明受限于任何特定的挑战和/或挑战条件或者特定的挑战顺序。
术语“热稳定性(thermal stability)”和“热稳定性(thermostability)”是指蛋白质(例如，本发明的重组脂肪酶)在特定温度发挥作用的能力。在一些实施方案中，该术语指蛋白质在特定温度孵育后发挥作用的能力。在一些实施方案中，本发明的重组脂肪酶是“耐热的”(即，酶在升高的温度保持其催化活性)。在一些实施方案中，重组脂肪酶在升高的温度耐受失活，并且在一些另外的实施方案中，在升高的温度持续延长的暴露时间保持催化活性。这些术语在本文中可互换使用。不意图本发明受限于任何特定温度和/或暴露时间。这样的稳定性可以通过本领域中已知的任何方法(例如，本文描述的方法)来测量。不意图本发明受限于任何特定的温度稳定性水平或温度范围。在一些实施方案中，在特定温度孵育蛋白质(例如，本发明的重组脂肪酶)后测量热稳定性。
术语“化学稳定性”是指蛋白质(例如，本发明的重组脂肪酶)在对另一蛋白质的功能产生不利影响的化学物质存在下发挥作用的能力。不意图本发明受限于任何特定的化学稳定性水平或化学稳定性范围。
“转化”是指底物向对应产物的酶促转化(或生物转化)。“转化百分比”是指在指定条件下在一定时间段内被转化为产物的底物的百分比。因此，脂肪酶多肽的“酶促活性”或“活性”可以表示为特定时间段内底物转化为产物的“转化百分比”。
如本文使用的，“杂交严格性”是指核酸杂交中的杂交条件，诸如洗涤条件。通常，杂交反应在较低严格性的条件下进行，随后是不同的但较高严格性的洗涤。术语“中度严格杂交”是指允许靶DNA结合以下互补核酸的条件，所述互补核酸与靶DNA具有约60％同一性、优选地约75％同一性、约85％同一性，与靶多核苷酸具有大于约90％同一性。示例性中度严格条件是等同于在50％甲酰胺、5×Denhart溶液、5×SSPE、0.2％SDS中在42℃杂交，随后在0.2×SSPE、0.2％SDS中在42℃洗涤的条件。“高严格性杂交”通常是指与如对限定的多核苷酸序列在溶液条件下确定的热解链温度Tm相差约10℃或更小的条件。在一些实施方案中，高严格性条件是指仅允许在0.018M NaCl中在65℃形成稳定杂交体的那些核酸序列的杂交的条件(即，如果杂交体在0.018M NaCl中在65℃是不稳定的，它在如本文预期的高严格性条件下将是不稳定的)。可以提供高严格性条件，例如，通过在等同于在50％甲酰胺、5×Denhart溶液、5×SSPE、0.2％SDS在42℃的条件杂交，然后在0.1×SSPE和0.1％SDS中在65℃洗涤提供。另一种高严格性条件是在等同于在含有0.1％(w/v)SDS的5X SSC中在65℃杂交的条件进行杂交和在含有0.1％SDS的0.1×SSC中在65℃洗涤。其他高严格性杂交条件以及中度严格条件在上文引用的参考文献中描述。
如本文使用的，“载体”是用于将DNA序列引入细胞中的DNA构建体。在一些实施方案中，载体是可操作地连接至能够实现DNA序列中编码的多肽在合适宿主中的表达的合适的控制序列的表达载体。在一些实施方案中，质粒可用作载体。在一些实施方案中，“表达载体”具有可操作地连接至DNA序列(例如，转基因)以驱动在宿主细胞中表达的启动子序列，并且在一些实施方案中，还包含转录终止子序列。
如本文使用的，“密码子优化的”是指编码蛋白的多核苷酸的密码子改变为在特定生物体中优先使用的那些密码子，使得编码的蛋白在感兴趣的生物体中更有效地表达。尽管遗传密码是简并的，即大多数氨基酸由被称为“同义”(“synonyms”)或“同义”(“synonymous”)密码子的若干密码子表示，但熟知的是，特定生物体的密码子使用是非随机的和对于特定的密码子三联体是有偏倚的。就给定基因、具有共同功能或祖先起源的基因、高表达的蛋白对比低拷贝数蛋白和生物体的基因组的聚集蛋白编码区而言，这种密码子使用偏倚可能更高。在一些实施方案中，编码脂肪酶的多核苷酸可以被密码子优化以用于从所选择的用于表达的宿主生物体优化产生。
如本文使用的，“控制序列”在本文中是指对本申请的多核苷酸和/或多肽的表达必要或有利的所有组分。每一个控制序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然的或外来的。这样的控制序列包括但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列、起始序列和转录终止子。最低程度而言，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入特定限制性位点的目的，控制序列可以与接头一起提供，所述特定限制性位点促进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区的连接。
“可操作地连接的”在本文被定义为如下配置：在所述配置中控制序列被适当地放置(即，以功能关系)在相对于感兴趣的多核苷酸的位置处，使得控制序列指导或调节感兴趣的多核苷酸和/或多肽的表达。
如本文使用的，“启动子序列”是指被宿主细胞识别用于表达感兴趣的多核苷酸诸如编码序列的核酸序列。启动子序列包含介导感兴趣的多核苷酸的表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示出转录活性的任何核酸序列，包括突变体、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
如本文使用的，措辞“合适的反应条件”是指在酶促转化反应溶液中的那些条件(例如，酶载量、底物载量、温度、pH、缓冲液、助溶剂等的范围)，在该条件下本申请的脂肪酶多肽能够将底物转化为期望的产物化合物。示例性的“合适的反应条件”被提供于本申请中并且通过实施例来说明。
如本文使用的，“载量”，诸如在“化合物载量”或“酶载量”中，是指在反应起始时组分在反应混合物中的浓度或量。
如本文使用的，在酶促转化反应过程的上下文中，“底物”是指脂肪酶多肽所作用于的化合物或分子。
如本文使用的，在酶促转化过程的上下文中，“产物”是指从酶多肽对底物发挥的作用而产生的化合物或分子。
如本文使用的，术语“表达”包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰。在一些实施方案中，该术语还涵盖多肽从细胞的分泌。
如本文使用的，术语“产生”是指蛋白和/或其他化合物从细胞的产生。意在该术语涵盖参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰。在一些实施方案中，该术语还涵盖多肽从细胞的分泌。
如本文使用的，如果氨基酸或核苷酸序列(例如，启动子序列、信号肽、终止子序列等)与它可操作地连接至的另一个序列在自然界中未缔合，则这两个序列是“异源的”。
如本文使用的，术语“宿主细胞”和“宿主菌株”是指用于包含本文提供的DNA(例如，编码脂肪酶变体的多核苷酸)的表达载体的合适的宿主。在一些实施方案中，宿主细胞是已经用使用如本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核细胞或真核细胞。
如本文使用的，术语“类似物”是指与参考多肽具有多于70％序列同一性，但少于100％序列同一性(例如，多于75％、78％、80％、83％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性)的多肽。在一些实施方案中，“类似物”包括含有一个或更多个非天然存在的氨基酸残基(包括但不限于高精氨酸、鸟氨酸和正缬氨酸)以及天然存在的氨基酸的多肽。在一些实施方案中，类似物还包括一个或更多个D-氨基酸残基和两个或更多个氨基酸残基之间的非肽键。
如本文使用的，术语“培养”是指细胞群体在任何合适的条件(例如，使用液体、凝胶或固体培养基)下的生长。在一些实施方案中，细胞是微生物细胞(例如，细菌)，而在一些其他实施方案中，细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或从另一种动物获得的细胞。不意图本发明受限于任何特定的细胞或细胞类型的培养或者任何特定的培养方法。实际上，意图本发明包括在任何合适的条件下培养的任何合适的细胞类型。
术语“治疗剂”是指向显示出病理学迹象或症状的受试者施用的提供有益或期望的效应(包括医学效应)的化合物。
术语“药物组合物”是指包含药学有效量的由本发明所包括的工程化脂肪酶多肽和可接受的载体的适用于受试者(例如，人类)的药物用途的组合物。
术语“有效量”意指足以产生期望的结果的量。本领域普通技术人员可以通过使用常规实验确定有效量是多少。
术语“受试者”包括动物，包括但不限于哺乳动物诸如人类、非人类灵长目动物、家畜、宠物和实验动物(例如，啮齿动物和兔形目动物)。意图的是该术语包括雌性以及雄性。
如本文使用的，术语“患者”意指正在被评估、治疗或正在经历疾病的任何受试者。
术语“婴儿”是指在出生之后第一个月至约一(1)岁的时期内的儿童。
如本文使用的，术语“新生儿”是指在从出生至生命的第28天的时期内的儿童。术语“早产婴儿”是指妊娠第二十个完整周之后但在妊娠期满之前出生的婴儿，通常在出生时体重～500至～2499克。“极低出生体重婴儿”是在出生时体重少于1500g的婴儿。
如本文使用的，术语“儿童”是指对于同意治疗或研究程序未达到法定年龄的人。在一些实施方案中，该术语是指在出生和青春期的时期之间的人。
如本文使用的，术语“成人”是指对于相关司法权已经达到法定年龄的人(例如，在美国为18岁)。在一些实施方案中，该术语是指任何完全发育成熟的生物体。在一些实施方案中，术语“年轻人”是指小于18岁但已经达到性成熟的人。
如本文使用的，“组合物”和“制剂”包括意图用于任何合适的用途(例如，药物组合物、膳食/营养补充剂、饲料等)的包含至少一种本发明的工程化脂肪酶的产物。
如本文使用的，术语“施用(administration)”和“施用(administering)”组合物意指向受试者(例如，遭受胰功能不全的效应的人)提供本发明的组合物。
当在本文中关于药物组合物使用时，术语“载体”意指标准药物载体、缓冲剂和赋形剂诸如稳定剂、防腐剂和佐剂中的任一种。
术语“药学上可接受的”意指可以向受试者施用而不引起任何不良生物效应或以有害的方式与在其中它被包含的组分的任何一种相互作用并且拥有期望的生物活性的材料。
如本文使用的，术语“赋形剂”是指任何药学上可接受的添加剂、载体、稀释剂、佐剂或其他成分，而不是活性药物成分(API；例如，本发明的工程化脂肪酶多肽)。赋形剂通常被包括以用于制剂和/或施用目的。
当提及疾病/状况的症状使用时，术语“治疗有效量”是指改善、减弱或消除疾病/状况的一种或更多种症状或者预防或延缓症状的发作的化合物(例如，工程化脂肪酶多肽)的量和/或浓度。
当提及疾病/状况使用时，术语“治疗有效量”是指改善、减弱或消除该疾病/状况的组合物(例如，工程化脂肪酶多肽)的量和/或浓度。在一些实施方案中，该术语被用于指组合物的量，所述组合物的量引发研究者、医师、兽医师或其他临床医师寻求的组织、系统或动物受试者的生物学(例如，医学)响应。
如本文使用的，术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”是指给予受试者(例如，人类患者)的医疗护理，包括药物组合物(诸如本文提供的那些)的施用。意图术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”包括预防性治疗(例如，预防剂)以及姑息治疗或护理。在一些实施方案中，提供治疗以预防或改善疾病的症状。在一些实施方案中，本发明的药物组合物可用于治疗或预防胰腺酶不足疾病或症状。
工程化脂肪酶：
本发明提供了适于各种用途(包括治疗胰腺酶不足)的工程化脂肪酶。在一些实施方案中，表现出改进的特性的工程化脂肪酶具有与SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868的至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％氨基酸序列同一性，以及与SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868相比，在一个或更多个氨基酸位置处(诸如，在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸位置处)相比于SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868的氨基酸残基差异，或者与SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868相比在一个或更多个位置处的残基差异包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个保守的氨基酸取代。然而，不意图本发明受限于具有保守氨基酸取代的脂肪酶变体，因为其他取代可用于本发明。在一些实施方案中，工程化脂肪酶多肽是表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和/或表5-1中列出的多肽。在一些实施方案中，工程化脂肪酶多肽包含SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868。
本发明还提供了至少一种重组脂肪酶，该重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2、3、4、22、27/46/97/136/149/385、27/46/385、27/70/136/231/385、27/136/323/385、27/149、27/149/385、27/385、34、38、41、44、46/70、46/149/183/231/385、48、70、73、73/305、82、82/94/101/194/199、82/94/199、83、85、87、89、92、94、96、97/149/385、135、136/385、140、141、142、144、146、149、149/231/385、151、174、175、178、181、183/385、189、194、194/199、195、195/231/385、199、199/213、210、212、213、213/330、216、218、219、226、231/385、238、247、250、270、274、281、292、296、300、308、330、338、379和385，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：2H、2M、2T、3A、3G、3R、3S、4M、4W、4Y、22N、27V/46T/97A/136V/149E/385P、27V/46T/385P、27V/70N/136V/231E/385P、27V/136V/323I/385P、27V/149E、27V/149E/385P、27V/385P、34D、38A、38H、38L、41V、44E、46T/70N、46T/149E/183L/231E/385P、48V、70N、73C/305I、73I、73R、82C、82E、82E/94S/101S/194N/199L、82E/94S/199L、82F、82G、82L、83G、83K、85I、85W、87R、89A、89T、89V、89W、92A、94S、96E、96N、96S、97A/149E/385P、135G、135Q、135S、135T、135V、136V/385P、140T、141A、141F、141L、141S、142A、142F、142I、142L、144M、144R、144W、146A、146F、146S、146Y、149E、149E/231E/385P、149K、149R、151A、151I、151L、174H、174R、175G、175L、175R、178R、178T、181H、183L/385P、189A、189E、189W、194N、194N/199L、194T、195D/231E/385P、195V、199L、199L/213A、210A、210V、212C、212G、212R、212T、213A/330T、213H、216R、216T、216W、218D、218G、218I、218M、218T、219C、219G、219K、219R、226R、231E/385P、238S、247R、250T、270V、274D、281K、281R、292A、292C、292L、292V、296M、296R、300A、300D、300T、308A、330Y、338N、379T、385A、385C、385D、385P、385R和385T，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:2编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：E2H、E2M、E2T、T3A、T3G、T3R、T3S、S4M、S4W、S4Y、G22N、Y27V/R46T/Y97A/Y136V/T149E/F385P、Y27V/R46T/F385P、Y27V/K70N/Y136V/Q231E/F385P、Y27V/Y136V/K323I/F385P、Y27V/T149E、Y27V/T149E/F385P、Y27V/F385P、K34D、F38A、F38H、F38L、N41V、G44E、R46T/K70N、R46T/T149E/F183L/Q231E/F385P、Y48V、K70N、T73C/V305I、T73I、T73R、K82C、K82E、K82E/P94S/D101S/K194N/I199L、K82E/P94S/I199L、K82F、K82G、K82L、E83G、E83K、G85I、G85W、A87R、F89A、F89T、F89V、F89W、T92A、P94S、I96E、I96N、I96S、Y97A/T149E/F385P、Y135G、Y135Q、Y135S、Y135T、Y135V、Y136V/F385P、P140T、E141A、E141F、E141L、E141S、E142A、E142F、E142I、E142L、I144M、I144R、I144W、P146A、P146F、P146S、P146Y、T149E、T149E/Q231E/F385P、T149K、T149R、G151A、G151I、G151L、E174H、E174R、Q175G、Q175L、Q175R、S178R、S178T、K181H、F183L/F385P、S189A、S189E、S189W、K194N、K194N/I199L、K194T、Q195D/Q231E/F385P、Q195V、I199L、I199L/P213A、K210A、K210V、Q212C、Q212G、Q212R、Q212T、P213A/N330T、P213H、S216R、S216T、S216W、H218D、H218G、H218I、H218M、H218T、A219C、A219G、A219K、A219R、T226R、Q231E/F385P、Y238S、E247R、Q250T、R270V、T274D、G281K、G281R、M292A、M292C、M292L、M292V、S296M、S296R、Q300A、Q300D、Q300T、R308A、N330Y、K338N、N379T、F385A、F385C、F385D、F385P、F385R和F385T，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2编号。
在一些实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:94具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：3/4/96/296/300、3/292/296、4、4/11/149/292/296/300、4/96/149/231/296/300、4/96/149/292/296/300、4/96/219/296、4/96/231/296/300、4/96/292/296/300、4/149/174、4/174/219/292/296、4/231/296/300、27、27/34/82、27/73/82/218、27/89、27/89/178、27/89/218、27/218、34/73/218、34/82、34/218、73/82、73/82/183、94/146/175、96/149/174/292/296、96/149/231/292/296、96/149/292/296、96/174/219/231/292/296、96/231/296、146/175/189/281、149/174/292/296、149/174/300、149/219/231/292/296/300、149/231/292/296、149/231/292/296/300、149/296、149/296/300、174/231、174/296、218、231、231/292/296、231/292/296/300、231/296、231/300、292/296、292/296/300、296和296/300，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:94编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:94具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：3S/4W/96E/296R/300D、3S/292L/296R、4W、4W/11A/149E/292L/296R/300D、4W/96E/149E/231E/296R/300D、4W/96E/149E/292L/296R/300D、4W/96E/219K/296R、4W/96E/231E/296R/300D、4W/96E/292L/296R/300D、4W/149E/174R、4W/174H/219K/292L/296R、4W/231E/296R/300D、27V、27V/34D/82E、27V/73I/82L/218I、27V/73I/82L/218M、27V/89T、27V/89T/178P、27V/89T/218I、27V/218I、34D/73I/218I、34D/82C、34D/218M、73I/82C、73I/82L/183L、94S/146F/175G、96E/149E/174H/292L/296R、96E/149E/231E/292L/296R、96E/149E/292L/296R、96E/174H/219K/231E/292L/296R、96E/231E/296R、146F/175G/189A/281K、149E/174H/292L/296R、149E/174H/300D、149E/219K/231E/292L/296R/300D、149E/231E/292L/296R、149E/231E/292L/296R/300D、149E/296R、149E/296R/300D、174H/296R、174R/231E、218I、231E、231E/292L/296R、231E/292L/296R/300D、231E/296R、231E/300D、292L/296R、292L/296R/300D、296R和296R/300D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:94编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:94具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：T3S/S4W/I96E/S296R/Q300D、T3S/M292L/S296R、S4W、S4W/V11A/T149E/M292L/S296R/Q300D、S4W/I96E/T149E/Q231E/S296R/Q300D、S4W/I96E/T149E/M292L/S296R/Q300D、S4W/I96E/A219K/S296R、S4W/I96E/Q231E/S296R/Q300D、S4W/I96E/M292L/S296R/Q300D、S4W/T149E/E174R、S4W/E174H/A219K/M292L/S296R、S4W/Q231E/S296R/Q300D、Y27V、Y27V/K34D/K82E、Y27V/T73I/K82L/H218I、Y27V/T73I/K82L/H218M、Y27V/F89T、Y27V/F89T/S178P、Y27V/F89T/H218I、Y27V/H218I、K34D/T73I/H218I、K34D/K82C、K34D/H218M、T73I/K82C、T73I/K82L/F183L、P94S/P146F/Q175G、I96E/T149E/E174H/M292L/S296R、I96E/T149E/Q231E/M292L/S296R、I96E/T149E/M292L/S296R、I96E/E174H/A219K/Q231E/M292L/S296R、I96E/Q231E/S296R、P146F/Q175G/S189A/G281K、T149E/E174H/M292L/S296R、T149E/E174H/Q300D、T149E/A219K/Q231E/M292L/S296R/Q300D、T149E/Q231E/M292L/S296R、T149E/Q231E/M292L/S296R/Q300D、T149E/S296R、T149E/S296R/Q300D、E174H/S296R、E174R/Q231E、H218I、Q231E、Q231E/M292L/S296R、Q231E/M292L/S296R/Q300D、Q231E/S296R、Q231E/Q300D、M292L/S296R、M292L/S296R/Q300D、S296R和S296R/Q300D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:94编号。
