JP2022545718A - 操作されたリパーゼ改変体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたリパーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、ならびに酸性(pH<7)および塩基性(pH>7)条件を含む幅広いpH条件下での安定性を提供するように最適化されている。本発明は、治療および/または栄養目的のための、操作されたリパーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびリパーゼポリペプチドを作製するための方法も提供する。
Description
本出願は、2019年8月30日に出願された米国仮出願第62/894,019号の優先権を主張し、その全体が、参照によりあらゆる目的のために本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたリパーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、および酸性(pH<7)条件を含む幅広いpH条件下での安定性を提供するように最適化されている。本発明は、治療および/または栄養目的のための、操作されたリパーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびリパーゼポリペプチドを作製するための方法も提供する。
本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたリパーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、および酸性(pH<7)条件を含む幅広いpH条件下での安定性を提供するように最適化されている。本発明は、治療および/または栄養目的のための、操作されたリパーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびリパーゼポリペプチドを作製するための方法も提供する。
配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
配列表の公式の写しは、「CX7-187WO2_ST25.txt」のファイル名、2020年8月27日の作成日および4.30メガバイトのサイズで、EFS-Webを介してASCII形式のテキストファイルとして本明細書と同時に提出される。EFS-Webを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
配列表の公式の写しは、「CX7-187WO2_ST25.txt」のファイル名、2020年8月27日の作成日および4.30メガバイトのサイズで、EFS-Webを介してASCII形式のテキストファイルとして本明細書と同時に提出される。EFS-Webを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
膵酵素補充療法(PERT)は、膵酵素機能不全(PEI)の処置における使用が見出されている。膵炎、嚢胞性線維症、セリアック病、炎症性腸疾患および膵臓癌を含む様々な障害は、十二指腸内への膵酵素の減少した分泌の結果としてPEIをもたらし得る。これは、食物の消化不良、腸による脂肪、タンパク質、炭水化物およびビタミンの不十分な吸収をもたらし、栄養不良につながり得る。経口的に投与されるPERT処置が現在利用可能であるが、胃腸管内でのPERTの不十分な活性および/または現行の処置プロトコルに伴う多大な服薬の負担を原因とする患者による不十分な治療の遵守のために、一部の人々では状態が緩和されないことがあり得る。一部の事例では、脂肪吸収係数(coefficient of fat absorption)(CFA)および/または窒素吸収係数(coefficient of nitrogen absorption)(CNA)は、健康な患者のものより劣っており、体重減少および他の健康上の懸念をもたらす。したがって、改善されたPERT処置に対する必要性が当該技術分野に残っている。
膵酵素補充療法(PERT)は、膵酵素機能不全(PEI)の処置における使用が見出されている。膵炎、嚢胞性線維症、セリアック病、炎症性腸疾患および膵臓癌を含む様々な障害は、十二指腸内への膵酵素の減少した分泌の結果としてPEIをもたらし得る。これは、食物の消化不良、腸による脂肪、タンパク質、炭水化物およびビタミンの不十分な吸収をもたらし、栄養不良につながり得る。経口的に投与されるPERT処置が現在利用可能であるが、胃腸管内でのPERTの不十分な活性および/または現行の処置プロトコルに伴う多大な服薬の負担を原因とする患者による不十分な治療の遵守のために、一部の人々では状態が緩和されないことがあり得る。一部の事例では、脂肪吸収係数(coefficient of fat absorption)(CFA)および/または窒素吸収係数(coefficient of nitrogen absorption)(CNA)は、健康な患者のものより劣っており、体重減少および他の健康上の懸念をもたらす。したがって、改善されたPERT処置に対する必要性が当該技術分野に残っている。
発明の概要
本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたリパーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、および酸性(pH<7)条件を含む幅広いpH条件下での安定性を提供するように最適化されている。本発明は、治療および/または栄養目的のための、操作されたリパーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびリパーゼポリペプチドを作製するための方法も提供する。
本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたリパーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、および酸性(pH<7)条件を含む幅広いpH条件下での安定性を提供するように最適化されている。本発明は、治療および/または栄養目的のための、操作されたリパーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびリパーゼポリペプチドを作製するための方法も提供する。
本発明は、配列番号2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、組換えリパーゼおよび/または生物学的に活性な組換えリパーゼ断片を提供する。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼおよび/または生物学的に活性な組換えリパーゼ断片は、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、2、3、4、22、27/46/97/136/149/385、27/46/385、27/70/136/231/385、27/136/323/385、27/149、27/149/385、27/385、34、38、41、44、46/70、46/149/183/231/385、48、70、73、73/305、82、82/94/101/194/199、82/94/199、83、85、87、89、92、94、96、97/149/385、135、136/385、140、141、142、144、146、149、149/231/385、151、174、175、178、181、183/385、189、194、194/199、195、195/231/385、199、199/213、210、212、213、213/330、216、218、219、226、231/385、238、247、250、270、274、281、292、296、300、308、330、338、379、および385から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、2H、2M、2T、3A、3G、3R、3S、4M、4W、4Y、22N、27V/46T/97A/136V/149E/385P、27V/46T/385P、27V/70N/136V/231E/385P、27V/136V/323I/385P、27V/149E、27V/149E/385P、27V/385P、34D、38A、38H、38L、41V、44E、46T/70N、46T/149E/183L/231E/385P、48V、70N、73C/305I、73I、73R、82C、82E、82E/94S/101S/194N/199L、82E/94S/199L、82F、82G、82L、83G、83K、85I、85W、87R、89A、89T、89V、89W、92A、94S、96E、96N、96S、97A/149E/385P、135G、135Q、135S、135T、135V、136V/385P、140T、141A、141F、141L、141S、142A、142F、142I、142L、144M、144R、144W、146A、146F、146S、146Y、149E、149E/231E/385P、149K、149R、151A、151I、151L、174H、174R、175G、175L、175R、178R、178T、181H、183L/385P、189A、189E、189W、194N、194N/199L、194T、195D/231E/385P、195V、199L、199L/213A、210A、210V、212C、212G、212R、212T、213A/330T、213H、216R、216T、216W、218D、218G、218I、218M、218T、219C、219G、219K、219R、226R、231E/385P、238S、247R、250T、270V、274D、281K、281R、292A、292C、292L、292V、296M、296R、300A、300D、300T、308A、330Y、338N、379T、385A、385C、385D、385P、385R、および385Tから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、E2H、E2M、E2T、T3A、T3G、T3R、T3S、S4M、S4W、S4Y、G22N、Y27V/R46T/Y97A/Y136V/T149E/F385P、Y27V/R46T/F385P、Y27V/K70N/Y136V/Q231E/F385P、Y27V/Y136V/K323I/F385P、Y27V/T149E、Y27V/T149E/F385P、Y27V/F385P、K34D、F38A、F38H、F38L、N41V、G44E、R46T/K70N、R46T/T149E/F183L/Q231E/F385P、Y48V、K70N、T73C/V305I、T73I、T73R、K82C、K82E、K82E/P94S/D101S/K194N/I199L、K82E/P94S/I199L、K82F、K82G、K82L、E83G、E83K、G85I、G85W、A87R、F89A、F89T、F89V、F89W、T92A、P94S、I96E、I96N、I96S、Y97A/T149E/F385P、Y135G、Y135Q、Y135S、Y135T、Y135V、Y136V/F385P、P140T、E141A、E141F、E141L、E141S、E142A、E142F、E142I、E142L、I144M、I144R、I144W、P146A、P146F、P146S、P146Y、T149E、T149E/Q231E/F385P、T149K、T149R、G151A、G151I、G151L、E174H、E174R、Q175G、Q175L、Q175R、S178R、S178T、K181H、F183L/F385P、S189A、S189E、S189W、K194N、K194N/I199L、K194T、Q195D/Q231E/F385P、Q195V、I199L、I199L/P213A、K210A、K210V、Q212C、Q212G、Q212R、Q212T、P213A/N330T、P213H、S216R、S216T、S216W、H218D、H218G、H218I、H218M、H218T、A219C、A219G、A219K、A219R、T226R、Q231E/F385P、Y238S、E247R、Q250T、R270V、T274D、G281K、G281R、M292A、M292C、M292L、M292V、S296M、S296R、Q300A、Q300D、Q300T、R308A、N330Y、K338N、N379T、F385A、F385C、F385D、F385P、F385R、およびF385Tから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して付番されている。
いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、3/4/96/296/300、3/292/296、4、4/11/149/292/296/300、4/96/149/231/296/300、4/96/149/292/296/300、4/96/219/296、4/96/231/296/300、4/96/292/296/300、4/149/174、4/174/219/292/296、4/231/296/300、27、27/34/82、27/73/82/218、27/89、27/89/178、27/89/218、27/218、34/73/218、34/82、34/218、73/82、73/82/183、94/146/175、96/149/174/292/296、96/149/231/292/296、96/149/292/296、96/174/219/231/292/296、96/231/296、146/175/189/281、149/174/292/296、149/174/300、149/219/231/292/296/300、149/231/292/296、149/231/292/296/300、149/296、149/296/300、174/231、174/296、218、231、231/292/296、231/292/296/300、231/296、231/300、292/296、292/296/300、296、および296/300から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号94を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、3S/4W/96E/296R/300D、3S/292L/296R、4W、4W/11A/149E/292L/296R/300D、4W/96E/149E/231E/296R/300D、4W/96E/149E/292L/296R/300D、4W/96E/219K/296R、4W/96E/231E/296R/300D、4W/96E/292L/296R/300D、4W/149E/174R、4W/174H/219K/292L/296R、4W/231E/296R/300D、27V、27V/34D/82E、27V/73I/82L/218I、27V/73I/82L/218M、27V/89T、27V/89T/178P、27V/89T/218I、27V/218I、34D/73I/218I、34D/82C、34D/218M、73I/82C、73I/82L/183L、94S/146F/175G、96E/149E/174H/292L/296R、96E/149E/231E/292L/296R、96E/149E/292L/296R、96E/174H/219K/231E/292L/296R、96E/231E/296R、146F/175G/189A/281K、149E/174H/292L/296R、149E/174H/300D、149E/219K/231E/292L/296R/300D、149E/231E/292L/296R、149E/231E/292L/296R/300D、149E/296R、149E/296R/300D、174H/296R、174R/231E、218I、231E、231E/292L/296R、231E/292L/296R/300D、231E/296R、231E/300D、292L/296R、292L/296R/300D、296R、および296R/300Dから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号94を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、T3S/S4W/I96E/S296R/Q300D、T3S/M292L/S296R、S4W、S4W/V11A/T149E/M292L/S296R/Q300D、S4W/I96E/T149E/Q231E/S296R/Q300D、S4W/I96E/T149E/M292L/S296R/Q300D、S4W/I96E/A219K/S296R、S4W/I96E/Q231E/S296R/Q300D、S4W/I96E/M292L/S296R/Q300D、S4W/T149E/E174R、S4W/E174H/A219K/M292L/S296R、S4W/Q231E/S296R/Q300D、Y27V、Y27V/K34D/K82E、Y27V/T73I/K82L/H218I、Y27V/T73I/K82L/H218M、Y27V/F89T、Y27V/F89T/S178P、Y27V/F89T/H218I、Y27V/H218I、K34D/T73I/H218I、K34D/K82C、K34D/H218M、T73I/K82C、T73I/K82L/F183L、P94S/P146F/Q175G、I96E/T149E/E174H/M292L/S296R、I96E/T149E/Q231E/M292L/S296R、I96E/T149E/M292L/S296R、I96E/E174H/A219K/Q231E/M292L/S296R、I96E/Q231E/S296R、P146F/Q175G/S189A/G281K、T149E/E174H/M292L/S296R、T149E/E174H/Q300D、T149E/A219K/Q231E/M292L/S296R/Q300D、T149E/Q231E/M292L/S296R、T149E/Q231E/M292L/S296R/Q300D、T149E/S296R、T149E/S296R/Q300D、E174H/S296R、E174R/Q231E、H218I、Q231E、Q231E/M292L/S296R、Q231E/M292L/S296R/Q300D、Q231E/S296R、Q231E/Q300D、M292L/S296R、M292L/S296R/Q300D、S296R、およびS296R/Q300Dから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号94を参照して付番されている。
いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号350に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、4、4/27/189/300、4/70、4/102、4/137、4/175/189/218、4/175/189/300、4/175/218/224、4/175/218/373、4/185、4/189/218/373、4/193、4/218/300/369/373、4/228、4/233、4/243、4/271、4/303、4/334、4/336、4/375、25、27/82/174/175/189/218/300/369/373、27/82/174/175/218/300/369、27/82/174/175/218/300/373/382、27/82/174/218/300/373、27/189/218/373、28、33、99、102、104、134、153、174/175/189、174/373、175/189/218/300/373、175/189/373、175/218、175/218/382、189/218/300/373、191、193、231、233、243、293、303、331、336、339、368、および373から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号350を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号350に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、4W、4W/27V/189A/300D、4W/70H、4W/102T、4W/137R、4W/175G/189A/218M、4W/175G/189A/300D、4W/175G/218M/224A、4W/175G/218M/373F、4W/185L、4W/189A/218M/373F、4W/193T、4W/218M/300D/369N/373F、4W/228E、4W/233R、4W/243R、4W/271D、4W/303P、4W/334T、4W/336S、4W/336T、4W/375A、25V、27V/82C/174H/175G/189A/218M/300D/369N/373F、27V/82C/174H/175G/218M/300D/369N、27V/82C/174H/175G/218M/300D/373F/382M、27V/82C/174H/218M/300D/373F、27V/189A/218M/373F、28N、33Y、99D、102L、104H、134R、153G、174H/175L/189A、174H/373F、175G/189A/218M/300D/373F、175G/218M、175G/218M/382M、175L/189A/373F、189A/218M/300D/373F、191L、193L、231Q、233G、233S、233W、243R、293R、303P、331R、336R、339K、368A、368T、および373Fから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号350を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号350に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、S4W、S4W/Y27V/S189A/Q300D、S4W/K70H、S4W/E102T、S4W/S137R、S4W/Q175G/S189A/H218M、S4W/Q175G/S189A/Q300D、S4W/Q175G/H218M/V224A、S4W/Q175G/H218M/Y373F、S4W/I185L、S4W/S189A/H218M/Y373F、S4W/Q193T、S4W/H218M/Q300D/S369N/Y373F、S4W/P228E、S4W/N233R、S4W/L243R、S4W/G271D、S4W/A303P、S4W/D334T、S4W/A336S、S4W/A336T、S4W/N375A、L25V、Y27V/K82C/E174H/Q175G/S189A/H218M/Q300D/S369N/Y373F、Y27V/K82C/E174H/Q175G/H218M/Q300D/S369N、Y27V/K82C/E174H/Q175G/H218M/Q300D/Y373F/H382M、Y27V/K82C/E174H/H218M/Q300D/Y373F、Y27V/S189A/H218M/Y373F、R28N、L33Y、Q99D、E102L、N104H、E134R、N153G、E174H/Q175L/S189A、E174H/Y373F、Q175G/S189A/H218M/Q300D/Y373F、Q175G/H218M、Q175G/H218M/H382M、Q175L/S189A/Y373F、S189A/H218M/Q300D/Y373F、A191L、Q193L、E231Q、N233G、N233S、N233W、L243R、Q293R、A303P、S331R、A336R、Q339K、F368A、F368T、およびY373Fから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号350を参照して付番されている。
いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号442に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、26、33、33/174/193/243、33/174/334、33/175/218/303、33/175/218/334/339、33/193、34、38、46、48、70/271/293/334、144、174、174/175/193、174/175/218/339、174/193/303/375、174/193/375、174/218/233/271/293/303、174/218/271/303、175/193/218/233/243/375、175/193/218/243、175/218/375、181、189、193、193/218/243、193/271/303/334、193/293/303、194、195、199、210、218、218/243、218/243/303/334、218/303、225、238、274、281、および330から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号442を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号442に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、26A、26R、26S、33Y、33Y/174H/193L/243R、33Y/174H/334T、33Y/175G/218M/303P、33Y/175G/218M/334T/339K、33Y/193L、34L、38A、38G、46P、48L、70H/271D/293R/334T、144L、174H、174H/175G/193L、174H/175G/218M/339K、174H/193L/303P/375A、174H/193L/375A、174H/218M/233R/271D/293R/303P、174H/218M/271D/303P、174R、175G/193L/218M/233R/243R/375A、175G/193L/218M/243R、175G/218M/375A、181Q、189H、193L、193L/218M/243R、193L/271D/303P/334T、193L/293R/303P、194T、195I、195L、195Y、199H、210V、218C、218D、218M、218M/243R、218M/243R/303P/334T、218M/303P、218P、225L、238W、274D、281K、281P、330F、および330Hから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号442を参照して付番されている。
いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号442に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、G26A、G26R、G26S、L33Y、L33Y/E174H/Q193L/L243R、L33Y/E174H/D334T、L33Y/L175G/H218M/A303P、L33Y/L175G/H218M/D334T/Q339K、L33Y/Q193L、K34L、F38A、F38G、R46P、Y48L、K70H/G271D/Q293R/D334T、I144L、E174H、E174H/L175G/Q193L、E174H/L175G/H218M/Q339K、E174H/Q193L/A303P/N375A、E174H/Q193L/N375A、E174H/H218M/N233R/G271D/Q293R/A303P、E174H/H218M/G271D/A303P、E174R、L175G/Q193L/H218M/N233R/L243R/N375A、L175G/Q193L/H218M/L243R、L175G/H218M/N375A、K181Q、A189H、Q193L、Q193L/H218M/L243R、Q193L/G271D/A303P/D334T、Q193L/Q293R/A303P、K194T、Q195I、Q195L、Q195Y、I199H、K210V、H218C、H218D、H218M、H218M/L243R、H218M/L243R/A303P/D334T、H218M/A303P、H218P、M225L、Y238W、T274D、G281K、G281P、N330F、およびN330Hから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号442を参照して付番されている。
いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号540に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、34/38/174/193/195/243/281/303/330、34/38/174/225/303、34/38/174/303/345、34/174、34/174/193/195/243/281、34/174/193/195/303/330、34/193/195/225/243、34/193/243/303/330、34/281/330、38、38/174/193/195/243/330、38/174/193/225/274/283/303/330、38/174/193/303、38/174/195/281/330、38/174/225/243/281/330、38/174/281、38/174/281/303、38/174/281/303/345、38/193/195/225/303/345、38/195/243/303、38/195/281/303/330、38/195/281/330、38/195/303、49、49/51/98/252/311、49/51/123/252/344、49/98/120/252/344、49/120/252/344、49/123/252/344、49/123/264/344、49/123/311、49/252/344、49/311/344、49/344、51、51/252/344、51/344、98、98/344、123/252/344、129、160、161、174/193/195/225、174/193/303/330、174/195/225/281/303/330/345、174/195/243/281/345、174/195/281/303、174/225/243/281/303/345、174/281/330、174/303、195/225/303/330、252、268、および344から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号540を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号540に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、34L/38A/174G/193L/195L/243R/281P/303P/330F、34L/38A/174R/303P/345I、34L/38G/174R/225L/303P、34L/174G、34L/174G/193L/195L/243R/281P、34L/174H/193L/195I/303P/330F、34L/193L/195I/225L/243R、34L/193L/243R/303P/330F、34L/281P/330H、38A/174H/193L/225L/274D/283I/303P/330F、38A/174R/281K/303P/345I、38A/193L/195L/225L/303P/345I、38A/195I/303P、38A/195Y/281K/303P/330F、38G、38G/174G/193L/303P、38G/174G/281K/303P、38G/174H/195L/281P/330F、38G/174H/225L/243R/281K/330H、38G/174H/281K、38G/174R/193L/195L/243R/330H、38G/195I/281P/330F、38G/195Y/243R/303P、49S、49T、49T/51A/98P/252V/311W、49T/51A/123Q/252V/344H、49T/98P/120T/252V/344H、49T/120T/252V/344H、49T/123Q/252V/344H、49T/123Q/264S/344H、49T/123Q/311W、49T/252V/344H、49T/311W/344H、49T/344H、51A/252V/344H、51A/344H、51V、98P/344H、98R、123Q/252V/344H、129F、160T、161I、174G/195I/225L/281K/303P/330F/345I、174G/225L/243R/281P/303P/345I、174H/195I/243R/281K/345I、174H/281P/330H、174R/193L/195I/225L、174R/193L/303P/330H、174R/195I/281K/303P、174R/303P、195Y/225L/303P/330H、252V、268T、344I、344V、および344Wから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号540を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号540に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、K34L/F38A/E174G/Q193L/Q195L/L243R/G281P/A303P/N330F、K34L/F38A/E174R/A303P/F345I、K34L/F38G/E174R/M225L/A303P、K34L/E174G、K34L/E174G/Q193L/Q195L/L243R/G281P、K34L/E174H/Q193L/Q195I/A303P/N330F、K34L/Q193L/Q195I/M225L/L243R、K34L/Q193L/L243R/A303P/N330F、K34L/G281P/N330H、F38A/E174H/Q193L/M225L/T274D/M283I/A303P/N330F、F38A/E174R/G281K/A303P/F345I、F38A/Q193L/Q195L/M225L/A303P/F345I、F38A/Q195I/A303P、F38A/Q195Y/G281K/A303P/N330F、F38G、F38G/E174G/Q193L/A303P、F38G/E174G/G281K/A303P、F38G/E174H/Q195L/G281P/N330F、F38G/E174H/M225L/L243R/G281K/N330H、F38G/E174H/G281K、F38G/E174R/Q193L/Q195L/L243R/N330H、F38G/Q195I/G281P/N330F、F38G/Q195Y/L243R/A303P、V49S、V49T、V49T/T51A/G98P/M252V/L311W、V49T/T51A/E123Q/M252V/S344H、V49T/G98P/M120T/M252V/S344H、V49T/M120T/M252V/S344H、V49T/E123Q/M252V/S344H、V49T/E123Q/T264S/S344H、V49T/E123Q/L311W、V49T/M252V/S344H、V49T/L311W/S344H、V49T/S344H、T51A/M252V/S344H、T51A/S344H、T51V、G98P/S344H、G98R、E123Q/M252V/S344H、S129F、S160T、L161I、E174G/Q195I/M225L/G281K/A303P/N330F/F345I、E174G/M225L/L243R/G281P/A303P/F345I、E174H/Q195I/L243R/G281K/F345I、E174H/G281P/N330H、E174R/Q193L/Q195I/M225L、E174R/Q193L/A303P/N330H、E174R/Q195I/G281K/A303P、E174R/A303P、Q195Y/M225L/A303P/N330H、M252V、S268T、S344I、S344V、およびS344Wから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号540を参照して付番されている。
いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号646に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、11/16/67/168/180/287、11/16/237/241/287、11/67/168/287、16/67/154/168/237/241/287、16/67/237/287/291、16/168/177、24、24/278、34/49/161/193/243/344、34/49/161/193/344、34/49/161/243/344、34/49/161/252/268/344、34/49/193/243/252/344、34/49/193/344、34/49/243/252、34/49/252/268/344、34/161/193/243/252/268、34/161/193/243/268/344、34/161/193/243/344、34/161/193/252/268/344、34/161/193/252/344、34/161/193/268/344、34/161/243/281/344、34/161/344、34/193/243/252/344、34/193/252/268/344、34/193/268/281、34/252/268/281/344、34/252/344、49/161/193/243/252/344、49/161/193/252/281/344、49/161/243/252/344、49/193/197/243/252/281/344、49/193/243/252/344、49/193/243/344、49/243/344、67/154/237/287、67/168/237、67/168/237/287、67/177/237、154/237/286/287、154/286/287、161/193/252/344、161/193/344、161/344、168/237、186/187/278、193/243/281/344、193/252/268/344、193/252/281/344、237、237/287/291、および281/344から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号646を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号646に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、11I/16F/67A/168T/180V/287L、11I/16F/237Q/241S/287L、11I/67A/168T/287L、16F/67A/154Y/168T/237Q/241S/287L、16F/67A/237Q/287L/291A、16F/168T/177L、24M、24M/278L、34K/49T/161I/193L/243R/344H、34K/49T/161I/193L/243R/344V、34K/49T/161I/193L/344W、34K/49T/161I/243R/344H、34K/49T/161I/252V/268T/344V、34K/49T/193L/243R/252V/344W、34K/49T/193L/344H、34K/49T/193L/344W、34K/49T/243R/252V、34K/49T/252V/268T/344V、34K/161I/193L/243R/252V/268T、34K/161I/193L/243R/268T/344V、34K/161I/193L/243R/344W、34K/161I/193L/252V/268T/344H、34K/161I/193L/252V/268T/344V、34K/161I/193L/252V/344H、34K/161I/193L/252V/344V、34K/161I/193L/252V/344W、34K/161I/193L/268T/344H、34K/161I/243R/281P/344V、34K/161I/344V、34K/161I/344W、34K/193L/243R/252V/344W、34K/193L/252V/268T/344H、34K/193L/268T/281P、34K/252V/268T/281P/344V、34K/252V/344V、49T/161I/193L/243R/252V/344W、49T/161I/193L/252V/281P/344H、49T/161I/243R/252V/344V、49T/193L/197G/243R/252V/281P/344H、49T/193L/243R/252V/344V、49T/193L/243R/344W、49T/243R/344V、67A/154Y/237Q/287L、67A/168T/237Q、67A/168T/237Q/287L、67A/177L/237Q、154Y/237Q/286V/287L、154Y/286V/287L、161I/193L/252V/344V、161I/193L/344W、161I/344W、168T/237Q、186T/187A/278L、193L/243R/281P/344W、193L/252V/268T/344V、193L/252V/281P/344H、237Q、237Q/287L/291A、および281P/344Wから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号646を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号646に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、V11I/L16F/Y67A/S168T/I180V/F287L、V11I/L16F/A237Q/T241S/F287L、V11I/Y67A/S168T/F287L、L16F/Y67A/W154Y/S168T/A237Q/T241S/F287L、L16F/Y67A/A237Q/F287L/S291A、L16F/S168T/V177L、F24M、F24M/Y278L、L34K/V49T/L161I/Q193L/L243R/S344H、L34K/V49T/L161I/Q193L/L243R/S344V、L34K/V49T/L161I/Q193L/S344W、L34K/V49T/L161I/L243R/S344H、L34K/V49T/L161I/M252V/S268T/S344V、L34K/V49T/Q193L/L243R/M252V/S344W、L34K/V49T/Q193L/S344H、L34K/V49T/Q193L/S344W、L34K/V49T/L243R/M252V、L34K/V49T/M252V/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/L243R/M252V/S268T、L34K/L161I/Q193L/L243R/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/L243R/S344W、L34K/L161I/Q193L/M252V/S268T/S344H、L34K/L161I/Q193L/M252V/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344H、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344V、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344W、L34K/L161I/Q193L/S268T/S344H、L34K/L161I/L243R/G281P/S344V、L34K/L161I/S344V、L34K/L161I/S344W、L34K/Q193L/L243R/M252V/S344W、L34K/Q193L/M252V/S268T/S344H、L34K/Q193L/S268T/G281P、L34K/M252V/S268T/G281P/S344V、L34K/M252V/S344V、V49T/L161I/Q193L/L243R/M252V/S344W、V49T/L161I/Q193L/M252V/G281P/S344H、V49T/L161I/L243R/M252V/S344V、V49T/Q193L/S197G/L243R/M252V/G281P/S344H、V49T/Q193L/L243R/M252V/S344V、V49T/Q193L/L243R/S344W、V49T/L243R/S344V、Y67A/W154Y/A237Q/F287L、Y67A/S168T/A237Q、Y67A/S168T/A237Q/F287L、Y67A/V177L/A237Q、W154Y/A237Q/L286V/F287L、W154Y/L286V/F287L、L161I/Q193L/M252V/S344V、L161I/Q193L/S344W、L161I/S344W、S168T/A237Q、H186T/L187A/Y278L、Q193L/L243R/G281P/S344W、Q193L/M252V/S268T/S344V、Q193L/M252V/G281P/S344H、A237Q、A237Q/F287L/S291A、およびG281P/S344Wから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号646を参照して付番されている。
いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、24/168/252/281、24/237/287/344、24/252、24/252/287、24/344、213/252/278/344、252/278/344、252/287/344および281から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、24M/168T/252V/281P、24M/237Q/287L/344S、24M/252V、24M/252V/287L、24M/344W、213S/252V/278L/344S、252V/278L/344W、252V/287L/344Sおよび281Pから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、F24M/S168T/M252V/G281P、F24M/A237Q/F287L/H344S、F24M/M252V、F24M/M252V/F287L、F24M/H344W、P213S/M252V/Y278L/H344S、M252V/Y278L/H344W、M252V/F287L/H344S、およびG281Pから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。
いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、24/168/252/281、24/237/287/344、24/252、24/252/287、24/344、213/252/278/344、252/278/344、252/287/344および281から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、24M/168T/252V/281P、24M/237Q/287L/344S、24M/252V、24M/252V/287L、24M/344W、213S/252V/278L/344S、252V/278L/344W、252V/287L/344Sおよび281Pから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、F24M/S168T/M252V/G281P、F24M/A237Q/F287L/H344S、F24M/M252V、F24M/M252V/F287L、F24M/H344W、P213S/M252V/Y278L/H344S、M252V/Y278L/H344W、M252V/F287L/H344S、およびG281Pから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。
いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、24、24/38/49/70/149/161/174/175/189/193/225/231/243/252/271/287/292/293/296/303/334/344/373/385、38、49、70、149、161、174、175、189、193、225、231、243、252、271、287、292、293、296、303、334、344、373、および385から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、24A、24C、24D、24E、24F、24F/38F/49V/70K/149T/161L/174E/175Q/189S/193Q/225M/231Q/243L/252M/271G/287F/292M/293Q/296S/303A/334D/344S/373Y/385F、24G、24H、24I、24K、24L、24N、24P、24Q、24R、24S、24T、24V、24W、24Y、38A、38C、38D、38E、38F、38H、38I、38K、38L、38M、38N、38P、38Q、38R、38S、38T、38V、38W、38Y、49A、49C、49D、49E、49F、49G、49H、49I、49K、49L、49M、49N、49P、49Q、49R、49S、49V、49W、49Y、70A、70C、70D、70E、70F、70G、70I、70K、70L、70M、70N、70P、70Q、70R、70S、70T、70V、70W、70Y、149A、149C、149D、149F、149G、149H、149I、149K、149L、149M、149N、149P、149Q、149R、149S、149T、149V、149W、149Y、161A、161C、161D、161E、161F、161G、161H、161K、161L、161M、161N、161P、161Q、161R、161S、161T、161V、161W、161Y、174A、174C、174D、174E、174F、174G、174H、174I、174K、174L、174M、174N、174P、174Q、174S、174T、174V、174W、174Y、175A、175C、175D、175E、175F、175G、175H、175I、175K、175M、175N、175P、175Q、175R、175S、175T、175V、175W、175Y、189C、189D、189E、189F、189G、189H、189I、189K、189L、189M、189N、189P、189Q、189R、189S、189T、189V、189W、189Y、193A、193C、193D、193E、193F、193G、193H、193I、193K、193M、193N、193P、193Q、193R、193S、193T、193V、193W、193Y、225A、225C、225D、225E、225F、225G、225H、225I、225K、225M、225N、225P、225Q、225R、225S、225T、225V、225W、225Y、231A、231C、231D、231F、231G、231H、231I、231K、231L、231M、231N、231P、231Q、231R、231S、231T、231V、231W、231Y、243A、243C、243D、243E、243F、243G、243H、243I、243K、243L、243M、243N、243P、243Q、243S、243T、243V、243W、243Y、252A、252C、252D、252E、252F、252G、252H、252I、252K、252L、252M、252N、252P、252Q、252R、252S、252T、252W、252Y、271A、271C、271E、271F、271G、271H、271I、271K、271L、271M、271N、271P、271Q、271R、271S、271T、271V、271W、271Y、287A、287C、287D、287E、287F、287G、287H、287I、287K、287M、287N、287P、287Q、287R、287S、287T、287V、287W、287Y、292A、292C、292D、292E、292F、292G、292H、292I、292K、292M、292N、292P、292Q、292R、292S、292T、292V、292W、292Y、293A、293C、293D、293E、293F、293G、293H、293I、293K、293L、293M、293N、293P、293Q、293S、293T、293V、293W、293Y、296A、296C、296D、296E、296F、296G、296H、296I、296K、296L、296M、296N、296P、296Q、296S、296T、296V、296W、296Y、303A、303C、303D、303E、303F、303G、303H、303I、303K、303L、303M、303N、303Q、303R、303S、303T、303V、303W、303Y、334A、334C、334D、334E、334F、334G、334H、334I、334K、334L、334M、334N、334P、334Q、334R、334S、334V、334W、334Y、344A、344C、344D、344E、344F、344G、344I、344K、344L、344M、344N、344P、344Q、344R、344S、344T、344V、344W、344Y、373A、373C、373D、373E、373G、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373P、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、373Y、385A、385C、385D、385E、385F、385G、385H、385I、385K、385L、385M、385N、385Q、385R、385S、385T、385V、385W、および385Yから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、M24A、M24C、M24D、M24E、M24F、M24F/G38F/T49V/H70K/E149T/I161L/R174E/L175Q/A189S/L193Q/L225M/E231Q/R243L/V252M/D271G/L287F/L292M/R293Q/R296S/P303A/T334D/H344S/F373Y/P385F、M24G、M24H、M24I、M24K、M24L、M24N、M24P、M24Q、M24R、M24S、M24T、M24V、M24W、M24Y、G38A、G38C、G38D、G38E、G38F、G38H、G38I、G38K、G38L、G38M、G38N、G38P、G38Q、G38R、G38S、G38T、G38V、G38W、G38Y、T49A、T49C、T49D、T49E、T49F、T49G、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49P、T49Q、T49R、T49S、T49V、T49W、T49Y、H70A、H70C、H70D、H70E、H70F、H70G、H70I、H70K、H70L、H70M、H70N、H70P、H70Q、H70R、H70S、H70T、H70V、H70W、H70Y、E149A、E149C、E149D、E149F、E149G、E149H、E149I、E149K、E149L、E149M、E149N、E149P、E149Q、E149R、E149S、E149T、E149V、E149W、E149Y、I161A、I161C、I161D、I161E、I161F、I161G、I161H、I161K、I161L、I161M、I161N、I161P、I161Q、I161R、I161S、I161T、I161V、I161W、I161Y、R174A、R174C、R174D、R174E、R174F、R174G、R174H、R174I、R174K、R174L、R174M、R174N、R174P、R174Q、R174S、R174T、R174V、R174W、R174Y、L175A、L175C、L175D、L175E、L175F、L175G、L175H、L175I、L175K、L175M、L175N、L175P、L175Q、L175R、L175S、L175T、L175V、L175W、L175Y、A189C、A189D、A189E、A189F、A189G、A189H、A189I、A189K、A189L、A189M、A189N、A189P、A189Q、A189R、A189S、A189T、A189V、A189W、A189Y、L193A、L193C、L193D、L193E、L193F、L193G、L193H、L193I、L193K、L193M、L193N、L193P、L193Q、L193R、L193S、L193T、L193V、L193W、L193Y、L225A、L225C、L225D、L225E、L225F、L225G、L225H、L225I、L225K、L225M、L225N、L225P、L225Q、L225R、L225S、L225T、L225V、L225W、L225Y、E231A、E231C、E231D、E231F、E231G、E231H、E231I、E231K、E231L、E231M、E231N、E231P、E231Q、E231R、E231S、E231T、E231V、E231W、E231Y、R243A、R243C、R243D、R243E、R243F、R243G、R243H、R243I、R243K、R243L、R243M、R243N、R243P、R243Q、R243S、R243T、R243V、R243W、R243Y、V252A、V252C、V252D、V252E、V252F、V252G、V252H、V252I、V252K、V252L、V252M、V252N、V252P、V252Q、V252R、V252S、V252T、V252W、V252Y、D271A、D271C、D271E、D271F、D271G、D271H、D271I、D271K、D271L、D271M、D271N、D271P、D271Q、D271R、D271S、D271T、D271V、D271W、D271Y、L287A、L287C、L287D、L287E、L287F、L287G、L287H、L287I、L287K、L287M、L287N、L287P、L287Q、L287R、L287S、L287T、L287V、L287W、L287Y、L292A、L292C、L292D、L292E、L292F、L292G、L292H、L292I、L292K、L292M、L292N、L292P、L292Q、L292R、L292S、L292T、L292V、L292W、L292Y、R293A、R293C、R2
93D、R293E、R293F、R293G、R293H、R293I、R293K、R293L、R293M、R293N、R293P、R293Q、R293S、R293T、R293V、R293W、R293Y、R296A、R296C、R296D、R296E、R296F、R296G、R296H、R296I、R296K、R296L、R296M、R296N、R296P、R296Q、R296S、R296T、R296V、R296W、R296Y、P303A、P303C、P303D、P303E、P303F、P303G、P303H、P303I、P303K、P303L、P303M、P303N、P303Q、P303R、P303S、P303T、P303V、P303W、P303Y、T334A、T334C、T334D、T334E、T334F、T334G、T334H、T334I、T334K、T334L、T334M、T334N、T334P、T334Q、T334R、T334S、T334V、T334W、T334Y、H344A、H344C、H344D、H344E、H344F、H344G、H344I、H344K、H344L、H344M、H344N、H344P、H344Q、H344R、H344S、H344T、H344V、H344W、H344Y、F373A、F373C、F373D、F373E、F373G、F373H、F373I、F373K、F373L、F373M、F373N、F373P、F373Q、F373R、F373S、F373T、F373V、F373W、F373Y、P385A、P385C、P385D、P385E、P385F、P385G、P385H、P385I、P385K、P385L、P385M、P385N、P385Q、P385R、P385S、P385T、P385V、P385W、およびP385Yから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。
93D、R293E、R293F、R293G、R293H、R293I、R293K、R293L、R293M、R293N、R293P、R293Q、R293S、R293T、R293V、R293W、R293Y、R296A、R296C、R296D、R296E、R296F、R296G、R296H、R296I、R296K、R296L、R296M、R296N、R296P、R296Q、R296S、R296T、R296V、R296W、R296Y、P303A、P303C、P303D、P303E、P303F、P303G、P303H、P303I、P303K、P303L、P303M、P303N、P303Q、P303R、P303S、P303T、P303V、P303W、P303Y、T334A、T334C、T334D、T334E、T334F、T334G、T334H、T334I、T334K、T334L、T334M、T334N、T334P、T334Q、T334R、T334S、T334V、T334W、T334Y、H344A、H344C、H344D、H344E、H344F、H344G、H344I、H344K、H344L、H344M、H344N、H344P、H344Q、H344R、H344S、H344T、H344V、H344W、H344Y、F373A、F373C、F373D、F373E、F373G、F373H、F373I、F373K、F373L、F373M、F373N、F373P、F373Q、F373R、F373S、F373T、F373V、F373W、F373Y、P385A、P385C、P385D、P385E、P385F、P385G、P385H、P385I、P385K、P385L、P385M、P385N、P385Q、P385R、P385S、P385T、P385V、P385W、およびP385Yから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。
いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/または5-1に示される少なくとも1つの位置に少なくとも1つの変異を含み、前記位置は、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号14~1796の偶数番号の配列に記載される少なくとも1つの配列に対して少なくとも約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号14~1796の偶数番号の配列に記載される少なくとも1つの配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号14~1796の偶数番号の配列に記載される少なくとも1つの配列を含む。
いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼより熱安定性が高い。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより熱安定性が高い。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、高温および/または低温への曝露後に酵素活性を保持する。いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、参照配列と比較して、高温および/または低温への曝露後により高い酵素活性を保持する。いくつかの実施形態において、参照配列は野生型リパーゼであるが、いくつかの他の実施形態において、参照配列は別の組換えリパーゼである。
いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは低pH環境において安定および/または活性であるが、他の実施形態においては、組換えリパーゼは高pH環境において安定および/または活性であり、なおさらなる実施形態では、組換えリパーゼは中性pH環境において安定および/または活性である。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは低pH環境および高pH環境において安定および/または活性であり、いくつかの追加の実施形態においては、リパーゼは低pH環境、中性pH環境および高pH環境において安定および/または活性である。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、低pH環境、高pH環境および/または中性pH環境への曝露後に酵素活性を保持する。いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、参照配列と比較して、高pH環境、中性pH環境および/または低pH環境においてより安定および/または活性である。いくつかの実施形態において、参照配列は野生型リパーゼであるが、他の実施形態において、参照配列は別の操作されたリパーゼである。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼより、7未満のpHで(すなわち、酸性pH条件またはレベルの下で)より安定および/または活性である。いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、pH7未満のpHで(すなわち、酸性pH条件またはレベルの下で)より安定および/または活性である。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼより、5未満のpHでより安定および/または活性である。いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼより、pH5でより安定および/または活性である。いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または688のリパーゼより、pH5でより安定および/または活性である。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼより、pH3.5でよりおよび/または活性安定である。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、pH3.5でより安定および/または活性である。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼより、pH3でより安定および/または活性である。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、pH3でより安定および/または活性である。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼより、タンパク質分解に対してより耐性である。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、タンパク質分解に対してより耐性である。いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼはトリプシンによるタンパク質分解に対して耐性である。いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼより、トリプシンによるタンパク質分解に対してより耐性である。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、トリプシンによるタンパク質分解に対してより耐性である。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、キモトリプシンによるタンパク質分解に対して耐性である。いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼより、キモトリプシンによるタンパク質分解に対してより耐性である。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、キモトリプシンによるタンパク質分解に対してより耐性である。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、ペプシン、トリプシンおよび/またはキモトリプシンによるタンパク質分解に対して耐性である。いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼより、ペプシン、トリプシンおよび/またはキモトリプシンによるタンパク質分解に対してより耐性である。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、ペプシン、トリプシンおよび/またはキモトリプシンによるタンパク質分解に対してより耐性である。
いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼより、少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下においてより活性である。いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下においてより活性である。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、胆汁酸塩への曝露後に酵素活性を保持する。いくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、参照配列と比較して、胆汁酸塩への曝露後により高い酵素活性を保持する。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼである。いくつかの追加の実施形態において、胆汁酸塩はタウロコラートである。
さらにいくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼより、酸性pHでより安定および/もしくは活性であり、より耐熱性であり、タンパク質分解に対してより耐性であり、ならびに/または少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下においてより活性である。さらにいくつかのさらなる実施形態において、リパーゼは、食品および/または飲料中で安定である。さらにいくつかの追加の実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、酸性pHでより安定および/もしくは活性であり、より耐熱性であり、タンパク質分解に対してより耐性であり、ならびに/または少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下においてより活性である。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼと比較して、酸性pHでの改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された耐性、ならびに/または少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも1つの改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼと比較して、酸性pHでの改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された耐性、ならびに/または少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも1つの改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼと比較して、酸性pHでの改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された耐性、ならびに/または少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも2つの改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼと比較して、酸性pHでの改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された耐性、ならびに/または少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも2つの改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼと比較して、酸性pHでの改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された耐性、ならびに/または少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも3つの改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼと比較して、酸性pHでの改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された耐性、ならびに/または少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも3つの改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼと比較して、酸性pHでの改善された安定性および/または活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された耐性、ならびに少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下での改善された活性の改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼと比較して、酸性pHでの改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された耐性、ならびに/または少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下での改善された活性の改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2のリパーゼと比較して、酸性pHでの改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された耐性、ならびに/または少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも1つの改善された特性に加えて、少なくとも1つのさらなる改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼと比較して、酸性pHでの改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された耐性、ならびに/または少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも1つの改善された特性に加えて、少なくとも1つのさらなる改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、参照配列と比較して、i)増強された触媒活性;ii)酸pHに対する増加した耐容性;iii)pH3.5に対する増加した耐容性;iv)pH3に対する増加した耐容性;v)少なくとも1つのプロテアーゼに対する増加した耐容性;vi)少なくとも1つの胆汁酸塩に対する増加した耐容性;vii)増加した耐熱性;またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)およびvii)のいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1つの改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、参照配列は配列番号2であるが、いくつかの代替の実施形態において、参照配列は配列番号94、350、442、540、646、758および868から選択される。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、少なくとも1つの参照配列と比較して、i)増強された触媒活性;ii)酸pHに対する増加した耐容性;iii)pH3.5に対する増加した耐容性;iv)pH3に対する増加した耐容性;v)少なくとも1つのプロテアーゼに対する増加した耐容性;vi)少なくとも1つの胆汁酸塩に対する増加した耐容性;vii)増加した耐熱性;またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)およびvii)のいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1つの改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、参照配列は配列番号2であるが、いくつかの代替の実施形態において、参照配列は配列番号94、350、442、540、646、758および868から選択される。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、少なくとも2つまたはそれを超える参照配列と比較して、i)増強された触媒活性;ii)酸pHに対する増加した耐容性;iii)pH3.5に対する増加した耐容性;iv)pH3に対する増加した耐容性;v)少なくとも1つのプロテアーゼに対する増加した耐容性;vi)少なくとも1つの胆汁酸塩に対する増加した耐容性;vii)増加した耐熱性;またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)およびvii)のいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1つの改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、ペプシン、トリプシンおよび/またはキモトリプシンから選択される。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号2、94、350、442、540、646、758および868から選択される。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは精製されている。
本発明は、本明細書で提供される少なくとも1つの組換えリパーゼをコードする組換えポリヌクレオチド配列も提供する。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチド配列はコドン最適化されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号13~1795の奇数番号の配列に記載される少なくとも1つの配列に対して少なくとも約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。いくつかのさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号13~1795の奇数番号の配列に記載される少なくとも1つの配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。いくつかの追加の実施形態において、本発明は、配列番号13~1795の奇数番号の配列に記載される少なくとも1つの配列を提供する。いくつかの追加の実施形態において、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号13~1795の奇数番号の配列から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号13~1795の奇数番号の配列から選択される配列を含み、前記配列は、本明細書に提供される組換えポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号13~1795の奇数番号の配列から選択される配列を含み、前記配列は、配列番号14~1796に提供される偶数番号の配列に提供される組換えポリペプチドをコードする。いくつかのさらなる実施形態において、本明細書に提供される組換えリパーゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、配列番号13~1795の奇数番号の配列に記載される少なくとも1つの配列に対して少なくとも約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。いくつかのさらなる実施形態において、本明細書において提供される組換えリパーゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、配列番号13~1795の奇数番号の配列に記載される少なくとも1つの配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。いくつかのさらなる実施形態において、本明細書において提供される組換えリパーゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、配列番号13~1795の奇数番号の配列に記載される少なくとも1つの配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み、組換えリパーゼは、配列番号14~1796に提供される偶数番号の配列を含むポリペプチド配列を含む。
本発明は、本明細書において提供される少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。本発明は、本明細書において提供される少なくとも1つの組換えリパーゼをコードする少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。いくつかの追加の実施形態において、組換えポリヌクレオチド配列は、制御配列に機能的に連結されている。いくつかの実施形態において、制御配列はプロモーターである。いくつかのさらなる実施形態において、プロモーターは異種プロモーターである。
本発明は、本明細書において提供される少なくとも1つの発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。本発明は、本明細書において提供される少なくとも1つの組換えリパーゼをコードする少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。本発明は、本明細書において提供される少なくとも1つの組換えリパーゼをコードする少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。本発明は、本明細書において提供される組換えリパーゼをコードする少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は真核生物であるが、いくつかの代替的な実施形態において、宿主細胞は原核生物である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Escherichia coliである。いくつかの代替的な実施形態において、宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiaeである。
本発明は、組換えポリヌクレオチドによってコードされる組換えリパーゼが産生される条件下で、本明細書において提供される少なくとも1つの宿主細胞を培養することを含む、少なくとも1つの組換えリパーゼを産生する方法も提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法は、リパーゼを回収する工程をさらに含む。さらにいくつかの追加の実施形態において、これらの方法は、リパーゼを精製する工程をさらに含む。
本発明は、本明細書において提供される少なくとも1つの組換えリパーゼを含む組成物も提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの組換えリパーゼを含む組成物は、薬学的組成物を含む。いくつかの追加の実施形態において、薬学的組成物は、膵機能不全の処置に適している。いくつかの追加の実施形態において、薬学的組成物は、薬学的に許容され得る担体および/または賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、ヒトへの非経口注射または注入に適している。いくつかの追加の実施形態において、薬学的組成物は、ヒトへの経口投与に適している。いくつかのさらなる実施形態において、薬学的組成物は、ヒトへの他の投与様式に適している。本発明は、本明細書において提供される少なくとも1つの組換えリパーゼを含む組成物であって、他の使用に適している組成物も提供する。
本発明は、被験体の膵機能不全の症状を処置および/または予防するための方法であって、膵機能不全を有する被験体を提供すること、および本明細書において提供される薬学的組成物を前記被験体に提供することを含む、方法も提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの組換えリパーゼを含む組成物を被験体に投与すると、膵機能不全の症状が被験体において改善される。いくつかの追加の実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも1つのプロテアーゼをさらに含む。いくつかのさらなる実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも1つのアミラーゼをさらに含む。さらにいくつかの追加の実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも1つのプロテアーゼと少なくとも1つのアミラーゼとをさらに含む。
いくつかのさらなる実施形態において、被験体は、膵機能不全の症状を示す被験体によって必要とされる食事より、その脂質含有量がより制限されていない食事を食べることができる。いくつかの追加の実施形態において、被験体は乳児であるが、いくつかの他の実施形態において、被験体は小児である。さらにいくつかのさらなる実施形態において、被験体は成体であるが、いくつかの代替的な実施形態において、被験体は若年成体である。本発明は、本明細書において提供される少なくとも1つの組換えリパーゼを含む医薬をさらに提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、脂肪および/または脂質を分解するための方法であって、少なくとも1つの脂肪および/または脂質ならびに本発明の少なくとも1つの操作されたリパーゼを提供することと、脂肪および/または脂質が分解される条件下で、脂肪および/または脂質を少なくとも1つの操作されたアミラーゼに曝露することと、を含む方法を提供する。いくつかの追加の実施形態において、本発明は、脂肪および/または脂質を分解するための方法であって、少なくとも1つの脂肪および/または脂質ならびに本発明の少なくとも1つの操作されたリパーゼを含む組成物を提供することと、脂肪および/または脂質が分解される条件下で、脂肪および/または脂質を少なくとも1つの操作されたアミラーゼを含む組成物に曝露することと、を含む方法を提供する。本発明は、本明細書において提供される少なくとも1つの組換えリパーゼを含む組成物の使用も提供する。本発明は、脂肪および/または脂質加水分解のための方法であって、脂肪および/または脂質ならびに本明細書において提供される少なくとも1つの操作されたリパーゼを提供することと、前記脂肪および/または脂質が前記操作されたアミラーゼによって加水分解されるような条件下で、前記脂肪および/または脂質を前記操作されたリパーゼに曝露することと、を含む方法を提供する。いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、脂肪および/または脂質加水分解のための方法であって、脂肪および/または脂質ならびに本明細書において提供される少なくとも1つの操作されたリパーゼを含む組成物を提供することと、前記脂肪および/または脂質が前記組成物の前記操作されたリパーゼによって加水分解されるような条件下で、前記脂肪および/または脂質を前記組成物に曝露することと、を含む方法を提供する。
発明の説明
本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたリパーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、および酸性(pH<7)条件を含む幅広いpH条件下での安定性を提供するように最適化されている。本発明は、治療目的のための、操作されたリパーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。いくつかの実施形態において、本発明のリパーゼ改変体は、PEI状態のPERT処置において使用が見出されている。いくつかの追加の実施形態において、リパーゼは、腸溶コーティングおよび/またはプロトンポンプ阻害剤(PPI)を必要としない形式で投与される。本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびリパーゼポリペプチドを作製するための方法も提供する。
本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたリパーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、および酸性(pH<7)条件を含む幅広いpH条件下での安定性を提供するように最適化されている。本発明は、治療目的のための、操作されたリパーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。いくつかの実施形態において、本発明のリパーゼ改変体は、PEI状態のPERT処置において使用が見出されている。いくつかの追加の実施形態において、リパーゼは、腸溶コーティングおよび/またはプロトンポンプ阻害剤(PPI)を必要としない形式で投与される。本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびリパーゼポリペプチドを作製するための方法も提供する。
略語および定義:
別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、一般に、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。一般に、本明細書において使用される命名法ならびに以下に記載されている細胞培養、分子遺伝学、微生物学、生化学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験室手順は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。そのような技術は周知であり、当業者に周知の多数の教科書および参考文献に記載されている。標準的な技術またはその改変が、化学合成および化学分析のために使用される。上記および下記の両方の本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、論文および刊行物は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、一般に、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。一般に、本明細書において使用される命名法ならびに以下に記載されている細胞培養、分子遺伝学、微生物学、生化学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験室手順は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。そのような技術は周知であり、当業者に周知の多数の教科書および参考文献に記載されている。標準的な技術またはその改変が、化学合成および化学分析のために使用される。上記および下記の両方の本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、論文および刊行物は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の適切な方法および材料が本発明の実施に使用されるが、本明細書にはいくつかの方法および材料が記載されている。当業者によって使用される状況に応じて具体的な方法論、プロトコルおよび試薬は変化し得るので、本発明は、記載されている具体的な方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないことを理解されたい。したがって、以下ですぐに定義されている用語は、全体として本出願を参照することによってより完全に説明される。上記および下記の両方の本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、論文および刊行物は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