在一些实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:350具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：4、4/27/189/300、4/70、4/102、4/137、4/175/189/218、4/175/189/300、4/175/218/224、4/175/218/373、4/185、4/189/218/373、4/193、4/218/300/369/373、4/228、4/233、4/243、4/271、4/303、4/334、4/336、4/375、25、27/82/174/175/189/218/300/369/373、27/82/174/175/218/300/369、27/82/174/175/218/300/373/382、27/82/174/218/300/373、27/189/218/373、28、33、99、102、104、134、153、174/175/189、174/373、175/189/218/300/373、175/189/373、175/218、175/218/382、189/218/300/373、191、193、231、233、243、293、303、331、336、339、368和373，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:350编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:350具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：4W、4W/27V/189A/300D、4W/70H、4W/102T、4W/137R、4W/175G/189A/218M、4W/175G/189A/300D、4W/175G/218M/224A、4W/175G/218M/373F、4W/185L、4W/189A/218M/373F、4W/193T、4W/218M/300D/369N/373F、4W/228E、4W/233R、4W/243R、4W/271D、4W/303P、4W/334T、4W/336S、4W/336T、4W/375A、25V、27V/82C/174H/175G/189A/218M/300D/369N/373F、27V/82C/174H/175G/218M/300D/369N、27V/82C/174H/175G/218M/300D/373F/382M、27V/82C/174H/218M/300D/373F、27V/189A/218M/373F、28N、33Y、99D、102L、104H、134R、153G、174H/175L/189A、174H/373F、175G/189A/218M/300D/373F、175G/218M、175G/218M/382M、175L/189A/373F、189A/218M/300D/373F、191L、193L、231Q、233G、233S、233W、243R、293R、303P、331R、336R、339K、368A、368T和373F，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:350编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:350具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：S4W、S4W/Y27V/S189A/Q300D、S4W/K70H、S4W/E102T、S4W/S137R、S4W/Q175G/S189A/H218M、S4W/Q175G/S189A/Q300D、S4W/Q175G/H218M/V224A、S4W/Q175G/H218M/Y373F、S4W/I185L、S4W/S189A/H218M/Y373F、S4W/Q193T、S4W/H218M/Q300D/S369N/Y373F、S4W/P228E、S4W/N233R、S4W/L243R、S4W/G271D、S4W/A303P、S4W/D334T、S4W/A336S、S4W/A336T、S4W/N375A、L25V、Y27V/K82C/E174H/Q175G/S189A/H218M/Q300D/S369N/Y373F、Y27V/K82C/E174H/Q175G/H218M/Q300D/S369N、Y27V/K82C/E174H/Q175G/H218M/Q300D/Y373F/H382M、Y27V/K82C/E174H/H218M/Q300D/Y373F、Y27V/S189A/H218M/Y373F、R28N、L33Y、Q99D、E102L、N104H、E134R、N153G、E174H/Q175L/S189A、E174H/Y373F、Q175G/S189A/H218M/Q300D/Y373F、Q175G/H218M、Q175G/H218M/H382M、Q175L/S189A/Y373F、S189A/H218M/Q300D/Y373F、A191L、Q193L、E231Q、N233G、N233S、N233W、L243R、Q293R、A303P、S331R、A336R、Q339K、F368A、F368T和Y373F，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:350编号。
在一些实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:442具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：26、33、33/174/193/243、33/174/334、33/175/218/303、33/175/218/334/339、33/193、34、38、46、48、70/271/293/334、144、174、174/175/193、174/175/218/339、174/193/303/375、174/193/375、174/218/233/271/293/303、174/218/271/303、175/193/218/233/243/375、175/193/218/243、175/218/375、181、189、193、193/218/243、193/271/303/334、193/293/303、194、195、199、210、218、218/243、218/243/303/334、218/303、225、238、274、281和330，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:442编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:442具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：G26A、G26R、G26S、L33Y、L33Y/E174H/Q193L/L243R、L33Y/E174H/D334T、L33Y/L175G/H218M/A303P、L33Y/L175G/H218M/D334T/Q339K、L33Y/Q193L、K34L、F38A、F38G、R46P、Y48L、K70H/G271D/Q293R/D334T、I144L、E174H、E174H/L175G/Q193L、E174H/L175G/H218M/Q339K、E174H/Q193L/A303P/N375A、E174H/Q193L/N375A、E174H/H218M/N233R/G271D/Q293R/A303P、E174H/H218M/G271D/A303P、E174R、L175G/Q193L/H218M/N233R/L243R/N375A、L175G/Q193L/H218M/L243R、L175G/H218M/N375A、K181Q、A189H、Q193L、Q193L/H218M/L243R、Q193L/G271D/A303P/D334T、Q193L/Q293R/A303P、K194T、Q195I、Q195L、Q195Y、I199H、K210V、H218C、H218D、H218M、H218M/L243R、H218M/L243R/A303P/D334T、H218M/A303P、H218P、M225L、Y238W、T274D、G281K、G281P、N330F和N330H，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:442编号。
在一些实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:540具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：34/38/174/193/195/243/281/303/330、34/38/174/225/303、34/38/174/303/345、34/174、34/174/193/195/243/281、34/174/193/195/303/330、34/193/195/225/243、34/193/243/303/330、34/281/330、38、38/174/193/195/243/330、38/174/193/225/274/283/303/330、38/174/193/303、38/174/195/281/330、38/174/225/243/281/330、38/174/281、38/174/281/303、38/174/281/303/345、38/193/195/225/303/345、38/195/243/303、38/195/281/303/330、38/195/281/330、38/195/303、49、49/51/98/252/311、49/51/123/252/344、49/98/120/252/344、49/120/252/344、49/123/252/344、49/123/264/344、49/123/311、49/252/344、49/311/344、49/344、51、51/252/344、51/344、98、98/344、123/252/344、129、160、161、174/193/195/225、174/193/303/330、174/195/225/281/303/330/345、174/195/243/281/345、174/195/281/303、174/225/243/281/303/345、174/281/330、174/303、195/225/303/330、252、268和344，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:540编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:540具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：34L/38A/174G/193L/195L/243R/281P/303P/330F、34L/38A/174R/303P/345I、34L/38G/174R/225L/303P、34L/174G、34L/174G/193L/195L/243R/281P、34L/174H/193L/195I/303P/330F、34L/193L/195I/225L/243R、34L/193L/243R/303P/330F、34L/281P/330H、38A/174H/193L/225L/274D/283I/303P/330F、38A/174R/281K/303P/345I、38A/193L/195L/225L/303P/345I、38A/195I/303P、38A/195Y/281K/303P/330F、38G、38G/174G/193L/303P、38G/174G/281K/303P、38G/174H/195L/281P/330F、38G/174H/225L/243R/281K/330H、38G/174H/281K、38G/174R/193L/195L/243R/330H、38G/195I/281P/330F、38G/195Y/243R/303P、49S、49T、49T/51A/98P/252V/311W、49T/51A/123Q/252V/344H、49T/98P/120T/252V/344H、49T/120T/252V/344H、49T/123Q/252V/344H、49T/123Q/264S/344H、49T/123Q/311W、49T/252V/344H、49T/311W/344H、49T/344H、51A/252V/344H、51A/344H、51V、98P/344H、98R、123Q/252V/344H、129F、160T、161I、174G/195I/225L/281K/303P/330F/345I、174G/225L/243R/281P/303P/345I、174H/195I/243R/281K/345I、174H/281P/330H、174R/193L/195I/225L、174R/193L/303P/330H、174R/195I/281K/303P、174R/303P、195Y/225L/303P/330H、252V、268T、344I、344V和344W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:540编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:540具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：K34L/F38A/E174G/Q193L/Q195L/L243R/G281P/A303P/N330F、K34L/F38A/E174R/A303P/F345I、K34L/F38G/E174R/M225L/A303P、K34L/E174G、K34L/E174G/Q193L/Q195L/L243R/G281P、K34L/E174H/Q193L/Q195I/A303P/N330F、K34L/Q193L/Q195I/M225L/L243R、K34L/Q193L/L243R/A303P/N330F、K34L/G281P/N330H、F38A/E174H/Q193L/M225L/T274D/M283I/A303P/N330F、F38A/E174R/G281K/A303P/F345I、F38A/Q193L/Q195L/M225L/A303P/F345I、F38A/Q195I/A303P、F38A/Q195Y/G281K/A303P/N330F、F38G、F38G/E174G/Q193L/A303P、F38G/E174G/G281K/A303P、F38G/E174H/Q195L/G281P/N330F、F38G/E174H/M225L/L243R/G281K/N330H、F38G/E174H/G281K、F38G/E174R/Q193L/Q195L/L243R/N330H、F38G/Q195I/G281P/N330F、F38G/Q195Y/L243R/A303P、V49S、V49T、V49T/T51A/G98P/M252V/L311W、V49T/T51A/E123Q/M252V/S344H、V49T/G98P/M120T/M252V/S344H、V49T/M120T/M252V/S344H、V49T/E123Q/M252V/S344H、V49T/E123Q/T264S/S344H、V49T/E123Q/L311W、V49T/M252V/S344H、V49T/L311W/S344H、V49T/S344H、T51A/M252V/S344H、T51A/S344H、T51V、G98P/S344H、G98R、E123Q/M252V/S344H、S129F、S160T、L161I、E174G/Q195I/M225L/G281K/A303P/N330F/F345I、E174G/M225L/L243R/G281P/A303P/F345I、E174H/Q195I/L243R/G281K/F345I、E174H/G281P/N330H、E174R/Q193L/Q195I/M225L、E174R/Q193L/A303P/N330H、E174R/Q195I/G281K/A303P、E174R/A303P、Q195Y/M225L/A303P/N330H、M252V、S268T、S344I、S344V和S344W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:540编号。
在一些实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:646具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：11/16/67/168/180/287、11/16/237/241/287、11/67/168/287、16/67/154/168/237/241/287、16/67/237/287/291、16/168/177、24、24/278、34/49/161/193/243/344、34/49/161/193/344、34/49/161/243/344、34/49/161/252/268/344、34/49/193/243/252/344、34/49/193/344、34/49/243/252、34/49/252/268/344、34/161/193/243/252/268、34/161/193/243/268/344、34/161/193/243/344、34/161/193/252/268/344、34/161/193/252/344、34/161/193/268/344、34/161/243/281/344、34/161/344、34/193/243/252/344、34/193/252/268/344、34/193/268/281、34/252/268/281/344、34/252/344、49/161/193/243/252/344、49/161/193/252/281/344、49/161/243/252/344、49/193/197/243/252/281/344、49/193/243/252/344、49/193/243/344、49/243/344、67/154/237/287、67/168/237、67/168/237/287、67/177/237、154/237/286/287、154/286/287、161/193/252/344、161/193/344、161/344、168/237、186/187/278、193/243/281/344、193/252/268/344、193/252/281/344、237、237/287/291和281/344，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:646编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:646具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：11I/16F/67A/168T/180V/287L、11I/16F/237Q/241S/287L、11I/67A/168T/287L、16F/67A/154Y/168T/237Q/241S/287L、16F/67A/237Q/287L/291A、16F/168T/177L、24M、24M/278L、34K/49T/161I/193L/243R/344H、34K/49T/161I/193L/243R/344V、34K/49T/161I/193L/344W、34K/49T/161I/243R/344H、34K/49T/161I/252V/268T/344V、34K/49T/193L/243R/252V/344W、34K/49T/193L/344H、34K/49T/193L/344W、34K/49T/243R/252V、34K/49T/252V/268T/344V、34K/161I/193L/243R/252V/268T、34K/161I/193L/243R/268T/344V、34K/161I/193L/243R/344W、34K/161I/193L/252V/268T/344H、34K/161I/193L/252V/268T/344V、34K/161I/193L/252V/344H、34K/161I/193L/252V/344V、34K/161I/193L/252V/344W、34K/161I/193L/268T/344H、34K/161I/243R/281P/344V、34K/161I/344V、34K/161I/344W、34K/193L/243R/252V/344W、34K/193L/252V/268T/344H、34K/193L/268T/281P、34K/252V/268T/281P/344V、34K/252V/344V、49T/161I/193L/243R/252V/344W、49T/161I/193L/252V/281P/344H、49T/161I/243R/252V/344V、49T/193L/197G/243R/252V/281P/344H、49T/193L/243R/252V/344V、49T/193L/243R/344W、49T/243R/344V、67A/154Y/237Q/287L、67A/168T/237Q、67A/168T/237Q/287L、67A/177L/237Q、154Y/237Q/286V/287L、154Y/286V/287L、161I/193L/252V/344V、161I/193L/344W、161I/344W、168T/237Q、186T/187A/278L、193L/243R/281P/344W、193L/252V/268T/344V、193L/252V/281P/344H、237Q、237Q/287L/291A和281P/344W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:646编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:646具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：V11I/L16F/Y67A/S168T/I180V/F287L、V11I/L16F/A237Q/T241S/F287L、V11I/Y67A/S168T/F287L、L16F/Y67A/W154Y/S168T/A237Q/T241S/F287L、L16F/Y67A/A237Q/F287L/S291A、L16F/S168T/V177L、F24M、F24M/Y278L、L34K/V49T/L161I/Q193L/L243R/S344H、L34K/V49T/L161I/Q193L/L243R/S344V、L34K/V49T/L161I/Q193L/S344W、L34K/V49T/L161I/L243R/S344H、L34K/V49T/L161I/M252V/S268T/S344V、L34K/V49T/Q193L/L243R/M252V/S344W、L34K/V49T/Q193L/S344H、L34K/V49T/Q193L/S344W、L34K/V49T/L243R/M252V、L34K/V49T/M252V/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/L243R/M252V/S268T、L34K/L161I/Q193L/L243R/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/L243R/S344W、L34K/L161I/Q193L/M252V/S268T/S344H、L34K/L161I/Q193L/M252V/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344H、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344V、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344W、L34K/L161I/Q193L/S268T/S344H、L34K/L161I/L243R/G281P/S344V、L34K/L161I/S344V、L34K/L161I/S344W、L34K/Q193L/L243R/M252V/S344W、L34K/Q193L/M252V/S268T/S344H、L34K/Q193L/S268T/G281P、L34K/M252V/S268T/G281P/S344V、L34K/M252V/S344V、V49T/L161I/Q193L/L243R/M252V/S344W、V49T/L161I/Q193L/M252V/G281P/S344H、V49T/L161I/L243R/M252V/S344V、V49T/Q193L/S197G/L243R/M252V/G281P/S344H、V49T/Q193L/L243R/M252V/S344V、V49T/Q193L/L243R/S344W、V49T/L243R/S344V、Y67A/W154Y/A237Q/F287L、Y67A/S168T/A237Q、Y67A/S168T/A237Q/F287L、Y67A/V177L/A237Q、W154Y/A237Q/L286V/F287L、W154Y/L286V/F287L、L161I/Q193L/M252V/S344V、L161I/Q193L/S344W、L161I/S344W、S168T/A237Q、H186T/L187A/Y278L、Q193L/L243R/G281P/S344W、Q193L/M252V/S268T/S344V、Q193L/M252V/G281P/S344H、A237Q、A237Q/F287L/S291A和G281P/S344W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:646编号。
在一些实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:758具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24/168/252/281、24/237/287/344、24/252、24/252/287、24/344、213/252/278/344、252/278/344、252/287/344和281，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:758编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:758具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：24M/168T/252V/281P、24M/237Q/287L/344S、24M/252V、24M/252V/287L、24M/344W、213S/252V/278L/344S、252V/278L/344W、252V/287L/344S和281P，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:758编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:758具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：F24M/S168T/M252V/G281P、F24M/A237Q/F287L/H344S、F24M/M252V、F24M/M252V/F287L、F24M/H344W、P213S/M252V/Y278L/H344S、M252V/Y278L/H344W、M252V/F287L/H344S和G281P，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:758编号。
在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:868具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24、24/38/49/70/149/161/174/175/189/193/225/231/243/252/271/287/292/293/296/303/334/344/373/385、38、49、70、149、161、174、175、189、193、225、231、243、252、271、287、292、293、296、303、334、344、373和385，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:868编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ IDNO:868具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：24A、24C、24D、24E、24F、24F/38F/49V/70K/149T/161L/174E/175Q/189S/193Q/225M/231Q/243L/252M/271G/287F/292M/293Q/296S/303A/334D/344S/373Y/385F、24G、24H、24I、24K、24L、24N、24P、24Q、24R、24S、24T、24V、24W、24Y、38A、38C、38D、38E、38F、38H、38I、38K、38L、38M、38N、38P、38Q、38R、38S、38T、38V、38W、38Y、49A、49C、49D、49E、49F、49G、49H、49I、49K、49L、49M、49N、49P、49Q、49R、49S、49V、49W、49Y、70A、70C、70D、70E、70F、70G、70I、70K、70L、70M、70N、70P、70Q、70R、70S、70T、70V、70W、70Y、149A、149C、149D、149F、149G、149H、149I、149K、149L、149M、149N、149P、149Q、149R、149S、149T、149V、149W、149Y、161A、161C、161D、161E、161F、161G、161H、161K、161L、161M、161N、161P、161Q、161R、161S、161T、161V、161W、161Y、174A、174C、174D、174E、174F、174G、174H、174I、174K、174L、174M、174N、174P、174Q、174S、174T、174V、174W、174Y、175A、175C、175D、175E、175F、175G、175H、175I、175K、175M、175N、175P、175Q、175R、175S、175T、175V、175W、175Y、189C、189D、189E、189F、189G、189H、189I、189K、189L、189M、189N、189P、189Q、189R、189S、189T、189V、189W、189Y、193A、193C、193D、193E、193F、193G、193H、193I、193K、193M、193N、193P、193Q、193R、193S、193T、193V、193W、193Y、225A、225C、225D、225E、225F、225G、225H、225I、225K、225M、225N、225P、225Q、225R、225S、225T、225V、225W、225Y、231A、231C、231D、231F、231G、231H、231I、231K、231L、231M、231N、231P、231Q、231R、231S、231T、231V、231W、231Y、243A、243C、243D、243E、243F、243G、243H、243I、243K、243L、243M、243N、243P、243Q、243S、243T、243V、243W、243Y、252A、252C、252D、252E、252F、252G、252H、252I、252K、252L、252M、252N、252P、252Q、252R、252S、252T、252W、252Y、271A、271C、271E、271F、271G、271H、271I、271K、271L、271M、271N、271P、271Q、271R、271S、271T、271V、271W、271Y、287A、287C、287D、287E、287F、287G、287H、287I、287K、287M、287N、287P、287Q、287R、287S、287T、287V、287W、287Y、292A、292C、292D、292E、292F、292G、292H、292I、292K、292M、292N、292P、292Q、292R、292S、292T、292V、292W、292Y、293A、293C、293D、293E、293F、293G、293H、293I、293K、293L、293M、293N、293P、293Q、293S、293T、293V、293W、293Y、296A、296C、296D、296E、296F、296G、296H、296I、296K、296L、296M、296N、296P、296Q、296S、296T、296V、296W、296Y、303A、303C、303D、303E、303F、303G、303H、303I、303K、303L、303M、303N、303Q、303R、303S、303T、303V、303W、303Y、334A、334C、334D、334E、334F、334G、334H、334I、334K、334L、334M、334N、334P、334Q、334R、334S、334V、334W、334Y、344A、344C、344D、344E、344F、344G、344I、344K、344L、344M、344N、344P、344Q、344R、344S、344T、344V、344W、344Y、373A、373C、373D、373E、373G、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373P、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、373Y、385A、385C、385D、385E、385F、385G、385H、385I、385K、385L、385M、385N、385Q、385R、385S、385T、385V、385W和385Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:868编号。在一些另外的实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:868具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：M24A、M24C、M24D、M24E、M24F、M24F/G38F/T49V/H70K/E149T/I161L/R174E/L175Q/A189S/L193Q/L225M/E231Q/R243L/V252M/D271G/L287F/L292M/R293Q/R296S/P303A/T334D/H344S/F373Y/P385F、M24G、M24H、M24I、M24K、M24L、M24N、M24P、M24Q、M24R、M24S、M24T、M24V、M24W、M24Y、G38A、G38C、G38D、G38E、G38F、G38H、G38I、G38K、G38L、G38M、G38N、G38P、G38Q、G38R、G38S、G38T、G38V、G38W、G38Y、T49A、T49C、T49D、T49E、T49F、T49G、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49P、T49Q、T49R、T49S、T49V、T49W、T49Y、H70A、H70C、H70D、H70E、H70F、H70G、H70I、H70K、H70L、H70M、H70N、H70P、H70Q、H70R、H70S、H70T、H70V、H70W、H70Y、E149A、E149C、E149D、E149F、E149G、E149H、E149I、E149K、E149L、E149M、E149N、E149P、E149Q、E149R、E149S、E149T、E149V、E149W、E149Y、I161A、I161C、I161D、I161E、I161F、I161G、I161H、I161K、I161L、I161M、I161N、I161P、I161Q、I161R、I161S、I161T、I161V、I161W、I161Y、R174A、R174C、R174D、R174E、R174F、R174G、R174H、R174I、R174K、R174L、R174M、R174N、R174P、R174Q、R174S、R174T、R174V、R174W、R174Y、L175A、L175C、L175D、L175E、L175F、L175G、L175H、L175I、L175K、L175M、L175N、L175P、L175Q、L175R、L175S、L175T、L175V、L175W、L175Y、A189C、A189D、A189E、A189F、A189G、A189H、A189I、A189K、A189L、A189M、A189N、A189P、A189Q、A189R、A189S、A189T、A189V、A189W、A189Y、L193A、L193C、L193D、L193E、L193F、L193G、L193H、L193I、L193K、L193M、L193N、L193P、L193Q、L193R、L193S、L193T、L193V、L193W、L193Y、L225A、L225C、L225D、L225E、L225F、L225G、L225H、L225I、L225K、L225M、L225N、L225P、L225Q、L225R、L225S、L225T、L225V、L225W、L225Y、E231A、E231C、E231D、E231F、E231G、E231H、E231I、E231K、E231L、E231M、E231N、E231P、E231Q、E231R、E231S、E231T、E231V、E231W、E231Y、R243A、R243C、R243D、R243E、R243F、R243G、R243H、R243I、R243K、R243L、R243M、R243N、R243P、R243Q、R243S、R243T、R243V、R243W、R243Y、V252A、V252C、V252D、V252E、V252F、V252G、V252H、V252I、V252K、V252L、V252M、V252N、V252P、V252Q、V252R、V252S、V252T、V252W、V252Y、D271A、D271C、D271E、D271F、D271G、D271H、D271I、D271K、D271L、D271M、D271N、D271P、D271Q、D271R、D271S、D271T、D271V、D271W、D271Y、L287A、L287C、L287D、L287E、L287F、L287G、L287H、L287I、L287K、L287M、L287N、L287P、L287Q、L287R、L287S、L287T、L287V、L287W、L287Y、L292A、L292C、L292D、L292E、L292F、L292G、L292H、L292I、L292K、L292M、L292N、L292P、L292Q、L292R、L292S、L292T、L292V、L292W、L292Y、R293A、R293C、R293D、R293E、R293F、R293G、R293H、R293I、R293K、R293L、R293M、R293N、R293P、R293Q、R293S、R293T、R293V、R293W、R293Y、R296A、R296C、R296D、R296E、R296F、R296G、R296H、R296I、R296K、R296L、R296M、R296N、R296P、R296Q、R296S、R296T、R296V、R296W、R296Y、P303A、P303C、P303D、P303E、P303F、P303G、P303H、P303I、P303K、P303L、P303M、P303N、P303Q、P303R、P303S、P303T、P303V、P303W、P303Y、T334A、T334C、T334D、T334E、T334F、T334G、T334H、T334I、T334K、T334L、T334M、T334N、T334P、T334Q、T334R、T334S、T334V、T334W、T334Y、H344A、H344C、H344D、H344E、H344F、H344G、H344I、H344K、H344L、H344M、H344N、H344P、H344Q、H344R、H344S、H344T、H344V、H344W、H344Y、F373A、F373C、F373D、F373E、F373G、F373H、F373I、F373K、F373L、F373M、F373N、F373P、F373Q、F373R、F373S、F373T、F373V、F373W、F373Y、P385A、P385C、P385D、P385E、P385F、P385G、P385H、P385I、P385K、P385L、P385M、P385N、P385Q、P385R、P385S、P385T、P385V、P385W和P385Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:868编号。
在一些实施方案中，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中多肽序列的氨基酸位置参考2、94、350、442、540、646、758和/或868编号。
在一些实施方案中，重组脂肪酶多肽序列与SEQ ID NO:14-1796中的偶数编号序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性。
在一些实施方案中，工程化脂肪酶多肽包含本发明所包含的工程化脂肪酶多肽的功能片段。功能片段具有其所源自的工程化脂肪酶多肽(即，亲本工程化脂肪酶)的活性的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，功能片段构成工程化脂肪酶的亲本序列的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％以及甚至99％。在一些实施方案中，功能片段被截短了少于5个、少于10个、少于15个、少于20个、少于25个、少于30个、少于35个、少于40个、少于45个和少于50个氨基酸。
编码工程化脂肪酶多肽的多核苷酸、表达载体和宿主细胞：
本发明提供了编码本文描述的工程化脂肪酶多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸被可操作地连接至控制基因表达的一个或更多个异源或同源调控序列，以创建能够表达多肽的重组多核苷酸。包含编码工程化脂肪酶多肽的异源多核苷酸的表达构建体可以被引入到适当的宿主细胞中以表达对应的脂肪酶多肽。
如对技术人员将是明显的，蛋白序列的可得性以及对对应于各种氨基酸的密码子的了解提供能够编码主题多肽的所有多核苷酸的描述。遗传密码的简并性，其中相同的氨基酸由可替代的密码子或同义密码子编码，允许制备极大数目的核酸，所有这些核酸都编码工程化脂肪酶多肽。因此，知道了特定的氨基酸序列后，本领域技术人员可以通过以不改变蛋白的氨基酸序列的方式简单修饰一个或更多个密码子的序列来制备任何数目的不同核酸。在这方面，本发明特别设想了可以通过基于可能的密码子选择来选择组合以制备编码本文描述的多肽的多核苷酸的每种和每一种可能的改变，并且对于本文描述的任何多肽，所有这样的改变，包括表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和表5-1中提供的变体，应被认为被特别地公开。
在各种实施方案中，优选地选择密码子来适应在其中产生蛋白的宿主细胞。例如，细菌中使用的优选的密码子被用于在细菌中的表达，而真菌中使用的优选的密码子被用于在真菌中的表达。因此，编码工程化脂肪酶多肽的密码子优化的多核苷酸在全长编码区的约40％、50％、60％、70％、80％或大于90％的密码子位置处包含优选的密码子。
在一些实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO:1、93、349、441、539、645、757和/或867具有至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的重组多核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO:1、93、349、441、539、645、757和/或867具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的重组多核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸序列与SEQID NO:13-1795中的奇数编号序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2、3、4、22、27/46/97/136/149/385、27/46/385、27/70/136/231/385、27/136/323/385、27/149、27/149/385、27/385、34、38、41、44、46/70、46/149/183/231/385、48、70、73、73/305、82、82/94/101/194/199、82/94/199、83、85、87、89、92、94、96、97/149/385、135、136/385、140、141、142、144、146、149、149/231/385、151、174、175、178、181、183/385、189、194、194/199、195、195/231/385、199、199/213、210、212、213、213/330、216、218、219、226、231/385、238、247、250、270、274、281、292、296、300、308、330、338、379和385，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：2H、2M、2T、3A、3G、3R、3S、4M、4W、4Y、22N、27V/46T/97A/136V/149E/385P、27V/46T/385P、27V/70N/136V/231E/385P、27V/136V/323I/385P、27V/149E、27V/149E/385P、27V/385P、34D、38A、38H、38L、41V、44E、46T/70N、46T/149E/183L/231E/385P、48V、70N、73C/305I、73I、73R、82C、82E、82E/94S/101S/194N/199L、82E/94S/199L、82F、82G、82L、83G、83K、85I、85W、87R、89A、89T、89V、89W、92A、94S、96E、96N、96S、97A/149E/385P、135G、135Q、135S、135T、135V、136V/385P、140T、141A、141F、141L、141S、142A、142F、142I、142L、144M、144R、144W、146A、146F、146S、146Y、149E、149E/231E/385P、149K、149R、151A、151I、151L、174H、174R、175G、175L、175R、178R、178T、181H、183L/385P、189A、189E、189W、194N、194N/199L、194T、195D/231E/385P、195V、199L、199L/213A、210A、210V、212C、212G、212R、212T、213A/330T、213H、216R、216T、216W、218D、218G、218I、218M、218T、219C、219G、219K、219R、226R、231E/385P、238S、247R、250T、270V、274D、281K、281R、292A、292C、292L、292V、296M、296R、300A、300D、300T、308A、330Y、338N、379T、385A、385C、385D、385P、385R和385T，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：E2H、E2M、E2T、T3A、T3G、T3R、T3S、S4M、S4W、S4Y、G22N、Y27V/R46T/Y97A/Y136V/T149E/F385P、Y27V/R46T/F385P、Y27V/K70N/Y136V/Q231E/F385P、Y27V/Y136V/K323I/F385P、Y27V/T149E、Y27V/T149E/F385P、Y27V/F385P、K34D、F38A、F38H、F38L、N41V、G44E、R46T/K70N、R46T/T149E/F183L/Q231E/F385P、Y48V、K70N、T73C/V305I、T73I、T73R、K82C、K82E、K82E/P94S/D101S/K194N/I199L、K82E/P94S/I199L、K82F、K82G、K82L、E83G、E83K、G85I、G85W、A87R、F89A、F89T、F89V、F89W、T92A、P94S、I96E、I96N、I96S、Y97A/T149E/F385P、Y135G、Y135Q、Y135S、Y135T、Y135V、Y136V/F385P、P140T、E141A、E141F、E141L、E141S、E142A、E142F、E142I、E142L、I144M、I144R、I144W、P146A、P146F、P146S、P146Y、T149E、T149E/Q231E/F385P、T149K、T149R、G151A、G151I、G151L、E174H、E174R、Q175G、Q175L、Q175R、S178R、S178T、K181H、F183L/F385P、S189A、S189E、S189W、K194N、K194N/I199L、K194T、Q195D/Q231E/F385P、Q195V、I199L、I199L/P213A、K210A、K210V、Q212C、Q212G、Q212R、Q212T、P213A/N330T、P213H、S216R、S216T、S216W、H218D、H218G、H218I、H218M、H218T、A219C、A219G、A219K、A219R、T226R、Q231E/F385P、Y238S、E247R、Q250T、R270V、T274D、G281K、G281R、M292A、M292C、M292L、M292V、S296M、S296R、Q300A、Q300D、Q300T、R308A、N330Y、K338N、N379T、F385A、F385C、F385D、F385P、F385R和F385T，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:94具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：3/4/96/296/300、3/292/296、4、4/11/149/292/296/300、4/96/149/231/296/300、4/96/149/292/296/300、4/96/219/296、4/96/231/296/300、4/96/292/296/300、4/149/174、4/174/219/292/296、4/231/296/300、27、27/34/82、27/73/82/218、27/89、27/89/178、27/89/218、27/218、34/73/218、34/82、34/218、73/82、73/82/183、94/146/175、96/149/174/292/296、96/149/231/292/296、96/149/292/296、96/174/219/231/292/296、96/231/296、146/175/189/281、149/174/292/296、149/174/300、149/219/231/292/296/300、149/231/292/296、149/231/292/296/300、149/296、149/296/300、174/231、174/296、218、231、231/292/296、231/292/296/300、231/296、231/300、292/296、292/296/300、296和296/300，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:94编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:94具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：3S/4W/96E/296R/300D、3S/292L/296R、4W、4W/11A/149E/292L/296R/300D、4W/96E/149E/231E/296R/300D、4W/96E/149E/292L/296R/300D、4W/96E/219K/296R、4W/96E/231E/296R/300D、4W/96E/292L/296R/300D、4W/149E/174R、4W/174H/219K/292L/296R、4W/231E/296R/300D、27V、27V/34D/82E、27V/73I/82L/218I、27V/73I/82L/218M、27V/89T、27V/89T/178P、27V/89T/218I、27V/218I、34D/73I/218I、34D/82C、34D/218M、73I/82C、73I/82L/183L、94S/146F/175G、96E/149E/174H/292L/296R、96E/149E/231E/292L/296R、96E/149E/292L/296R、96E/174H/219K/231E/292L/296R、96E/231E/296R、146F/175G/189A/281K、149E/174H/292L/296R、149E/174H/300D、149E/219K/231E/292L/296R/300D、149E/231E/292L/296R、149E/231E/292L/296R/300D、149E/296R、149E/296R/300D、174H/296R、174R/231E、218I、231E、231E/292L/296R、231E/292L/296R/300D、231E/296R、231E/300D、292L/296R、292L/296R/300D、296R和296R/300D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:94编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:94具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：T3S/S4W/I96E/S296R/Q300D、T3S/M292L/S296R、S4W、S4W/V11A/T149E/M292L/S296R/Q300D、S4W/I96E/T149E/Q231E/S296R/Q300D、S4W/I96E/T149E/M292L/S296R/Q300D、S4W/I96E/A219K/S296R、S4W/I96E/Q231E/S296R/Q300D、S4W/I96E/M292L/S296R/Q300D、S4W/T149E/E174R、S4W/E174H/A219K/M292L/S296R、S4W/Q231E/S296R/Q300D、Y27V、Y27V/K34D/K82E、Y27V/T73I/K82L/H218I、Y27V/T73I/K82L/H218M、Y27V/F89T、Y27V/F89T/S178P、Y27V/F89T/H218I、Y27V/H218I、K34D/T73I/H218I、K34D/K82C、K34D/H218M、T73I/K82C、T73I/K82L/F183L、P94S/P146F/Q175G、I96E/T149E/E174H/M292L/S296R、I96E/T149E/Q231E/M292L/S296R、I96E/T149E/M292L/S296R、I96E/E174H/A219K/Q231E/M292L/S296R、I96E/Q231E/S296R、P146F/Q175G/S189A/G281K、T149E/E174H/M292L/S296R、T149E/E174H/Q300D、T149E/A219K/Q231E/M292L/S296R/Q300D、T149E/Q231E/M292L/S296R、T149E/Q231E/M292L/S296R/Q300D、T149E/S296R、T149E/S296R/Q300D、E174H/S296R、E174R/Q231E、H218I、Q231E、Q231E/M292L/S296R、Q231E