本明細書で使用される場合、単数形の「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に反対の意味を示さなければ、複数表記を含む。
数値範囲は、範囲を規定する数を含む。したがって、本明細書に開示されるすべての数値範囲は、全てのより狭い数値範囲がすべて本明細書に明示的に記載されているかのように、そのようなより広い数値範囲内に入る全てのより狭い数値範囲を包含することを意図している。本明細書に開示される全ての最大(または最小)数値限定は、全てのより低い(またはより高い)数値限定が本明細書に明示的に記載されているかのように、全てのより低い(またはより高い)数値限定を含むことも意図される。
用語「約」は、特定の値について許容され得る誤差を意味する。いくつかの例では、「約」は、所与の値の範囲の0.05%、0.5%、1.0%または2.0%以内を意味する。いくつかの例では、「約」は、所与の値の1、2、3または4標準偏差以内を意味する。
さらに、本明細書で提供される見出しは、全体として本出願を参照することによって有することができる本発明の様々な局面または実施形態の限定ではない。したがって、以下ですぐに定義されている用語は、全体として本出願を参照することによってより完全に定義される。それにもかかわらず、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語が以下に定義される。
別段の指示がない限り、それぞれ、核酸は、5’から3’方向に左から右に書かれており、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシへの方向で左から右に書かれている。
本明細書で使用される場合、「含む(comprising)」という用語およびその同族語は、包括的な意味で(すなわち、「含む(including)」という用語およびその対応する同族語と等しい)使用される。
本明細書で使用される場合、「EC」番号は、Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(NC-IUBMB)の酵素命名法を指す。IUBMB生化学的分類は、酵素が触媒する化学反応に基づく酵素の数値分類システムである。
本明細書で使用される場合、「ATCC」は、そのバイオリポジトリコレクションが遺伝子および株を含むAmerican Type Culture Collectionを指す。
本明細書で使用される場合、「NCBI」とは、National Center for Biological Informationおよびその中に提供される配列データベースを指す。
本明細書で使用される場合、「リパーゼ」は、トリグリセリドのエステル結合を加水分解することによって脂肪の加水分解を触媒する、一般に「リパーゼ」と呼ばれる任意の酵素を指す。膵臓のリパーゼは、脂肪酸、グリセロールおよびその他のアルコールへの脂肪の分解において重要である。リパーゼは、ほとんどの生物における食事性脂質の消化、輸送および処理に不可欠である。
本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、脂肪酸およびそのエステル、ステロール、プレノール、特定の難溶性ビタミン、およびその他の関連化合物を含む水不溶性高分子のクラスを指す。「脂肪」は、脂肪酸エステル(例えば、グリセロールおよび3つの脂肪酸から作られるトリグリセリド)から構成される脂質の部分集団である。本発明が任意の特定の脂質および/または脂肪に限定されることは意図されていない。文脈を考慮すると、「脂肪」および「脂質」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ」(ならびに「プロテイナーゼ」および「ペプチダーゼ」)は、タンパク質を加水分解する多数の酵素を指す。より小さなポリペプチド単位(unties)または単一のアミノ酸へのタンパク質の分解に関与する多数のプロテアーゼが存在する。プロテアーゼは、摂取されたタンパク質の消化、タンパク質異化および細胞シグナル伝達を含む多くの生物学的機能にとって重要である。
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾(例えば、グリコシル化またはリン酸化)にかかわらず、アミド結合によって共有結合された少なくとも2つのアミノ酸のポリマーを表すために本明細書で互換的に使用される。
「アミノ酸」は、本明細書では、IUPAC-IUBのBiochemical Nomenclature Commissionによって推奨される一般的に知られた三文字記号または一文字記号のいずれかによって表される。同様に、ヌクレオチドは、一般的に受け入れられた一文字コードによって表され得る。
「操作された(engineered)」、「組換え」、「天然に存在しない」および「改変体」という用語は、細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、ほかに天然に存在しない様式で修飾された、または天然もしくはネイティブ形態の材料と同一であるが、合成材料からおよび/もしくは組換え技術を使用した操作によって生成もしくは誘導された材料またはその材料の天然もしくはネイティブ形態に対応する材料を指す。
組換えポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて製造することができる。関心対象の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、プラスミドなどのベクターにクローニングし、E.coli、S.cerevisiaeなどの所望の宿主中で発現させることができる。組換えポリペプチドの改変体は、当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。実際に、当業者に周知の多種多様な異なる変異誘発技術が存在する。さらに、変異誘発キットは、多くの市販の分子生物学供給業者からも入手可能である。規定のアミノ酸においての特異的置換(部位特異的)、遺伝子の局所領域での特異的もしくはランダムな変異(領域特異的)、または遺伝子全体にわたるランダム変異誘発(例えば、飽和変異誘発)を行うための方法が利用可能である。PCR、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンPCR、シャッフリング、および化学的飽和変異誘発を使用する一本鎖DNAまたは二本鎖DNAの部位特異的変異誘発、または当技術分野で公知の任意の他の適切な方法を含むがこれらに限定されない、酵素改変体を生成するための多数の適切な方法が当業者に公知である。DNAおよびタンパク質の操作のために使用される方法の非限定的な例は、以下の特許:米国特許第6,117,679号;米国特許第6,420,175号;米国特許第6,376,246号;米国特許第6,586,182号;米国特許第7,747,391号;米国特許第7,747,393号;米国特許第7,783,428号;および米国特許第8,383,346号に提供されている。改変体を作製した後、任意の所望の特性(例えば、高いもしくは増加した活性、または低いもしくは低下した活性、増加した熱活性、増加した熱的安定性および/または酸性pH安定性など)について改変体をスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態において、「組換えリパーゼポリペプチド」(本明細書では「操作されたリパーゼポリペプチド」、「改変体リパーゼ酵素」、および「リパーゼ改変体」とも呼ばれる。)が使用される。
本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、自然において見られる形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の供給源から単離することができ、ヒトの操作によって意図的に改変されていない、生物中に存在する配列である。
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸(例えば、遺伝子)の部分を指す。
「パーセント(%)配列同一性」という用語は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間での比較を指すために本明細書において使用され、比較ウィンドウにわたって2つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列と比較して付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。パーセンテージは、両方の配列中に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較のウィンドウ内の位置の総数で除算し、結果に100を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算され得る。あるいは、パーセンテージは、両方の配列中に同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が存在するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップと整列される位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較のウィンドウ内の位置の総数で除算し、結果に100を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算され得る。当業者は、2つの配列を整列するために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解する。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム(Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482[1981])によって、NeedlemanおよびWunschの相同性アラインメントアルゴリズム(Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443[1970)によって、PearsonおよびLipmanの類似性検索方法(Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444[1988])によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装(例えば、GCG Wisconsin Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)によって、または当該技術分野で公知であるように、目視検査によって行うことができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例としては、Altschulらによって記載されているBLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムが挙げられるが(それぞれ、Altschulら、J.Mol.Biol.,215:403-410[1990];およびAltschulら、Nucleic Acids Res.,3389-3402[1977]を参照)、これらに限定されない。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationのウェブサイトを通じて公に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列されたときにある正の値の閾値スコアTと一致するまたはこれを満たす、検索配列中の長さWの短いワードを特定することによって、まず、高スコア配列対(HSP)を特定することを含む。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる(上記のAltschulらを参照)。これらの最初の隣接ワードヒットは、これらを含有するより長いHSPを見つけるための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、これらのワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータM(一対の一致する残基に対する報酬スコア;常に>0)およびN(一致しない残基に対するペナルティスコア;常に<0)を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコア行列を使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ低下したとき;累積スコアが、1もしくはそれを超える負のスコアの残基アラインメントの蓄積のために0もしくはそれを下回ったとき;またはいずれかの配列の末端に達したときに、ワードヒットの各方向への伸長は停止される。BLASTアルゴリズムパラメータW、TおよびXは、アライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両鎖の比較を初期設定として使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、3のワード長(W)、10の期待値(E)およびBLOSUM62スコアリング行列を初期設定として使用する(Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915[1989]を参照)。配列アラインメントおよび%配列同一性の例示的な決定は、提供される初期設定パラメータを使用して、GCG Wisconsin Softwareパッケージ(Accelrys,Madison WI)のBESTFITまたはGAPプログラムを使用することができる。
本明細書で使用される場合、「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される規定の配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば完全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、核酸またはポリペプチドの少なくとも20ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の長さ、少なくとも25残基の長さ、少なくとも50残基の長さ、少なくとも100残基の長さまたは完全長である。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、(1)2つの配列間で類似する配列(すなわち、完全な配列の一部)を含み得、(2)2つのポリヌクレオチド間で相違する配列をさらに含み得るので、2つの(またはそれを超える)ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には、配列が類似する局所領域を同定および比較するために、「比較ウィンドウ」にわたって2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較することによって行われる。いくつかの実施形態において、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくことができ、参照配列は、一次配列中に1またはそれを超える変化を有することができる配列である。「比較ウィンドウ」は、少なくとも約20個の連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、配列は、少なくとも20個の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得、比較ウィンドウ内の配列の部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために、(付加または欠失を含まない)参照配列と比較して20%またはそれ未満の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。比較ウィンドウは、20個の連続する残基より長くてすることができ、必要に応じて30、40、50、100、またはそれより長いウィンドウを含む。
所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の付番の文脈で使用される場合の「~に対応する」、「~の参照」または「~に対する」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合の指定された参照配列の残基の付番を指す。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値位置によってではなく、参照配列に関して指定される。例えば、操作されたリパーゼのアミノ酸配列などの所与のアミノ酸配列は、2つの配列間での残基の一致を最適化するためにギャップを導入することによって参照配列に整列させることができる。これらの場合、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の付番は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が整列された参照配列に関して行われる。
本明細書で使用される場合、「変異」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列における任意の変化を指す。配列中に存在する(すなわち、開始または参照配列と比較して)任意の数の(すなわち、1またはそれを超える)置換、挿入、欠失および/または再編成を包含することが意図される。したがって、配列中の変異は、本明細書で提供されるような改変体ポリペプチド(例えば、改変体または組換えリパーゼ)の産生をもたらす。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸差異」または「残基差異」は、参照配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基に対するポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸差異の位置は、一般に、本明細書中で「Xn」と称され、nは、残基差異が基礎としている参照配列中の対応する位置を指す。例えば、「配列番号2と比較した位置X92における残基差異」は、配列番号2の位置92に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差を指す。したがって、配列番号2の参照ポリペプチドが位置92にトレオニンを有する場合、「配列番号2と比較した位置X92における残基差異」は、配列番号2の位置92に対応するポリペプチドの位置にトレオニン以外のアミノ酸残基が存在すること(例えば、T92A)を意味する。本明細書におけるほとんどの例では、ある位置における特定のアミノ酸残基差異は「XnY」として示され、「Xn」は上記の対応する位置を指定し、「Y」は操作されたポリペプチド中に見出されるアミノ酸(すなわち、参照ポリペプチド中の残基とは異なる残基)の一文字識別子である。いくつかの例では(例えば、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/または5-1では)、本開示は、慣用の表記「AnB」によって示される特定のアミノ酸差異も提供し、Aは参照配列中の残基の一文字識別子であり、「n」は参照配列中の残基位置の番号であり、Bは操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である。いくつかの例では、本開示のポリペプチドは、参照配列に対して残基差異が存在する指定された位置のリストによって示される、参照配列に対する1またはそれを超えるアミノ酸残基差異を含むことができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの特定の残基位置に1を超えるアミノ酸を使用することができる場合、使用することができる様々なアミノ酸残基は、「/」によって区切られる(例えば、X2H/X2M/X2TまたはX2H/M/TまたはE2H/M/T)。いくつかの実施形態において、酵素改変体は1より多くの置換を含む。これらの置換は、読みやすいようにスラッシュで区切られる(例えば、Y27V/F385P)。本出願は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の一方/または両方を含む1またはそれを超えるアミノ酸差異を含む操作されたポリペプチド配列を含む。
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する異なる残基での、残基の置換を指し、したがって、典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸の、アミノ酸の同一または類似の規定されたクラス内のアミノ酸での置換を含む。例として、限定ではなく、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン)で置換され得;ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、セリンおよびトレオニン)で置換され;芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン)で置換され;塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、リジンおよびアルギニン)で置換され;酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)で置換され;および/または疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性もしくは親水性アミノ酸で置き換えられる。
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」とは、ポリペプチド中のアミノ酸の、著しく異なる側鎖特性を有するアミノ酸での置換を指す。非保存的置換は、規定された群内ではなく、規定された群間のアミノ酸を使用し得、(a)置換の領域中のペプチド骨格の構造(例えば、グリシンの代わりにプロリン)、(b)電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖の嵩に影響を及ぼす。例として、限定ではなく、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸;小アミノ酸で置換された芳香族アミノ酸;および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。
本明細書で使用される場合、「欠失」とは、参照ポリペプチドからの1またはそれを超えるアミノ酸の除去によるポリペプチドへの改変を指す。欠失は、操作された酵素の酵素活性を保持しながらおよび/または改善された特性を保持しながら、参照酵素を構成する、1もしくはそれを超えるアミノ酸、2もしくはそれを超えるアミノ酸、5もしくはそれを超えるアミノ酸、10もしくはそれを超えるアミノ酸、15もしくはそれを超えるアミノ酸、または20もしくはそれを超えるアミノ酸、アミノ酸の総数の最大10%、またはアミノ酸の総数の最大20%を除去することを含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内部部分および/または末端部分を対象とすることができる。様々な実施形態において、欠失は連続セグメントを含むことができ、または不連続であり得る。
本明細書で使用される場合、「挿入」とは、参照ポリペプチドからの1またはそれを超えるアミノ酸の付加によるポリペプチドへの改変を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分、またはカルボキシもしくはアミノ末端へのものであり得る。本明細書で使用される挿入には、当技術分野で公知の融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続セグメントであり得、または天然に存在するポリペプチド中のアミノ酸の1もしくはそれより多くによって隔てられ得る。
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の文脈で使用されるアスタリスク(*)は、ポリヌクレオチド配列内の終止コドンの存在を示す。いくつかの実施形態において、改変体プロテアーゼは、停止コドンの存在により、出発配列または参照配列と比較して切断されている。
「機能的断片」および「生物学的に活性な断片」は、本明細書において互換的に使用され、アミノ末端および/またはカルボキシ末端の欠失および/または内部欠失を有する(例えば、配列は切断されている)が、残りのアミノ酸配列は、それが比較されている配列(例えば、本発明の完全長の操作されたリパーゼ)中の対応する位置と同一であり、完全長ポリペプチドの活性の実質的にすべてを保持するポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、当該ポリペプチドに天然に付随する他の夾雑物(例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド)から実質的に分離されているポリペプチドを指す。本用語は、ポリペプチドの天然に存在する環境または発現系(例えば、宿主細胞またはインビトロ合成)から取り除かれたまたは精製されたポリペプチドを包含する。組換えリパーゼポリペプチドは、細胞内に存在し得、細胞培地中に存在し得、または溶解物もしくは単離された調製物などの様々な形態で調製され得る。したがって、いくつかの実施形態において、組換えリパーゼポリペプチドは単離されたポリペプチドであり得る。
用語「単離された」および「精製された」は、その分子に天然に付随する少なくとも1つの他の成分から取り除かれた分子(例えば、単離された核酸、ポリペプチドなど)または他の成分を指すために使用される。「精製された」という用語は、絶対的な純度を要求せず、むしろ相対的な定義として意図される。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、そのポリペプチド種が存在する優勢種である(すなわち、モル基準または重量基準で、組成物中の任意の他の個々の高分子種よりも豊富である)組成物を指し、一般に、対象種が、モルまたは重量%で、存在する高分子種の少なくとも約50%を構成する場合に、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なリパーゼ組成物は、モルまたは%重量で、組成物中に存在する全ての高分子種の約60%またはそれより多く、約70%またはそれより多く、約80%またはそれより多く、約90%またはそれより多く、約95%またはそれより多く、および約98%またはそれより多くを構成する。いくつかの実施形態において、対象種は、出発調製物から本質的な均一性(すなわち、慣用の検出方法によって、夾雑物種を組成物中に検出することができない)まで精製され、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、小分子(<500ダルトン)および元素イオン種は、高分子種と見なされない。いくつかの実施形態において、単離された組換えリパーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。いくつかの実施形態において、単離された組換えリパーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。いくつかの実施形態において、本発明での使用に適した製剤に添加される実質的に純粋な組換えリパーゼポリペプチド調製物(例えば、多糖類、界面活性剤など)。
本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」および「改善された特性」という用語は、参照リパーゼポリペプチドおよび/または野生型リパーゼポリペプチドまたは別の操作されたリパーゼポリペプチドと比較して任意の酵素特性の改善を含む、操作されたリパーゼポリペプチドの特性を指す。改善された特性には、増加したタンパク質発現、増加した熱活性(thermoactivity)、増加した熱安定性、増加したpH活性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性または親和性、増加した比活性、基質または最終生成物阻害に対する増加した耐性、増加した化学的安定性、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、酸性または塩基性pHに対する増加した耐容性、タンパク質分解活性に対する増加した耐容性(すなわち、タンパク質分解に対する低下された感受性)、低下した凝集、増加した溶解度、低下された免疫原性、改善された翻訳後修飾(例えば、グリコシル化)、および変化した温度プロファイルなどの特性が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」または「増強された触媒活性」は、参照リパーゼ酵素と比較して、比活性(例えば、生成された生成物/時間/重量タンパク質)の増加または基質の生成物へのパーセント変換(例えば、指定された量のリパーゼを使用した、指定された期間での基質の出発量の生成物へのパーセント変換)の増加によって表すことができる操作されたリパーゼポリペプチドの改善された特性を指す。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例に提供されている。Km、Vmaxまたはkcatの古典的な酵素特性を含む、酵素活性に関連する任意の特性が影響を受ける可能性があり、その変化は増加した酵素活性をもたらすことができる。酵素活性の改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約1.1倍から、天然に存在するリパーゼまたはリパーゼポリペプチドが由来する別の操作されたリパーゼより2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍またはそれを超える酵素活性までであり得る。
リパーゼ活性は、当技術分野で公知の任意の適切な方法(例えば、反応物または生成物の分光光度特性の変化をモニタリングするなどの標準的なアッセイ)によって測定することができる。いくつかの実施形態において、生成された生成物の量は、UV吸光度と組み合わされた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分離によって測定することができる。いくつかの実施形態において、生成された生成物の量は、RAPIDFIRE(登録商標)質量分析計を使用して測定することができるが、いくつかの他の実施形態においては、生成物は、当技術分野で公知の代替方法を使用して測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書でさらに詳細に説明されるように、酵素の規定された調製物、設定条件下での規定されたアッセイ、および1またはそれを超える規定された基質を使用して行われる。
本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ安定な」および「タンパク質分解に対する安定性」という用語は、タンパク質(例えば、本発明の組換えリパーゼ)が機能し、任意のタンパク質分解酵素またはその他のタンパク質分解化合物もしくは因子によって媒介されるタンパク質分解に耐え、プロテアーゼへの曝露後にその機能を保持する能力を指す。本用語が、タンパク質の安定性を評価するための任意の特定のプロテアーゼの使用に限定されることは意図されない。実際、本発明の操作されたリパーゼは、様々なプロテアーゼの存在下でまたは様々なプロテアーゼへの曝露後に安定であり、酵素活性を保持する。いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼはトリプシン、キモトリプシンおよび/またはペプシンの存在下で安定である。しかしながら、本発明が、任意の特定のプロテアーゼまたはタンパク質分解安定性を評価する任意の特定の方法に限定されることは意図されない。
本明細書で使用される場合、「pH安定性」という用語は、特定のpHでのインキュベーション後にタンパク質(例えば、本発明の組換えリパーゼ)が機能する能力を指す。いくつかの実施形態において、本発明は、pH2~pH7の範囲を含むがこれに限定されないpHの範囲で安定な組換えリパーゼを提供する。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、本明細書で提供される実施例に示されるように、異なるpH範囲で安定である。本発明が、いかなるpH安定性レベルにもpH範囲にも限定されることは意図されない。
本明細書で使用される場合、「酸性pHに対する改善された耐容性」という用語は、本発明による組換えリパーゼが、参照リパーゼまたは別の酵素と比較して増加した安定性(特定の期間[例えば、1時間、最長24時間など]酸性pHに曝露した後、約pH7、6、5、4、3、2、またはさらに低いpHにおいて、より高い保持された活性)を有することを意味する。
本明細書で使用される「生理的pH」は、被験体の(例えば、ヒトの)血液(例えば、pH7.2~7.4)に一般的に見られるpH範囲を意味する。
(例えば、塩基性pH条件に対する改善された安定性または塩基性pHに対する増大した耐容性に関して使用される)「塩基性pH」という用語は、約7~11の、またはいくつかの実施形態においては、pH11より大きいpH範囲を意味する。
(例えば、酸性pH条件に対する改善された安定性または酸性pHに対する増大した耐容性に関して使用される)「酸性pH」という用語は、7未満の任意のpH値を包含するpH範囲を意味する。いくつかの実施形態において、酸のpHは7未満であるが、いくつかの他の実施形態においては、pHは約6、5、4、3、2未満であり、またはそれより低い。いくつかの代替的実施形態において、本発明の組換えリパーゼは2~4のpHレベルにおいて安定である。しかしながら、本発明が、任意の特定のpH値または値の範囲に限定されることは意図されない。
本明細書で使用される場合、「胃チャレンジ(gastric challenge)」という語句は、組換えリパーゼが胃(例えば、ヒトの胃)内で遭遇し得る条件に曝露されるように、本発明の組換えリパーゼを低pH環境および少なくとも1つの酵素(例えば、ペプシン)の存在に曝露することを指す。
本明細書で使用される場合、「腸チャレンジ(intestinal challenge)」という語句は、組換えリパーゼが腸管(例えば、ヒトの腸)内で遭遇し得る条件に曝露されるように、中性pH環境ならびにトリプシンおよびキモトリプシンなどの腸プロテアーゼおよび少なくとも1つの胆汁酸塩(例えば、タウロコール酸ナトリウム)の存在に本発明の組換えリパーゼを曝露することを指す。
本明細書中で使用される場合、「順次の複数のチャレンジ」という語句は、一連のチャレンジ条件への本発明の組換えリパーゼの曝露を指す。例えば、いくつかの実施形態において、1時間の熱チャレンジの後に、1時間の胃チャレンジ、次いで、1時間の腸チャレンジが続いた。本発明が、任意の特定のチャレンジおよび/またはチャレンジ条件またはチャレンジの特定の順序に限定されることは意図されない。
「熱的安定性」および「熱安定性」という用語は、タンパク質(例えば、本発明の組換えリパーゼ)が特定の温度で機能する能力を指す。いくつかの実施形態において、本用語は、特定の温度でのインキュベーション後に機能するタンパク質の能力を指す。いくつかの実施形態において、本発明の組換えリパーゼは、「耐熱性」である(すなわち、酵素は、高温でそれらの触媒活性を維持する)。いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、高温での不活化に耐え、いくつかの追加の実施形態においては、長時間の曝露時間にわたって高温で触媒活性を維持する。これらの用語は、本明細書では互換的に使用される。本発明が、任意の特定の温度および/または曝露時間に限定されることは意図されない。このような安定性は、当技術分野で公知の任意の方法(例えば、本明細書中に記載される方法)によって測定することができる。本発明が、任意の特定の温度安定性レベルまたは温度範囲に限定されることは意図されない。いくつかの実施形態において、熱的安定性は、特定の温度でのタンパク質(例えば、本発明の組換えリパーゼ)のインキュベーション後に測定される。
「化学的安定性」という用語は、別のタンパク質の機能に悪影響を及ぼす化学物質の存在下でタンパク質(例えば、本発明の組換えリパーゼ)が機能する能力を指す。本発明が、任意の特定の化学的安定性レベルまたは化学的安定性の範囲に限定されることは意図されない。
「変換」は、対応する生成物への基質の酵素的変換(または生体内変換)を指す。「パーセント変換」は、指定された条件下で一定期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、リパーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、指定された期間での基質の生成物への「パーセント変換」として表すことができる。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われた後に、様々な、但しより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という用語は、標的DNAが、標的ポリヌクレオチドに対して約90%を超える同一性で、標的DNAに対して約60%の同一性、好ましくは約75%の同一性、約85%の同一性を有する相補的核酸を結合することを可能にする条件を指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、42℃での50%ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2%SDS中でのハイブリダイゼーション、続いて42℃での0.2×SSPE、0.2%SDS中での洗浄と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、一般に、規定されたポリヌクレオチド配列に対して溶液条件下で決定された熱融解温度Tmから約10℃またはそれ未満である条件を指す。いくつかの実施形態において、高ストリンジェンシー条件は、65℃の0.018M NaCl中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す(すなわち、ハイブリッドが65℃の0.018M NaCl中で安定でなければ、本明細書で企図されるように、ハイブリットは高ストリンジェンシー条件下で安定ではない)。高ストリンジェンシー条件は、例えば、42℃で50%ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2%SDSと同等の条件でのハイブリダイゼーションの後、65℃で0.1×SSPEおよび0.1%SDSでの洗浄によって提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、65℃で0.1%(w/v)SDSを含有する5×SSC中でのハイブリダイゼーションおよび65℃で0.1%SDSを含有する0.1×SSC中での洗浄と同等の条件でのハイブリダイゼーションである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件および中程度にストリンジェントな条件は、上に引用された参考文献に記載されている。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、DNA配列を細胞中に導入するためのDNA構築物である。いくつかの実施形態において、ベクターは、DNA配列にコードされるポリペプチドの、適切な宿主中での発現をもたらすことができる適切な制御配列に機能的に連結された発現ベクターである。いくつかの実施形態において、プラスミドがベクターとして使用される。いくつかの実施形態において、「発現ベクター」は、宿主細胞中での発現を駆動するためにDNA配列(例えば導入遺伝子)に機能的に連結されたプロモーター配列を有し、いくつかの実施形態において、転写ターミネーター配列も含む。
本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」とは、コードされたタンパク質が関心対象の生物中でより効率的に発現されるように、特定の生物中で優先的に使用されるコドンへの、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの変化を指す。ほとんどのアミノ酸が「同義語」または「同義」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点で、遺伝暗号は縮重しているが、特定の生物によるコドン使用は非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることは周知である。このコドン使用の偏りは、所与の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、高発現タンパク質対低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの総タンパク質コード領域に関してより高くなり得る。いくつかの実施形態において、リパーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化され得る。
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本明細書では、本出願のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現に必要または有利であるすべての成分を指す。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブのものであり得、または外来のものであり得る。このような制御配列には、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との制御配列のライゲーションを容易にする特定の制限部位を導入する目的で、制御配列にはリンカーが提供され得る。
「機能的に連結された」は、本明細書では、制御配列が関心対象のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現を指示または調節するような関心対象のポリヌクレオチドに対する位置に、制御配列が適切に配置されている(すなわち、機能的な関係性で)構成として定義される。
本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」は、コード配列などの関心対象のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、関心対象のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体プロモーター、切断されたプロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞と相同なまたは異種の細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から取得され得る。
本明細書で使用される場合、「適切な反応条件」という語句は、その条件下において本出願のリパーゼポリペプチドが基質を所望の生成物化合物に変換することができる酵素変換反応溶液中の条件(例えば、酵素負荷量、基質負荷量、温度、pH、緩衝液、共溶媒などの範囲)を指し、例示的な「適切な反応条件」は本出願に提供され、実施例によって例示される。
本明細書で使用される場合、「化合物負荷量」または「酵素負荷量」などにおける「負荷量(loading)」は、反応開始時の反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
本明細書で使用される場合、酵素変換反応過程の文脈において使用される「基質」という用語は、リパーゼポリペプチドによって作用される化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、酵素変換過程の文脈において使用される「生成物」という用語は、基質に対するリパーゼポリペプチドの作用から生じる化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含む。いくつかの実施形態において、本用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、「産生する」という用語は、細胞によるタンパク質および/または他の化合物の産生を指す。本用語は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されないポリペプチドの産生に関与する任意の工程を包含することが意図される。いくつかの実施形態において、本用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、2つの配列が自然の状態で随伴していなければ、アミノ酸またはヌクレオチド配列(例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など)は、それが機能的に連結されている別の配列に対して「異種」である。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」および「宿主株」という用語は、本明細書で提供されるDNA(例えば、リパーゼ改変体をコードするポリヌクレオチド)を含む発現ベクターに適した宿主を指す。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、当技術分野で公知の組換えDNA技術を使用して構築されたベクターで形質転換またはトランスフェクションされた原核細胞または真核細胞である。
本明細書で使用される場合、「類似体」という用語は、参照ポリペプチドと70%を超える配列同一性を有するが100%未満の配列同一性(例えば、75%、78%、80%、83%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%を超える配列同一性)を有するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、類似体は、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンを含むがこれらに限定されない1またはそれを超える天然に存在しないアミノ酸残基ならびに天然に存在するアミノ酸を含有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、類似体は、1またはそれを超えるD-アミノ酸残基および2またはそれを超えるアミノ酸残基間の非ペプチド結合も含む。