/M292L/S296R/Q300D、Q231E/S296R、Q231E/Q300D、M292L/S296R、M292L/S296R/Q300D、S296R和S296R/Q300D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:94编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:350具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：4、4/27/189/300、4/70、4/102、4/137、4/175/189/218、4/175/189/300、4/175/218/224、4/175/218/373、4/185、4/189/218/373、4/193、4/218/300/369/373、4/228、4/233、4/243、4/271、4/303、4/334、4/336、4/375、25、27/82/174/175/189/218/300/369/373、27/82/174/175/218/300/369、27/82/174/175/218/300/373/382、27/82/174/218/300/373、27/189/218/373、28、33、99、102、104、134、153、174/175/189、174/373、175/189/218/300/373、175/189/373、175/218、175/218/382、189/218/300/373、191、193、231、233、243、293、303、331、336、339、368和373，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:350编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:350具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：4W、4W/27V/189A/300D、4W/70H、4W/102T、4W/137R、4W/175G/189A/218M、4W/175G/189A/300D、4W/175G/218M/224A、4W/175G/218M/373F、4W/185L、4W/189A/218M/373F、4W/193T、4W/218M/300D/369N/373F、4W/228E、4W/233R、4W/243R、4W/271D、4W/303P、4W/334T、4W/336S、4W/336T、4W/375A、25V、27V/82C/174H/175G/189A/218M/300D/369N/373F、27V/82C/174H/175G/218M/300D/369N、27V/82C/174H/175G/218M/300D/373F/382M、27V/82C/174H/218M/300D/373F、27V/189A/218M/373F、28N、33Y、99D、102L、104H、134R、153G、174H/175L/189A、174H/373F、175G/189A/218M/300D/373F、175G/218M、175G/218M/382M、175L/189A/373F、189A/218M/300D/373F、191L、193L、231Q、233G、233S、233W、243R、293R、303P、331R、336R、339K、368A、368T和373F，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:350编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:350具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：S4W、S4W/Y27V/S189A/Q300D、S4W/K70H、S4W/E102T、S4W/S137R、S4W/Q175G/S189A/H218M、S4W/Q175G/S189A/Q300D、S4W/Q175G/H218M/V224A、S4W/Q175G/H218M/Y373F、S4W/I185L、S4W/S189A/H218M/Y373F、S4W/Q193T、S4W/H218M/Q300D/S369N/Y373F、S4W/P228E、S4W/N233R、S4W/L243R、S4W/G271D、S4W/A303P、S4W/D334T、S4W/A336S、S4W/A336T、S4W/N375A、L25V、Y27V/K82C/E174H/Q175G/S189A/H218M/Q300D/S369N/Y373F、Y27V/K82C/E174H/Q175G/H218M/Q300D/S369N、Y27V/K82C/E174H/Q175G/H218M/Q300D/Y373F/H382M、Y27V/K82C/E174H/H218M/Q300D/Y373F、Y27V/S189A/H218M/Y373F、R28N、L33Y、Q99D、E102L、N104H、E134R、N153G、E174H/Q175L/S189A、E174H/Y373F、Q175G/S189A/H218M/Q300D/Y373F、Q175G/H218M、Q175G/H218M/H382M、Q175L/S189A/Y373F、S189A/H218M/Q300D/Y373F、A191L、Q193L、E231Q、N233G、N233S、N233W、L243R、Q293R、A303P、S331R、A336R、Q339K、F368A、F368T和Y373F，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:350编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:442具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：26、33、33/174/193/243、33/174/334、33/175/218/303、33/175/218/334/339、33/193、34、38、46、48、70/271/293/334、144、174、174/175/193、174/175/218/339、174/193/303/375、174/193/375、174/218/233/271/293/303、174/218/271/303、175/193/218/233/243/375、175/193/218/243、175/218/375、181、189、193、193/218/243、193/271/303/334、193/293/303、194、195、199、210、218、218/243、218/243/303/334、218/303、225、238、274、281和330，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:442编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:442具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：G26A、G26R、G26S、L33Y、L33Y/E174H/Q193L/L243R、L33Y/E174H/D334T、L33Y/L175G/H218M/A303P、L33Y/L175G/H218M/D334T/Q339K、L33Y/Q193L、K34L、F38A、F38G、R46P、Y48L、K70H/G271D/Q293R/D334T、I144L、E174H、E174H/L175G/Q193L、E174H/L175G/H218M/Q339K、E174H/Q193L/A303P/N375A、E174H/Q193L/N375A、E174H/H218M/N233R/G271D/Q293R/A303P、E174H/H218M/G271D/A303P、E174R、L175G/Q193L/H218M/N233R/L243R/N375A、L175G/Q193L/H218M/L243R、L175G/H218M/N375A、K181Q、A189H、Q193L、Q193L/H218M/L243R、Q193L/G271D/A303P/D334T、Q193L/Q293R/A303P、K194T、Q195I、Q195L、Q195Y、I199H、K210V、H218C、H218D、H218M、H218M/L243R、H218M/L243R/A303P/D334T、H218M/A303P、H218P、M225L、Y238W、T274D、G281K、G281P、N330F和N330H，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:442编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:442具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：G26A、G26R、G26S、L33Y、L33Y/E174H/Q193L/L243R、L33Y/E174H/D334T、L33Y/L175G/H218M/A303P、L33Y/L175G/H218M/D334T/Q339K、L33Y/Q193L、K34L、F38A、F38G、R46P、Y48L、K70H/G271D/Q293R/D334T、I144L、E174H、E174H/L175G/Q193L、E174H/L175G/H218M/Q339K、E174H/Q193L/A303P/N375A、E174H/Q193L/N375A、E174H/H218M/N233R/G271D/Q293R/A303P、E174H/H218M/G271D/A303P、E174R、L175G/Q193L/H218M/N233R/L243R/N375A、L175G/Q193L/H218M/L243R、L175G/H218M/N375A、K181Q、A189H、Q193L、Q193L/H218M/L243R、Q193L/G271D/A303P/D334T、Q193L/Q293R/A303P、K194T、Q195I、Q195L、Q195Y、I199H、K210V、H218C、H218D、H218M、H218M/L243R、H218M/L243R/A303P/D334T、H218M/A303P、H218P、M225L、Y238W、T274D、G281K、G281P、N330F和N330H，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:442编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:540具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：34/38/174/193/195/243/281/303/330、34/38/174/225/303、34/38/174/303/345、34/174、34/174/193/195/243/281、34/174/193/195/303/330、34/193/195/225/243、34/193/243/303/330、34/281/330、38、38/174/193/195/243/330、38/174/193/225/274/283/303/330、38/174/193/303、38/174/195/281/330、38/174/225/243/281/330、38/174/281、38/174/281/303、38/174/281/303/345、38/193/195/225/303/345、38/195/243/303、38/195/281/303/330、38/195/281/330、38/195/303、49、49/51/98/252/311、49/51/123/252/344、49/98/120/252/344、49/120/252/344、49/123/252/344、49/123/264/344、49/123/311、49/252/344、49/311/344、49/344、51、51/252/344、51/344、98、98/344、123/252/344、129、160、161、174/193/195/225、174/193/303/330、174/195/225/281/303/330/345、174/195/243/281/345、174/195/281/303、174/225/243/281/303/345、174/281/330、174/303、195/225/303/330、252、268和344，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:540编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:540具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：34L/38A/174G/193L/195L/243R/281P/303P/330F、34L/38A/174R/303P/345I、34L/38G/174R/225L/303P、34L/174G、34L/174G/193L/195L/243R/281P、34L/174H/193L/195I/303P/330F、34L/193L/195I/225L/243R、34L/193L/243R/303P/330F、34L/281P/330H、38A/174H/193L/225L/274D/283I/303P/330F、38A/174R/281K/303P/345I、38A/193L/195L/225L/303P/345I、38A/195I/303P、38A/195Y/281K/303P/330F、38G、38G/174G/193L/303P、38G/174G/281K/303P、38G/174H/195L/281P/330F、38G/174H/225L/243R/281K/330H、38G/174H/281K、38G/174R/193L/195L/243R/330H、38G/195I/281P/330F、38G/195Y/243R/303P、49S、49T、49T/51A/98P/252V/311W、49T/51A/123Q/252V/344H、49T/98P/120T/252V/344H、49T/120T/252V/344H、49T/123Q/252V/344H、49T/123Q/264S/344H、49T/123Q/311W、49T/252V/344H、49T/311W/344H、49T/344H、51A/252V/344H、51A/344H、51V、98P/344H、98R、123Q/252V/344H、129F、160T、161I、174G/195I/225L/281K/303P/330F/345I、174G/225L/243R/281P/303P/345I、174H/195I/243R/281K/345I、174H/281P/330H、174R/193L/195I/225L、174R/193L/303P/330H、174R/195I/281K/303P、174R/303P、195Y/225L/303P/330H、252V、268T、344I、344V和344W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:540编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:540具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：K34L/F38A/E174G/Q193L/Q195L/L243R/G281P/A303P/N330F、K34L/F38A/E174R/A303P/F345I、K34L/F38G/E174R/M225L/A303P、K34L/E174G、K34L/E174G/Q193L/Q195L/L243R/G281P、K34L/E174H/Q193L/Q195I/A303P/N330F、K34L/Q193L/Q195I/M225L/L243R、K34L/Q193L/L243R/A303P/N330F、K34L/G281P/N330H、F38A/E174H/Q193L/M225L/T274D/M283I/A303P/N330F、F38A/E174R/G281K/A303P/F345I、F38A/Q193L/Q195L/M225L/A303P/F345I、F38A/Q195I/A303P、F38A/Q195Y/G281K/A303P/N330F、F38G、F38G/E174G/Q193L/A303P、F38G/E174G/G281K/A303P、F38G/E174H/Q195L/G281P/N330F、F38G/E174H/M225L/L243R/G281K/N330H、F38G/E174H/G281K、F38G/E174R/Q193L/Q195L/L243R/N330H、F38G/Q195I/G281P/N330F、F38G/Q195Y/L243R/A303P、V49S、V49T、V49T/T51A/G98P/M252V/L311W、V49T/T51A/E123Q/M252V/S344H、V49T/G98P/M120T/M252V/S344H、V49T/M120T/M252V/S344H、V49T/E123Q/M252V/S344H、V49T/E123Q/T264S/S344H、V49T/E123Q/L311W、V49T/M252V/S344H、V49T/L311W/S344H、V49T/S344H、T51A/M252V/S344H、T51A/S344H、T51V、G98P/S344H、G98R、E123Q/M252V/S344H、S129F、S160T、L161I、E174G/Q195I/M225L/G281K/A303P/N330F/F345I、E174G/M225L/L243R/G281P/A303P/F345I、E174H/Q195I/L243R/G281K/F345I、E174H/G281P/N330H、E174R/Q193L/Q195I/M225L、E174R/Q193L/A303P/N330H、E174R/Q195I/G281K/A303P、E174R/A303P、Q195Y/M225L/A303P/N330H、M252V、S268T、S344I、S344V和S344W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:540编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:646具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：11/16/67/168/180/287、11/16/237/241/287、11/67/168/287、16/67/154/168/237/241/287、16/67/237/287/291、16/168/177、24、24/278、34/49/161/193/243/344、34/49/161/193/344、34/49/161/243/344、34/49/161/252/268/344、34/49/193/243/252/344、34/49/193/344、34/49/243/252、34/49/252/268/344、34/161/193/243/252/268、34/161/193/243/268/344、34/161/193/243/344、34/161/193/252/268/344、34/161/193/252/344、34/161/193/268/344、34/161/243/281/344、34/161/344、34/193/243/252/344、34/193/252/268/344、34/193/268/281、34/252/268/281/344、34/252/344、49/161/193/243/252/344、49/161/193/252/281/344、49/161/243/252/344、49/193/197/243/252/281/344、49/193/243/252/344、49/193/243/344、49/243/344、67/154/237/287、67/168/237、67/168/237/287、67/177/237、154/237/286/287、154/286/287、161/193/252/344、161/193/344、161/344、168/237、186/187/278、193/243/281/344、193/252/268/344、193/252/281/344、237、237/287/291和281/344，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:646编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:646具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：11I/16F/67A/168T/180V/287L、11I/16F/237Q/241S/287L、11I/67A/168T/287L、16F/67A/154Y/168T/237Q/241S/287L、16F/67A/237Q/287L/291A、16F/168T/177L、24M、24M/278L、34K/49T/161I/193L/243R/344H、34K/49T/161I/193L/243R/344V、34K/49T/161I/193L/344W、34K/49T/161I/243R/344H、34K/49T/161I/252V/268T/344V、34K/49T/193L/243R/252V/344W、34K/49T/193L/344H、34K/49T/193L/344W、34K/49T/243R/252V、34K/49T/252V/268T/344V、34K/161I/193L/243R/252V/268T、34K/161I/193L/243R/268T/344V、34K/161I/193L/243R/344W、34K/161I/193L/252V/268T/344H、34K/161I/193L/252V/268T/344V、34K/161I/193L/252V/344H、34K/161I/193L/252V/344V、34K/161I/193L/252V/344W、34K/161I/193L/268T/344H、34K/161I/243R/281P/344V、34K/161I/344V、34K/161I/344W、34K/193L/243R/252V/344W、34K/193L/252V/268T/344H、34K/193L/268T/281P、34K/252V/268T/281P/344V、34K/252V/344V、49T/161I/193L/243R/252V/344W、49T/161I/193L/252V/281P/344H、49T/161I/243R/252V/344V、49T/193L/197G/243R/252V/281P/344H、49T/193L/243R/252V/344V、49T/193L/243R/344W、49T/243R/344V、67A/154Y/237Q/287L、67A/168T/237Q、67A/168T/237Q/287L、67A/177L/237Q、154Y/237Q/286V/287L、154Y/286V/287L、161I/193L/252V/344V、161I/193L/344W、161I/344W、168T/237Q、186T/187A/278L、193L/243R/281P/344W、193L/252V/268T/344V、193L/252V/281P/344H、237Q、237Q/287L/291A和281P/344W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:646编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ IDNO:646具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：V11I/L16F/Y67A/S168T/I180V/F287L、V11I/L16F/A237Q/T241S/F287L、V11I/Y67A/S168T/F287L、L16F/Y67A/W154Y/S168T/A237Q/T241S/F287L、L16F/Y67A/A237Q/F287L/S291A、L16F/S168T/V177L、F24M、F24M/Y278L、L34K/V49T/L161I/Q193L/L243R/S344H、L34K/V49T/L161I/Q193L/L243R/S344V、L34K/V49T/L161I/Q193L/S344W、L34K/V49T/L161I/L243R/S344H、L34K/V49T/L161I/M252V/S268T/S344V、L34K/V49T/Q193L/L243R/M252V/S344W、L34K/V49T/Q193L/S344H、L34K/V49T/Q193L/S344W、L34K/V49T/L243R/M252V、L34K/V49T/M252V/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/L243R/M252V/S268T、L34K/L161I/Q193L/L243R/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/L243R/S344W、L34K/L161I/Q193L/M252V/S268T/S344H、L34K/L161I/Q193L/M252V/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344H、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344V、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344W、L34K/L161I/Q193L/S268T/S344H、L34K/L161I/L243R/G281P/S344V、L34K/L161I/S344V、L34K/L161I/S344W、L34K/Q193L/L243R/M252V/S344W、L34K/Q193L/M252V/S268T/S344H、L34K/Q193L/S268T/G281P、L34K/M252V/S268T/G281P/S344V、L34K/M252V/S344V、V49T/L161I/Q193L/L243R/M252V/S344W、V49T/L161I/Q193L/M252V/G281P/S344H、V49T/L161I/L243R/M252V/S344V、V49T/Q193L/S197G/L243R/M252V/G281P/S344H、V49T/Q193L/L243R/M252V/S344V、V49T/Q193L/L243R/S344W、V49T/L243R/S344V、Y67A/W154Y/A237Q/F287L、Y67A/S168T/A237Q、Y67A/S168T/A237Q/F287L、Y67A/V177L/A237Q、W154Y/A237Q/L286V/F287L、W154Y/L286V/F287L、L161I/Q193L/M252V/S344V、L161I/Q193L/S344W、L161I/S344W、S168T/A237Q、H186T/L187A/Y278L、Q193L/L243R/G281P/S344W、Q193L/M252V/S268T/S344V、Q193L/M252V/G281P/S344H、A237Q、A237Q/F287L/S291A和G281P/S344W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:646编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:758具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24/168/252/281、24/237/287/344、24/252、24/252/287、24/344、213/252/278/344、252/278/344、252/287/344和281，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:758编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:758具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：24M/168T/252V/281P、24M/237Q/287L/344S、24M/252V、24M/252V/287L、24M/344W、213S/252V/278L/344S、252V/278L/344W、252V/287L/344S和281P，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:758编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:758具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：F24M/S168T/M252V/G281P、F24M/A237Q/F287L/H344S、F24M/M252V、F24M/M252V/F287L、F24M/H344W、P213S/M252V/Y278L/H344S、M252V/Y278L/H344W、M252V/F287L/H344S和G281P，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:758编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:868具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中重组脂肪酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24、24/38/49/70/149/161/174/175/189/193/225/231/243/252/271/287/292/293/296/303/334/344/373/385、38、49、70、149、161、174、175、189、193、225、231、243、252、271、287、292、293、296、303、334、344、373和385，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:868编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:868具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：24A、24C、24D、24E、24F、24F/38F/49V/70K/149T/161L/174E/175Q/189S/193Q/225M/231Q/243L/252M/271G/287F/292M/293Q/296S/303A/334D/344S/373Y/385F、24G、24H、24I、24K、24L、24N、24P、24Q、24R、24S、24T、24V、24W、24Y、38A、38C、38D、38E、38F、38H、38I、38K、38L、38M、38N、38P、38Q、38R、38S、38T、38V、38W、38Y、49A、49C、49D、49E、49F、49G、49H、49I、49K、49L、49M、49N、49P、49Q、49R、49S、49V、49W、49Y、70A、70C、70D、70E、70F、70G、70I、70K、70L、70M、70N、70P、70Q、70R、70S、70T、70V、70W、70Y、149A、149C、149D、149F、149G、149H、149I、149K、149L、149M、149N、149P、149Q、149R、149S、149T、149V、149W、149Y、161A、161C、161D、161E、161F、161G、161H、161K、161L、161M、161N、161P、161Q、161R、161S、161T、161V、161W、161Y、174A、174C、174D、174E、174F、174G、174H、174I、174K、174L、174M、174N、174P、174Q、174S、174T、174V、174W、174Y、175A、175C、175D、175E、175F、175G、175H、175I、175K、175M、175N、175P、175Q、175R、175S、175T、175V、175W、175Y、189C、189D、189E、189F、189G、189H、189I、189K、189L、189M、189N、189P、189Q、189R、189S、189T、189V、189W、189Y、193A、193C、193D、193E、193F、193G、193H、193I、193K、193M、193N、193P、193Q、193R、193S、193T、193V、193W、193Y、225A、225C、225D、225E、225F、225G、225H、225I、225K、225M、225N、225P、225Q、225R、225S、225T、225V、225W、225Y、231A、231C、231D、231F、231G、231H、231I、231K、231L、231M、231N、231P、231Q、231R、231S、231T、231V、231W、231Y、243A、243C、243D、243E、243F、243G、243H、243I、243K、243L、243M、243N、243P、243Q、243S、243T、243V、243W、243Y、252A、252C、252D、252E、252F、252G、252H、252I、252K、252L、252M、252N、252P、252Q、252R、252S、252T、252W、252Y、271A、271C、271E、271F、271G、271H、271I、271K、271L、271M、271N、271P、271Q、271R、271S、271T、271V、271W、271Y、287A、287C、287D、287E、287F、287G、287H、287I、287K、287M、287N、287P、287Q、287R、287S、287T、287V、287W、287Y、292A、292C、292D、292E、292F、292G、292H、292I、292K、292M、292N、292P、292Q、292R、292S、292T、292V、292W、292Y、293A、293C、293D、293E、293F、293G、293H、293I、293K、293L、293M、293N、293P、293Q、293S、293T、293V、293W、293Y、296A、296C、296D、296E、296F、296G、296H、296I、296K、296L、296M、296N、296P、296Q、296S、296T、296V、296W、296Y、303A、303C、303D、303E、303F、303G、303H、303I、303K、303L、303M、303N、303Q、303R、303S、303T、303V、303W、303Y、334A、334C、334D、334E、334F、334G、334H、334I、334K、334L、334M、334N、334P、334Q、334R、334S、334V、334W、334Y、344A、344C、344D、344E、344F、344G、344I、344K、344L、344M、344N、344P、344Q、344R、344S、344T、344V、344W、344Y、373A、373C、373D、373E、373G、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373P、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、373Y、385A、385C、385D、385E、385F、385G、385H、385I、385K、385L、385M、385N、385Q、385R、385S、385T、385V、385W和385Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:868编号。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组脂肪酶，重组脂肪酶包含与SEQ IDNO:868具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组脂肪酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：M24A、M24C、M24D、M24E、M24F、M24F/G38F/T49V/H70K/E149T/I161L/R174E/L175Q/A189S/L193Q/L225M/E231Q/R243L/V252M/D271G/L287F/L292M/R293Q/R296S/P303A/T334D/H344S/F373Y/P385F、M24G、M24H、M24I、M24K、M24L、M24N、M24P、M24Q、M24R、M24S、M24T、M24V、M24W、M24Y、G38A、G38C、G38D、G38E、G38F、G38H、G38I、G38K、G38L、G38M、G38N、G38P、G38Q、G38R、G38S、G38T、G38V、G38W、G38Y、T49A、T49C、T49D、T49E、T49F、T49G、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49P、T49Q、T49R、T49S、T49V、T49W、T49Y、H70A、H70C、H70D、H70E、H70F、H70G、H70I、H70K、H70L、H70M、H70N、H70P、H70Q、H70R、H70S、H70T、H70V、H70W、H70Y、E149A、E149C、E149D、E149F、E149G、E149H、E149I、E149K、E149L、E149M、E149N、E149P、E149Q、E149R、E149S、E149T、E149V、E149W、E149Y、I161A、I161C、I161D、I161E、I161F、I161G、I161H、I161K、I161L、I161M、I161N、I161P、I161Q、I161R、I161S、I161T、I161V、I161W、I161Y、R174A、R174C、R174D、R174E、R174F、R174G、R174H、R174I、R174K、R174L、R174M、R174N、R174P、R174Q、R174S、R174T、R174V、R174W、R174Y、L175A、L175C、L175D、L175E、L175F、L175G、L175H、L175I、L175K、L175M、L175N、L175P、L175Q、L175R、L175S、L175T、L175V、L175W、L175Y、A189C、A189D、A189E、A189F、A189G、A189H、A189I、A189K、A189L、A189M、A189N、A189P、A189Q、A189R、A189S、A189T、A189V、A189W、A189Y、L193A、L193C、L193D、L193E、L193F、L193G、L193H、L193I、L193K、L193M、L193N、L193P、L193Q、L193R、L193S、L193T、L193V、L193W、L193Y、L225A、L225C、L225D、L225E、L225F、L225G、L225H、L225I、L225K、L225M、L225N、L225P、L225Q、L225R、L225S、L225T、L225V、L225W、L225Y、E231A、E231C、E231D、E231F、E231G、E231H、E231I、E231K、E231L、E231M、E231N、E231P、E231Q、E231R、E231S、E231T、E231V、E231W、E231Y、R243A、R243C、R243D、R243E、R243F、R243G、R243H、R243I、R243K、R243L、R243M、R243N、R243P、R243Q、R243S、R243T、R243V、R243W、R243Y、V252A、V252C、V252D、V252E、V252F、V252G、V252H、V252I、V252K、V252L、V252M、V252N、V252P、V252Q、V252R、V252S、V252T、V252W、V252Y、D271A、D271C、D271E、D271F、D271G、D271H、D271I、D271K、D271L、D271M、D271N、D271P、D271Q、D271R、D271S、D271T、D271V、D271W、D271Y、L287A、L287C、L287D、L287E、L287F、L287G、L287H、L287I、L287K、L287M、L287N、L287P、L287Q、L287R、L287S、L287T、L287V、L287W、L287Y、L292A、L292C、L292D、L292E、L292F、L292G、L292H、L292I、L292K、L292M、L292N、L292P、L292Q、L292R、L292S、L292T、L292V、L292W、L292Y、R293A、R293C、R293D、R293E、R293F、R293G、R293H、R293I、R293K、R293L、R293M、R293N、R293P、R293Q、R293S、R293T、R293V、R293W、R293Y、R296A、R296C、R296D、R296E、R296F、R296G、R296H、R296I、R296K、R296L、R296M、R296N、R296P、R296Q、R296S、R296T、R296V、R296W、R296Y、P303A、P303C、P303D、P303E、P303F、P303G、P303H、P303I、P303K、P303L、P303M、P303N、P303Q、P303R、P303S、P303T、P303V、P303W、P303Y、T334A、T334C、T334D、T334E、T334F、T334G、T334H、T334I、T334K、T334L、T334M、T334N、T334P、T334Q、T334R、T334S、T334V、T334W、T334Y、H344A、H344C、H344D、H344E、H344F、H344G、H344I、H344K、H344L、H344M、H344N、H344P、H344Q、H344R、H344S、H344T、H344V、H344W、H344Y、F373A、F373C、F373D、F373E、F373G、F373H、F373I、F373K、F373L、F373M、F373N、F373P、F373Q、F373R、F373S、F373T、F373V、F373W、F373Y、P385A、P385C、P385D、P385E、P385F、P385G、P385H、P385I、P385K、P385L、P385M、P385N、P385Q、P385R、P385S、P385T、P385V、P385W和P385Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:868编号。
在一些实施方案中，如以上描述的，多核苷酸编码具有本文公开的特性的脂肪酶活性的工程化多肽，其中多肽包含与参考序列(例如，SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列，或如表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和/或表5-1中公开的任何变体的氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868的参考多肽或如表中公开的任何变体的氨基酸序列相比的一个或更多个残基差异(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸残基位置)。在一些实施方案中，多核苷酸编码具有本发明公开的特性的脂肪酶活性的工程化多肽，其中多肽包含与参考序列SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868相比的一个或更多个残基差异，所述一个或更多个残基差异位于选自在与SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868的多肽最佳比对时表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和/或表5-1中提供的那些的残基位置处。
在一些另外的实施方案中，多核苷酸包含与参考序列SEQ ID NO:1、93、349、441、539、645、757、和/或867具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的序列。在一些另外的实施方案中，多核苷酸包含与表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和/或表5-1中提供的至少一种多核苷酸序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的序列。在一些另外的实施方案中，多核苷酸包含与参考序列SEQ ID NO:1、93、349、441、539、645、757和/或867具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。在一些另外的实施方案中，多核苷酸包含与表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和/或表5-1中提供的至少一种多核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。在一些实施方案中，编码工程化脂肪酶多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:93、349、441、539、645、757和/或867的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，多核苷酸能够在高严格性条件下与参考多核苷酸序列杂交。在一些实施方案中，参考序列选自SEQ ID NO:1、93、349、441、539、645、757和/或867或其互补序列或编码本文提供的任何变体脂肪酶多肽的多核苷酸序列。在一些实施方案中，能够在高严格性条件下杂交的多核苷酸编码脂肪酶多肽，所述脂肪酶多肽包含与SEQ ID NO:1、93、349、441、539、645、757和/或867相比在选自如表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和/或表5-1中列出的任何位置的残基位置处具有一个或更多个残基差异的氨基酸序列。在一些另外的实施方案中，工程化多核苷酸选自表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和/或表5-1中提供的那些，或包含与选自SEQ ID NO:1、93、349、441、539、645、757和/或867的参考序列具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，多核苷酸包含与表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和/或表5-1中提供的至少一种多核苷酸序列和/或SEQ ID NO:1、93、349、441、539、645、757和/或867具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。在一些另外的实施方案中，与参考多核苷酸序列相比，工程化多核苷酸序列包含1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-9个、1-10个、1-15个、1-20个、1-21个、1-22个、1-23个、1-24个、1-25个、1-30个、1-35个、1-40个、1-45个或1-50个碱基变化。在又一些另外的实施方案中，与参考多核苷酸序列相比，工程化多核苷酸序列包含1个、2个、3个、4个、5个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、40个、45个或50个碱基变化。在一些实施方案中，与参考多核苷酸序列相比，工程化多核苷酸序列包含1个、2个、3个、4个、5个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、18个、20个、21个、22个、23个、24个或25个碱基变化。
在一些实施方案中，编码本文提供的任何工程化脂肪酶多肽的分离的多核苷酸以各种方式被操作，以提供多肽基因的表达和多肽的产生。在一些实施方案中，编码多肽的多核苷酸以表达载体提供，其中存在一个或更多个控制序列以调控多核苷酸和/或多肽的表达。取决于表达载体，在将分离的多核苷酸插入到载体中之前对其进行操作可以是期望的或必要的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸和核酸序列的技术是本领域熟知的。
在一些实施方案中，控制序列包括，除其他序列以外，启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子。如本领域已知的，合适的控制序列可以基于使用的宿主细胞来选择。不意图本发明受限于任何特定的控制序列。
用于细菌宿主细胞的示例性启动子包括但不限于从以下基因获得的启动子：大肠杆菌乳糖操纵子、色氨酸操纵子、阿拉伯糖操纵子、来自T7噬菌体的T7启动子和红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)红霉素抗性基因。
用于丝状真菌宿主细胞的示例性启动子包括从以下的基因获得的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定型α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(参见，例如WO 96/00787)，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子的杂合体)，和其突变体、截短的和杂合的启动子。示例性酵母细胞启动子可以来自以下的基因：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的启动子是本领域已知的(参见例如，Romanos等人，Yeast 8:423-488[1992])。
用于在哺乳动物细胞中使用的示例性启动子包括但不限于，来自巨细胞病毒(CMV)的启动子、猿猴空泡病毒40(SV40)的启动子、来自智人(Homo sapiens)的磷酸甘油酸激酶、β-肌动蛋白、延伸因子-1a或甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子或来自原鸡(Gallusgallus)β-肌动蛋白的启动子。
在一些实施方案中，控制序列是合适的转录终止子序列，转录终止子序列为由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列被可操作地连接至编码多肽的核酸序列的3’末端。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。例如，可以从T7细菌噬菌体(例如T7终止子)或大肠杆菌核糖体RNA(例如rrnB终止子)获得用于细菌宿主细胞的示例性转录终止子。例如，用于丝状真菌宿主细胞的示例性转录终止子可以从以下的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。用于酵母宿主细胞的示例性终止子可以从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子是本领域已知的(参见例如，Romanos等人，上文)。用于哺乳动物细胞的示例性终止子包括但不限于来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴空泡病毒40(SV40)或来自智人生长激素的终止子。
在一些实施方案中，控制序列是合适的前导序列，前导序列为对由宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列被可操作地连接至编码多肽的核酸序列的5’末端。可以使用在所选择的宿主细胞中起作用的任何前导序列。用于丝状真菌宿主细胞的示例性前导序列从以下的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶。用于酵母宿主细胞的合适的前导序列包括但不限于从以下的基因获得的那些：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
在一些实施方案中，控制序列还可以是多腺苷酸化序列，多腺苷酸化序列为可操作地连接于核酸序列的3’末端并且当转录时被宿主细胞识别为向转录的mRNA添加多腺苷残基的信号的序列。在本发明中可以使用在所选择的宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。用于丝状真菌宿主细胞的示例性多腺苷酸化序列包括但不限于从以下的基因获得的那些：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡萄糖苷酶。用于酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列是本领域已知的(参见例如，Guo和Sherman,Mol.Cell.Biol.,15:5983-5990[1995])。
在一些实施方案中，控制序列为信号肽编码区，所述信号肽编码区编码连接至多肽的氨基末端的氨基酸序列并将编码的多肽引导到细胞的分泌途径中。核酸序列的编码序列的5’末端可以固有地包含信号肽编码区，所述信号肽编码区符合翻译阅读框地(intranslation reading frame)与编码分泌多肽的编码区的区段天然地连接。可选地，编码序列的5’末端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码区。