本明細書で使用される場合、「培養」という用語は、任意の適切な条件下での(例えば、液体、ゲルまたは固体培地を使用する)細胞の集団の成長を指す。いくつかの実施形態において、細胞は微生物細胞(例えば、細菌)であるが、いくつかの他の実施形態において、細胞は哺乳動物細胞、昆虫細胞または別の動物から得られた細胞である。本発明が、任意の特定の細胞もしくは細胞型の培養または任意の特定の培養の方法に限定されることは意図されない。実際、本発明は、任意の適切な条件下で培養された任意の適切な細胞型を包含することが意図される。
「治療薬」という用語は、病理の徴候または症状を示す被験体に投与される、医学的効果を含む有益なまたは望ましい効果を提供する化合物を指す。
「薬学的組成物」という用語は、薬学的有効量の本発明によって包含される操作されたリパーゼポリペプチドと、許容され得る担体とを含む、被験体(例えば、ヒト)における薬学的使用に適した組成物を指す。
「有効量」という用語は、所望の結果をもたらすのに十分な量を意味する。当業者は、日常的な実験を使用することによって有効量を決定し得る。
「被験体」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、伴侶動物および実験動物(例えば、げっ歯類およびウサギ目の動物(lagamorph))などの哺乳動物を含むがこれらに限定されない動物を包含する。本用語は、雌性(female)および雄性(male)を包含することが意図される。
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、疾患について評価されている、疾患について処置されている、または疾患を経験している任意の被験体を意味する。
「乳児」という用語は、生後1ヶ月から約1歳までの期間の小児を指す。
本明細書で使用される場合、「新生児」という用語は、誕生から生後28日までの期間の小児を指す。「早産児」という用語は、妊娠の第20週が完了した後であるが正産期前に生まれた乳児を指し、一般に出生時の体重は約500~約2499グラムである。「超低出生体重児」は、出生時に1500g未満の体重の乳児である。
本明細書中で使用される場合、「小児」という用語は、処置または研究手順に対する同意のための法定年齢に達していない者を指す。いくつかの実施形態において、本用語は、出生時と青年期の間の者を指す。
本明細書で使用される場合、「成体」という用語は、関係する管轄の法定年齢(例えば、米国では18歳)に達した者を指す。いくつかの実施形態において、本用語は、任意の完全に成長した成熟生物を指す。いくつかの実施形態において、「若年成体」という用語は、18歳未満であるが性的成熟に達した者を指す。
本明細書で使用される場合、「組成物」および「製剤」は、任意の適切な使用が意図された、本発明の少なくとも1つの操作されたリパーゼを含む製品(例えば、薬学的組成物、栄養補助食品(dietary supplement)および/または栄養補助剤(nutritional supplement)、餌(feed)など)を包含する。
本明細書で使用される場合、組成物を「投与」および「投与する」という用語は、本発明の組成物を被験体に(例えば、膵機能不全の影響を受けている者に)提供することを意味する。
「担体」という用語は、薬学的組成物に関して本明細書で使用される場合、標準的な薬学的担体、緩衝液および賦形剤、例えば安定剤、保存剤および補助剤のいずれかを意味する。
「薬学的に許容され得る」という用語は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、または材料が含有されている成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく被験体に投与することができ、所望の生物学的活性を有する材料を意味する。
本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、活性薬学的成分(API;例えば、本発明の操作されたリパーゼポリペプチド)以外の任意の薬学的に許容され得る、添加剤、担体、希釈剤、補助剤またはその他の成分を指す。賦形剤は、典型的には、製剤および/または投与目的のために含まれる。
疾患/状態の症状に関して使用される場合の「治療有効量」という用語は、疾患/状態の1またはそれを超える症状を改善、減弱、もしくは排除する、または症状の発症を予防もしくは遅延する化合物(例えば、操作されたリパーゼポリペプチド)の量および/または濃度を指す。
「治療有効量」という用語は、疾患/状態に関して使用される場合、疾患/状態を改善、減弱または排除する組成物(例えば、操作されたリパーゼポリペプチド)の量および/または濃度を指す。いくつかの実施形態において、本用語は、研究者、医師、獣医またはその他の臨床家によって求められる組織、系または動物被験体による生物学的(例えば、医学的)応答を誘発する組成物の量に関して使用される。
本明細書で使用される場合、「処置すること」、「処置する」および「処置」という用語は、本明細書で提供される薬学的組成物などの薬学的組成物の投与を含む、被験体(例えば、ヒト患者)に施される医療を指す。「処置すること」、「処置する」および「処置」という用語は、予防的(preventive)(例えば、予防法(prophylactic))および緩和的処置またはケアを包含することが意図される。いくつかの実施形態において、疾患の症状を予防または改善するための処置が提供される。いくつかの実施形態においては、本発明の薬学的組成物は、膵酵素機能不全疾患または状態の処置または予防において使用が見いだされる。
操作されたリパーゼ:
本発明は、膵酵素機能不全の処置を含む様々な使用に適した操作されたリパーゼを提供する。いくつかの実施形態において、改善された特性を示す操作されたリパーゼは、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/もしくは868と少なくとも約85%、少なくとも約88%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、もしくは約100%のアミノ酸配列同一性と、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/もしくは868または配列番号2、94、350、442、540、646、758および/もしくは868と少なくとも85%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した1もしくはそれを超えるアミノ酸位置に(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれを超えるアミノ酸位置に)配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868と比較したアミノ酸残基差異とを有する。いくつかの実施形態において、1またはそれを超える位置における、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868と比較した残基差異は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 11、12、14、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれを超える保存的アミノ酸置換を含む。しかしながら、他の置換が本発明において使用が見いだされるので、本発明が保存的アミノ酸置換を有するリパーゼ改変体に限定されることは意図されない。いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/または5-1に列挙されるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868を含む。
本発明は、膵酵素機能不全の処置を含む様々な使用に適した操作されたリパーゼを提供する。いくつかの実施形態において、改善された特性を示す操作されたリパーゼは、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/もしくは868と少なくとも約85%、少なくとも約88%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、もしくは約100%のアミノ酸配列同一性と、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/もしくは868または配列番号2、94、350、442、540、646、758および/もしくは868と少なくとも85%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した1もしくはそれを超えるアミノ酸位置に(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれを超えるアミノ酸位置に)配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868と比較したアミノ酸残基差異とを有する。いくつかの実施形態において、1またはそれを超える位置における、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868と比較した残基差異は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 11、12、14、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれを超える保存的アミノ酸置換を含む。しかしながら、他の置換が本発明において使用が見いだされるので、本発明が保存的アミノ酸置換を有するリパーゼ改変体に限定されることは意図されない。いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/または5-1に列挙されるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868を含む。
本発明は、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む少なくとも1つの組換えリパーゼであって、組換えリパーゼは、2、3、4、22、27/46/97/136/149/385、27/46/385、27/70/136/231/385、27/136/323/385、27/149、27/149/385、27/385、34、38、41、44、46/70、46/149/183/231/385、48、70、73、73/305、82、82/94/101/194/199、82/94/199、83、85、87、89、92、94、96、97/149/385、135、136/385、140、141、142、144、146、149、149/231/385、151、174、175、178、181、183/385、189、194、194/199、195、195/231/385、199、199/213、210、212、213、213/330、216、218、219、226、231/385、238、247、250、270、274、281、292、296、300、308、330、338、379、および385から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して付番されている、少なくとも1つの組換えリパーゼも提供する。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、2H、2M、2T、3A、3G、3R、3S、4M、4W、4Y、22N、27V/46T/97A/136V/149E/385P、27V/46T/385P、27V/70N/136V/231E/385P、27V/136V/323I/385P、27V/149E、27V/149E/385P、27V/385P、34D、38A、38H、38L、41V、44E、46T/70N、46T/149E/183L/231E/385P、48V、70N、73C/305I、73I、73R、82C、82E、82E/94S/101S/194N/199L、82E/94S/199L、82F、82G、82L、83G、83K、85I、85W、87R、89A、89T、89V、89W、92A、94S、96E、96N、96S、97A/149E/385P、135G、135Q、135S、135T、135V、136V/385P、140T、141A、141F、141L、141S、142A、142F、142I、142L、144M、144R、144W、146A、146F、146S、146Y、149E、149E/231E/385P、149K、149R、151A、151I、151L、174H、174R、175G、175L、175R、178R、178T、181H、183L/385P、189A、189E、189W、194N、194N/199L、194T、195D/231E/385P、195V、199L、199L/213A、210A、210V、212C、212G、212R、212T、213A/330T、213H、216R、216T、216W、218D、218G、218I、218M、218T、219C、219G、219K、219R、226R、231E/385P、238S、247R、250T、270V、274D、281K、281R、292A、292C、292L、292V、296M、296R、300A、300D、300T、308A、330Y、338N、379T、385A、385C、385D、385P、385R、および385Tから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、E2H、E2M、E2T、T3A、T3G、T3R、T3S、S4M、S4W、S4Y、G22N、Y27V/R46T/Y97A/Y136V/T149E/F385P、Y27V/R46T/F385P、Y27V/K70N/Y136V/Q231E/F385P、Y27V/Y136V/K323I/F385P、Y27V/T149E、Y27V/T149E/F385P、Y27V/F385P、K34D、F38A、F38H、F38L、N41V、G44E、R46T/K70N、R46T/T149E/F183L/Q231E/F385P、Y48V、K70N、T73C/V305I、T73I、T73R、K82C、K82E、K82E/P94S/D101S/K194N/I199L、K82E/P94S/I199L、K82F、K82G、K82L、E83G、E83K、G85I、G85W、A87R、F89A、F89T、F89V、F89W、T92A、P94S、I96E、I96N、I96S、Y97A/T149E/F385P、Y135G、Y135Q、Y135S、Y135T、Y135V、Y136V/F385P、P140T、E141A、E141F、E141L、E141S、E142A、E142F、E142I、E142L、I144M、I144R、I144W、P146A、P146F、P146S、P146Y、T149E、T149E/Q231E/F385P、T149K、T149R、G151A、G151I、G151L、E174H、E174R、Q175G、Q175L、Q175R、S178R、S178T、K181H、F183L/F385P、S189A、S189E、S189W、K194N、K194N/I199L、K194T、Q195D/Q231E/F385P、Q195V、I199L、I199L/P213A、K210A、K210V、Q212C、Q212G、Q212R、Q212T、P213A/N330T、P213H、S216R、S216T、S216W、H218D、H218G、H218I、H218M、H218T、A219C、A219G、A219K、A219R、T226R、Q231E/F385P、Y238S、E247R、Q250T、R270V、T274D、G281K、G281R、M292A、M292C、M292L、M292V、S296M、S296R、Q300A、Q300D、Q300T、R308A、N330Y、K338N、N379T、F385A、F385C、F385D、F385P、F385R、およびF385Tから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、組換えリパーゼAは、配列番号94に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、3/4/96/296/300、3/292/296、4、4/11/149/292/296/300、4/96/149/231/296/300、4/96/149/292/296/300、4/96/219/296、4/96/231/296/300、4/96/292/296/300、4/149/174、4/174/219/292/296、4/231/296/300、27、27/34/82、27/73/82/218、27/89、27/89/178、27/89/218、27/218、34/73/218、34/82、34/218、73/82、73/82/183、94/146/175、96/149/174/292/296、96/149/231/292/296、96/149/292/296、96/174/219/231/292/296、96/231/296、146/175/189/281、149/174/292/296、149/174/300、149/219/231/292/296/300、149/231/292/296、149/231/292/296/300、149/296、149/296/300、174/231、174/296、218、231、231/292/296、231/292/296/300、231/296、231/300、292/296、292/296/300、296、および296/300から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号94を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、3S/4W/96E/296R/300D、3S/292L/296R、4W、4W/11A/149E/292L/296R/300D、4W/96E/149E/231E/296R/300D、4W/96E/149E/292L/296R/300D、4W/96E/219K/296R、4W/96E/231E/296R/300D、4W/96E/292L/296R/300D、4W/149E/174R、4W/174H/219K/292L/296R、4W/231E/296R/300D、27V、27V/34D/82E、27V/73I/82L/218I、27V/73I/82L/218M、27V/89T、27V/89T/178P、27V/89T/218I、27V/218I、34D/73I/218I、34D/82C、34D/218M、73I/82C、73I/82L/183L、94S/146F/175G、96E/149E/174H/292L/296R、96E/149E/231E/292L/296R、96E/149E/292L/296R、96E/174H/219K/231E/292L/296R、96E/231E/296R、146F/175G/189A/281K、149E/174H/292L/296R、149E/174H/300D、149E/219K/231E/292L/296R/300D、149E/231E/292L/296R、149E/231E/292L/296R/300D、149E/296R、149E/296R/300D、174H/296R、174R/231E、218I、231E、231E/292L/296R、231E/292L/296R/300D、231E/296R、231E/300D、292L/296R、292L/296R/300D、296R、および296R/300Dから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号94を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号94に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、T3S/S4W/I96E/S296R/Q300D、T3S/M292L/S296R、S4W、S4W/V11A/T149E/M292L/S296R/Q300D、S4W/I96E/T149E/Q231E/S296R/Q300D、S4W/I96E/T149E/M292L/S296R/Q300D、S4W/I96E/A219K/S296R、S4W/I96E/Q231E/S296R/Q300D、S4W/I96E/M292L/S296R/Q300D、S4W/T149E/E174R、S4W/E174H/A219K/M292L/S296R、S4W/Q231E/S296R/Q300D、Y27V、Y27V/K34D/K82E、Y27V/T73I/K82L/H218I、Y27V/T73I/K82L/H218M、Y27V/F89T、Y27V/F89T/S178P、Y27V/F89T/H218I、Y27V/H218I、K34D/T73I/H218I、K34D/K82C、K34D/H218M、T73I/K82C、T73I/K82L/F183L、P94S/P146F/Q175G、I96E/T149E/E174H/M292L/S296R、I96E/T149E/Q231E/M292L/S296R、I96E/T149E/M292L/S296R、I96E/E174H/A219K/Q231E/M292L/S296R、I96E/Q231E/S296R、P146F/Q175G/S189A/G281K、T149E/E174H/M292L/S296R、T149E/E174H/Q300D、T149E/A219K/Q231E/M292L/S296R/Q300D、T149E/Q231E/M292L/S296R、T149E/Q231E/M292L/S296R/Q300D、T149E/S296R、T149E/S296R/Q300D、E174H/S296R、E174R/Q231E、H218I、Q231E、Q231E/M292L/S296R、Q231E/M292L/S296R/Q300D、Q231E/S296R、Q231E/Q300D、M292L/S296R、M292L/S296R/Q300D、S296R、およびS296R/Q300Dから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号94を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号350に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、4、4/27/189/300、4/70、4/102、4/137、4/175/189/218、4/175/189/300、4/175/218/224、4/175/218/373、4/185、4/189/218/373、4/193、4/218/300/369/373、4/228、4/233、4/243、4/271、4/303、4/334、4/336、4/375、25、27/82/174/175/189/218/300/369/373、27/82/174/175/218/300/369、27/82/174/175/218/300/373/382、27/82/174/218/300/373、27/189/218/373、28、33、99、102、104、134、153、174/175/189、174/373、175/189/218/300/373、175/189/373、175/218、175/218/382、189/218/300/373、191、193、231、233、243、293、303、331、336、339、368、および373から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号350を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号350に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、4W、4W/27V/189A/300D、4W/70H、4W/102T、4W/137R、4W/175G/189A/218M、4W/175G/189A/300D、4W/175G/218M/224A、4W/175G/218M/373F、4W/185L、4W/189A/218M/373F、4W/193T、4W/218M/300D/369N/373F、4W/228E、4W/233R、4W/243R、4W/271D、4W/303P、4W/334T、4W/336S、4W/336T、4W/375A、25V、27V/82C/174H/175G/189A/218M/300D/369N/373F、27V/82C/174H/175G/218M/300D/369N、27V/82C/174H/175G/218M/300D/373F/382M、27V/82C/174H/218M/300D/373F、27V/189A/218M/373F、28N、33Y、99D、102L、104H、134R、153G、174H/175L/189A、174H/373F、175G/189A/218M/300D/373F、175G/218M、175G/218M/382M、175L/189A/373F、189A/218M/300D/373F、191L、193L、231Q、233G、233S、233W、243R、293R、303P、331R、336R、339K、368A、368T、および373Fから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号350を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号350に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、S4W、S4W/Y27V/S189A/Q300D、S4W/K70H、S4W/E102T、S4W/S137R、S4W/Q175G/S189A/H218M、S4W/Q175G/S189A/Q300D、S4W/Q175G/H218M/V224A、S4W/Q175G/H218M/Y373F、S4W/I185L、S4W/S189A/H218M/Y373F、S4W/Q193T、S4W/H218M/Q300D/S369N/Y373F、S4W/P228E、S4W/N233R、S4W/L243R、S4W/G271D、S4W/A303P、S4W/D334T、S4W/A336S、S4W/A336T、S4W/N375A、L25V、Y27V/K82C/E174H/Q175G/S189A/H218M/Q300D/S369N/Y373F、Y27V/K82C/E174H/Q175G/H218M/Q300D/S369N、Y27V/K82C/E174H/Q175G/H218M/Q300D/Y373F/H382M、Y27V/K82C/E174H/H218M/Q300D/Y373F、Y27V/S189A/H218M/Y373F、R28N、L33Y、Q99D、E102L、N104H、E134R、N153G、E174H/Q175L/S189A、E174H/Y373F、Q175G/S189A/H218M/Q300D/Y373F、Q175G/H218M、Q175G/H218M/H382M、Q175L/S189A/Y373F、S189A/H218M/Q300D/Y373F、A191L、Q193L、E231Q、N233G、N233S、N233W、L243R、Q293R、A303P、S331R、A336R、Q339K、F368A、F368T、およびY373Fから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号350を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、組換えリパーゼAは、配列番号442に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、26、33、33/174/193/243、33/174/334、33/175/218/303、33/175/218/334/339、33/193、34、38、46、48、70/271/293/334、144、174、174/175/193、174/175/218/339、174/193/303/375、174/193/375、174/218/233/271/293/303、174/218/271/303、175/193/218/233/243/375、175/193/218/243、175/218/375、181、189、193、193/218/243、193/271/303/334、193/293/303、194、195、199、210、218、218/243、218/243/303/334、218/303、225、238、274、281、および330から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号442を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号442に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、G26A、G26R、G26S、L33Y、L33Y/E174H/Q193L/L243R、L33Y/E174H/D334T、L33Y/L175G/H218M/A303P、L33Y/L175G/H218M/D334T/Q339K、L33Y/Q193L、K34L、F38A、F38G、R46P、Y48L、K70H/G271D/Q293R/D334T、I144L、E174H、E174H/L175G/Q193L、E174H/L175G/H218M/Q339K、E174H/Q193L/A303P/N375A、E174H/Q193L/N375A、E174H/H218M/N233R/G271D/Q293R/A303P、E174H/H218M/G271D/A303P、E174R、L175G/Q193L/H218M/N233R/L243R/N375A、L175G/Q193L/H218M/L243R、L175G/H218M/N375A、K181Q、A189H、Q193L、Q193L/H218M/L243R、Q193L/G271D/A303P/D334T、Q193L/Q293R/A303P、K194T、Q195I、Q195L、Q195Y、I199H、K210V、H218C、H218D、H218M、H218M/L243R、H218M/L243R/A303P/D334T、H218M/A303P、H218P、M225L、Y238W、T274D、G281K、G281P、N330F、およびN330Hから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号442を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、組換えリパーゼAは、配列番号540に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、34/38/174/193/195/243/281/303/330、34/38/174/225/303、34/38/174/303/345、34/174、34/174/193/195/243/281、34/174/193/195/303/330、34/193/195/225/243、34/193/243/303/330、34/281/330、38、38/174/193/195/243/330、38/174/193/225/274/283/303/330、38/174/193/303、38/174/195/281/330、38/174/225/243/281/330、38/174/281、38/174/281/303、38/174/281/303/345、38/193/195/225/303/345、38/195/243/303、38/195/281/303/330、38/195/281/330、38/195/303、49、49/51/98/252/311、49/51/123/252/344、49/98/120/252/344、49/120/252/344、49/123/252/344、49/123/264/344、49/123/311、49/252/344、49/311/344、49/344、51、51/252/344、51/344、98、98/344、123/252/344、129、160、161、174/193/195/225、174/193/303/330、174/195/225/281/303/330/345、174/195/243/281/345、174/195/281/303、174/225/243/281/303/345、174/281/330、174/303、195/225/303/330、252、268、および344から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号540を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号540に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、34L/38A/174G/193L/195L/243R/281P/303P/330F、34L/38A/174R/303P/345I、34L/38G/174R/225L/303P、34L/174G、34L/174G/193L/195L/243R/281P、34L/174H/193L/195I/303P/330F、34L/193L/195I/225L/243R、34L/193L/243R/303P/330F、34L/281P/330H、38A/174H/193L/225L/274D/283I/303P/330F、38A/174R/281K/303P/345I、38A/193L/195L/225L/303P/345I、38A/195I/303P、38A/195Y/281K/303P/330F、38G、38G/174G/193L/303P、38G/174G/281K/303P、38G/174H/195L/281P/330F、38G/174H/225L/243R/281K/330H、38G/174H/281K、38G/174R/193L/195L/243R/330H、38G/195I/281P/330F、38G/195Y/243R/303P、49S、49T、49T/51A/98P/252V/311W、49T/51A/123Q/252V/344H、49T/98P/120T/252V/344H、49T/120T/252V/344H、49T/123Q/252V/344H、49T/123Q/264S/344H、49T/123Q/311W、49T/252V/344H、49T/311W/344H、49T/344H、51A/252V/344H、51A/344H、51V、98P/344H、98R、123Q/252V/344H、129F、160T、161I、174G/195I/225L/281K/303P/330F/345I、174G/225L/243R/281P/303P/345I、174H/195I/243R/281K/345I、174H/281P/330H、174R/193L/195I/225L、174R/193L/303P/330H、174R/195I/281K/303P、174R/303P、195Y/225L/303P/330H、252V、268T、344I、344V、および344Wから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号540を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号540に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、K34L/F38A/E174G/Q193L/Q195L/L243R/G281P/A303P/N330F、K34L/F38A/E174R/A303P/F345I、K34L/F38G/E174R/M225L/A303P、K34L/E174G、K34L/E174G/Q193L/Q195L/L243R/G281P、K34L/E174H/Q193L/Q195I/A303P/N330F、K34L/Q193L/Q195I/M225L/L243R、K34L/Q193L/L243R/A303P/N330F、K34L/G281P/N330H、F38A/E174H/Q193L/M225L/T274D/M283I/A303P/N330F、F38A/E174R/G281K/A303P/F345I、F38A/Q193L/Q195L/M225L/A303P/F345I、F38A/Q195I/A303P、F38A/Q195Y/G281K/A303P/N330F、F38G、F38G/E174G/Q193L/A303P、F38G/E174G/G281K/A303P、F38G/E174H/Q195L/G281P/N330F、F38G/E174H/M225L/L243R/G281K/N330H、F38G/E174H/G281K、F38G/E174R/Q193L/Q195L/L243R/N330H、F38G/Q195I/G281P/N330F、F38G/Q195Y/L243R/A303P、V49S、V49T、V49T/T51A/G98P/M252V/L311W、V49T/T51A/E123Q/M252V/S344H、V49T/G98P/M120T/M252V/S344H、V49T/M120T/M252V/S344H、V49T/E123Q/M252V/S344H、V49T/E123Q/T264S/S344H、V49T/E123Q/L311W、V49T/M252V/S344H、V49T/L311W/S344H、V49T/S344H、T51A/M252V/S344H、T51A/S344H、T51V、G98P/S344H、G98R、E123Q/M252V/S344H、S129F、S160T、L161I、E174G/Q195I/M225L/G281K/A303P/N330F/F345I、E174G/M225L/L243R/G281P/A303P/F345I、E174H/Q195I/L243R/G281K/F345I、E174H/G281P/N330H、E174R/Q193L/Q195I/M225L、E174R/Q193L/A303P/N330H、E174R/Q195I/G281K/A303P、E174R/A303P、Q195Y/M225L/A303P/N330H、M252V、S268T、S344I、S344V、およびS344Wから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号540を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号646に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、11/16/67/168/180/287、11/16/237/241/287、11/67/168/287、16/67/154/168/237/241/287、16/67/237/287/291、16/168/177、24、24/278、34/49/161/193/243/344、34/49/161/193/344、34/49/161/243/344、34/49/161/252/268/344、34/49/193/243/252/344、34/49/193/344、34/49/243/252、34/49/252/268/344、34/161/193/243/252/268、34/161/193/243/268/344、34/161/193/243/344、34/161/193/252/268/344、34/161/193/252/344、34/161/193/268/344、34/161/243/281/344、34/161/344、34/193/243/252/344、34/193/252/268/344、34/193/268/281、34/252/268/281/344、34/252/344、49/161/193/243/252/344、49/161/193/252/281/344、49/161/243/252/344、49/193/197/243/252/281/344、49/193/243/252/344、49/193/243/344、49/243/344、67/154/237/287、67/168/237、67/168/237/287、67/177/237、154/237/286/287、154/286/287、161/193/252/344、161/193/344、161/344、168/237、186/187/278、193/243/281/344、193/252/268/344、193/252/281/344、237、237/287/291、および281/344から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号646を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号646に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、11I/16F/67A/168T/180V/287L、11I/16F/237Q/241S/287L、11I/67A/168T/287L、16F/67A/154Y/168T/237Q/241S/287L、16F/67A/237Q/287L/291A、16F/168T/177L、24M、24M/278L、34K/49T/161I/193L/243R/344H、34K/49T/161I/193L/243R/344V、34K/49T/161I/193L/344W、34K/49T/161I/243R/344H、34K/49T/161I/252V/268T/344V、34K/49T/193L/243R/252V/344W、34K/49T/193L/344H、34K/49T/193L/344W、34K/49T/243R/252V、34K/49T/252V/268T/344V、34K/161I/193L/243R/252V/268T、34K/161I/193L/243R/268T/344V、34K/161I/193L/243R/344W、34K/161I/193L/252V/268T/344H、34K/161I/193L/252V/268T/344V、34K/161I/193L/252V/344H、34K/161I/193L/252V/344V、34K/161I/193L/252V/344W、34K/161I/193L/268T/344H、34K/161I/243R/281P/344V、34K/161I/344V、34K/161I/344W、34K/193L/243R/252V/344W、34K/193L/252V/268T/344H、34K/193L/268T/281P、34K/252V/268T/281P/344V、34K/252V/344V、49T/161I/193L/243R/252V/344W、49T/161I/193L/252V/281P/344H、49T/161I/243R/252V/344V、49T/193L/197G/243R/252V/281P/344H、49T/193L/243R/252V/344V、49T/193L/243R/344W、49T/243R/344V、67A/154Y/237Q/287L、67A/168T/237Q、67A/168T/237Q/287L、67A/177L/237Q、154Y/237Q/286V/287L、154Y/286V/287L、161I/193L/252V/344V、161I/193L/344W、161I/344W、168T/237Q、186T/187A/278L、193L/243R/281P/344W、193L/252V/268T/344V、193L/252V/281P/344H、237Q、237Q/287L/291A、および281P/344Wから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号646を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号646に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、V11I/L16F/Y67A/S168T/I180V/F287L、V11I/L16F/A237Q/T241S/F287L、V11I/Y67A/S168T/F287L、L16F/Y67A/W154Y/S168T/A237Q/T241S/F287L、L16F/Y67A/A237Q/F287L/S291A、L16F/S168T/V177L、F24M、F24M/Y278L、L34K/V49T/L161I/Q193L/L243R/S344H、L34K/V49T/L161I/Q193L/L243R/S344V、L34K/V49T/L161I/Q193L/S344W、L34K/V49T/L161I/L243R/S344H、L34K/V49T/L161I/M252V/S268T/S344V、L34K/V49T/Q193L/L243R/M252V/S344W、L34K/V49T/Q193L/S344H、L34K/V49T/Q193L/S344W、L34K/V49T/L243R/M252V、L34K/V49T/M252V/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/L243R/M252V/S268T、L34K/L161I/Q193L/L243R/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/L243R/S344W、L34K/L161I/Q193L/M252V/S268T/S344H、L34K/L161I/Q193L/M252V/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344H、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344V、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344W、L34K/L161I/Q193L/S268T/S344H、L34K/L161I/L243R/G281P/S344V、L34K/L161I/S344V、L34K/L161I/S344W、L34K/Q193L/L243R/M252V/S344W、L34K/Q193L/M252V/S268T/S344H、L34K/Q193L/S268T/G281P、L34K/M252V/S268T/G281P/S344V、L34K/M252V/S344V、V49T/L161I/Q193L/L243R/M252V/S344W、V49T/L161I/Q193L/M252V/G281P/S344H、V49T/L161I/L243R/M252V/S344V、V49T/Q193L/S197G/L243R/M252V/G281P/S344H、V49T/Q193L/L243R/M252V/S344V、V49T/Q193L/L243R/S344W、V49T/L243R/S344V、Y67A/W154Y/A237Q/F287L、Y67A/S168T/A237Q、Y67A/S168T/A237Q/F287L、Y67A/V177L/A237Q、W154Y/A237Q/L286V/F287L、W154Y/L286V/F287L、L161I/Q193L/M252V/S344V、L161I/Q193L/S344W、L161I/S344W、S168T/A237Q、H186T/L187A/Y278L、Q193L/L243R/G281P/S344W、Q193L/M252V/S268T/S344V、Q193L/M252V/G281P/S344H、A237Q、A237Q/F287L/S291A、およびG281P/S344Wから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号646を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、組換えリパーゼAは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、24/168/252/281、24/237/287/344、24/252、24/252/287、24/344、213/252/278/344、252/278/344、252/287/344および281から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、24M/168T/252V/281P、24M/237Q/287L/344S、24M/252V、24M/252V/287L、24M/344W、213S/252V/278L/344S、252V/278L/344W、252V/287L/344Sおよび281Pから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、F24M/S168T/M252V/G281P、F24M/A237Q/F287L/H344S、F24M/M252V、F24M/M252V/F287L、F24M/H344W、P213S/M252V/Y278L/H344S、M252V/Y278L/H344W、M252V/F287L/H344SおよびG281Pから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。
いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、24、24/38/49/70/149/161/174/175/189/193/225/231/243/252/271/287/292/293/296/303/334/344/373/385、38、49、70、149、161、174、175、189、193、225、231、243、252、271、287、292、293、296、303、334、344、373および385から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、24A、24C、24D、24E、24F、24F/38F/49V/70K/149T/161L/174E/175Q/189S/193Q/225M/231Q/243L/252M/271G/287F/292M/293Q/296S/303A/334D/344S/373Y/385F、24G、24H、24I、24K、24L、24N、24P、24Q、24R、24S、24T、24V、24W、24Y、38A、38C、38D、38E、38F、38H、38I、38K、38L、38M、38N、38P、38Q、38R、38S、38T、38V、38W、38Y、49A、49C、49D、49E、49F、49G、49H、49I、49K、49L、49M、49N、49P、49Q、49R、49S、49V、49W、49Y、70A、70C、70D、70E、70F、70G、70I、70K、70L、70M、70N、70P、70Q、70R、70S、70T、70V、70W、70Y、149A、149C、149D、149F、149G、149H、149I、149K、149L、149M、149N、149P、149Q、149R、149S、149T、149V、149W、149Y、161A、161C、161D、161E、161F、161G、161H、161K、161L、161M、161N、161P、161Q、161R、161S、161T、161V、161W、161Y、174A、174C、174D、174E、174F、174G、174H、174I、174K、174L、174M、174N、174P、174Q、174S、174T、174V、174W、174Y、175A、175C、175D、175E、175F、175G、175H、175I、175K、175M、175N、175P、175Q、175R、175S、175T、175V、175W、175Y、189C、189D、189E、189F、189G、189H、189I、189K、189L、189M、189N、189P、189Q、189R、189S、189T、189V、189W、189Y、193A、193C、193D、193E、193F、193G、193H、193I、193K、193M、193N、193P、193Q、193R、193S、193T、193V、193W、193Y、225A、225C、225D、225E、225F、225G、225H、225I、225K、225M、225N、225P、225Q、225R、225S、225T、225V、225W、225Y、231A、231C、231D、231F、231G、231H、231I、231K、231L、231M、231N、231P、231Q、231R、231S、231T、231V、231W、231Y、243A、243C、243D、243E、243F、243G、243H、243I、243K、243L、243M、243N、243P、243Q、243S、243T、243V、243W、243Y、252A、252C、252D、252E、252F、252G、252H、252I、252K、252L、252M、252N、252P、252Q、252R、252S、252T、252W、252Y、271A、271C、271E、271F、271G、271H、271I、271K、271L、271M、271N、271P、271Q、271R、271S、271T、271V、271W、271Y、287A、287C、287D、287E、287F、287G、287H、287I、287K、287M、287N、287P、287Q、287R、287S、287T、287V、287W、287Y、292A、292C、292D、292E、292F、292G、292H、292I、292K、292M、292N、292P、292Q、292R、292S、292T、292V、292W、292Y、293A、293C、293D、293E、293F、293G、293H、293I、293K、293L、293M、293N、293P、293Q、293S、293T、293V、293W、293Y、296A、296C、296D、296E、296F、296G、296H、296I、296K、296L、296M、296N、296P、296Q、296S、296T、296V、296W、296Y、303A、303C、303D、303E、303F、303G、303H、303I、303K、303L、303M、303N、303Q、303R、303S、303T、303V、303W、303Y、334A、334C、334D、334E、334F、334G、334H、334I、334K、334L、334M、334N、334P、334Q、334R、334S、334V、334W、334Y、344A、344C、344D、344E、344F、344G、344I、344K、344L、344M、344N、344P、344Q、344R、344S、344T、344V、344W、344Y、373A、373C、373D、373E、373G、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373P、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、373Y、385A、385C、385D、385E、385F、385G、385H、385I、385K、385L、385M、385N、385Q、385R、385S、385T、385V、385W、および385Yから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、M24A、M24C、M24D、M24E、M24F、M24F/G38F/T49V/H70K/E149T/I161L/R174E/L175Q/A189S/L193Q/L225M/E231Q/R243L/V252M/D271G/L287F/L292M/R293Q/R296S/P303A/T334D/H344S/F373Y/P385F、M24G、M24H、M24I、M24K、M24L、M24N、M24P、M24Q、M24R、M24S、M24T、M24V、M24W、M24Y、G38A、G38C、G38D、G38E、G38F、G38H、G38I、G38K、G38L、G38M、G38N、G38P、G38Q、G38R、G38S、G38T、G38V、G38W、G38Y、T49A、T49C、T49D、T49E、T49F、T49G、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49P、T49Q、T49R、T49S、T49V、T49W、T49Y、H70A、H70C、H70D、H70E、H70F、H70G、H70I、H70K、H70L、H70M、H70N、H70P、H70Q、H70R、H70S、H70T、H70V、H70W、H70Y、E149A、E149C、E149D、E149F、E149G、E149H、E149I、E149K、E149L、E149M、E149N、E149P、E149Q、E149R、E149S、E149T、E149V、E149W、E149Y、I161A、I161C、I161D、I161E、I161F、I161G、I161H、I161K、I161L、I161M、I161N、I161P、I161Q、I161R、I161S、I161T、I161V、I161W、I161Y、R174A、R174C、R174D、R174E、R174F、R174G、R174H、R174I、R174K、R174L、R174M、R174N、R174P、R174Q、R174S、R174T、R174V、R174W、R174Y、L175A、L175C、L175D、L175E、L175F、L175G、L175H、L175I、L175K、L175M、L175N、L175P、L175Q、L175R、L175S、L175T、L175V、L175W、L175Y、A189C、A189D、A189E、A189F、A189G、A189H、A189I、A189K、A189L、A189M、A189N、A189P、A189Q、A189R、A189S、A189T、A189V、A189W、A189Y、L193A、L193C、L193D、L193E、L193F、L193G、L193H、L193I、L193K、L193M、L193N、L193P、L193Q、L193R、L193S、L193T、L193V、L193W、L193Y、L225A、L225C、L225D、L225E、L225F、L225G、L225H、L225I、L225K、L225M、L225N、L225P、L225Q、L225R、L225S、L225T、L225V、L225W、L225Y、E231A、E231C、E231D、E231F、E231G、E231H、E231I、E231K、E231L、E231M、E231N、E231P、E231Q、E231R、E231S、E231T、E231V、E231W、E231Y、R243A、R243C、R243D、R243E、R243F、R243G、R243H、R243I、R243K、R243L、R243M、R243N、R243P、R243Q、R243S、R243T、R243V、R243W、R243Y、V252A、V252C、V252D、V252E、V252F、V252G、V252H、V252I、V252K、V252L、V252M、V252N、V252P、V252Q、V252R、V252S、V252T、V252W、V252Y、D271A、D271C、D271E、D271F、D271G、D271H、D271I、D271K、D271L、D271M、D271N、D271P、D271Q、D271R、D271S、D271T、D271V、D271W、D271Y、L287A、L287C、L287D、L287E、L287F、L287G、L287H、L287I、L287K、L287M、L287N、L287P、L287Q、L287R、L287S、L287T、L287V、L287W、L287Y、L292A、L292C、L292D、L292E、L292F、L292G、L292H、L292I、L292K、L292M、L292N、L292P、L292Q、L292R、L292S、L292T、L292V、L292W、L292Y、R293A、R293C、R29
3D、R293E、R293F、R293G、R293H、R293I、R293K、R293L、R293M、R293N、R293P、R293Q、R293S、R293T、R293V、R293W、R293Y、R296A、R296C、R296D、R296E、R296F、R296G、R296H、R296I、R296K、R296L、R296M、R296N、R296P、R296Q、R296S、R296T、R296V、R296W、R296Y、P303A、P303C、P303D、P303E、P303F、P303G、P303H、P303I、P303K、P303L、P303M、P303N、P303Q、P303R、P303S、P303T、P303V、P303W、P303Y、T334A、T334C、T334D、T334E、T334F、T334G、T334H、T334I、T334K、T334L、T334M、T334N、T334P、T334Q、T334R、T334S、T334V、T334W、T334Y、H344A、H344C、H344D、H344E、H344F、H344G、H344I、H344K、H344L、H344M、H344N、H344P、H344Q、H344R、H344S、H344T、H344V、H344W、H344Y、F373A、F373C、F373D、F373E、F373G、F373H、F373I、F373K、F373L、F373M、F373N、F373P、F373Q、F373R、F373S、F373T、F373V、F373W、F373Y、P385A、P385C、P385D、P385E、P385F、P385G、P385H、P385I、P385K、P385L、P385M、P385N、P385Q、P385R、P385S、P385T、P385V、P385W、およびP385Yから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。
3D、R293E、R293F、R293G、R293H、R293I、R293K、R293L、R293M、R293N、R293P、R293Q、R293S、R293T、R293V、R293W、R293Y、R296A、R296C、R296D、R296E、R296F、R296G、R296H、R296I、R296K、R296L、R296M、R296N、R296P、R296Q、R296S、R296T、R296V、R296W、R296Y、P303A、P303C、P303D、P303E、P303F、P303G、P303H、P303I、P303K、P303L、P303M、P303N、P303Q、P303R、P303S、P303T、P303V、P303W、P303Y、T334A、T334C、T334D、T334E、T334F、T334G、T334H、T334I、T334K、T334L、T334M、T334N、T334P、T334Q、T334R、T334S、T334V、T334W、T334Y、H344A、H344C、H344D、H344E、H344F、H344G、H344I、H344K、H344L、H344M、H344N、H344P、H344Q、H344R、H344S、H344T、H344V、H344W、H344Y、F373A、F373C、F373D、F373E、F373G、F373H、F373I、F373K、F373L、F373M、F373N、F373P、F373Q、F373R、F373S、F373T、F373V、F373W、F373Y、P385A、P385C、P385D、P385E、P385F、P385G、P385H、P385I、P385K、P385L、P385M、P385N、P385Q、P385R、P385S、P385T、P385V、P385W、およびP385Yから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼ、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、組換えリパーゼポリペプチド配列は、配列番号14~1796の偶数番号の配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、本発明によって包含される操作されたリパーゼポリペプチドの機能的断片を含む。機能的断片は、機能的断片が由来する操作されたリパーゼポリペプチド(すなわち、親の操作されたリパーゼ)の活性の少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%を有する。いくつかの実施形態において、機能的断片は、操作されたリパーゼの親配列の少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%およびさらには99%を含む。いくつかの実施形態において、機能的断片は、5未満、10未満、15未満、10未満、25未満、30未満、35未満、40未満、45未満および50未満のアミノ酸が切断されている。
操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞:
本発明は、本明細書に記載の操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製するために、遺伝子発現を制御する1またはそれを超える異種調節配列に機能的に連結される。対応するリパーゼポリペプチドを発現させるために、操作されたリパーゼポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞中に導入することができる。
本発明は、本明細書に記載の操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製するために、遺伝子発現を制御する1またはそれを超える異種調節配列に機能的に連結される。対応するリパーゼポリペプチドを発現させるために、操作されたリパーゼポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞中に導入することができる。
当業者に明らかなように、タンパク質配列の利用可能性および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識は、本ポリペプチドをコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの記述を提供する。同じアミノ酸が代替的または同義的コドンによってコードされる遺伝暗号の縮重は、非常に多数の核酸を作製することを可能にし、それらの全てが操作されたリパーゼポリペプチドをコードする。したがって、具体的なアミノ酸配列の知識を有せば、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させないように1またはそれを超えるコドンの配列を単に改変することによって任意の数の異なる核酸を作製することができるであろう。これに関して、本発明は、可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって本明細書に記載されているポリペプチドをコードするように作製され得るポリヌクレオチドのありとあらゆる可能な変形を特に企図しており、このようなすべての変形は、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および5-1に提供される改変体を含む、本明細書に記載されている任意のポリペプチドについて具体的に開示されていると見なされるべきである。
様々な実施形態において、コドンは、好ましくは、その中でタンパク質が産生されている宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌における発現のために使用され、一方、真菌において使用される好ましいコドンは、真菌における発現のために使用される。その結果、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドは、完全長コード領域のコドン位置の約40%、50%、60%、70%、80%、または90%超に好ましいコドンを含有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号1、93、349、441、539、645、757および/または867に対して少なくとも約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号1、93、349、441、539、645、757および/または867に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号13~1795の奇数番号の配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、2、3、4、22、27/46/97/136/149/385、27/46/385、27/70/136/231/385、27/136/323/385、27/149、27/149/385、27/385、34、38、41、44、46/70、46/149/183/231/385、48、70、73、73/305、82、82/94/101/194/199、82/94/199、83、85、87、89、92、94、96、97/149/385、135、136/385、140、141、142、144、146、149、149/231/385、151、174、175、178、181、183/385、189、194、194/199、195、195/231/385、199、199/213、210、212、213、213/330、216、218、219、226、231/385、238、247、250、270、274、281、292、296、300、308、330、338、379、および385から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、2H、2M、2T、3A、3G、3R、3S、4M、4W、4Y、22N、27V/46T/97A/136V/149E/385P、27V/46T/385P、27V/70N/136V/231E/385P、27V/136V/323I/385P、27V/149E、27V/149E/385P、27V/385P、34D、38A、38H、38L、41V、44E、46T/70N、46T/149E/183L/231E/385P、48V、70N、73C/305I、73I、73R、82C、82E、82E/94S/101S/194N/199L、82E/94S/199L、82F、82G、82L、83G、83K、85I、85W、87R、89A、89T、89V、89W、92A、94S、96E、96N、96S、97A/149E/385P、135G、135Q、135S、135T、135V、136V/385P、140T、141A、141F、141L、141S、142A、142F、142I、142L、144M、144R、144W、146A、146F、146S、146Y、149E、149E/231E/385P、149K、149R、151A、151I、151L、174H、174R、175G、175L、175R、178R、178T、181H、183L/385P、189A、189E、189W、194N、194N/199L、194T、195D/231E/385P、195V、199L、199L/213A、210A、210V、212C、212G、212R、212T、213A/330T、213H、216R、216T、216W、218D、218G、218I、218M、218T、219C、219G、219K、219R、226R、231E/385P、238S、247R、250T、270V、274D、281K、281R、292A、292C、292L、292V、296M、296R、300A、300D、300T、308A、330Y、338N、379T、385A、385C、385D、385P、385R、および385Tから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、E2H、E2M、E2T、T3A、T3G、T3R、T3S、S4M、S4W、S4Y、G22N、Y27V/R46T/Y97A/Y136V/T149E/F385P、Y27V/R46T/F385P、Y27V/K70N/Y136V/Q231E/F385P、Y27V/Y136V/K323I/F385P、Y27V/T149E、Y27V/T149E/F385P、Y27V/F385P、K34D、F38A、F38H、F38L、N41V、G44E、R46T/K70N、R46T/T149E/F183L/Q231E/F385P、Y48V、K70N、T73C/V305I、T73I、T73R、K82C、K82E、K82E/P94S/D101S/K194N/I199L、K82E/P94S/I199L、K82F、K82G、K82L、E83G、E83K、G85I、G85W、A87R、F89A、F89T、F89V、F89W、T92A、P94S、I96E、I96N、I96S、Y97A/T149E/F385P、Y135G、Y135Q、Y135S、Y135T、Y135V、Y136V/F385P、P140T、E141A、E141F、E141L、E141S、E142A、E142F、E142I、E142L、I144M、I144R、I144W、P146A、P146F、P146S、P146Y、T149E、T149E/Q231E/F385P、T149K、T149R、G151A、G151I、G151L、E174H、E174R、Q175G、Q175L、Q175R、S178R、S178T、K181H、F183L/F385P、S189A、S189E、S189W、K194N、K194N/I199L、K194T、Q195D/Q231E/F385P、Q195V、I199L、I199L/P213A、K210A、K210V、Q212C、Q212G、Q212R、Q212T、P213A/N330T、P213H、S216R、S216T、S216W、H218D、H218G、H218I、H218M、H218T、A219C、A219G、A219K、A219R、T226R、Q231E/F385P、Y238S、E247R、Q250T、R270V、T274D、G281K、G281R、M292A、M292C、M292L、M292V、S296M、S296R、Q300A、Q300D、Q300T、R308A、N330Y、K338N、N379T、F385A、F385C、F385D、F385P、F385R、およびF385Tから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号94に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、3/4/96/296/300、3/292/296、4、4/11/149/292/296/300、4/96/149/231/296/300、4/96/149/292/296/300、4/96/219/296、4/96/231/296/300、4/96/292/296/300、4/149/174、4/174/219/292/296、4/231/296/300、27、27/34/82、27/73/82/218、27/89、27/89/178、27/89/218、27/218、34/73/218、34/82、34/218、73/82、73/82/183、94/146/175、96/149/174/292/296、96/149/231/292/296、96/149/292/296、96/174/219/231/292/296、96/231/296、146/175/189/281、149/174/292/296、149/174/300、149/219/231/292/296/300、149/231/292/296、149/231/292/296/300、149/296、149/296/300、174/231、174/296、218、231、231/292/296、231/292/296/300、231/296、231/300、292/296、292/296/300、296、および296/300から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号94を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号94に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、3S/4W/96E/296R/300D、3S/292L/296R、4W、4W/11A/149E/292L/296R/300D、4W/96E/149E/231E/296R/300D、4W/96E/149E/292L/296R/300D、4W/96E/219K/296R、4W/96E/231E/296R/300D、4W/96E/292L/296R/300D、4W/149E/174R、4W/174H/219K/292L/296R、4W/231E/296R/300D、27V、27V/34D/82E、27V/73I/82L/218I、27V/73I/82L/218M、27V/89T、27V/89T/178P、27V/89T/218I、27V/218I、34D/73I/218I、34D/82C、34D/218M、73I/82C、73I/82L/183L、94S/146F/175G、96E/149E/174H/292L/296R、96E/149E/231E/292L/296R、96E/149E/292L/296R、96E/174H/219K/231E/292L/296R、96E/231E/296R、146F/175G/189A/281K、149E/174H/292L/296R、149E/174H/300D、149E/219K/231E/292L/296R/300D、149E/231E/292L/296R、149E/231E/292L/296R/300D、149E/296R、149E/296R/300D、174H/296R、174R/231E、218I、231E、231E/292L/296R、231E/292L/296R/300D、231E/296R、231E/300D、292L/296R、292L/296R/300D、296R、および296R/300Dから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号94を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号94に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、T3S/S4W/I96E/S296R/Q300D、T3S/M292L/S296R、S4W、S4W/V11A/T149E/M292L/S296R/Q300D、S4W/I96E/T149E/Q231E/S296R/Q300D、S4W/I96E/T149E/M292L/S296R/Q300D、S4W/I96E/A219K/S296R、S4W/I96E/Q231E/S296R/Q300D、S4W/I96E/M292L/S296R/Q300D、S4W/T149E/E174R、S4W/E174H/A219K/M292L/S296R、S4W/Q231E/S296R/Q300D、Y27V、Y27V/K34D/K82E、Y27V/T73I/K82L/H218I、Y27V/T73I/K82L/H218M、Y27V/F89T、Y27V/F89T/S178P、Y27V/F89T/H218I、Y27V/H218I、K34D/T73I/H218I、K34D/K82C、K34D/H218M、T73I/K82C、T73I/K82L/F183L、P94S/P146F/Q175G、I96E/T149E/E174H/M292L/S296R、I96E/T149E/Q231E/M292L/S296R、I96E/T149E/M292L/S296R、I96E/E174H/A219K/Q231E/M292L/S296R、I96E/Q231E/S296R、P146F/Q175G/S189A/G281K、T149E/E174H/M292L/S296R、T149E/E174H/Q300D、T149E/A219K/Q231E/M292L/S296R/Q300D、T149E/Q231E/M292L/S296R、T149E/Q231E/M292L/S296R/Q300D、T149E/S296R、T149E/S296R/Q300D、E174H/S296R、E174R/Q231E、H218I、Q231E、Q231E/M292L/S296R、Q231E/M292L/S296R/Q300D、Q231E/S296R、Q231E/Q300D、M292L/S296R、M292L/S296R/Q300D、S296R、およびS296R/Q300Dから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号94を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号350に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、4、4/27/189/300、4/70、4/102、4/137、4/175/189/218、4/175/189/300、4/175/218/224、4/175/218/373、4/185、4/189/218/373、4/193、4/218/300/369/373、4/228、4/233、4/243、4/271、4/303、4/334、4/336、4/375、25、27/82/174/175/189/218/300/369/373、27/82/174/175/218/300/369、27/82/174/175/218/300/373/382、27/82/174/218/300/373、27/189/218/373、28、33、99、102、104、134、153、174/175/189、174/373、175/189/218/300/373、175/189/373、175/218、175/218/382、189/218/300/373、191、193、231、233、243、293、303、331、336、339、368、および373から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号350を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号350に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、4W、4W/27V/189A/300D、4W/70H、4W/102T、4W/137R、4W/175G/189A/218M、4W/175G/189A/300D、4W/175G/218M/224A、4W/175G/218M/373F、4W/185L、4W/189A/218M/373F、4W/193T、4W/218M/300D/369N/373F、4W/228E、4W/233R、4W/243R、4W/271D、4W/303P、4W/334T、4W/336S、4W/336T、4W/375A、25V、27V/82C/174H/175G/189A/218M/300D/369N/373F、27V/82C/174H/175G/218M/300D/369N、27V/82C/174H/175G/218M/300D/373F/382M、27V/82C/174H/218M/300D/373F、27V/189A/218M/373F、28N、33Y、99D、102L、104H、134R、153G、174H/175L/189A、174H/373F、175G/189A/218M/300D/373F、175G/218M、175G/218M/382M、175L/189A/373F、189A/218M/300D/373F、191L、193L、231Q、233G、233S、233W、243R、293R、303P、331R、336R、339K、368A、368T、および373Fから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号350を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号350に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、S4W、S4W/Y27V/S189A/Q300D、S4W/K70H、S4W/E102T、S4W/S137R、S4W/Q175G/S189A/H218M、S4W/Q175G/S189A/Q300D、S4W/Q175G/H218M/V224A、S4W/Q175G/H218M/Y373F、S4W/I185L、S4W/S189A/H218M/Y373F、S4W/Q193T、S4W/H218M/Q300D/S369N/Y373F、S4W/P228E、S4W/N233R、S4W/L243R、S4W/G271D、S4W/A303P、S4W/D334T、S4W/A336S、S4W/A336T、S4W/N375A、L25V、Y27V/K82C/E174H/Q175G/S189A/H218M/Q300D/S369N/Y373F、Y27V/K82C/E174H/Q175G/H218M/Q300D/S369N、Y27V/K82C/E174H/Q175G/H218M/Q300D/Y373F/H382M、Y27V/K82C/E174H/H218M/Q300D/Y373F、Y27V/S189A/H218M/Y373F、R28N、L33Y、Q99D、E102L、N104H、E134R、N153G、E174H/Q175L/S189A、E174H/Y373F、Q175G/S189A/H218M/Q300D/Y373F、Q175G/H218M、Q175G/H218M/H382M、Q175L/S189A/Y373F、S189A/H218M/Q300D/Y373F、A191L、Q193L、E231Q、N233G、N233S、N233W、L243R、Q293R、A303P、S331R、A336R、Q339K、F368A、F368T、およびY373Fから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号350を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号442に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、26、33、33/174/193/243、33/174/334、33/175/218/303、33/175/218/334/339、33/193、34、38、46、48、70/271/293/334、144、174、174/175/193、174/175/218/339、174/193/303/375、174/193/375、174/218/233/271/293/303、174/218/271/303、175/193/218/233/243/375、175/193/218/243、175/218/375、181、189、193、193/218/243、193/271/303/334、193/293/303、194、195、199、210、218、218/243、218/243/303/334、218/303、225、238、274、281、および330から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号442を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号442に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、G26A、G26R、G26S、L33Y、L33Y/E174H/Q193L/L243R、L33Y/E174H/D334T、L33Y/L175G/H218M/A303P、L33Y/L175G/H218M/D334T/Q339K、L33Y/Q193L、K34L、F38A、F38G、R46P、Y48L、K70H/G271D/Q293R/D334T、I144L、E174H、E174H/L175G/Q193L、E174H/L175G/H218M/Q339K、E174H/Q193L/A303P/N375A、E174H/Q193L/N375A、E174H/H218M/N233R/G271D/Q293R/A303P、E174H/H218M/G271D/A303P、E174R、L175G/Q193L/H218M/N233R/L243R/N375A、L175G/Q193L/H218M/L243R、L175G/H218M/N375A、K181Q、A189H、Q193L、Q193L/H218M/L243R、Q193L/G271D/A303P/D334T、Q193L/Q293R/A303P、K194T、Q195I、Q195L、Q195Y、I199H、K210V、H218C、H218D、H218M、H218M/L243R、H218M/L243R/A303P/D334T、H218M/A303P、H218P、M225L、Y238W、T274D、G281K、G281P、N330F、およびN330Hから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号442を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号442に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、G26A、G26R、G26S、L33Y、L33Y/E174H/Q193L/L243R、L33Y/E174H/D334T、L33Y/L175G/H218M/A303P、L33Y/L175G/H218M/D334T/Q339K、L33Y/Q193L、K34L、F38A、F38G、R46P、Y48L、K70H/G271D/Q293R/D334T、I144L、E174H、E174H/L175G/Q193L、E174H/L175G/H218M/Q339K、E174H/Q193L/A303P/N375A、E174H/Q193L/N375A、E174H/H218M/N233R/G271D/Q293R/A303P、E174H/H218M/G271D/A303P、E174R、L175G/Q193L/H218M/N233R/L243R/N375A、L175G/Q193L/H218M/L243R、L175G/H218M/N375A、K181Q、A189H、Q193L、Q193L/H218M/L243R、Q193L/G271D/A303P/D334T、Q193L/Q293R/A303P、K194T、Q195I、Q195L、Q195Y、I199H、K210V、H218C、H218D、H218M、H218M/L243R、H218M/L243R/A303P/D334T、H218M/A303P、H218P、M225L、Y238W、T274D、G281K、G281P、N330F、およびN330Hから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号442を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号540に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、34/38/174/193/195/243/281/303/330、34/38/174/225/303、34/38/174/303/345、34/174、34/174/193/195/243/281、34/174/193/195/303/330、34/193/195/225/243、34/193/243/303/330、34/281/330、38、38/174/193/195/243/330、38/174/193/225/274/283/303/330、38/174/193/303、38/174/195/281/330、38/174/225/243/281/330、38/174/281、38/174/281/303、38/174/281/303/345、38/193/195/225/303/345、38/195/243/303、38/195/281/303/330、38/195/281/330、38/195/303、49、49/51/98/252/311、49/51/123/252/344、49/98/120/252/344、49/120/252/344、49/123/252/344、49/123/264/344、49/123/311、49/252/344、49/311/344、49/344、51、51/252/344、51/344、98、98/344、123/252/344、129、160、161、174/193/195/225、174/193/303/330、174/195/225/281/303/330/345、174/195/243/281/345、174/195/281/303、174/225/243/281/303/345、174/281/330、174/303、195/225/303/330、252、268および344から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号540を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号540に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、34L/38A/174G/193L/195L/243R/281P/303P/330F、34L/38A/174R/303P/345I、34L/38G/174R/225L/303P、34L/174G、34L/174G/193L/195L/243R/281P、34L/174H/193L/195I/303P/330F、34L/193L/195I/225L/243R、34L/193L/243R/303P/330F、34L/281P/330H、38A/174H/193L/225L/274D/283I/303P/330F、38A/174R/281K/303P/345I、38A/193L/195L/225L/303P/345I、38A/195I/303P、38A/195Y/281K/303P/330F、38G、38G/174G/193L/303P、38G/174G/281K/303P、38G/174H/195L/281P/330F、38G/