将表达的多肽引导到选择的宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码区可用于本文提供的工程化脂肪酶多肽的表达。用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码区包括但不限于从以下的基因获得的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶和绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶。用于酵母宿主细胞的有用的信号肽包括但不限于来自以下的基因的那些：酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶。用于哺乳动物宿主细胞的有用的信号肽包括但不限于来自免疫球蛋白γ(IgG)基因的信号肽。
在一些实施方案中，控制序列为前肽编码区，所述前肽编码区编码定位在多肽的氨基末端处的氨基酸序列。产生的多肽被称为“前酶(proenzyme)”、“前多肽(propolypeptide)”或在某些情况下称为“酶原(zymogen)”。前多肽可以通过催化或自体催化前肽从前多肽的裂解被转化为成熟活性多肽。
在另一方面，本发明还提供了重组表达载体，所述重组表达载体包含编码工程化脂肪酶多肽的多核苷酸和取决于多核苷酸被引入的宿主细胞的类型的一个或更多个表达调控区域，诸如启动子和终止子、复制起点等。在一些实施方案中，将以上描述的各种核酸和控制序列连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体包含一个或更多个方便的限制位点以允许编码变体脂肪酶多肽的核酸序列在这样的位点处插入或取代。可选地，本发明的多核苷酸序列通过将包含该多核苷酸序列的多核苷酸序列或核酸构建体插入到用于表达的适当的载体中来表达。在产生表达载体时，编码序列位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当的控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地经受重组DNA程序并且可以导致变体脂肪酶多核苷酸序列的表达。载体的选择通常将取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性质粒或闭合的环状质粒。
在一些实施方案中，表达载体是自主复制载体(即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，诸如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体)。载体可以包含用于确保自我复制的任何工具(means)。在一些可选的实施方案中，载体可以是当被引入到宿主细胞中时，被整合到基因组中并与其被整合进的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单一载体或质粒或者一起包含待引入到宿主细胞基因组中的总DNA的两种或更多种载体或质粒、或转座子。
在一些实施方案中，表达载体优选地包含允许容易选择转化的细胞的一个或更多个选择标志物(selectable marker)。“选择标志物”是一种基因，其产物提供杀生物剂或病毒耐受性、对重金属的耐受性、对营养缺陷型提供原养型等。用于细菌宿主细胞的合适的标志物包括但不限于提供针对以下的抗性的那些：羧苄青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素、卡那霉素、吉欧霉素(zeocin)。用于酵母宿主细胞的合适的标志物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择标志物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶(sulfate adenyltransferase))和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及其等效物。在另一方面，本发明提供了包含编码本申请的至少一种工程化脂肪酶多肽的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸被可操作地连接至一个或更多个控制序列，用于在宿主细胞中表达工程化脂肪酶。
用于表达由本发明的表达载体编码的多肽的宿主细胞是本领域熟知的，并且包括但不限于细菌细胞(例如，大肠杆菌)；真菌细胞，诸如酵母细胞(例如，酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)[例如，ATCC登录号201178])；昆虫细胞(例如，果蝇属(Drosophila)S2和夜蛾属(Spodoptera)Sf9细胞)、植物细胞、动物细胞(例如，CHO、CHO-K1、COS和BHK)和人类细胞(例如，HEK293T、人类成纤维细胞、THP-1、Jurkat和Bowes黑素瘤细胞系)。
因此，在另一方面，本发明提供了用于产生工程化脂肪酶多肽的方法，其中该方法包括将能够表达编码工程化脂肪酶多肽的多核苷酸的宿主细胞在适于表达该多肽的条件下培养。在一些实施方案中，方法还包括分离和/或纯化如本文描述的脂肪酶多肽的步骤。
用于上文描述的宿主细胞的适当的培养基和生长条件是本领域熟知的。用于表达脂肪酶的多核苷酸可以通过本领域已知的各种方法引入细胞中。技术包括，除了其他以外，电穿孔、生物弹射粒子轰击(biolistic particle bombardment)、脂质体介导的转染、氯化钙转染和原生质体融合。
具有本文公开的特性的工程化脂肪酶可以通过使编码天然存在或工程化的脂肪酶多肽的多核苷酸经受本领域已知和/或如本文描述的诱变和/或定向演化方法来获得。示例性定向演化技术为诱变和/或DNA改组(参见例如，Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751[1994]；WO 95/22625；WO 97/0078；WO 97/35966；WO 98/27230；WO 00/42651；WO 01/75767和美国专利6,537,746)。可以使用的其他定向演化程序包括交错延伸过程(StEP)、体外重组(参见例如，Zhao等人，Nat.Biotechnol.，16:258-261[1998])、诱变PCR(参见例如，Caldwell等人，PCR Methods Appl.,3:S136-S140[1994])和盒式诱变(参见例如，Black等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:3525-3529[1996])以及其他。
重组多肽可以使用本领域已知的任何合适的方法产生。编码感兴趣的野生型多肽的基因可以在载体诸如质粒中克隆，并在期望的宿主诸如大肠杆菌等中表达。重组多肽的变体可以通过本领域已知的各种方法产生。事实上，存在本领域技术人员熟知的各种各样不同的诱变技术。此外，诱变试剂盒还可从许多商业分子生物学供应商获得。方法可用于做出确定的氨基酸(定点)处的特定取代、基因的局部区域中的特异性(区域特异性)或随机突变，或整个基因内的随机诱变(例如，饱和诱变)。本领域的技术人员已知产生酶变体的许多合适的方法，包括但不限于，使用PCR对单链DNA或双链DNA定点诱变、盒式诱变、基因合成、易错PCR、改组和化学饱和诱变，或本领域已知的任何其他合适的方法。诱变和定向演化方法可以容易地应用于编码酶的多核苷酸，以产生可以被表达、筛选和测定的变体文库。任何合适的诱变和定向演化方法都可以在本发明中使用，并且在本领域中是熟知的(参见例如，美国专利第5,605,793号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号、第5,837,458号、第5,928,905号、第6,096,548号、第6,117,679号、第6,132,970号、第6,165,793号、第6,180,406号、第6,251,674号、第6,265,201号、第6,277,638号、第6,287,861号、第6,287,862号、第6,291,242号、第6,297,053号、第6,303,344号、第6,309,883号、第6,319,713号、第6,319,714号、第6,323,030号、第6,326,204号、第6,335,160号、第6,335,198号、第6,344,356号、第6,352,859号、第6,355,484号、第6,358,740号、第6,358,742号、第6,365,377号、第6,365,408号、第6,368,861号、第6,372,497号、第6,337,186号、第6,376,246号、第6,379,964号、第6,387,702号、第6,391,552号、第6,391,640号、第6,395,547号、第6,406,855号、第6,406,910号、第6,413,745号、第6,413,774号、第6,420,175号、第6,423,542号、第6,426,224号、第6,436,675号、第6,444,468号、第6,455,253号、第6,479,652号、第6,482,647号、第6,483,011号、第6,484,105号、第6,489,146号、第6,500,617号、第6,500,639号、第6,506,602号、第6,506,603号、第6,518,065号、第6,519,065号、第6,521,453号、第6,528,311号、第6,537,746号、第6,573,098号、第6,576,467号、第6,579,678号、第6,586,182号、第6,602,986号、第6,605,430号、第6,613,514号、第6,653,072号、第6,686,515号、第6,703,240号、第6,716,631号、第6,825,001号、第6,902,922号、第6,917,882号、第6,946,296号、第6,961,664号、第6,995,017号、第7,024,312号、第7,058,515号、第7,105,297号、第7,148,054号、第7,220,566号、第7,288,375号、第7,384,387号、第7,421,347号、第7,430,477号、第7,462,469号、第7,534,564号、第7,620,500号、第7,620,502号、第7,629,170号、第7,702,464号、第7,747,391号、第7,747,393号、第7,751,986号、第7,776,598号、第7,783,428号、第7,795,030号、第7,853,410号、第7,868,138号、第7,783,428号、第7,873,477号、第7,873,499号、第7,904,249号、第7,957,912号、第7,981,614号、第8,014,961号、第8,029,988号、第8,048,674号、第8,058,001号、第8,076,138号、第8,108,150号、第8,170,806号、第8,224,580号、第8,377,681号、第8,383,346号、第8,457,903号、第8,504,498号、第8,589,085号、第8,762,066号、第8,768,871号、第8,849,575号、第9,593,326号、第9,665,694号、第9,684,771号、第9,803,224号、第9,864,833号、第9.821,613号、第9,996,661号、第10,738,286号和所有相关美国以及PCT和非美国对应专利；Ling等人,Anal.Biochem.,254(2):157-78[1997]；Dale等人,Meth.Mol.Biol.,57:369-74[1996]；Smith,Ann.Rev.Genet.,19:423-462[1985]；Botstein等人,Science,229:1193-1201[1985]；Carter,Biochem.J.,237:1-7[1986]；Kramer等人,Cell,38:879-887[1984]；Wells等人,Gene,34:315-323[1985]；Minshull等人,Curr.Op.Chem.Biol.,3:284-290[1999]；Christians等人,Nat.Biotechnol.,17:259-264[1999]；Crameri等人,Nature,391:288-291[1998]；Crameri等人,Nat.Biotechnol.,15:436-438[1997]；Zhang等人,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,94:4504-4509[1997]；Crameri等人,Nat.Biotechnol.,14:315-319[1996]；Stemmer,Nature,370:389-391[1994]；Stemmer,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:10747-10751[1994]；WO 95/22625、WO 97/0078、WO 97/35966、WO 98/27230、WO 00/42651、WO 01/75767和WO 2009/152336，所有这些通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，诱变处理后获得的酶变体通过使酶变体经受确定的温度(或其他测定条件)并测量热处理或其他测定条件之后剩余的酶活性的量来筛选。然后从宿主细胞中分离包含编码脂肪酶多肽的多核苷酸的DNA，测序以鉴定核苷酸序列改变(如果有的话)，并用于在不同或相同的宿主细胞中表达酶。测量来自表达文库的酶活性可以使用本领域已知的任何合适的方法(例如，标准生物化学技术，诸如HPLC分析)来进行。
对于已知序列的工程化多肽，编码酶的多核苷酸可以根据已知的合成方法通过标准的固相方法制备。在一些实施方案中，多达约100个碱基的片段可以被单独合成、然后被连接(例如，通过酶促或化学连接方法或聚合酶介导的方法)以形成任何期望的连续序列。例如，本文公开的多核苷酸和寡核苷酸可以使用经典的亚磷酰胺方法(参见例如，Beaucage等人,Tetra.Lett.,22:1859-69[1981]和Matthes等人,EMBO J.,3:801-05[1984])，如通常在自动化合成方法中所实践的，通过化学合成制备。根据亚磷酰胺方法，寡核苷酸被合成(例如，在自动DNA合成仪中)、纯化、退火、连接并克隆入适当的载体。但是，不意图本发明受限于任何特定的用于产生多核苷酸或寡核苷酸的方法，因为任何合适的方法可用于本发明。
因此，在一些实施方案中，用于制备工程化脂肪酶多肽的方法可以包括：(a)合成编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含选自表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和/或表5-1中提供的任何变体的氨基酸序列以及SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868，和(b)表达由该多核苷酸编码的脂肪酶多肽。在方法的一些实施方案中，由多核苷酸编码的氨基酸序列包含一个或若干个(例如，最多3个、4个、5个或最多10个)氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，氨基酸序列包含1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个、1-15个、1-20个、1-21个、1-22个、1-23个、1-24个、1-25个、1-30个、1-35个、1-40个、1-45个或1-50个氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，氨基酸序列包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，氨基酸序列包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、18个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，取代包括保守取代和/或非保守取代。
可以使用本领域已知的任何合适的测定，包括但并不限于本文描述的测定和条件，评估所表达的工程化脂肪酶多肽的任何期望的改进特性(例如，活性、选择性、稳定性、酸耐受性、蛋白酶敏感性等)。
在一些实施方案中，使用用于蛋白纯化的熟知技术中的任何一种或更多种，将在宿主细胞中表达的工程化脂肪酶多肽的任一种从细胞和/或培养基中回收，用于蛋白纯化的熟知技术除了其他以外包括，溶菌酶处理、声处理(sonication)、过滤、盐析、热处理、超速离心和色谱法。
用于分离脂肪酶多肽的色谱技术，除了其他以外，包括，反相色谱法、高效液相色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、凝胶电泳和亲和色谱法。用于纯化特定酶的条件部分地取决于因素诸如净电荷、疏水性、亲水性、分子量、分子形状等，并且对本领域技术人员将是明显的。在一些实施方案中，亲和技术可以用于分离改进的变体脂肪酶。在利用亲和色谱法纯化的一些实施方案中，可使用特异性结合变体脂肪酶多肽的任何抗体。
在一些利用亲和色谱法纯化的实施方案中，可使用与共价附接至脂肪酶的聚糖结合的蛋白。在利用亲和色谱法纯化的其他实施方案中，可使用任何与脂肪酶活性位点结合的小分子。为了产生抗体，通过注射多肽(例如，脂肪酶变体)或其片段来免疫接种各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。在一些实施方案中，脂肪酶多肽或片段通过侧链官能团或附接至侧链官能团的接头的手段附接至合适的载体，诸如BSA。
在一些实施方案中，工程化脂肪酶多肽通过包括以下的方法在宿主细胞中产生：将包含编码如本文描述的工程化脂肪酶多肽的多核苷酸序列的宿主细胞(例如，大肠杆菌、酿酒酵母、胡萝卜(Daucus carota)、烟草(Nicotiana tabacum)、智人(例如，HEK293T)或灰仓鼠(Cricetulus griseus)(例如，CHO))在有利于工程化脂肪酶多肽产生的条件下培养，并从细胞和/或培养基回收工程化脂肪酶多肽。
在一些实施方案中，本发明包括产生工程化脂肪酶多肽的方法，该方法包括在合适的培养条件下培养包含编码工程化脂肪酶多肽的多核苷酸序列的重组真核细胞，以允许产生工程化脂肪酶多肽，并任选地从培养基和/或培养的真核细胞回收工程化脂肪酶多肽，所述工程化脂肪酶多肽具有与参考序列(例如，SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868)的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，以及与SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868相比的一个或更多个氨基酸残基差异，所述一个或更多个氨基酸残基差异选自当与SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868的氨基酸序列最佳比对时表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和/或表5-1中提供的那些氨基酸残基差异和/或其组合。
在一些实施方案中，将工程化多肽从重组宿主细胞或细胞培养基回收后，将它们通过本领域已知的任何合适的方法进一步纯化。在一些另外的实施方案中，将纯化的脂肪酶多肽与其他成分和化合物组合，来提供适用于不同应用和用途的包含工程化脂肪酶多肽的组合物和制剂(例如，药物组合物)。在一些另外的实施方案中，纯化的脂肪酶多肽或配制的脂肪酶多肽被冻干。
组合物：
本发明提供了各种组合物和形式，包括但不限于下文描述的那些。在一些实施方案中，本发明提供了工程化脂肪酶多肽，所述工程化脂肪酶多肽适于在药物组合物和其他组合物(诸如膳食和/或营养补充剂)中使用。
取决于施用方式，包含治疗有效量的根据本发明的工程化脂肪酶的这些组合物呈固体、半固体或液体的形式。在一些实施方案中，组合物包括其他药学上可接受的组分，诸如稀释剂、缓冲剂、赋形剂、盐、乳化剂、防腐剂、稳定剂、填料和其他成分。用于配制和施用的技术的细节是本领域熟知的，并在文献中被描述。
在一些实施方案中，配制工程化脂肪酶多肽用于在药物组合物中使用。用于在递送工程化脂肪酶多肽中使用的任何合适的形式可用于本发明，所述形式包括但不限于丸剂、片剂、凝胶片(gel tab)、胶囊、锭剂、糖衣丸、粉末、软凝胶、溶胶凝胶、凝胶、乳剂、植入物、贴剂、喷雾剂、软膏剂、搽剂、霜剂、糊剂、凝胶剂、涂剂、气雾剂、口香糖、缓和剂(demulcent)、条状物、溶液、悬浮液(包括但不限于油基悬浮液、水包油乳剂等)、浆液、糖浆剂、控释制剂、栓剂等。在一些实施方案中，工程化脂肪酶多肽以适于注射或输注的形式(即，以可注射制剂)提供。在一些实施方案中，工程化脂肪酶多肽以生物相容性基质诸如溶胶凝胶，包括基于二氧化硅(例如，氧基硅烷(oxysilane))的溶胶凝胶来提供。在一些实施方案中，将工程化脂肪酶多肽封装和/或肠溶包衣。在一些可选的实施方案中，将工程化脂肪酶多肽封装在纳米结构(例如，纳米管、纳米小管、纳米胶囊或微米胶囊、微球体、脂质体等)中。实际上，不意图本发明受限于任何特定递送制剂和/或递送方式。意图工程化脂肪酶多肽通过本领域已知的任何合适的方式来施用，包括但不限于：肠胃外、口服、局部、经皮、鼻内、眼内、鞘内、经由植入物等。
在一些实施方案中，工程化脂肪酶多肽通过糖基化、化学交联试剂、聚乙二醇化(即，用聚乙二醇[PEG]或活化的PEG等修饰)或其他化合物被化学修饰(参见例如，Ikeda,Amino Acids 29:283-287[2005]；美国专利第7,531,341号、第7,534,595号、第7,560,263号和第7,53,653号；美国专利申请公布第2013/0039898号、第2012/0177722号等)。实际上，不意图本发明受限于任何特定递送方法和/或机制。
在一些另外的实施方案中，工程化脂肪酶多肽在包含基质稳定的酶晶体的制剂中来提供。在一些实施方案中，制剂包含交联的结晶工程化脂肪酶和具有附接至酶晶体的反应部分的聚合物。本发明还以聚合物提供了工程化脂肪酶多肽。
在一些实施方案中，包含本发明的工程化脂肪酶多肽的组合物包含一种或更多种常用的载体化合物，包括但不限于糖(例如，乳糖、蔗糖、甘露糖醇和/或山梨糖醇)、淀粉(例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉或其他植物淀粉)、纤维素(例如，甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠)、树胶(例如，阿拉伯胶、黄芪胶、瓜尔胶等)和/或蛋白(例如，明胶、胶原蛋白等)。
在一些实施方案中，工程化脂肪酶多肽适合用于改进膳食脂肪吸收和降低粪便中的膳食脂质。在一些实施方案中，本发明提供了适用于降低流体(诸如血液、脑脊液等)中糖脂浓度的工程化脂肪酶多肽。施用的工程化脂肪酶多肽的剂量取决于状况或疾病、受试者的一般状况以及本领域技术人员已知的其他因素。在一些实施方案中，意图将组合物单次或多于一次施用。在一些实施方案中，设想向患有胰功能不全病的人类施用的一种或更多种组合物中一种或更多种工程化脂肪酶多肽的浓度足以有效治疗和/或改善疾病(例如，胰功能不全病)。在一些实施方案中，工程化脂肪酶多肽可用于与其他酶(诸如淀粉酶和/或蛋白酶)组合用于治疗疾病(诸如胰腺酶不足)。
在一些实施方案中，工程化脂肪酶多肽与其他药物和/或膳食组合物(包括但不限于膳食补充剂、营养保健品等)组合施用。不意图本发明受限于任何特定的施用方法或形式，因为任何合适的方法和/或形式都可以使用。
实验
提供以下实施例，包括实验和获得的结果，仅用于说明的目的，而不应被解释为限制本发明。
在以下的实验公开内容中，应用以下缩写：ppm (百万分率(parts permillion))；M(摩尔/升)；mM(毫摩尔/升),uM和μM(微摩尔/升)；nM(纳摩尔/升)；mol(摩尔)；gm和g(克)；mg(毫克)；ug和μg(微克)；L和l(升)；ml和mL(毫升)；cm(厘米)；mm(毫米)；um和μm(微米)；sec.(秒)；min(s)(分钟)；h(s)和hr(s)(小时)；U(单位)；MW(分子量)；rpm(转/分钟)；℃(摄氏度)；CDS(编码序列)；DNA(脱氧核糖核酸)；RNA(核糖核酸)；大肠杆菌W3110(常用的实验室大肠杆菌菌株，可从大肠杆菌遗传资源中心(Coli Genetic Stock Center)[CGSC],New Haven,CT获得)；EPI(外分泌胰功能不全)；LIP和lip(脂肪酶)；btLIP(热噬淀 粉芽孢杆菌(B.thermoamylovorans)脂肪酶)；HPLC(高压液相色谱法)；ms(质谱法或质谱)；SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PES(聚醚砜)；ACN(乙腈)；IPA(异丙醇)；IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)；PMBS(硫酸多黏菌素B)；NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸膦酸)；LB(Luria肉汤)；PBS(磷酸盐缓冲盐水)；MeOH(甲醇)；TAG(三油酸甘油酯(triolein))；DAG(二油酸甘油酯(diolein))；MAG(油酸单甘油酯(monoolein))；OA(油酸)；FIOPC和FIOP(相对于阳性对照的倍数改进)；HTP(高通量)；CAV(池加速电压；碰撞池加速电压)；CE(碰撞能量)；RF(射频)；Sinclair(Sinclair Research和Sinclair Bio Resources,Auxvasse,MO)；Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)；Pall Corp.(Pall,Corp.,Pt.Washington,NY)；Millipore(Millipore,Corp.,Billerica MA)；Difco(DifcoLaboratories,BD Diagnostic Systems,Detroit,MI)；Molecular Devices(MolecularDevices,LLC,Sunnyvale,CA)；Kuhner(Adolf Kuhner,AG,Basel,Switzerland)；AppliedBiosystems(Applied Biosystems,Life Technologies,Corp.的一部分,Grand Island,NY),Agilent(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)；
Figure BDA0003625357360000931
MS(
Figure BDA0003625357360000932
质谱仪,Agilent)；Thermo Scientific(ThermoFisher Scientific的一部分,Waltham,MA)；Gibco(ThermoFisher Scientific)；Pierce(Pierce Biotechnology(现在是Thermo Fisher Scientific的一部分),Rockford,IL)；ThermoFisher Scientific(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)；Corning(Corning,Inc.,Palo Alto,CA)；AbbVie(AbbVie,Inc.,North Chicago,IL)；和Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA).