174H/225L/243R/281K/330H、38G/174H/281K、38G/174R/193L/195L/243R/330H、38G/195I/281P/330F、38G/195Y/243R/303P、49S、49T、49T/51A/98P/252V/311W、49T/51A/123Q/252V/344H、49T/98P/120T/252V/344H、49T/120T/252V/344H、49T/123Q/252V/344H、49T/123Q/264S/344H、49T/123Q/311W、49T/252V/344H、49T/311W/344H、49T/344H、51A/252V/344H、51A/344H、51V、98P/344H、98R、123Q/252V/344H、129F、160T、161I、174G/195I/225L/281K/303P/330F/345I、174G/225L/243R/281P/303P/345I、174H/195I/243R/281K/345I、174H/281P/330H、174R/193L/195I/225L、174R/193L/303P/330H、174R/195I/281K/303P、174R/303P、195Y/225L/303P/330H、252V、268T、344I、344V、および344Wから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号540を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号540に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、K34L/F38A/E174G/Q193L/Q195L/L243R/G281P/A303P/N330F、K34L/F38A/E174R/A303P/F345I、K34L/F38G/E174R/M225L/A303P、K34L/E174G、K34L/E174G/Q193L/Q195L/L243R/G281P、K34L/E174H/Q193L/Q195I/A303P/N330F、K34L/Q193L/Q195I/M225L/L243R、K34L/Q193L/L243R/A303P/N330F、K34L/G281P/N330H、F38A/E174H/Q193L/M225L/T274D/M283I/A303P/N330F、F38A/E174R/G281K/A303P/F345I、F38A/Q193L/Q195L/M225L/A303P/F345I、F38A/Q195I/A303P、F38A/Q195Y/G281K/A303P/N330F、F38G、F38G/E174G/Q193L/A303P、F38G/E174G/G281K/A303P、F38G/E174H/Q195L/G281P/N330F、F38G/E174H/M225L/L243R/G281K/N330H、F38G/E174H/G281K、F38G/E174R/Q193L/Q195L/L243R/N330H、F38G/Q195I/G281P/N330F、F38G/Q195Y/L243R/A303P、V49S、V49T、V49T/T51A/G98P/M252V/L311W、V49T/T51A/E123Q/M252V/S344H、V49T/G98P/M120T/M252V/S344H、V49T/M120T/M252V/S344H、V49T/E123Q/M252V/S344H、V49T/E123Q/T264S/S344H、V49T/E123Q/L311W、V49T/M252V/S344H、V49T/L311W/S344H、V49T/S344H、T51A/M252V/S344H、T51A/S344H、T51V、G98P/S344H、G98R、E123Q/M252V/S344H、S129F、S160T、L161I、E174G/Q195I/M225L/G281K/A303P/N330F/F345I、E174G/M225L/L243R/G281P/A303P/F345I、E174H/Q195I/L243R/G281K/F345I、E174H/G281P/N330H、E174R/Q193L/Q195I/M225L、E174R/Q193L/A303P/N330H、E174R/Q195I/G281K/A303P、E174R/A303P、Q195Y/M225L/A303P/N330H、M252V、S268T、S344I、S344V、およびS344Wから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号540を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号646に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、11/16/67/168/180/287、11/16/237/241/287、11/67/168/287、16/67/154/168/237/241/287、16/67/237/287/291、16/168/177、24、24/278、34/49/161/193/243/344、34/49/161/193/344、34/49/161/243/344、34/49/161/252/268/344、34/49/193/243/252/344、34/49/193/344、34/49/243/252、34/49/252/268/344、34/161/193/243/252/268、34/161/193/243/268/344、34/161/193/243/344、34/161/193/252/268/344、34/161/193/252/344、34/161/193/268/344、34/161/243/281/344、34/161/344、34/193/243/252/344、34/193/252/268/344、34/193/268/281、34/252/268/281/344、34/252/344、49/161/193/243/252/344、49/161/193/252/281/344、49/161/243/252/344、49/193/197/243/252/281/344、49/193/243/252/344、49/193/243/344、49/243/344、67/154/237/287、67/168/237、67/168/237/287、67/177/237、154/237/286/287、154/286/287、161/193/252/344、161/193/344、161/344、168/237、186/187/278、193/243/281/344、193/252/268/344、193/252/281/344、237、237/287/291、および281/344から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号646を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号646に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、11I/16F/67A/168T/180V/287L、11I/16F/237Q/241S/287L、11I/67A/168T/287L、16F/67A/154Y/168T/237Q/241S/287L、16F/67A/237Q/287L/291A、16F/168T/177L、24M、24M/278L、34K/49T/161I/193L/243R/344H、34K/49T/161I/193L/243R/344V、34K/49T/161I/193L/344W、34K/49T/161I/243R/344H、34K/49T/161I/252V/268T/344V、34K/49T/193L/243R/252V/344W、34K/49T/193L/344H、34K/49T/193L/344W、34K/49T/243R/252V、34K/49T/252V/268T/344V、34K/161I/193L/243R/252V/268T、34K/161I/193L/243R/268T/344V、34K/161I/193L/243R/344W、34K/161I/193L/252V/268T/344H、34K/161I/193L/252V/268T/344V、34K/161I/193L/252V/344H、34K/161I/193L/252V/344V、34K/161I/193L/252V/344W、34K/161I/193L/268T/344H、34K/161I/243R/281P/344V、34K/161I/344V、34K/161I/344W、34K/193L/243R/252V/344W、34K/193L/252V/268T/344H、34K/193L/268T/281P、34K/252V/268T/281P/344V、34K/252V/344V、49T/161I/193L/243R/252V/344W、49T/161I/193L/252V/281P/344H、49T/161I/243R/252V/344V、49T/193L/197G/243R/252V/281P/344H、49T/193L/243R/252V/344V、49T/193L/243R/344W、49T/243R/344V、67A/154Y/237Q/287L、67A/168T/237Q、67A/168T/237Q/287L、67A/177L/237Q、154Y/237Q/286V/287L、154Y/286V/287L、161I/193L/252V/344V、161I/193L/344W、161I/344W、168T/237Q、186T/187A/278L、193L/243R/281P/344W、193L/252V/268T/344V、193L/252V/281P/344H、237Q、237Q/287L/291A、および281P/344Wから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号646を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号646に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、V11I/L16F/Y67A/S168T/I180V/F287L、V11I/L16F/A237Q/T241S/F287L、V11I/Y67A/S168T/F287L、L16F/Y67A/W154Y/S168T/A237Q/T241S/F287L、L16F/Y67A/A237Q/F287L/S291A、L16F/S168T/V177L、F24M、F24M/Y278L、L34K/V49T/L161I/Q193L/L243R/S344H、L34K/V49T/L161I/Q193L/L243R/S344V、L34K/V49T/L161I/Q193L/S344W、L34K/V49T/L161I/L243R/S344H、L34K/V49T/L161I/M252V/S268T/S344V、L34K/V49T/Q193L/L243R/M252V/S344W、L34K/V49T/Q193L/S344H、L34K/V49T/Q193L/S344W、L34K/V49T/L243R/M252V、L34K/V49T/M252V/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/L243R/M252V/S268T、L34K/L161I/Q193L/L243R/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/L243R/S344W、L34K/L161I/Q193L/M252V/S268T/S344H、L34K/L161I/Q193L/M252V/S268T/S344V、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344H、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344V、L34K/L161I/Q193L/M252V/S344W、L34K/L161I/Q193L/S268T/S344H、L34K/L161I/L243R/G281P/S344V、L34K/L161I/S344V、L34K/L161I/S344W、L34K/Q193L/L243R/M252V/S344W、L34K/Q193L/M252V/S268T/S344H、L34K/Q193L/S268T/G281P、L34K/M252V/S268T/G281P/S344V、L34K/M252V/S344V、V49T/L161I/Q193L/L243R/M252V/S344W、V49T/L161I/Q193L/M252V/G281P/S344H、V49T/L161I/L243R/M252V/S344V、V49T/Q193L/S197G/L243R/M252V/G281P/S344H、V49T/Q193L/L243R/M252V/S344V、V49T/Q193L/L243R/S344W、V49T/L243R/S344V、Y67A/W154Y/A237Q/F287L、Y67A/S168T/A237Q、Y67A/S168T/A237Q/F287L、Y67A/V177L/A237Q、W154Y/A237Q/L286V/F287L、W154Y/L286V/F287L、L161I/Q193L/M252V/S344V、L161I/Q193L/S344W、L161I/S344W、S168T/A237Q、H186T/L187A/Y278L、Q193L/L243R/G281P/S344W、Q193L/M252V/S268T/S344V、Q193L/M252V/G281P/S344H、A237Q、A237Q/F287L/S291A、およびG281P/S344Wから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号646を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、24/168/252/281、24/237/287/344、24/252、24/252/287、24/344、213/252/278/344、252/278/344、252/287/344および281から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、24M/168T/252V/281P、24M/237Q/287L/344S、24M/252V、24M/252V/287L、24M/344W、213S/252V/278L/344S、252V/278L/344W、252V/287L/344Sおよび281Pから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、F24M/S168T/M252V/G281P、F24M/A237Q/F287L/H344S、F24M/M252V、F24M/M252V/F287L、F24M/H344W、P213S/M252V/Y278L/H344S、M252V/Y278L/H344W、M252V/F287L/H344SおよびG281Pから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、24、24/38/49/70/149/161/174/175/189/193/225/231/243/252/271/287/292/293/296/303/334/344/373/385、38、49、70、149、161、174、175、189、193、225、231、243、252、271、287、292、293、296、303、334、344、373および385から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、24A、24C、24D、24E、24F、24F/38F/49V/70K/149T/161L/174E/175Q/189S/193Q/225M/231Q/243L/252M/271G/287F/292M/293Q/296S/303A/334D/344S/373Y/385F、24G、24H、24I、24K、24L、24N、24P、24Q、24R、24S、24T、24V、24W、24Y、38A、38C、38D、38E、38F、38H、38I、38K、38L、38M、38N、38P、38Q、38R、38S、38T、38V、38W、38Y、49A、49C、49D、49E、49F、49G、49H、49I、49K、49L、49M、49N、49P、49Q、49R、49S、49V、49W、49Y、70A、70C、70D、70E、70F、70G、70I、70K、70L、70M、70N、70P、70Q、70R、70S、70T、70V、70W、70Y、149A、149C、149D、149F、149G、149H、149I、149K、149L、149M、149N、149P、149Q、149R、149S、149T、149V、149W、149Y、161A、161C、161D、161E、161F、161G、161H、161K、161L、161M、161N、161P、161Q、161R、161S、161T、161V、161W、161Y、174A、174C、174D、174E、174F、174G、174H、174I、174K、174L、174M、174N、174P、174Q、174S、174T、174V、174W、174Y、175A、175C、175D、175E、175F、175G、175H、175I、175K、175M、175N、175P、175Q、175R、175S、175T、175V、175W、175Y、189C、189D、189E、189F、189G、189H、189I、189K、189L、189M、189N、189P、189Q、189R、189S、189T、189V、189W、189Y、193A、193C、193D、193E、193F、193G、193H、193I、193K、193M、193N、193P、193Q、193R、193S、193T、193V、193W、193Y、225A、225C、225D、225E、225F、225G、225H、225I、225K、225M、225N、225P、225Q、225R、225S、225T、225V、225W、225Y、231A、231C、231D、231F、231G、231H、231I、231K、231L、231M、231N、231P、231Q、231R、231S、231T、231V、231W、231Y、243A、243C、243D、243E、243F、243G、243H、243I、243K、243L、243M、243N、243P、243Q、243S、243T、243V、243W、243Y、252A、252C、252D、252E、252F、252G、252H、252I、252K、252L、252M、252N、252P、252Q、252R、252S、252T、252W、252Y、271A、271C、271E、271F、271G、271H、271I、271K、271L、271M、271N、271P、271Q、271R、271S、271T、271V、271W、271Y、287A、287C、287D、287E、287F、287G、287H、287I、287K、287M、287N、287P、287Q、287R、287S、287T、287V、287W、287Y、292A、292C、292D、292E、292F、292G、292H、292I、292K、292M、292N、292P、292Q、292R、292S、292T、292V、292W、292Y、293A、293C、293D、293E、293F、293G、293H、293I、293K、293L、293M、293N、293P、293Q、293S、293T、293V、293W、293Y、296A、296C、296D、296E、296F、296G、296H、296I、296K、296L、296M、296N、296P、296Q、296S、296T、296V、296W、296Y、303A、303C、303D、303E、303F、303G、303H、303I、303K、303L、303M、303N、303Q、303R、303S、303T、303V、303W、303Y、334A、334C、334D、334E、334F、334G、334H、334I、334K、334L、334M、334N、334P、334Q、334R、334S、334V、334W、334Y、344A、344C、344D、344E、344F、344G、344I、344K、344L、344M、344N、344P、344Q、344R、344S、344T、344V、344W、344Y、373A、373C、373D、373E、373G、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373P、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、373Y、385A、385C、385D、385E、385F、385G、385H、385I、385K、385L、385M、385N、385Q、385R、385S、385T、385V、385W、および385Y,から選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む組換えリパーゼをコードし、組換えリパーゼは、M24A、M24C、M24D、M24E、M24F、M24F/G38F/T49V/H70K/E149T/I161L/R174E/L175Q/A189S/L193Q/L225M/E231Q/R243L/V252M/D271G/L287F/L292M/R293Q/R296S/P303A/T334D/H344S/F373Y/P385F、M24G、M24H、M24I、M24K、M24L、M24N、M24P、M24Q、M24R、M24S、M24T、M24V、M24W、M24Y、G38A、G38C、G38D、G38E、G38F、G38H、G38I、G38K、G38L、G38M、G38N、G38P、G38Q、G38R、G38S、G38T、G38V、G38W、G38Y、T49A、T49C、T49D、T49E、T49F、T49G、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49P、T49Q、T49R、T49S、T49V、T49W、T49Y、H70A、H70C、H70D、H70E、H70F、H70G、H70I、H70K、H70L、H70M、H70N、H70P、H70Q、H70R、H70S、H70T、H70V、H70W、H70Y、E149A、E149C、E149D、E149F、E149G、E149H、E149I、E149K、E149L、E149M、E149N、E149P、E149Q、E149R、E149S、E149T、E149V、E149W、E149Y、I161A、I161C、I161D、I161E、I161F、I161G、I161H、I161K、I161L、I161M、I161N、I161P、I161Q、I161R、I161S、I161T、I161V、I161W、I161Y、R174A、R174C、R174D、R174E、R174F、R174G、R174H、R174I、R174K、R174L、R174M、R174N、R174P、R174Q、R174S、R174T、R174V、R174W、R174Y、L175A、L175C、L175D、L175E、L175F、L175G、L175H、L175I、L175K、L175M、L175N、L175P、L175Q、L175R、L175S、L175T、L175V、L175W、L175Y、A189C、A189D、A189E、A189F、A189G、A189H、A189I、A189K、A189L、A189M、A189N、A189P、A189Q、A189R、A189S、A189T、A189V、A189W、A189Y、L193A、L193C、L193D、L193E、L193F、L193G、L193H、L193I、L193K、L193M、L193N、L193P、L193Q、L193R、L193S、L193T、L193V、L193W、L193Y、L225A、L225C、L225D、L225E、L225F、L225G、L225H、L225I、L225K、L225M、L225N、L225P、L225Q、L225R、L225S、L225T、L225V、L225W、L225Y、E231A、E231C、E231D、E231F、E231G、E231H、E231I、E231K、E231L、E231M、E231N、E231P、E231Q、E231R、E231S、E231T、E231V、E231W、E231Y、R243A、R243C、R243D、R243E、R243F、R243G、R243H、R243I、R243K、R243L、R243M、R243N、R243P、R243Q、R243S、R243T、R243V、R243W、R243Y、V252A、V252C、V252D、V252E、V252F、V252G、V252H、V252I、V252K、V252L、V252M、V252N、V252P、V252Q、V252R、V252S、V252T、V252W、V252Y、D271A、D271C、D271E、D271F、D271G、D271H、D271I、D271K、D271L、D271M、D271N、D271P、D271Q、D271R、D271S、D271T、D271V、D271W、D271Y、L287A、L287C、L287D、L287E、L287F、L287G、L287H、L287I、L287K、L287M、L287N、L287P、L287Q、L287R、L287S、L287T、L287V、L287W、L287Y、L292A、L292C、L292D、L292E、L292F、L292G、L292H、L292I、L292K、L292M、L292N、L292P、L292Q、L292R、L292S、L292T、L292V
、L292W、L292Y、R293A、R293C、R293D、R293E、R293F、R293G、R293H、R293I、R293K、R293L、R293M、R293N、R293P、R293Q、R293S、R293T、R293V、R293W、R293Y、R296A、R296C、R296D、R296E、R296F、R296G、R296H、R296I、R296K、R296L、R296M、R296N、R296P、R296Q、R296S、R296T、R296V、R296W、R296Y、P303A、P303C、P303D、P303E、P303F、P303G、P303H、P303I、P303K、P303L、P303M、P303N、P303Q、P303R、P303S、P303T、P303V、P303W、P303Y、T334A、T334C、T334D、T334E、T334F、T334G、T334H、T334I、T334K、T334L、T334M、T334N、T334P、T334Q、T334R、T334S、T334V、T334W、T334Y、H344A、H344C、H344D、H344E、H344F、H344G、H344I、H344K、H344L、H344M、H344N、H344P、H344Q、H344R、H344S、H344T、H344V、H344W、H344Y、F373A、F373C、F373D、F373E、F373G、F373H、F373I、F373K、F373L、F373M、F373N、F373P、F373Q、F373R、F373S、F373T、F373V、F373W、F373Y、P385A、P385C、P385D、P385E、P385F、P385G、P385H、P385I、P385K、P385L、P385M、P385N、P385Q、P385R、P385S、P385T、P385V、P385W、およびP385Yから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。
、L292W、L292Y、R293A、R293C、R293D、R293E、R293F、R293G、R293H、R293I、R293K、R293L、R293M、R293N、R293P、R293Q、R293S、R293T、R293V、R293W、R293Y、R296A、R296C、R296D、R296E、R296F、R296G、R296H、R296I、R296K、R296L、R296M、R296N、R296P、R296Q、R296S、R296T、R296V、R296W、R296Y、P303A、P303C、P303D、P303E、P303F、P303G、P303H、P303I、P303K、P303L、P303M、P303N、P303Q、P303R、P303S、P303T、P303V、P303W、P303Y、T334A、T334C、T334D、T334E、T334F、T334G、T334H、T334I、T334K、T334L、T334M、T334N、T334P、T334Q、T334R、T334S、T334V、T334W、T334Y、H344A、H344C、H344D、H344E、H344F、H344G、H344I、H344K、H344L、H344M、H344N、H344P、H344Q、H344R、H344S、H344T、H344V、H344W、H344Y、F373A、F373C、F373D、F373E、F373G、F373H、F373I、F373K、F373L、F373M、F373N、F373P、F373Q、F373R、F373S、F373T、F373V、F373W、F373Y、P385A、P385C、P385D、P385E、P385F、P385G、P385H、P385I、P385K、P385L、P385M、P385N、P385Q、P385R、P385S、P385T、P385V、P385W、およびP385Yから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。
いくつかの実施形態において、上記のように、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている特性を有するリパーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、参照配列(例えば、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868)または表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/もしくは5-1に開示される任意の改変体のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える同一性と、配列番号2、94、350、442、540、646、758、および/もしくは868の参照ポリペプチドまたは前記表に開示される任意の改変体のアミノ酸配列と比較した1もしくはそれを超える残基差異(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれを超えるアミノ酸残基位置)とを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される特性を有するリパーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868のポリペプチドと最適に整列された場合に、参照配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性と、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/または5-1において提供される残基位置から選択される残基位置において、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868と比較した1またはそれを超える残基差異とを有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの追加の実施形態において、ポリヌクレオチドは、参照配列1、93、349、441、539、645、757および/または867に対して少なくとも約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。いくつかの追加の実施形態において、ポリヌクレオチドは、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/または5-1に提供される少なくとも1つのポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。いくつかの追加の実施形態において、ポリヌクレオチドは、参照配列1、93、349、441、539、645、757および/または867に対して少なくとも70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。いくつかの追加の実施形態において、ポリヌクレオチドは、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/または5-1に提供される少なくとも1つのポリヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号93、349、441、539、645、757および/または867のポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号1、93、349、441、539、645、757および/もしくは867、もしくはこれらの相補鎖(complement)、または本明細書に提供される改変体リパーゼポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列から選択される。いくつかの実施形態において、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/または5-1に記載される任意の位置から選択される残基位置に、配列番号1、93、349、441、539、645、757および/または867と比較して1またはそれを超える残基差異を有するアミノ酸配列を含むリパーゼポリペプチドをコードする。いくつかのさらなる実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/もしくは5-1に提供されるものから選択され、または配列番号1、93、349、441、539、645、757および/もしくは867から選択される参照配列と少なくとも70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの追加の実施形態において、ポリヌクレオチドは、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/もしくは5-1に提供される少なくとも1つのポリヌクレオチド配列ならびに/または配列番号1、93、349、441、539、645、757および/もしくは867に対して少なくとも70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。いくつかのさらなる実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド配列と比較して、1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~15、1~20、1~21、1~22、1~23、1~24、1~25、1~30、1~35、1~40、1~45または1~50個の塩基変化を含む。さらにいくつかの他の実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド配列と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、31、32、33、34、35、40、45または50個の塩基変化を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド配列と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24または25個の塩基変化を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される操作されたリパーゼポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、遺伝子の発現およびポリペプチドの産生を提供するために様々な方法で操作される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現を調節するために1またはそれを超える制御配列がその中に存在する発現ベクターとして提供される。発現ベクターに応じて、ベクター中へのその挿入前の単離されたポリヌクレオチドの操作(manipulation)が、望ましいまたは必要であり得る。組換えDNA法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技術は、当技術分野で周知である。
いくつかの実施形態において、制御配列としては、配列の中でも特に、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。当技術分野で公知のように、適切な制御配列は、使用される宿主細胞に基づいて選択することができる。本発明はいかなる特定の制御配列にも限定されることは意図されない。
細菌宿主細胞のための例示的なプロモーターには、Escherichia coliラクトースオペロン、トリプトファンオペロン、アラビノースオペロン、T7バクテリオファージ由来のT7プロモーターおよびSaccharopolyspora erythraeaエリスロマイシン耐性遺伝子の遺伝子から得られるプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターとしては、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Aspergillus niger中性α-アミラーゼ、Aspergillus niger酸安定性α-アミラーゼ、Aspergillus nigerまたはAspergillus awamoriグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiリパーゼ、Aspergillus oryzaeアルカリプロテアーゼ、Aspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼ、Aspergillus nidulansアセトアミダーゼ、およびFusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼ(例えば、国際公開第96/00787号を参照)の遺伝子から得られるプロモーターに加えて、NA2-tpiプロモーター(Aspergillus niger中性α-アミラーゼおよびAspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド)、ならびにこれらの変異体、切断型およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiaeガラクトキナーゼ(GAL1)、Saccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)およびSaccharomyces cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る、遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、当技術分野において公知である(例えば、Romanosら、Yeast 8:423-488[1992]を参照)。
哺乳動物細胞において使用するための例示的なプロモーターには、サイトメガロウイルス(CMV)、サル空胞形成ウイルス40(SV40)、Homo Sapiensホスホグリセリン酸キナーゼ、βアクチン、伸長因子-1aまたはグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、またはGallus gallus β-アクチン由来のものが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、制御配列は、適切な転写ターミネーター配列、すなわち、転写を終結させるために宿主細胞によって認識される配列である。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’末端に機能的に連結されている。選択された宿主細胞において機能的である任意のターミネーターが本発明において使用される。例えば、細菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、T7ターミネーターのためにT7細菌ファージ、またはEscherichia coliリボソームRNA、例えばrrnBターミネーターから得ることができる。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Aspergillus niger α-グルコシダーゼ、およびFusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ、Saccharomyces cerevisiaeチトクロムC(CYC1)およびSaccharomyces cerevisiaeグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当技術分野において公知である(例えば、Romanosら、前出を参照)。哺乳動物細胞のための例示的なターミネーターには、サイトメガロウイルス(CMV)、サル空胞形成ウイルス40(SV40)またはHomo sapiens成長ホルモン由来のものが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、制御配列は、適切なリーダー配列、宿主細胞による翻訳のために重要なmRNAの非翻訳領域である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の5’末端に機能的に連結されている。選択された宿主細胞において機能的である任意のリーダー配列が使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼおよびAspergillus nidulansトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞に適したリーダーとしては、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、Saccharomyces cerevisiae α-因子、およびSaccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)の遺伝子から得られるものが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、制御配列は、ポリアデニル化配列、すなわち、核酸配列の3’末端に機能的に連結された配列であって、転写されたときに、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列でもあり得る。選択された宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列が本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列には、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Fusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼおよびAspergillus niger α-グルコシダーゼの遺伝子由来のものが含まれるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞に有用なポリアデニル化配列も当技術分野において公知である(例えば、GuoおよびSherman、Mol.Cell.Biol.,15:5983-5990[1995]参照)。
いくつかの実施形態において、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に導くシグナルペプチドコード領域である。核酸配列のコード配列の5’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み枠中で天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を固有に含有し得る。あるいは、コード配列の5’末端は、コード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード領域を含有し得る。
発現されたポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に導く任意のシグナルペプチドコード領域が、本明細書において提供される操作されたリパーゼポリペプチドの発現のために使用される。糸状菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域には、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus niger中性アミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Humicola insolensセルラーゼおよびHumicola lanuginosaリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が含まれるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドとしては、Saccharomyces cerevisiae α-因子およびSaccharomyces cerevisiaeインベルターゼの遺伝子由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物宿主細胞に有用なシグナルペプチドには、免疫グロブリンガンマ(IgG)の遺伝子由来のものが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。得られたポリペプチドは、いくつかの事例では、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」または「チモーゲン」と呼ばれる)。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって成熟活性ポリペプチドに変換され得る。
別の局面において、本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、導入される宿主の種類に応じた、プロモーターおよびターミネーター、複製起点などの1またはそれを超える発現調節領域とを含む組換え発現ベクターも提供する。いくつかの実施形態において、1またはそれを超える都合のよい制限部位において改変体リパーゼポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にするための1またはそれを超える都合のよい制限部位を含む組換え発現ベクターを作製するために、上記の様々な核酸および制御配列は一緒に連結される。あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現される。発現ベクターの作製において、コード配列は、コード配列が発現のための適切な制御配列と機能的に連結されるようにベクター中で配置される。