实施例1
细菌脂肪酶基因的获取及表达载体的构建
对编码热噬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)脂肪酶(SEQ ID NO:2)的DNA序列进行密码子优化用于在大肠杆菌中表达并克隆到大肠杆菌表达载体pCK110900载体系统(参见例如，美国专利第7,629,157号和第9,714,437号，以及美国专利申请公布2006/0195947，所有这些在此通过引用并入本文)或pJV110900载体系统(参见例如，美国专利申请公布2017/213758，其也通过引用并入本文)。但是，不意图本发明受限于任何特定的载体。此外，在一些实施方案中，可使用缺乏抗微生物的抗性标志物的表达载体。将质粒构建体转化到源自W3110的大肠杆菌菌株中。使用本领域技术人员通常已知的定向演化技术从该质粒构建体产生基因变体文库(参见例如，美国专利第8,383,346号和WO2010/144103)及其衍生物。
实施例2
哺乳动物脂肪酶基因的获取、表达载体的构建及HTP生长和活性筛选
对编码表2-1中的哺乳动物脂肪酶的基因(SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11)进行密码子优化用于在酿酒酵母中表达。酿酒酵母交配因子α(MFα)信号肽与脂肪酶的成熟形式遗传地融合，用于脂肪酶的分泌型表达。这些酵母菌株以HTP生长，如WO 2016/105889中描述的(通过引用并入本文)。对这些酵母培养物的上清液的活性进行测定，如实施例3中描述的。从这些脂肪酶获得的活性在表2-1中示出。
Figure BDA0003625357360000941
实施例3
脂肪酶变体的高通量(HTP)生长及筛选条件
对脂肪酶变体的生长和筛选进行的实验在以下描述。
热噬淀粉芽孢杆菌脂肪酶(btLIP)和脂肪酶(LIP)变体的高通量(HTP)生长：
将转化的大肠杆菌细胞通过铺在含有1％葡萄糖和选择物的LB琼脂板上来选择。在37℃孵育过夜后，将菌落放置到96孔浅平底板(NUNCTM,Thermo-Scientific)的孔中，所述孔中填充有180μl/孔的补充有1％葡萄糖和选择物的LB。允许培养物在摇动培养箱(200rpm，30℃和85％相对湿度；Kuhner)中过夜生长18-20小时。将过夜生长的样品(20μL)转移到填充有380μL的补充有选择化合物(例如，氯霉素)的极好肉汤(Terrific Broth)的
Figure BDA0003625357360000951
96孔深板中。将板在摇动培养箱(250rpm，30℃和85％相对湿度；Kuhner)中孵育135分钟。然后用40μL的在无菌水中的10mM IPTG诱导脂肪酶变体的表达，并将培养物在摇动培养箱(250rpm、30℃和85％相对湿度；Kuhner)中过夜孵育20-24小时。使细胞通过离心(4000rpm x 20min)沉淀，将上清液弃去，并将细胞在-80℃冷冻，然后分析。
HTP沉淀的裂解：
首先，向细胞沉淀添加200-400μL的裂解缓冲液(1X PBS，1mg/ml溶菌酶，和0.5mg/ml硫酸多黏菌素B)。将细胞沉淀和缓冲液在室温温和地摇动1.5-2h，并离心(4000rpm x5min)，然后在本文描述的各个HTP测定中使用澄清的裂解物。通过SDS-PAGE对这些裂解物进行的分析揭示，过表达的蛋白以～45kDa的表观MW存在，与预期的btLIP的MW一致。
澄清裂解物的脂肪酶活性的分析：
通过测量油酸、二油酸甘油酯和油酸单甘油酯的形成(通过它们随时间的丰度变化)来确定btLIP变体活性。对于本测定，将90μL的100mM磷酸钠和2.5μL pH 7.0的三油酸甘油酯与10μL的裂解物混合，并添加到聚丙烯酸酯96孔微量滴定板(
Figure BDA0003625357360000952
板#3635，Corning)的孔中，并在37℃孵育30min至1hr。反应用600μL ACN:IPA(1:3)猝灭，用离心进行澄清，并在C18
Figure BDA0003625357360000953
5μm 150mm柱上用乙腈中55％IPA的等度流运行进行分离，以在214nm处检测油酸、二油酸甘油酯、油酸单甘油酯和三油酸甘油酯。可选地，使猝灭的反应澄清并将10μL稀释到190μL的50:50IPA:MeOH中，摇动1min，然后通过将10μL添加到190μL的50:25:25H2O:IPA:MeOH中再次稀释。然后通过
Figure BDA0003625357360000954
MS对样品进行分析。在以下实施例中，“未挑战的活性(unchallenged activity)”是指在没有任何外部预处理/挑战的情况下进行的如以下测定方法描述中描述的脂肪酶活性确定。
Figure BDA0003625357360000961
Figure BDA0003625357360000971
用热预处理进行预处理的澄清裂解物的HTP分析：
在37℃至65℃孵育后确定btLIP变体的活性。首先，将100μL的澄清裂解物添加到96孔BioRad Hard-Shell PCR薄壁微量滴定板(#hsp9601；BioRad)的孔中。将板密封，并在37℃至65℃在热循环仪中孵育1h，然后分析。通过测量油酸、二油酸甘油酯和油酸单甘油酯的形成(通过它们随时间的丰度变化)来确定变体活性。对于本测定，将90μL的100mM磷酸钠和2.5μL pH 7.0的三油酸甘油酯与10μL的裂解物混合，并添加到聚丙烯酸酯96孔微量滴定板(
Figure BDA0003625357360000973
板#3635；Corning)的孔中，并在37℃孵育30min至1hr。反应用600μL ACN:IPA(1:3)猝灭，澄清并将10μL稀释到190μL的50:50IPA:MeOH中，摇动1min，然后通过将10μL添加到190μL的50:25:25H2O:IPA:MeOH中再次稀释。然后通过
Figure BDA0003625357360000972
MS对样品进行分析。结果在实施例4中的表格中提供。
具有低pH及有或没有胃蛋白酶预处理的澄清裂解物的HTP分析：
在与胃蛋白酶孵育以模拟胃的环境后，确定btLIP变体的活性。首先，将90μL的100mM柠檬酸钠、2.5mg pH 2.0至5.0的TAG、含有或没有1.5mg/mL胃蛋白酶(P7000 Sigma)，和10μL的澄清裂解物添加到96孔圆底微量滴定板(
Figure BDA0003625357360000974
板#3798；Corning)的孔中。将板密封，并在37℃伴随摇动地(
Figure BDA0003625357360000975
摇动器HT Infors AJ185，400rpm、1"摆幅)孵育1h，然后分析。通过测量油酸、二油酸甘油酯和油酸单甘油酯的形成(通过它们随时间的丰度变化)来确定变体活性。对于本测定，将90μL的100mM磷酸钠和2.5μL pH 7.0的三油酸甘油酯与10μL的胃蛋白酶反应混合物混合，并添加到聚丙烯酸酯96孔微量滴定板(
Figure BDA0003625357360000976
板#3635；Corning)的孔中，并在37℃孵育30min至1hr。反应用600μL ACN:IPA(1:3)猝灭，澄清并将10μL稀释到190μL的50:50IPA:MeOH中，摇动1min，然后通过将10μL添加到190μL的50:25:25H2O:IPA:MeOH中再次稀释。然后通过
Figure BDA0003625357360000981
MS对样品进行分析。结果在实施例4中的表格中提供。
用蛋白酶预处理的澄清裂解物的HTP分析：
在与胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶孵育以模拟下肠道(lower intestine)环境后，确定btLIP变体的活性。首先，将50μL蛋白酶混合物(0.01-100mg/ml胰凝乳蛋白酶(C4129,Sigma)、0.01-100mg/ml胰蛋白酶(C4129,Sigma)、0-30μL的在pH 6.5至7.0的100mM磷酸钠中的20mM牛磺胆酸钠和50μL的澄清裂解物添加到96孔圆底微量滴定板(
Figure BDA0003625357360000982
板#3798；Corning)的孔中。将板密封，并在37℃伴随摇动地(
Figure BDA0003625357360000983
摇动器HTInfors AJ185，400rpm、1"摆幅)孵育1h，然后分析。通过测量油酸、二油酸甘油酯和油酸单甘油酯的形成(通过它们随时间的丰度变化)来确定变体活性。对于本测定，将90μL的100mM磷酸钠和2.5μL pH 7.0的三油酸甘油酯与10μL蛋白酶反应混合物混合，并添加到聚丙烯酸酯96孔微量滴定板(
Figure BDA0003625357360000984
板#3635；Corning)的孔中，并在37℃孵育30min至1hr。反应用600μL ACN:IPA(1:3)猝灭，澄清并将10μL稀释到190μL的50:50IPA:MeOH中，摇动1min，然后通过将10μL添加到190μL的50:25:25H2O:IPA:MeOH中再次稀释。然后通过
Figure BDA0003625357360000986
MS对样品进行分析。结果在实施例4中的表格中提供。
具有多步胃肠(GI)挑战的澄清裂解物的HTP分析：
在37℃至65℃孵育后确定btLIP变体的活性。首先，将100μL的澄清裂解物添加到96孔BioRad Hard-Shell PCR薄壁微量滴定板(#hsp9601；BioRad)的孔中。将板密封并在37℃至65℃在热循环仪中孵育1h，然后胃挑战。接下来，将btLIP变体与胃蛋白酶一起孵育来模拟胃的环境。首先，将含有3.0mg/mL胃蛋白酶(P7000 Sigma)的50μL的pH 2.0至5.0的100mM柠檬酸钠和50μL经热处理的裂解物添加到96孔圆底微量滴定板(
Figure BDA0003625357360000987
板#3798；Corning)的孔中。将板密封，并在37℃伴随摇动地(
Figure BDA0003625357360000985
摇动器HTInfors AJ185，400rpm、1"摆幅)孵育1h，然后分析。接下来，将btLIP变体与胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶一起孵育来模拟下肠道环境。在该步骤中，将100μL的蛋白酶混合物(0.01-100mg/ml胰凝乳蛋白酶[C4129；Sigma]和0.01-100mg/ml胰蛋白酶[T7409；Sigma])、0-30μL的在pH6.5至7.0的100mM磷酸钠中的20mM牛磺胆酸钠，和100μL的热处理的胃挑战裂解物，添加到96孔圆底微量滴定板(
Figure BDA0003625357360000992
板#3798；Corning)的孔中。将板密封，并在37℃伴随摇动地(
Figure BDA0003625357360000993
摇动器HT Infors AJ185，400rpm、1"摆幅)孵育1h，然后分析。通过测量油酸、二油酸甘油酯和油酸单甘油酯的形成(通过它们随时间的丰度变化)来确定变体活性。对于本测定，将90μL的100mM磷酸钠和2.5μL pH 7.0的三油酸甘油酯与10μL胃肠道反应物混合，并添加到聚丙烯酸酯96孔微量滴定板(
Figure BDA0003625357360000995
板#3635；Corning)的孔中，并在37℃孵育30min至1hr。反应用600μL ACN:IPA(1:3)猝灭，澄清并将10μL稀释到190μL的50:50IPA:MeOH中，摇动1min，然后通过将10μL添加到190μL的50:25:25H2O:IPA:MeOH中再次稀释。然后通过
Figure BDA0003625357360000994
MS对样品进行分析。结果在实施例4中的表格中提供。
实施例4
脂肪酶变体的筛选结果
在如实施例3中描述的几种不同条件下筛选由同源多样性(homologs diversity)和饱和诱变产生的变体。结果(相对于SEQ ID NO:2)在表4-1中提供。在该表格中，氨基酸差异相对于SEQ ID NO:2指明。
Figure BDA0003625357360000991
Figure BDA0003625357360001001
Figure BDA0003625357360001011
Figure BDA0003625357360001021
Figure BDA0003625357360001031
基于表4-1中示出的结果，选择SEQ ID NO:94作为用于接下来蛋白质优化迭代的亲本序列。从表4-1中示出的结果鉴定出的有益突变被重组到骨架中。在如实施例3中描述的相同条件下筛选变体。唯一的区别是酸挑战筛选是在pH3.5而不是pH3进行的。相对于SEQID NO:94的数据在
表4-2中列出。在该表格中，氨基酸差异相对于SEQ ID NO:94指明。
Figure BDA0003625357360001041
Figure BDA0003625357360001051
Figure BDA0003625357360001061
基于表4-2中示出的结果，选择SEQ ID NO:350作为用于接下来蛋白质优化迭代的亲本序列。从表4-2鉴定出的有益突变被重组到骨架中。此外，还使用SEQ ID NO:350通过不同位置处的饱和诱变构建变体。变体如实施例3中描述的进行测定，并且结果在表4-3中提供。在该表格中，氨基酸差异相对于SEQ ID NO:350指明。
Figure BDA0003625357360001062
Figure BDA0003625357360001071
Figure BDA0003625357360001081
基于来自表4-3中的结果，选择SEQ ID NO:442作为用于接下来蛋白质优化迭代的亲本序列。基于表4-3中示出的结果鉴定出的有益突变被重组到骨架中。此外，还在SEQ IDNO:442上通过不同位置处的饱和诱变构建变体。变体如实施例3中描述的进行测定，并且结果在表4-4中提供。在该表格中，氨基酸差异相对于SEQ ID NO:442指明。
Figure BDA0003625357360001082
Figure BDA0003625357360001091
Figure BDA0003625357360001101
基于表4-4中示出的结果，选择SEQ ID NO:540作为用于接下来蛋白质优化迭代的亲本序列。基于表4-4中示出的结果鉴定出的有益突变被重组到骨架中。此外，还在SEQ IDNO:540上通过不同位置处的饱和诱变构建变体。变体如实施例3中描述的进行测定，并且结果在表4-5中提供。在该表格中，氨基酸差异相对于SEQ ID NO:540指明。
Figure BDA0003625357360001102
Figure BDA0003625357360001111
Figure BDA0003625357360001121
基于表4-5中示出的结果，选择SEQ ID NO:646作为用于接下来蛋白质优化迭代的亲本序列。基于表4-5中示出的结果鉴定出的有益突变被重组到骨架中。变体如实施例3中描述的进行测定，并且结果在表4-6中提供。在该表格中，氨基酸差异相对于SEQ ID NO:646指明。
Figure BDA0003625357360001122
Figure BDA0003625357360001131
Figure BDA0003625357360001141
基于表4-6中示出的结果，选择SEQ ID NO:758作为用于接下来蛋白质优化迭代的亲本序列。基于表4-6中示出的结果鉴定出的有益突变被重组到骨架中。变体如实施例3中描述的进行测定，并且结果在表4-7中提供。在该表格中，氨基酸差异相对于SEQ ID NO:758指明。
Figure BDA0003625357360001142
实施例5
SEQ ID NO:868上单独突变变体的筛选结果
在SEQ ID NO:868上通过在24个不同于SEQ ID NO:2的位置处的位点饱和突变来构建单点突变。在这些变体经历如实施例3中描述的各种预处理后，对这些变体进行脂肪酶活性测定。每种变体以一式三份测试，并参考SEQ ID NO:868和SEQ ID NO:2二者对活性数据进行分析，在表5-1中列出。
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Figure BDA0003625357360001231
Figure BDA0003625357360001241
Figure BDA0003625357360001251
Figure BDA0003625357360001261
Figure BDA0003625357360001271
Figure BDA0003625357360001281
Figure BDA0003625357360001291
Figure BDA0003625357360001301
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实施例6
小型猪中外分泌胰功能不全的手术模型的验证
通过胰管结扎在小型猪中产生外分泌胰功能不全(EPI)的手术模型。从手术前7天开始，并在整个实验过程中继续给3-4月龄的雌性SINCLAIRTM小型猪饲喂高脂肪膳食(HFD；Sinclair标准膳食S-9与
Figure BDA0003625357360001332
橄榄油10:1w/w混合)，一天一次。手术前连续3天和手术后第15天、第16天、第17天收集24h内总粪便输出。通过以下来制备来自每只动物的每日总粪便收集物用于后续分析：添加约1.5x粪便净重的体积的蒸馏水，匀浆，分成3x50mL等份试样，并在-20℃冷冻直至分析。通过以下来验证模型：测量粪便样品中的脂肪吸收系数(CFA；通过修改的Van de Kamer方法；参见Seligson(编辑),Standard Methods of Clinical Chemistry,第2卷,Academic Press,New York,NY[1958],pp.34-39中的Van deKamer)和氮吸收系数(CNA；由Vario Max CN机器通过燃烧方法的Kjeldahl总氮；参见Peters等人(编辑)Recommended Methods of Manure Analysis,Univ.of WisconsinCooperative Extension Publishing,出版号A3769.Madison,WI.[2003],p.18-24中的Watson等人)，并评估手术前后的百分比变化。手术前，健康小型猪CFA和CNA分别为91.3％±1.1SEM和84.2％±1.2SEM。手术后，CFA下降了53.2％(p<0.0001,n＝11)并且CNA下降了28.7％(p<0.0001，n＝11)，因此证明该手术模型可用于EPI研究。
实施例7
与
Figure BDA0003625357360001341
胰脂肪酶相比，SEQ ID NO:868的体内表征
经验证的SINCLAIRTM小型猪EPI手术模型(雌性，4-5月龄)进一步用于体内研究以评估与目前标准护理(
Figure BDA0003625357360001342
胰脂肪酶；AbbVie,Inc.)相比的工程化脂肪酶变体(SEQID NO:868)。从给药前至少8天开始，一天一次给动物提供与一杯3.9oz.的未加甜味剂的苹果酱组合的HFD(Sinclair标准S-9膳食与
Figure BDA0003625357360001343
橄榄油10:1，w/w混合)。在给药日期间，按顺序为每只动物准备膳食，以确保在摄取前离体脂肪酶与膳食脂肪的相互作用最低。简言之，首先在干净的饲喂碗中准备HFD。接下来，将酶(0.5g冻干的SEQ ID NO:868粉末或从7x36,000U
Figure BDA0003625357360001344
胰脂肪酶胶囊汇集的5.6g的微球，其分别相当于258,000U和252,000U的脂肪酶)混合到一杯3.9oz.的未加甜味剂的苹果酱中，因为酸性pH防止早期酶活化。每餐给药的酶单位基于脂肪酶的比活力，通过USP脂肪酶测定(United StatesPharmacopeia and National Formulary(USP 42-NF 37).Rockville,MD:United StatesPharmacopeial Convention；2016；可在online.uspnf.com/uspnf/document/GUID-AC788D41-90A2-4F36-A6E7-769954A9ED09_1_en-us获得)和计算出的膳食中提供的总脂肪来确定。然后将脂肪酶-苹果酱混合物转移到HFD并迅速混合。最后，将饲喂碗立即提供给动物，然后进入下一准备。2小时后，移走饲喂碗；动物在30分钟或更短的时间内吃完整顿饭。采用交叉设计使每组微型猪的数目最大化(n＝3)。研究在每10天给药阶段之间引入8天的“冲刷(washout)”(每日一次HFD+不含酶的苹果酱)。在给药临开始前连续3天和各个阶段的第9天、第10天和第11天给药后24小时收集总粪便物质。粪便样品通过以下制备：向各个每日总粪便收集物添加1.5x粪便净重的体积的蒸馏水，匀浆，分成3x50mL，并在-20℃冷冻直到分析，弃去剩余的。分析按照上文关于模型验证描述的完成。
Figure BDA0003625357360001351
胰脂肪酶和SEQID NO:868二者导致类似的CFA改进，其值与手术前基线没有显著差异。
实施例8
SEQ ID NO:868的体内剂量响应表征
经验证的SINCLAIRTM小型猪EPI手术模型(雌性，4-6月龄)用于另外的体内SEQ IDNO:868剂量响应研究。HFD和饲喂方案、脂肪酶混合方案、粪便样品收集和制备以及分析与上文描述的相同。与手术前的值(92.8％+/-3.2SD,n ＝8)相比，给药前刚测量的手术后CFA降至39.9％+/-13.2SD(p<0.0001,n＝8)。SEQ ID NO:868以258,000U(0.5g冻干粉末)给药以与先前的研究相衔接，并以86,000U(167mg)和29,000U(55.5mg)给药以评估低剂量效力。评价的所有剂量都以剂量依赖方式导致CFA的积极的效果。与给药前相比，从高剂量到低剂量，CFA值分别增加至81.3％+/-3.9SD(p<0.0001,n＝3)，74％+/-3.6SD(p<0.0001,n＝3)和65.5％+/-3.7SD(p<0.0001,n＝2)。
出于所有目的，本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件在此通过引用以其整体并入，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件被单独地指出出于所有目的通过引用并入一样。
虽然已说明并描述了多种具体实施方案，但是应当理解，可以进行各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (47)

1.一种重组脂肪酶，所述重组脂肪酶包含含有与SEQ ID NO:2的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:94、350、442、540、646、758和/或868具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列。
3.根据权利要求1所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中所述多肽序列在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2、3、4、22、27/46/97/136/149/385、27/46/385、27/70/136/231/385、27/136/323/385、27/149、27/149/385、27/385、34、38、41、44、46/70、46/149/183/231/385、48、70、73、73/305、82、82/94/101/194/199、82/94/199、83、85、87、89、92、94、96、97/149/385、135、136/385、140、141、142、144、146、149、149/231/385、151、174、175、178、181、183/385、189、194、194/199、195、195/231/385、199、199/213、210、212、213、213/330、216、218、219、226、231/385、238、247、250、270、274、281、292、296、300、308、330、338、379和385，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2编号。
4.根据权利要求1所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:94具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中所述多肽序列在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：3/4/96/296/300、3/292/296、4、4/11/149/292/296/300、4/96/149/231/296/300、4/96/149/292/296/300、4/96/219/296、4/96/231/296/300、4/96/292/296/300、4/149/174、4/174/219/292/296、4/231/296/300、27、27/34/82、27/73/82/218、27/89、27/89/178、27/89/218、27/218、34/73/218、34/82、34/218、73/82、73/82/183、94/146/175、96/149/174/292/296、96/149/231/292/296、96/149/292/296、96/174/219/231/292/296、96/231/296、146/175/189/281、149/174/292/296、149/174/300、149/219/231/292/296/300、149/231/292/296、149/231/292/296/300、149/296、149/296/300、174/231、174/296、218、231、231/292/296、231/292/296/300、231/296、231/300、292/296、292/296/300、296和296/300，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:94编号。
5.根据权利要求1所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:350具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中所述多肽序列在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：4、4/27/189/300、4/70、4/102、4/137、4/175/189/218、4/175/189/300、4/175/218/224、4/175/218/373、4/185、4/189/218/373、4/193、4/218/300/369/373、4/228、4/233、4/243、4/271、4/303、4/334、4/336、4/375、25、27/82/174/175/189/218/300/369/373、27/82/174/175/218/300/369、27/82/174/175/218/300/373/382、27/82/174/218/300/373、27/189/218/373、28、33、99、102、104、134、153、174/175/189、174/373、175/189/218/300/373、175/189/373、175/218、175/218/382、189/218/300/373、191、193、231、233、243、293、303、331、336、339、368和373，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:350编号。
6.根据权利要求1所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:442具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中所述多肽序列在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：26、33、33/174/193/243、33/174/334、33/175/218/303、33/175/218/334/339、33/193、34、38、46、48、70/271/293/334、144、174、174/175/193、174/175/218/339、174/193/303/375、174/193/375、174/218/233/271/293/303、174/218/271/303、175/193/218/233/243/375、175/193/218/243、175/218/375、181、189、193、193/218/243、193/271/303/334、193/293/303、194、195、199、210、218、218/243、218/243/303/334、218/303、225、238、274、281和330，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:442编号。
7.根据权利要求1所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:540具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中所述多肽序列在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：34/38/174/193/195/243/281/303/330、34/38/174/225/303、34/38/174/303/345、34/174、34/174/193/195/243/281、34/174/193/195/303/330、34/193/195/225/243、34/193/243/303/330、34/281/330、38、38/174/193/195/243/330、38/174/193/225/274/283/303/330、38/174/193/303、38/174/195/281/330、38/174/225/243/281/330、38/174/281、38/174/281/303、38/174/281/303/345、38/193/195/225/303/345、38/195/243/303、38/195/281/303/330、38/195/281/330、38/195/303、49、49/51/98/252/311、49/51/123/252/344、49/98/120/252/344、49/120/252/344、49/123/252/344、49/123/264/344、49/123/311、49/252/344、49/311/344、49/344、51、51/252/344、51/344、98、98/344、123/252/344、129、160、161、174/193/195/225、174/193/303/330、174/195/225/281/303/330/345、174/195/243/281/345、174/195/281/303、174/225/243/281/303/345、174/281/330、174/303、195/225/303/330、252、268和344，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:540编号。
8.根据权利要求1所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:646具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中所述多肽序列在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：11/16/67/168/180/287、11/16/237/241/287、11/67/168/287、16/67/154/168/237/241/287、16/67/237/287/291、16/168/177、24、24/278、34/49/161/193/243/344、34/49/161/193/344、34/49/161/243/344、34/49/161/252/268/344、34/49/193/243/252/344、34/49/193/344、34/49/243/252、34/49/252/268/344、34/161/193/243/252/268、34/161/193/243/268/344、34/161/193/243/344、34/161/193/252/268/344、34/161/193/252/344、34/161/193/268/344、34/161/243/281/344、34/161/344、34/193/243/252/344、34/193/252/268/344、34/193/268/281、34/252/268/281/344、34/252/344、49/161/193/243/252/344、49/161/193/252/281/344、49/161/243/252/344、49/193/197/243/252/281/344、49/193/243/252/344、49/193/243/344、49/243/344、67/154/237/287、67/168/237、67/168/237/287、67/177/237、154/237/286/287、154/286/287、161/193/252/344、161/193/344、161/344、168/237、186/187/278、193/243/281/344、193/252/268/344、193/252/281/344、237、237/287/291和281/344，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:646编号。
9.根据权利要求1所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:758具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中所述多肽序列在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24/168/252/281、24/237/287/344、24/252、24/252/287、24/344、213/252/278/344、252/278/344、252/287/344和281，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:758编号。
10.根据权利要求1所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶包含与SEQ ID NO:868具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中所述多肽序列在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24、24/38/49/70/149/161/174/175/189/193/225/231/243/252/271/287/292/293/296/303/334/344/373/385、38、49、70、149、161、174、175、189、193、225、231、243、252、271、287、292、293、296、303、334、344、373和385，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:868编号。
11.根据权利要求1所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶在表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7和/或表5-1中提供的至少一个位置中包含至少一个突变，其中所述位置参考SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868编号。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶比SEQ IDNO:2、94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶更具热稳定性。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶比SEQ IDNO:2、94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶在酸性pH水平更稳定。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶比SEQ IDNO:2、94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶对蛋白水解更具耐受性。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶在至少一种胆盐的存在下比SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶更具活性。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶在至少一种胆盐的存在下比SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和/或868的脂肪酶更具活性。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的重组脂肪酶，其中所述重组脂肪酶是纯化的。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的重组脂肪酶，其中与参考序列相比，所述重组脂肪酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性；ii)增加的对酸性pH的耐受性；iii)增加的对pH 3.5的耐受性；iv)增加的对pH 3的耐受性；v)增加的对至少一种蛋白酶的耐受性；vi)增加的对至少一种胆盐的耐受性；vii)增加的热耐受性；或i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)和vii)的任何组合。
19.根据权利要求18所述的重组脂肪酶，其中所述参考序列选自SEQ ID NO:2、94、350、442、540、646、758和868。
20.一种组合物，所述组合物包含至少一种根据权利要求1-19中任一项所述的重组脂肪酶。
21.一种重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码至少一种根据权利要求1-19中任一项所述的重组脂肪酶。
22.根据权利要求21所述的重组多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列是密码子优化的。
23.一种表达载体，所述表达载体包含至少一种根据权利要求21和/或22所述的重组多核苷酸序列。
24.根据权利要求23所述的表达载体，其中所述重组多核苷酸序列可操作地连接至控制序列。
25.根据权利要求23或24所述的表达载体，其中所述控制序列是启动子。
26.根据权利要求25所述的表达载体，其中所述启动子是异源启动子。
27.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求23-26中任一项所述的表达载体。
28.根据权利要求27所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核的或原核的。
29.一种产生重组脂肪酶的方法，所述方法包括将根据权利要求27或28所述的宿主细胞在产生由所述重组多核苷酸编码的所述重组脂肪酶的条件下培养。
30.根据权利要求29所述的方法，所述方法还包括回收所述脂肪酶的步骤。
31.根据权利要求30所述的方法，所述方法还包括纯化所述脂肪酶的步骤。
32.一种药物组合物，用于治疗胰功能不全，所述药物组合物包含根据权利要求20所述的组合物。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
34.根据权利要求32和/或33所述的组合物，所述组合物还包含选自至少一种蛋白酶和至少一种淀粉酶的至少一种另外的酶。
35.根据权利要求32和/或33所述的组合物，所述组合物还包含胰提取物，所述胰提取物含有脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物适用于肠胃外注射或输注、皮下注射、吸入或皮肤应用至人类。
37.根据权利要求32至35中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物适用于口服施用至人类。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述组合物还包含肠溶包衣。
39.一种用于治疗和/或预防受试者的胰功能不全的症状的方法，所述方法包括提供具有胰功能不全的受试者，并向所述受试者提供根据权利要求32-38中任一项所述的药物组合物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述胰功能不全的症状得到改善。
41.根据权利要求39和/或40所述的方法，其中所述受试者能够食用比表现出所述胰功能不全的症状的受试者所需的饮食在脂质含量方面的限制更少的饮食。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述受试者是婴儿或儿童。
43.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述受试者是成年人或年轻人。
44.根据权利要求1-19中任一项所述的重组脂肪酶，或根据权利要求20和32-38中任一项所述的组合物，用作药物。
45.根据权利要求1-19中任一项所述的重组脂肪酶，或根据权利要求20和32-38中任一项所述的组合物，用作营养补充剂。
46.根据权利要求1-19中任一项所述的重组脂肪酶，或根据权利要求20和32-38中任一项所述的组合物，用于治疗或预防胰功能不全的症状。
47.根据权利要求20和32-38中任一项提供的所述组合物的用途。
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