組換え発現ベクターは、組換えDNA手順に都合よく供することができ、改変体リパーゼポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意のベクター(例えば、プラスミドまたはウイルス)であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞との、ベクターの適合性に依存する。ベクターは、直鎖または閉じた環状プラスミドであり得る。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、自律的に複製するベクター(すなわち、その複製が染色体の複製とは独立している染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体または人工染色体)である。ベクターは、自己複製を確保するための任意の手段を含有し得る。いくつかの代替的実施形態において、ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに、ゲノム中に組み込まれ、ベクターが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノム中に導入される全DNAを一緒に含有する2もしくはそれを超えるベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンが使用され得る。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする1またはそれを超える選択可能なマーカーを含有する。「選択可能なマーカー」は、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌宿主細胞に適したマーカーには、カルベニシリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシンおよびゼオシンが含まれるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞に適したマーカーとしては、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1およびURA3が挙げられるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞において使用するための選択可能なマーカーには、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pyrG(オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)、およびtrpC(アントラニル酸シンターゼ)ならびにこれらの等価物が含まれるが、これらに限定されない。別の局面では、本発明は、少なくとも1つの本出願の操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチドは、宿主細胞における操作されたリパーゼ酵素の発現のための1またはそれを超える制御配列に機能的に連結されている。
本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドを発現する上で使用するための宿主細胞は当技術分野において周知であり、細菌細胞(例えば、E.coli);真菌細胞、例えば、酵母細胞(例えば、Saccharomyces cerevisiaeおよびPichia pastoris[例えば、ATCCアクセッション番号201178]);昆虫細胞(例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9細胞)、植物細胞、動物細胞(例えば、CHO、COSおよびBHK)およびヒト細胞(例えば、HEK293T、ヒト線維芽細胞、THP-1、JurkatおよびBowes黒色腫細胞株)が含まれるが、これらに限定されない。
したがって、別の局面において、本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドを産生するための方法であって、ポリペプチドの発現に適した条件下で、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載されるように、リパーゼポリペプチドを単離および/または精製する工程をさらに含む。
上記宿主細胞のための適切な培養培地および増殖条件は、当技術分野において周知である。リパーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の様々な方法によって細胞中に導入され得る。技術としては、とりわけ、電気穿孔、微粒子銃(biolistic particle bombardment)、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が挙げられる。
本明細書に開示される特性を有する操作されたリパーゼは、天然に存在するまたは操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当技術分野で公知のおよび本明細書に記載されている変異誘発および/または定向進化法に供することによって得ることができる。例示的な定向進化技術は、変異誘発および/またはDNAシャッフリングである(例えば、Stemmer、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751[1994];国際公開第95/22625号;国際公開第97/0078号;国際公開第97/35966号;国際公開第98/27230号;国際公開第00/42651号;国際公開第01/75767号および米国特許第6,537,746号を参照)。使用され得る他の定向進化手順としては、とりわけ、スタッガード伸長プロセス(staggered extension process)(StEP)、インビトロ組換え(例えば、Zhaoら、Nat.Biotechnol.,16:258-261[1998])、変異誘発PCR(例えば、Caldwellら、PCR Methods Appl.,3:S136-S140[1994]参照)およびカセット変異誘発(例えば、Blackら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:3525-3529[1996]参照)が挙げられる。
組換えポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて作製することができる。関心対象の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、プラスミドなどのベクターにクローニングし、E.coliなどの所望の宿主中で発現させることができる。組換えポリペプチドの改変体は、当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。実際に、当業者に周知の多種多様な異なる変異誘発技術が存在する。さらに、変異誘発キットは、多くの市販の分子生物学供給業者からも入手可能である。規定のアミノ酸においての特異的置換(部位特異的)、遺伝子の局所領域での特異的もしくはランダムな変異(領域特異的)、または遺伝子全体にわたるランダム変異誘発(例えば、飽和変異誘発)を行うための方法が利用可能である。PCR、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンPCR、シャッフリング、および化学的飽和変異誘発を使用する一本鎖DNAまたは二本鎖DNAの部位特異的変異誘発、または当技術分野で公知の任意の他の適切な方法を含むがこれらに限定されない、酵素改変体を生成するための多数の適切な方法が当業者に公知である。変異誘発および定向進化法は、発現、スクリーニングおよびアッセイすることができる改変体ライブラリを生成するために、酵素をコードするポリヌクレオチドに対して容易に適用することができる。任意の適切な変異誘発および定向進化法が本発明において使用され、当技術分野で周知である(例えば、米国特許第5,605,793号、同第5,811,238号、同第5,830,721号、同第5,834,252号、同第5,837,458号、同第5,928,905号、同第6,096,548号、同第6,117,679号、同第6,132,970号、同第6,165,793号、同第6,180,406号、同第6,251,674号、同第6,265,201号、同第6,277,638号、同第6,287,861号、同第6,287,862号、同第6,291,242号、同第6,297,053号、同第6,303,344号、同第6,309,883号、同第6,319,713号、同第6,319,714号、同第6,323,030号、同第6,326,204号、同第6,335,160号、同第6,335,198号、同第6,344,356号、同第6,352,859号、同第6,355,484号、同第6,358,740号、同第6,358,742号、同第6,365,377号、同第6,365,408号、同第6,368,861号、同第6,372,497号、同第6,337,186号、同第6,376,246号、同第6,379,964号、同第6,387,702号、同第6,391,552号、同第6,391,640号、同第6,395,547号、同第6,406,855号、同第6,406,910号、同第6,413,745号、同第6,413,774号、同第6,420,175号、同第6,423,542号、同第6,426,224号、同第6,436,675号、同第6,444,468号、同第6,455,253号、同第6,479,652号、同第6,482,647号、同第6,483,011号、同第6,484,105号、同第6,489,146号、同第6,500,617号、同第6,500,639号、同第6,506,602号、同第6,506,603号、同第6,518,065号、同第6,519,065号、同第6,521,453号、同第6,528,311号、同第6,537,746号、同第6,573,098号、同第6,576,467号、同第6,579,678号、同第6,586,182号、同第6,602,986号、同第6,605,430号、同第6,613,514号、同第6,653,072号、同第6,686,515号、同第6,703,240号、同第6,716,631号、同第6,825,001号、同第6,902,922号、同第6,917,882号、同第6,946,296号、同第6,961,664号、同第6,995,017号、同第7,024,312号、同第7,058,515号、同第7,105,297号、同第7,148,054号、同第7,220,566号、同第7,288,375号、同第7,384,387号、同第7,421,347号、同第7,430,477号、同第7,462,469号、同第7,534,564号、同第7,620,500号、同第7,620,502号、同第7,629,170号、同第7,702,464号、同第7,747,391号、同第7,747,393号、同第7,751,986号、同第7,776,598号、同第7,783,428号、同第7,795,030号、同第7,853,410号、同第7,868,138号、同第7,783,428号、同第7,873,477号、同第7,873,499号、同第7,904,249号、同第7,957,912号、同第7,981,614号、同第8,014,961号、同第8,029,988号、同第8,048,674号、同第8,058,001号、同第8,076,138号、同第8,108,150号、同第8,170,806号、同第8,224,580号、同第8,377,681号、同第8,383,346号、同第8,457,903号、同第8,504,498号、同第8,589,085号、同第8,762,066号、同第8,768,871号、同第8,849,575号、同第9,593,326号、同第9,665,694号、同第9,684,771号、同第9,803,224号、同第9,864,833号、同第9.821,613号、同第9,996,661号、同第10,738,286号,および全ての関連米国ならびにPCTおよび非米国対応物;Lingら、Anal.Biochem.,254(2):157-78[1997];Daleら、Meth.Mol.Biol.57:369-74[1996];Smith,Ann.Rev.Genet.,19:423-462[1985];Botsteinら、Science,229:1193-1201[1985];Carter,Biochem.J.,237:1-7[1986];Kramerら、Cell,38:879-887[1984];Wellsら、Gene,34:315-323[1985];Minshullら、Curr.Op.Chem.Biol.3:284-290[1999];Christiansら、Nat.Biotechnol.,17:259-264[1999];Crameriら、Nature,391:288-291[1998];Crameriら、Nat.Biotechnol.,15:436-438[1997];Zhangら、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,94:4504-4509[1997];Crameriら、Nat.Biotechnol.,14:315-319[1996];Stemmer,Nature,370:389-391[1994];Stemmer、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:10747-10751[1994];国際公開第95/22625号;国際公開第97/0078号;国際公開第97/35966号;国際公開第98/27230号;国際公開第00/42651号;国際公開第01/75767号;および国際公開第2009/152336号を参照されたい、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる)。
いくつかの実施形態において、酵素改変体を規定の温度(またはその他のアッセイ条件)に供し、熱処理またはその他のアッセイ条件後に残存する酵素活性の量を測定することによって、変異誘発処理後に得られた酵素改変体はスクリーニングされる。次いで、リパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するDNAを宿主細胞から単離し、ヌクレオチド配列変化(もし存在すれば)を同定するために配列決定し、異なるまたは同じ宿主細胞中で酵素を発現させるために使用する。発現ライブラリからの酵素活性を測定することは、当技術分野で公知の任意の適切な方法(例えば、HPLC分析などの標準的な生化学技術)を用いて行うことができる。
既知の配列の操作されたポリペプチドの場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成方法に従って、標準的な固相法によって調製することができる。いくつかの実施形態において、最大約100塩基の断片を個々に合成し、次いで連結して(例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション法、またはポリメラーゼによって媒介される方法によって)、任意の所望の連続配列を形成することができる。古典的なホスホルアミダイト法は、典型的には、自動化された合成方法で実施されるので、例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、古典的なホスホルアミダイト法を用いた化学合成によって調製することができる(例えば、Beaucageら、Tetra.Lett.,22:1859-69[1981];およびMatthesら、EMBO J.,3:801-05[1984]を参照)。ホスホルアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは合成され(例えば、自動DNA合成装置で)、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされ、適切なベクターにクローニングされる。しかしながら、任意の適切な方法が本発明において使用されるので、本発明がポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの製造のための任意の特定の方法に限定されることは意図されていない。
したがって、いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/または5-1に提供される任意の改変体のアミノ酸配列ならびに配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することと、(b)前記ポリヌクレオチドによってコードされるリパーゼポリペプチドを発現させることと、を含むことができる。本方法のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、1つまたはいくつか(例えば、最大3、4、5、または最大10)のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~15、1~20、1~21、1~22、1~23、1~24、1~25、1~30、1~35、1~40、1~45、または1~50個のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24または25個のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または置換を含む。いくつかの実施形態において、置換は保存的置換および/または非保存的置換を含む。
発現された操作されたリパーゼポリペプチドは、本明細書に記載されているアッセイおよび条件を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の任意の適切なアッセイを使用して、任意の所望の改善された特性(例えば、活性、選択性、安定性、酸耐容性、プロテアーゼ感受性など)について評価することができる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞中で発現された操作されたリパーゼポリペプチドのいずれもが、とりわけリゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、熱処理、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含むタンパク質精製のための周知の技術の任意の1またはそれより多くを使用して、細胞および/または培養培地から回収される。
リパーゼポリペプチドを単離するためのクロマトグラフィー技術としては、とりわけ、逆相クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、部分的には、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの要因に依存し、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、改善された改変体リパーゼ酵素を単離するために、アフィニティー技術が使用され得る。アフィニティークロマトグラフィー精製を利用するいくつかの実施形態においては、改変体リパーゼポリペプチドを特異的に結合する任意の抗体が使用される。
アフィニティークロマトグラフィー精製を利用するいくつかの実施形態において、リパーゼに共有結合されたグリカンに結合するタンパク質が使用される。アフィニティークロマトグラフィー精製を利用するさらに他の実施形態において、リパーゼ活性部位に結合する任意の小分子が使用される。抗体の産生のために、ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない様々な宿主動物が、ポリペプチド(例えば、リパーゼ改変体)またはその断片での注射によって免疫化される。いくつかの実施形態において、リパーゼポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基または側鎖官能基に結合されたリンカーによって、BSAなどの適切な担体に結合される。
いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、操作されたリパーゼポリペプチドの産生を促進する条件下で、本明細書に記載されている操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞(例えば、E.coli、S.cerevisiae、Daucus carota、Nicotiana tabacum、H.sapiens(例えば、HEK293T)、またはCricetulus griseus(例えば、CHO))を培養することと、細胞および/または培養培地から操作されたリパーゼポリペプチドを回収することと、を含む方法によって宿主細胞中で産生される。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868のアミノ酸配列と最適に整列されたときに、参照配列(例えば、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868)に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性と、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/もしくは5-1に提供されるアミノ酸残基差異ならびに/またはそれらの組み合わせから選択される、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868と比較した1またはそれを超えるアミノ酸残基差異とを有する操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え真核細胞を、操作されたリパーゼポリペプチドの産生を可能にする適切な培養条件下で培養することと、培養物および/または培養された細菌細胞から操作されたリパーゼポリペプチドを必要に応じて回収することと、を含む操作されたリパーゼポリペプチドを産生する方法を包含する。
いくつかの実施形態において、操作されたポリペプチドが組換え宿主細胞または細胞培養培地から回収されると、操作されたポリペプチドは当技術分野で公知の任意の適切な方法によってさらに精製される。いくつかの追加の実施形態において、異なる適用および使用に適切なように、操作されたリパーゼポリペプチドを含む組成物および製剤(例えば、薬学的組成物)を提供するために、精製されたリパーゼポリペプチドは、他の成分および化合物と組み合わされる。いくつかの追加の実施形態において、精製されたvポリペプチドまたは製剤化されたリパーゼポリペプチドは凍結乾燥される。
組成物:
本発明は、以下に記載されるものを含むがこれらに限定されない様々な組成物およびフォーマットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、薬学的およびその他の組成物、例えば、栄養補助食品および/または栄養補助剤における使用に適した操作されたリパーゼポリペプチドを提供する。
本発明は、以下に記載されるものを含むがこれらに限定されない様々な組成物およびフォーマットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、薬学的およびその他の組成物、例えば、栄養補助食品および/または栄養補助剤における使用に適した操作されたリパーゼポリペプチドを提供する。
投与の様式に応じて、治療有効量の本発明による操作されたリパーゼを含むこれらの組成物は、固体、半固体または液体の形態である。いくつかの実施形態において、組成物は、希釈剤、緩衝液、賦形剤、塩、乳化剤、保存剤、安定剤、充填剤および他の成分などの他の薬学的に許容され得る成分を含む。製剤化および投与のための技術に関する詳細は当技術分野で周知であり、文献に記載されている。
いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、薬学的組成物において使用するために製剤化される。操作されたリパーゼポリペプチドを送達する際に使用するための任意の適切なフォーマットが、本発明において使用され、丸剤、錠剤、ジェルタブ(gel tab)、カプセル、ロゼンジ、糖衣錠、散剤、軟ゲル、ゾル-ゲル(sol-gel)、ゲル、エマルジョン、インプラント、パッチ、スプレー、軟膏、リニメント剤、クリーム、ペースト、ゼリー、塗布剤、エアロゾル、チューインガム、粘滑薬、スティック(stick)、溶液、懸濁物(油性懸濁物、水中油型エマルジョンなどを含むが、これらに限定されない)、スラリー、シロップ、制御放出製剤、坐剤などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、注射または注入に適したフォーマットで(すなわち、注射用製剤で)提供される。いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、シリカベースの(例えば、オキシシラン)ゾルゲルを含むゾルゲルなどの生体適合性マトリックス中に提供される。いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、カプセル化され、および/または腸溶コーティングされる。いくつかの代替の実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、ナノ構造体(例えば、ナノチューブ、ナノ小管(nanotubule)、ナノカプセル、またはマイクロカプセル、ミクロスフェア、リポソームなど)中に封入される。実際には、本発明が任意の特定の送達製剤および/または送達の手段に限定されることは意図されない。操作されたリパーゼポリペプチドは、非経口、経口、局所、経皮、鼻腔内、眼内、髄腔内、インプラントを介してなどを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の適切な手段によって投与されることが意図される。
いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、グリコシル化、化学的架橋試薬、ペグ化(すなわち、ポリエチレングリコール[PEG]または活性化されたPEGなどで修飾されている)またはその他の化合物によって化学的に修飾される(例えば、Ikeda,Amino Acids 29:283-287[2005];米国特許第7,531,341号、同第7,534,595号、同第7,560,263号および同第7,53,653号;米国特許出願公開第2013/0039898号、同第2012/0177722号などを参照)。実際には、本発明がいかなる特定の送達方法および/または機構にも限定されることは意図されていない。
いくつかの追加の実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、マトリックスで安定化された酵素結晶を含む製剤で提供される。いくつかの実施形態において、製剤は、架橋された結晶性の操作されたリパーゼ酵素と、酵素結晶に付着する反応性部分を有するポリマーとを含む。本発明は、ポリマー中の操作されたリパーゼポリペプチドも提供する。
いくつかの実施形態において、本発明の操作されたリパーゼポリペプチドを含む組成物は、糖(例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールおよび/またはソルビトール)、デンプン(例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、またはその他の植物デンプン)、セルロース(例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム)、ガム(例えば、アラビア、トラガカント、グアーなど)、および/またはタンパク質(例えば、ゼラチン、コラーゲンなど)を含むが、これらに限定されない1またはそれを超える一般的に使用される担体化合物を含む。
いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、食事性脂肪吸収を改善し、糞便中の食事性脂質を減少させるための使用に適している。いくつかの実施形態において、本発明は、血液、脳脊髄液などの流体中の糖脂質の濃度を減少させる上での使用に適した操作されたリパーゼポリペプチドを提供する。投与される操作されたリパーゼポリペプチドの投与量は、状態または疾患、被験体の一般的な状態、および当業者に公知の他の因子に依存する。いくつかの実施形態において、組成物は、単回または複数回投与を意図している。いくつかの実施形態において、膵機能不全疾患を有するヒトに投与される組成物中の操作されたリパーゼポリペプチドの濃度は、疾患(例えば、膵機能不全疾患)を有効に処置および/または改善するのに十分であることが企図される。いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、膵酵素機能不全などの疾患の処置のために、アミラーゼおよび/またはプロテアーゼなどの他の酵素と組み合わせて使用される。
いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、食事補助食品、栄養補給食品(nutraceutical)などを含むがこれらに限定されない他の薬学的組成物および/または食事組成物と組み合わせて投与される。任意の適切な方法および/または形態が使用されるので、本発明が任意の特定の投与方法または形態に限定されることは意図されていない。
実験
以下の実施例(実験および達成された結果を含む)は、例示のみを目的として提供されており、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
以下の実験の開示では、以下の略語が適用される:ppm(百万分率);M(モル濃度);mM(ミリモル濃度)、uMおよびμM(マイクロモル濃度);nM(ナノモル濃度);mol(モル);gmおよびg(グラム);mg(ミリグラム);ugおよびμg(マイクログラム);Lおよびl(リットル);mlおよびmL(ミリリットル);cm(センチメートル);mm(ミリメートル);umおよびμm(マイクロメートル);sec(秒);min(分);hおよびhr(時間);U(単位);MW(分子量);rpm(毎分回転数);℃(摂氏度);CDS(コード配列);DNA(デオキシリボ核酸);RNA(リボ核酸);E.coli W3110(Coli Genetic Stock Center [CGSC]、New Haven,CTから入手可能な、一般的に使用される実験用E.coli株);EPI(膵外分泌機能不全);LIPおよびlip(リパーゼ);btLIP(B.thermoamylovorans)リパーゼ);HPLC(高圧液体クロマトグラフィー);ms(質量分析または質量分光測定法);SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動);PES(ポリエーテルスルホン);ACN(アセトニトリル);IPA(イソプロピルアルコール);IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド);PMBS(硫酸ポリミキシンB);NADPH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸);LB(ルリアブロス);PBS(リン酸緩衝食塩水);MeOH(メタノール);TAG(トリオレイン);DAG(ジオレイン);MAG(モノオレイン);OA(オレイン酸);FIOPCおよびFIOP(陽性対照に対する倍数改善(fold improvement));HTP(高スループット);CAV(セル加速器電圧;コリジョンセル加速器電圧);CE(衝突エネルギー);RF(無線周波数);Sinclair(Sinclair Research、およびSinclair Bio Resources、Auxvasse、MO);Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO);Pall Corp.(Pall,Corp.,Pt.Washington、NY);Millipore(Millipore,Corp.,Billerica MA);Difco(Difco Laboratories,BD Diagnostic Systems,Detroit,MI);Molecular Devices(Molecular Devices,LLC,Sunnyvale,CA);Kuhner(Adolf Kuhner、AG、Basel、Switzerland);Applied Biosystems(Applied Biosystems、Life Technologies、Corp.,Grand Island、NYの一部)、Agilent(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara、CA);RAPIDFIRE(登録商標)MS(RAPIDFIRE(登録商標)質量分析器、Agilent);Thermo Scientific(ThermoFisher Scientific,Waltham,MAの一部);Gibco(ThermoFisher Scientific);Pierce(Pierce Biotechnology(現在は、Thermo Fisher Scientificの一部)、Rockford、IL);ThermoFisher Scientific(Thermo Fisher Scientific,Waltham、MA);Corning(Corning,Inc.,Palo Alto、CA);AbbVie(AbbVie,Inc.,North Chicago、IL);およびBio-Rad(Bio-Rad Laboratories,Hercules、CA)。
以下の実施例(実験および達成された結果を含む)は、例示のみを目的として提供されており、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
以下の実験の開示では、以下の略語が適用される:ppm(百万分率);M(モル濃度);mM(ミリモル濃度)、uMおよびμM(マイクロモル濃度);nM(ナノモル濃度);mol(モル);gmおよびg(グラム);mg(ミリグラム);ugおよびμg(マイクログラム);Lおよびl(リットル);mlおよびmL(ミリリットル);cm(センチメートル);mm(ミリメートル);umおよびμm(マイクロメートル);sec(秒);min(分);hおよびhr(時間);U(単位);MW(分子量);rpm(毎分回転数);℃(摂氏度);CDS(コード配列);DNA(デオキシリボ核酸);RNA(リボ核酸);E.coli W3110(Coli Genetic Stock Center [CGSC]、New Haven,CTから入手可能な、一般的に使用される実験用E.coli株);EPI(膵外分泌機能不全);LIPおよびlip(リパーゼ);btLIP(B.thermoamylovorans)リパーゼ);HPLC(高圧液体クロマトグラフィー);ms(質量分析または質量分光測定法);SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動);PES(ポリエーテルスルホン);ACN(アセトニトリル);IPA(イソプロピルアルコール);IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド);PMBS(硫酸ポリミキシンB);NADPH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸);LB(ルリアブロス);PBS(リン酸緩衝食塩水);MeOH(メタノール);TAG(トリオレイン);DAG(ジオレイン);MAG(モノオレイン);OA(オレイン酸);FIOPCおよびFIOP(陽性対照に対する倍数改善(fold improvement));HTP(高スループット);CAV(セル加速器電圧;コリジョンセル加速器電圧);CE(衝突エネルギー);RF(無線周波数);Sinclair(Sinclair Research、およびSinclair Bio Resources、Auxvasse、MO);Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO);Pall Corp.(Pall,Corp.,Pt.Washington、NY);Millipore(Millipore,Corp.,Billerica MA);Difco(Difco Laboratories,BD Diagnostic Systems,Detroit,MI);Molecular Devices(Molecular Devices,LLC,Sunnyvale,CA);Kuhner(Adolf Kuhner、AG、Basel、Switzerland);Applied Biosystems(Applied Biosystems、Life Technologies、Corp.,Grand Island、NYの一部)、Agilent(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara、CA);RAPIDFIRE(登録商標)MS(RAPIDFIRE(登録商標)質量分析器、Agilent);Thermo Scientific(ThermoFisher Scientific,Waltham,MAの一部);Gibco(ThermoFisher Scientific);Pierce(Pierce Biotechnology(現在は、Thermo Fisher Scientificの一部)、Rockford、IL);ThermoFisher Scientific(Thermo Fisher Scientific,Waltham、MA);Corning(Corning,Inc.,Palo Alto、CA);AbbVie(AbbVie,Inc.,North Chicago、IL);およびBio-Rad(Bio-Rad Laboratories,Hercules、CA)。
(実施例1)
細菌リパーゼ遺伝子の取得および発現ベクターの構築
Bacillus thermoamylovoransリパーゼ(配列番号2)をコードするDNA配列をE.coliでの発現のためにコドン最適化し、E.coli発現ベクターpCK110900ベクター系(例えば、米国特許第7,629,157号、米国特許第9,714,437号および米国特許出願公開第2006/0195947号を参照、これらはすべて、参照により本明細書に組み入れられる)またはpJV110900ベクター系(例えば、米国特許出願公開第2017/213758号を参照、同じく参照により本明細書に組み入れられる)にクローニングした。しかしながら、本発明がいかなる特定のベクターにも限定されることは意図されていない。さらに、いくつかの実施形態においては、抗菌剤耐性マーカーを欠く発現ベクターが使用される。W3110由来のE.coli株中に、プラスミド構築物を形質転換した。当業者に周知の定向進化技術を使用して、このプラスミド構築物からの遺伝子改変体(例えば、米国特許第8,383,346号、国際公開第2010/144103号を参照)およびその誘導体のライブラリを作製した。
細菌リパーゼ遺伝子の取得および発現ベクターの構築
Bacillus thermoamylovoransリパーゼ(配列番号2)をコードするDNA配列をE.coliでの発現のためにコドン最適化し、E.coli発現ベクターpCK110900ベクター系(例えば、米国特許第7,629,157号、米国特許第9,714,437号および米国特許出願公開第2006/0195947号を参照、これらはすべて、参照により本明細書に組み入れられる)またはpJV110900ベクター系(例えば、米国特許出願公開第2017/213758号を参照、同じく参照により本明細書に組み入れられる)にクローニングした。しかしながら、本発明がいかなる特定のベクターにも限定されることは意図されていない。さらに、いくつかの実施形態においては、抗菌剤耐性マーカーを欠く発現ベクターが使用される。W3110由来のE.coli株中に、プラスミド構築物を形質転換した。当業者に周知の定向進化技術を使用して、このプラスミド構築物からの遺伝子改変体(例えば、米国特許第8,383,346号、国際公開第2010/144103号を参照)およびその誘導体のライブラリを作製した。
(実施例2)
哺乳動物リパーゼ遺伝子の取得、発現ベクターの構築ならびにHTP増殖および活性スクリーニング
表1中の哺乳動物リパーゼをコードする遺伝子(配列番号1、3、5、7、9および11)を、Saccharomyces cerevisiaeにおける発現のためにコドン最適化した。リパーゼの分泌発現のために、S.cerevisiae接合因子アルファ(MFα)シグナルペプチドを成熟形態のリパーゼに遺伝的に融合させた。国際公開第2016/105889号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、これらの酵母株をHTPで増殖させた。これらの酵母培養物からの上清を、実施例3に記載されているとおりの活性についてアッセイした。これらのリパーゼから得られた活性を表2-1に示す。
哺乳動物リパーゼ遺伝子の取得、発現ベクターの構築ならびにHTP増殖および活性スクリーニング
表1中の哺乳動物リパーゼをコードする遺伝子(配列番号1、3、5、7、9および11)を、Saccharomyces cerevisiaeにおける発現のためにコドン最適化した。リパーゼの分泌発現のために、S.cerevisiae接合因子アルファ(MFα)シグナルペプチドを成熟形態のリパーゼに遺伝的に融合させた。国際公開第2016/105889号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、これらの酵母株をHTPで増殖させた。これらの酵母培養物からの上清を、実施例3に記載されているとおりの活性についてアッセイした。これらのリパーゼから得られた活性を表2-1に示す。
(実施例3)
リパーゼ改変体のハイスループット(HTP)増殖およびスクリーニング条件
リパーゼ改変体の増殖およびスクリーニングについて行った実験を以下に記載する。
リパーゼ改変体のハイスループット(HTP)増殖およびスクリーニング条件
リパーゼ改変体の増殖およびスクリーニングについて行った実験を以下に記載する。
B.thermoamylovoransリパーゼ(btLIP)およびリパーゼ(LIP)改変体のハイスループット(HTP)増殖:
選択を加えた、1%グルコースを含有するLB寒天プレート上に播種することによって、形質転換されたE.coli細胞を選択した。37℃で一晩インキュベートした後、1%グルコースおよび選択を追加補充した180μl/ウェルのLBで満たされた96ウェルの浅い平底プレート(NUNC(商標)、Thermo-Scientific)のウェル中にコロニーを配置した。振盪インキュベータ(200rpm、30℃、相対湿度85%;Kuhner)内で18~20時間、培養物を一晩増殖させた。選択化合物(例えば、クロラムフェニコール)を追加補充した380μLのTerrific Brothで満たされたCOSTAR(登録商標)96ウェル深プレート中に、一晩増殖試料(20μL)を移した。振盪インキュベータ(250rpm、30℃、85%相対湿度;Kuhner)中で135分間、プレートをインキュベートした。次いで、無菌水中の40μLの10mM IPTGでリパーゼ改変体の発現を誘導し、振盪インキュベータ(250rpm、30℃、85%相対湿度;Kuhner)中で一晩、培養物を20~24時間インキュベートした。遠心分離(4000rpm×20分)によって細胞をペレット化し、上清を廃棄し、細胞を分析前に-80℃で凍結した。
選択を加えた、1%グルコースを含有するLB寒天プレート上に播種することによって、形質転換されたE.coli細胞を選択した。37℃で一晩インキュベートした後、1%グルコースおよび選択を追加補充した180μl/ウェルのLBで満たされた96ウェルの浅い平底プレート(NUNC(商標)、Thermo-Scientific)のウェル中にコロニーを配置した。振盪インキュベータ(200rpm、30℃、相対湿度85%;Kuhner)内で18~20時間、培養物を一晩増殖させた。選択化合物(例えば、クロラムフェニコール)を追加補充した380μLのTerrific Brothで満たされたCOSTAR(登録商標)96ウェル深プレート中に、一晩増殖試料(20μL)を移した。振盪インキュベータ(250rpm、30℃、85%相対湿度;Kuhner)中で135分間、プレートをインキュベートした。次いで、無菌水中の40μLの10mM IPTGでリパーゼ改変体の発現を誘導し、振盪インキュベータ(250rpm、30℃、85%相対湿度;Kuhner)中で一晩、培養物を20~24時間インキュベートした。遠心分離(4000rpm×20分)によって細胞をペレット化し、上清を廃棄し、細胞を分析前に-80℃で凍結した。
HTPペレットの溶解:
まず、200~400μLの溶解緩衝液(1×PBS、1mg/mlリゾチームおよび0.5mg/ml硫酸ポリミキシンB)を細胞ペレットに添加した。細胞ペレットおよび緩衝液を室温で1.5~2時間穏やかに振盪し、本明細書に記載されている様々なHTPアッセイにおいて清澄化された溶解物を使用する前に遠心分離した(4000rpm×5分)。SDS-PAGEによるこれらの溶解物の分析は、btLIPの予想MWと一致する約45kDaの見かけのMWで過剰発現されたタンパク質の存在を明らかにした。
まず、200~400μLの溶解緩衝液(1×PBS、1mg/mlリゾチームおよび0.5mg/ml硫酸ポリミキシンB)を細胞ペレットに添加した。細胞ペレットおよび緩衝液を室温で1.5~2時間穏やかに振盪し、本明細書に記載されている様々なHTPアッセイにおいて清澄化された溶解物を使用する前に遠心分離した(4000rpm×5分)。SDS-PAGEによるこれらの溶解物の分析は、btLIPの予想MWと一致する約45kDaの見かけのMWで過剰発現されたタンパク質の存在を明らかにした。
リパーゼ活性についての清澄化された溶解物の分析:
オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、btLIP改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLの溶解物と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。反応を600μLのACN:IPA(1:3)でクエンチし、遠心分離で清澄化し、アセトニトリル中55%IPAの均一濃度流で実行するC18 POROSHELL(登録商標)5μm 150mmカラムで分離して、214nmのオレイン酸、ジオレイン、モノオレインおよびトリオレインを検出した。あるいは、クエンチした反応物を清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。以下の実施例において、「チャレンジなしの活性」とは、以下のアッセイ方法の説明に記載されているように、外的前処理/チャレンジなしで行われたリパーゼ活性決定を指す。
オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、btLIP改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLの溶解物と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。反応を600μLのACN:IPA(1:3)でクエンチし、遠心分離で清澄化し、アセトニトリル中55%IPAの均一濃度流で実行するC18 POROSHELL(登録商標)5μm 150mmカラムで分離して、214nmのオレイン酸、ジオレイン、モノオレインおよびトリオレインを検出した。あるいは、クエンチした反応物を清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。以下の実施例において、「チャレンジなしの活性」とは、以下のアッセイ方法の説明に記載されているように、外的前処理/チャレンジなしで行われたリパーゼ活性決定を指す。
加熱前処理で前処理された清澄化された溶解物のHTP分析:
37℃~65℃でのインキュベーション後に、btLIP改変体の活性を決定した。まず、100μLの清澄化された溶解物を96ウェルBioRad Hard-Shell PCR薄壁マイクロタイタープレート(#hsp9601;BioRad)のウェルに添加した。プレートを密封し、分析前にサーモサイクラー中で、37℃~65℃で1時間インキュベートした。オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLの溶解物と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。600μLのACN:IPA(1:3)で反応をクエンチし、清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。結果を実施例4の表に示す。
37℃~65℃でのインキュベーション後に、btLIP改変体の活性を決定した。まず、100μLの清澄化された溶解物を96ウェルBioRad Hard-Shell PCR薄壁マイクロタイタープレート(#hsp9601;BioRad)のウェルに添加した。プレートを密封し、分析前にサーモサイクラー中で、37℃~65℃で1時間インキュベートした。オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLの溶解物と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。600μLのACN:IPA(1:3)で反応をクエンチし、清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。結果を実施例4の表に示す。
低pHでのおよびペプシン前処理ありまたはなしでの清澄化された溶解物のHTP分析:
胃の環境をシミュレートするためにペプシンとのインキュベーション後にbtLIP改変体の活性を決定した。まず、90μLの100mMクエン酸ナトリウム、1.5mg/mLペプシン(P7000 Sigma)を含むまたは含まない2.5mgTAG pH2.0~5.0、および10μLの清澄化された溶解物を96ウェル丸底マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3798;Corning)のウェルに添加した。プレートを密封し、分析前に振盪(THERMOTRON(登録商標)シェーカーHT Infors AJ185、400rpm、行程1インチ)しながら37℃で1時間インキュベートした。オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLのペプシン反応混合物と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。600μLのACN:IPA(1:3)で反応をクエンチし、清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。結果を実施例4の表に示す。
胃の環境をシミュレートするためにペプシンとのインキュベーション後にbtLIP改変体の活性を決定した。まず、90μLの100mMクエン酸ナトリウム、1.5mg/mLペプシン(P7000 Sigma)を含むまたは含まない2.5mgTAG pH2.0~5.0、および10μLの清澄化された溶解物を96ウェル丸底マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3798;Corning)のウェルに添加した。プレートを密封し、分析前に振盪(THERMOTRON(登録商標)シェーカーHT Infors AJ185、400rpm、行程1インチ)しながら37℃で1時間インキュベートした。オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLのペプシン反応混合物と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。600μLのACN:IPA(1:3)で反応をクエンチし、清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。結果を実施例4の表に示す。
プロテアーゼ前処理による清澄化された溶解物のHTP分析:
下部腸の環境をシミュレートするために、キモトリプシンおよびトリプシンとのインキュベーション後にbtLIP改変体の活性を決定した。まず、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3798;Corning)のウェルに、50μLのプロテアーゼミックス(0.01~100mg/mlキモトリプシン(C4129、Sigma)、0.01~100mg/mlトリプシン(T7409、Sigma)、0~30μLの、100mMリン酸ナトリウムpH6.5~7.0中の20mMタウロコール酸ナトリウム、および50μLの清澄化された溶解物を加えた。プレートを密封し、分析前に振盪(THERMOTRON(登録商標)シェーカーHT Infors AJ185、400rpm、行程1インチ)しながら37℃で1時間インキュベートした。オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLのプロテアーゼ反応混合物と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。600μLのACN:IPA(1:3)で反応をクエンチし、清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。結果を実施例4の表に示す。
下部腸の環境をシミュレートするために、キモトリプシンおよびトリプシンとのインキュベーション後にbtLIP改変体の活性を決定した。まず、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3798;Corning)のウェルに、50μLのプロテアーゼミックス(0.01~100mg/mlキモトリプシン(C4129、Sigma)、0.01~100mg/mlトリプシン(T7409、Sigma)、0~30μLの、100mMリン酸ナトリウムpH6.5~7.0中の20mMタウロコール酸ナトリウム、および50μLの清澄化された溶解物を加えた。プレートを密封し、分析前に振盪(THERMOTRON(登録商標)シェーカーHT Infors AJ185、400rpm、行程1インチ)しながら37℃で1時間インキュベートした。オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLのプロテアーゼ反応混合物と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。600μLのACN:IPA(1:3)で反応をクエンチし、清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。結果を実施例4の表に示す。
多段階胃腸(GI)チャレンジによる清澄化された溶解物のHTP分析:
37℃~65℃でのインキュベーション後に、btLIP改変体の活性を決定した。まず、100μLの清澄化された溶解物を96ウェルBioRad Hard-Shell PCR薄壁マイクロタイタープレート(#hsp9601;BioRad)のウェルに添加した。プレートを密封し、胃チャレンジより前にサーモサイクラー中で、37℃~65℃で1時間インキュベートした。次に、胃の環境をシミュレートするために、ペプシンとともにbtLIP改変体をインキュベートした。まず、3.0mg/mLペプシン(P7000 Sigma)を含む50μLの100mMクエン酸ナトリウムpH2.0~5.0、および50μLの熱処理された溶解物を96ウェル丸底マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3798;Corning)のウェルに添加した。プレートを密封し、分析前に振盪(THERMOTRON(登録商標)シェーカーHT Infors AJ185、400rpm、行程1インチ)しながら37℃で1時間インキュベートした。次に、下部腸の環境をシミュレートするために、btLIP改変体をキモトリプシンおよびトリプシンとともにインキュベートした。この工程では、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3798;Corning)のウェルに、100μLのプロテアーゼミックス(0.01~100mg/mlキモトリプシン[C4129;Sigma]、および0.01~100mg/mlトリプシン[T7409;Sigma])、0~30μLの、100mMリン酸ナトリウムpH6.5~7.0中の20mMタウロコール酸ナトリウム、および100μLの熱処理された、胃チャレンジされた溶解物を加えた。プレートを密封し、分析前に振盪(THERMOTRON(登録商標)シェーカーHT Infors AJ185、400rpm、行程1インチ)しながら37℃で1時間インキュベートした。オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLの胃腸反応と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。600μLのACN:IPA(1:3)で反応をクエンチし、清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。結果を実施例4の表に示す。
37℃~65℃でのインキュベーション後に、btLIP改変体の活性を決定した。まず、100μLの清澄化された溶解物を96ウェルBioRad Hard-Shell PCR薄壁マイクロタイタープレート(#hsp9601;BioRad)のウェルに添加した。プレートを密封し、胃チャレンジより前にサーモサイクラー中で、37℃~65℃で1時間インキュベートした。次に、胃の環境をシミュレートするために、ペプシンとともにbtLIP改変体をインキュベートした。まず、3.0mg/mLペプシン(P7000 Sigma)を含む50μLの100mMクエン酸ナトリウムpH2.0~5.0、および50μLの熱処理された溶解物を96ウェル丸底マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3798;Corning)のウェルに添加した。プレートを密封し、分析前に振盪(THERMOTRON(登録商標)シェーカーHT Infors AJ185、400rpm、行程1インチ)しながら37℃で1時間インキュベートした。次に、下部腸の環境をシミュレートするために、btLIP改変体をキモトリプシンおよびトリプシンとともにインキュベートした。この工程では、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3798;Corning)のウェルに、100μLのプロテアーゼミックス(0.01~100mg/mlキモトリプシン[C4129;Sigma]、および0.01~100mg/mlトリプシン[T7409;Sigma])、0~30μLの、100mMリン酸ナトリウムpH6.5~7.0中の20mMタウロコール酸ナトリウム、および100μLの熱処理された、胃チャレンジされた溶解物を加えた。プレートを密封し、分析前に振盪(THERMOTRON(登録商標)シェーカーHT Infors AJ185、400rpm、行程1インチ)しながら37℃で1時間インキュベートした。オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLの胃腸反応と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。600μLのACN:IPA(1:3)で反応をクエンチし、清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。結果を実施例4の表に示す。
(実施例4)
リパーゼ改変体に対するスクリーニング結果
相同体多様性および飽和変異誘発から生成された改変体を、実施例3に記載されているようにいくつかの異なる条件下でスクリーニングした。(配列番号2と比べた)結果を表4-1に示す。この表では、アミノ酸差異は配列番号2と比較して示されている。
リパーゼ改変体に対するスクリーニング結果
相同体多様性および飽和変異誘発から生成された改変体を、実施例3に記載されているようにいくつかの異なる条件下でスクリーニングした。(配列番号2と比べた)結果を表4-1に示す。この表では、アミノ酸差異は配列番号2と比較して示されている。
表4-1に示されている結果に基づいて、タンパク質最適化の次の反復のための親配列として配列番号94を選択した。表4-1に示されている結果から同定された有益な変異を骨格中に組み換えた。実施例3に記載されているのと同じ条件下で改変体をスクリーニングした。唯一の差異は、酸チャレンジスクリーニングがpH3に代えてpH3.5で行われたことである。配列番号94と比べたデータを表4-2に列挙する。この表では、アミノ酸差異は配列番94と比べて示されている。
表4-2に示されている結果に基づいて、タンパク質最適化の次の反復のための次の親配列として配列番号350を選択した。表4-2から同定された有益な変異を骨格中に組み換えた。さらに、異なる位置での飽和変異誘発を通じて、配列番号350を使用して改変体も構築した。実施例3に記載されるように改変体をアッセイし、結果を表4-3に提供する。この表では、アミノ酸差異は配列番号350と比べて示されている。
表4-3からの結果に基づいて、タンパク質最適化の次の反復のための次の親配列として配列番号442を選択した。表4-3に示されている結果に基づいて同定された有益な変異を骨格中に組み換えた。さらに、異なる位置での飽和変異誘発を通じて、配列番号442に対して改変体も構築した。実施例3に記載されるように改変体をアッセイし、結果を表4-4に提供する。この表では、アミノ酸差異は配列番号442と比べて示されている。
表4-4に示されている結果に基づいて、タンパク質最適化の次の反復のための次の親配列として配列番号540を選択した。表4-4に示されている結果に基づいて同定された有益な変異を骨格中に組み換えた。さらに、異なる位置での飽和変異誘発を通じて、配列番号540に対して改変体も構築した。実施例3に記載されるように改変体をアッセイし、結果を表4-5に提供する。この表では、アミノ酸差異は配列番号540と比べて示されている。
表4-5に示されている結果に基づいて、タンパク質最適化の次の反復のための次の親配列として配列番号646を選択した。表4-5に示されている結果に基づいて同定された有益な変異を骨格中に組み換えた。実施例3に記載されるように改変体をアッセイし、結果を表4-6に提供する。この表では、アミノ酸差異は配列番号646と比べて示されている。
表4-6に示されている結果に基づいて、タンパク質最適化の次の反復のための次の親配列として配列番号758を選択した。表4-6に示されている結果に基づいて同定された有益な変異を骨格中に組み換えた。実施例3に記載されるように改変体をアッセイし、結果を表4-7に提供する。この表では、アミノ酸差異は配列番号758と比べて示されている。
(実施例5)
配列番号868に対する個々の変異改変体のスクリーニング結果
配列番号2とは異なる24の位置での部位飽和変異誘発を通じて、配列番号868上に単一の点変異を構築した。実施例3に記載されるような様々な前処理に供した後、これらの改変体をリパーゼ活性についてアッセイした。各改変体は三連で試験され、配列番号868および配列番号2の両方に関する活性データの分析が表5-1に列挙されている。
配列番号868に対する個々の変異改変体のスクリーニング結果
配列番号2とは異なる24の位置での部位飽和変異誘発を通じて、配列番号868上に単一の点変異を構築した。実施例3に記載されるような様々な前処理に供した後、これらの改変体をリパーゼ活性についてアッセイした。各改変体は三連で試験され、配列番号868および配列番号2の両方に関する活性データの分析が表5-1に列挙されている。
(実施例6)
ミニブタにおける膵外分泌機能不全の外科的モデルの検証
膵管結紮によってミニブタにおいて膵外分泌機能不全(EPI)の外科的モデルを作製した。手術の7日前から開始し、実験全体を通して継続して、3~4月齢の雌のSINCLAIR(商標)ミニブタに、高脂肪食(HFD;10:1w/wでBERTOLLI(登録商標)オリーブ油と混合したSinclair標準食S-9)を1日1回与えた。手術前の3連続日ならびに手術後15、16および17日目に、24時間にわたる総糞便排出を収集した。便の正味重量の約1.5倍の体積の蒸留水を添加し、ホモジナイズし、3×50mLのアリコートに分割し、分析まで-20℃で凍結することによって、その後の分析のために、各動物からの毎日の総糞便収集物を調製した。糞便試料中で、脂肪吸収係数(CFA;改変されたVan de Kamer法による;Van de Kamer,in Seligson(ed),Standard Methods of Clinical Chemistry,volume 2,Academic Press,New York,NY[1958],pp.34-39参照)および窒素吸収係数(CNA;燃焼法によるVario Max CN機器によるKjeldahl総窒素;Watsonら、in Petersら(eds.)Recommended Methods of Manure Analysis,Univ.of Wisconsin Cooperative Extension Publishing,Publication No.A3769.Madison WI.[2003],p.18-24参照)を測定し、手術前および手術後にパーセント変化を評価することによって、モデルを検証した。手術前に、健康なミニブタのCFAおよびCNAは、それぞれ91.3%±1.1SEMおよび84.2%±1.2SEMであった。手術後に、CFAは53.2%減少し(p<0.0001、n=11)、CNAは28.7%減少し(p<0.0001、n=11)、したがってEPI研究に関して、この外科的モデルが有効であることが確認された。
ミニブタにおける膵外分泌機能不全の外科的モデルの検証
膵管結紮によってミニブタにおいて膵外分泌機能不全(EPI)の外科的モデルを作製した。手術の7日前から開始し、実験全体を通して継続して、3~4月齢の雌のSINCLAIR(商標)ミニブタに、高脂肪食(HFD;10:1w/wでBERTOLLI(登録商標)オリーブ油と混合したSinclair標準食S-9)を1日1回与えた。手術前の3連続日ならびに手術後15、16および17日目に、24時間にわたる総糞便排出を収集した。便の正味重量の約1.5倍の体積の蒸留水を添加し、ホモジナイズし、3×50mLのアリコートに分割し、分析まで-20℃で凍結することによって、その後の分析のために、各動物からの毎日の総糞便収集物を調製した。糞便試料中で、脂肪吸収係数(CFA;改変されたVan de Kamer法による;Van de Kamer,in Seligson(ed),Standard Methods of Clinical Chemistry,volume 2,Academic Press,New York,NY[1958],pp.34-39参照)および窒素吸収係数(CNA;燃焼法によるVario Max CN機器によるKjeldahl総窒素;Watsonら、in Petersら(eds.)Recommended Methods of Manure Analysis,Univ.of Wisconsin Cooperative Extension Publishing,Publication No.A3769.Madison WI.[2003],p.18-24参照)を測定し、手術前および手術後にパーセント変化を評価することによって、モデルを検証した。手術前に、健康なミニブタのCFAおよびCNAは、それぞれ91.3%±1.1SEMおよび84.2%±1.2SEMであった。手術後に、CFAは53.2%減少し(p<0.0001、n=11)、CNAは28.7%減少し(p<0.0001、n=11)、したがってEPI研究に関して、この外科的モデルが有効であることが確認された。
(実施例7)
CREON(登録商標)Pancrelipaseと比較した、配列番号868のインビボ特徴づけ
現在の標準治療(CREON(登録商標)pancrelipase;AbbVie,Inc.)と比較して操作されたリパーゼ改変体(配列番号868)を評価するために、EPIの検証されたSINCLAIR(商標)ミニブタ外科的モデル(雌、4~5月齢)をインビボ研究へと進めた。投与の少なくとも8日前に開始して、3.9オンスカップ1カップの甘味無添加のアップルソースと組み合わせたHFD(10:1w/wの、BERTOLLI(登録商標)無刺激オリーブ油と混合したSinclair標準S-9食)を1日1回動物に与えた。投与日の間、摂取前に食事性脂肪とのエクスビボでのリパーゼ相互作用を最小限に抑えるために、食事は各動物に対して逐次に調製した。手短に言えば、まず、清潔な給餌ボウル中にHFDを調製した。酸性pHは早期酵素活性化に対して保護したので、次に、酵素(それぞれ258,000Uおよび252,000Uのリパーゼに相当した、0.5gの凍結乾燥された配列番号868粉末、または7×36,000UのCREON(登録商標)pancrelipaseカプセルからプールされた5.6gのミクロスフェア)を3.9オンスカップ1カップの甘味無添加のアップルソース中に混合した。一食あたりに投与された酵素の単位は、USPリパーゼアッセイ(米国薬局方および国民医薬品集(USP42-NF37)Rockville,MD:United States Pharmacopeial Convention;2016;uspnf.com/uspnf/document/GUID-AC788D41-90A2-4F36-A6E7-769954A9ED09_1_en-USからインターネット上で入手可能)によって決定されたリパーゼの比活性および食事中に提供された総算出脂肪に基づいた。次いで、リパーゼ-アップルソース混合物をHFDに移し、迅速に混合した。最後に、次の調製に進む前に、給餌ボウルを直ちに動物に与えた。2時間後、給餌ボウルを取り除いた。動物は30分またはそれ未満に食事全体を消費した。群あたりのミニブタの数を最大化するために(n=3)、クロスオーバー設計を使用した。この研究には、各10日間の投与期の間に8日間の「ウォッシュアウト」(1日1回のHFD+酵素なしのアップルソース)を組み込んだ。投与開始直前ならびに各期の9、10および11日での投与の24時間後に、3日連続、総糞便を収集した。便の正味重量の約1.5倍の体積の蒸留水を各1日の全便収集物に添加し、ホモジナイズし、3×50mLに分割し、分析するまで-20℃で凍結し、残りを廃棄することによって、便試料を調製した。上記のモデル検証について記載したように、分析を完了した。CREON(登録商標)pancrelipaseおよび配列番号868はいずれも、CFAを手術前のベースラインと有意に異ならない値まで同様に改善した。
CREON(登録商標)Pancrelipaseと比較した、配列番号868のインビボ特徴づけ
現在の標準治療(CREON(登録商標)pancrelipase;AbbVie,Inc.)と比較して操作されたリパーゼ改変体(配列番号868)を評価するために、EPIの検証されたSINCLAIR(商標)ミニブタ外科的モデル(雌、4~5月齢)をインビボ研究へと進めた。投与の少なくとも8日前に開始して、3.9オンスカップ1カップの甘味無添加のアップルソースと組み合わせたHFD(10:1w/wの、BERTOLLI(登録商標)無刺激オリーブ油と混合したSinclair標準S-9食)を1日1回動物に与えた。投与日の間、摂取前に食事性脂肪とのエクスビボでのリパーゼ相互作用を最小限に抑えるために、食事は各動物に対して逐次に調製した。手短に言えば、まず、清潔な給餌ボウル中にHFDを調製した。酸性pHは早期酵素活性化に対して保護したので、次に、酵素(それぞれ258,000Uおよび252,000Uのリパーゼに相当した、0.5gの凍結乾燥された配列番号868粉末、または7×36,000UのCREON(登録商標)pancrelipaseカプセルからプールされた5.6gのミクロスフェア)を3.9オンスカップ1カップの甘味無添加のアップルソース中に混合した。一食あたりに投与された酵素の単位は、USPリパーゼアッセイ(米国薬局方および国民医薬品集(USP42-NF37)Rockville,MD:United States Pharmacopeial Convention;2016;uspnf.com/uspnf/document/GUID-AC788D41-90A2-4F36-A6E7-769954A9ED09_1_en-USからインターネット上で入手可能)によって決定されたリパーゼの比活性および食事中に提供された総算出脂肪に基づいた。次いで、リパーゼ-アップルソース混合物をHFDに移し、迅速に混合した。最後に、次の調製に進む前に、給餌ボウルを直ちに動物に与えた。2時間後、給餌ボウルを取り除いた。動物は30分またはそれ未満に食事全体を消費した。群あたりのミニブタの数を最大化するために(n=3)、クロスオーバー設計を使用した。この研究には、各10日間の投与期の間に8日間の「ウォッシュアウト」(1日1回のHFD+酵素なしのアップルソース)を組み込んだ。投与開始直前ならびに各期の9、10および11日での投与の24時間後に、3日連続、総糞便を収集した。便の正味重量の約1.5倍の体積の蒸留水を各1日の全便収集物に添加し、ホモジナイズし、3×50mLに分割し、分析するまで-20℃で凍結し、残りを廃棄することによって、便試料を調製した。上記のモデル検証について記載したように、分析を完了した。CREON(登録商標)pancrelipaseおよび配列番号868はいずれも、CFAを手術前のベースラインと有意に異ならない値まで同様に改善した。
(実施例8)
配列番号868のインビボ用量応答の特徴づけ
さらなるインビボ配列番号868用量応答研究のために、EPIの検証されたSINCLAIR(商標)ミニブタ外科モデル(雌、4~6月齢)を使用した。HFDおよび給餌レジメン、リパーゼ混合プロトコル、糞便試料の収集および調製、ならびに分析は上記と同じであった。術前値(92.8%+/-3.2SD、n=8)と比較して、投与直前に測定された術後CFAは39.9%+/-13.2SD(p<0.0001、n=8)に減少した。配列番号868を、以前の研究と橋渡しするために258,000U(0.5gの凍結乾燥された粉末)で投与し、低用量有効性を評価するために86,000U(167mg)および29,000U(55.5mg)で投与した。評価した全ての用量は、用量依存的にCFAにプラスの効果をもたらした。高用量から低用量まで、CFA値は、投与前と比較して、それぞれ81.3%+/-3.9SD(p<0.0001、n=3)、74%+/-3.6SD(p<0.0001、n=3)および65.5%+/-3.7SD(p<0.0001、n=2)に増加した。
配列番号868のインビボ用量応答の特徴づけ
さらなるインビボ配列番号868用量応答研究のために、EPIの検証されたSINCLAIR(商標)ミニブタ外科モデル(雌、4~6月齢)を使用した。HFDおよび給餌レジメン、リパーゼ混合プロトコル、糞便試料の収集および調製、ならびに分析は上記と同じであった。術前値(92.8%+/-3.2SD、n=8)と比較して、投与直前に測定された術後CFAは39.9%+/-13.2SD(p<0.0001、n=8)に減少した。配列番号868を、以前の研究と橋渡しするために258,000U(0.5gの凍結乾燥された粉末)で投与し、低用量有効性を評価するために86,000U(167mg)および29,000U(55.5mg)で投与した。評価した全ての用量は、用量依存的にCFAにプラスの効果をもたらした。高用量から低用量まで、CFA値は、投与前と比較して、それぞれ81.3%+/-3.9SD(p<0.0001、n=3)、74%+/-3.6SD(p<0.0001、n=3)および65.5%+/-3.7SD(p<0.0001、n=2)に増加した。
本願中に引用されている全ての刊行物、特許、特許出願およびその他の文献は、それぞれの個別の刊行物、特許、特許出願またはその他の文献が、あらゆる目的のために、参照により組み入れられることが個別に示されているのと同じ程度まで、その全体が、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み入れられる。
様々な特定の実施形態を例示および記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができることが理解されよう。
Claims (47)
- 配列番号2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、2、3、4、22、27/46/97/136/149/385、27/46/385、27/70/136/231/385、27/136/323/385、27/149、27/149/385、27/385、34、38、41、44、46/70、46/149/183/231/385、48、70、73、73/305、82、82/94/101/194/199、82/94/199、83、85、87、89、92、94、96、97/149/385、135、136/385、140、141、142、144、146、149、149/231/385、151、174、175、178、181、183/385、189、194、194/199、195、195/231/385、199、199/213、210、212、213、213/330、216、218、219、226、231/385、238、247、250、270、274、281、292、296、300、308、330、338、379および385から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号94に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、3/4/96/296/300、3/292/296、4、4/11/149/292/296/300、4/96/149/231/296/300、4/96/149/292/296/300、4/96/219/296、4/96/231/296/300、4/96/292/296/300、4/149/174、4/174/219/292/296、4/231/296/300、27、27/34/82、27/73/82/218、27/89、27/89/178、27/89/218、27/218、34/73/218、34/82、34/218、73/82、73/82/183、94/146/175、96/149/174/292/296、96/149/231/292/296、96/149/292/296、96/174/219/231/292/296、96/231/296、146/175/189/281、149/174/292/296、149/174/300、149/219/231/292/296/300、149/231/292/296、149/231/292/296/300、149/296、149/296/300、174/231、174/296、218、231、231/292/296、231/292/296/300、231/296、231/300、292/296、292/296/300、296および296/300から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号94を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号350に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、4、4/27/189/300、4/70、4/102、4/137、4/175/189/218、4/175/189/300、4/175/218/224、4/175/218/373、4/185、4/189/218/373、4/193、4/218/300/369/373、4/228、4/233、4/243、4/271、4/303、4/334、4/336、4/375、25、27/82/174/175/189/218/300/369/373、27/82/174/175/218/300/369、27/82/174/175/218/300/373/382、27/82/174/218/300/373、27/189/218/373、28、33、99、102、104、134、153、174/175/189、174/373、175/189/218/300/373、175/189/373、175/218、175/218/382、189/218/300/373、191、193、231、233、243、293、303、331、336、339、368および373から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号350を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号442に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、26、33、33/174/193/243、33/174/334、33/175/218/303、33/175/218/334/339、33/193、34、38、46、48、70/271/293/334、144、174、174/175/193、174/175/218/339、174/193/303/375、174/193/375、174/218/233/271/293/303、174/218/271/303、175/193/218/233/243/375、175/193/218/243、175/218/375、181、189、193、193/218/243、193/271/303/334、193/293/303、194、195、199、210、218、218/243、218/243/303/334、218/303、225、238、274、281および330から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号442を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号540に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、34/38/174/193/195/243/281/303/330、34/38/174/225/303、34/38/174/303/345、34/174、34/174/193/195/243/281、34/174/193/195/303/330、34/193/195/225/243、34/193/243/303/330、34/281/330、38、38/174/193/195/243/330、38/174/193/225/274/283/303/330、38/174/193/303、38/174/195/281/330、38/174/225/243/281/330、38/174/281、38/174/281/303、38/174/281/303/345、38/193/195/225/303/345、38/195/243/303、38/195/281/303/330、38/195/281/330、38/195/303、49、49/51/98/252/311、49/51/123/252/344、49/98/120/252/344、49/120/252/344、49/123/252/344、49/123/264/344、49/123/311、49/252/344、49/311/344、49/344、51、51/252/344、51/344、98、98/344、123/252/344、129、160、161、174/193/195/225、174/193/303/330、174/195/225/281/303/330/345、174/195/243/281/345、174/195/281/303、174/225/243/281/303/345、174/281/330、174/303、195/225/303/330、252、268および344から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号540を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号646に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、11/16/67/168/180/287、11/16/237/241/287、11/67/168/287、16/67/154/168/237/241/287、16/67/237/287/291、16/168/177、24、24/278、34/49/161/193/243/344、34/49/161/193/344、34/49/161/243/344、34/49/161/252/268/344、34/49/193/243/252/344、34/49/193/344、34/49/243/252、34/49/252/268/344、34/161/193/243/252/268、34/161/193/243/268/344、34/161/193/243/344、34/161/193/252/268/344、34/161/193/252/344、34/161/193/268/344、34/161/243/281/344、34/161/344、34/193/243/252/344、34/193/252/268/344、34/193/268/281、34/252/268/281/344、34/252/344、49/161/193/243/252/344、49/161/193/252/281/344、49/161/243/252/344、49/193/197/243/252/281/344、49/193/243/252/344、49/193/243/344、49/243/344、67/154/237/287、67/168/237、67/168/237/287、67/177/237、154/237/286/287、154/286/287、161/193/252/344、161/193/344、161/344、168/237、186/187/278、193/243/281/344、193/252/268/344、193/252/281/344、237、237/287/291および281/344から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号646を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、24/168/252/281、24/237/287/344、24/252、24/252/287、24/344、213/252/278/344、252/278/344、252/287/344および281から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、24、24/38/49/70/149/161/174/175/189/193/225/231/243/252/271/287/292/293/296/303/334/344/373/385、38、49、70、149、161、174、175、189、193、225、231、243、252、271、287、292、293、296、303、334、344、373および385から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/または5-1に示される少なくとも1つの位置に少なくとも1つの変異を含み、前記位置は、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより熱安定性が高い、請求項1~11のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、酸性pHレベルでより安定である、請求項1~12のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、タンパク質分解に対してより耐性である、請求項1~13のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下においてより活性である、請求項1~14のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下においてより活性である、請求項1~15のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが精製されている、請求項1~16のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、参照配列と比較して、i)増強された触媒活性;ii)酸pHに対する増加した耐容性;iii)pH3.5に対する増加した耐容性;iv)pH3に対する増加した耐容性;v)少なくとも1つのプロテアーゼに対する増加した耐容性;vi)少なくとも1つの胆汁酸塩に対する増加した耐容性;vii)増加した耐熱性;またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)およびvii)のいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1つの改善された特性を示す、請求項1~17のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記参照配列が、配列番号2、94、350、442、540、646、758および868から選択される、請求項18に記載の組換えリパーゼ。
- 請求項1~19のいずれか一項に記載の少なくとも1つの組換えリパーゼを含む組成物。
- 請求項1~19のいずれか一項に記載の少なくとも1つの組換えリパーゼをコードする組換えポリヌクレオチド配列。
- 前記ポリヌクレオチド配列がコドン最適化されている、請求項21に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
- 請求項21および/または22に記載の少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 前記組換えポリヌクレオチド配列が、制御配列に機能的に連結されている、請求項23に記載の発現ベクター。
- 前記制御配列がプロモーターである、請求項23または24に記載の発現ベクター。
- 前記プロモーターが異種プロモーターである、請求項25に記載の発現ベクター。
- 請求項23~26のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が真核生物または原核生物である、請求項27に記載の宿主細胞。
- 組換えポリヌクレオチドによってコードされる組換えリパーゼが産生される条件下で、請求項27または28に記載の宿主細胞を培養することを含む、組換えリパーゼを産生する方法。
- 前記リパーゼを回収する工程をさらに含む、請求項29に記載の方法。
- 前記リパーゼを精製する工程をさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 請求項20に記載の組成物を含む、膵機能不全の処置のための薬学的組成物。
- 薬学的に許容され得る担体および/または賦形剤をさらに含む、請求項32に記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1つのプロテアーゼおよび少なくとも1つのアミラーゼから選択される少なくとも1つの追加の酵素をさらに含む、請求項32および/または33に記載の組成物。
- リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼ活性を含有する膵臓抽出物をさらに含む、請求項32および/または33に記載の組成物。
- 前記組成物が、ヒトへの非経口注射もしくは注入、皮下注射、吸入または皮膚適用に適している、請求項32~35のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物がヒトへの経口投与に適している、請求項32~35のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物が腸溶コーティングをさらに含む、請求項37に記載の薬学的組成物。
- 被験体の膵機能不全の症状を処置および/または予防するための方法であって、膵機能不全を有する被験体を提供すること、および請求項32~38のいずれか一項に記載の薬学的組成物を前記被験体に提供することを含む、方法。
- 膵機能不全の前記症状が改善される、請求項39に記載の方法。
- 前記被験体が、膵機能不全の前記症状を示す被験体によって必要とされる食事より、その脂質含有量がより制限されていない食事を食べることができる、請求項39および/または40に記載の方法。
- 前記被験体が乳児または小児である、請求項39~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験体が成体または若年成体である、請求項39~41のいずれか一項に記載の方法。
- 医薬として使用するための、請求項1~19のいずれか一項に記載の組換えリパーゼまたは請求項20および32~38のいずれか一項に記載の組成物。
- 栄養補助剤として使用するための、請求項1~19のいずれか一項に記載の組換えリパーゼまたは請求項20および32~38のいずれか一項に記載の組成物。
- 膵機能不全の症状の処置または予防において使用するための、請求項1~19のいずれか一項に記載の組換えリパーゼまたは請求項20および32~38のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項20および32~38のいずれか一項に記載の組成物の使用。
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