JP2022545718A - 操作されたリパーゼ改変体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたリパーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、および酸性(pH<7)条件を含む幅広いpH条件下での安定性を提供するように最適化されている。本発明は、治療および/または栄養目的のための、操作されたリパーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびリパーゼポリペプチドを作製するための方法も提供する。
配列表の公式の写しは、「CX7-187WO2_ST25.txt」のファイル名、2020年8月27日の作成日および4.30メガバイトのサイズで、EFS-Webを介してASCII形式のテキストファイルとして本明細書と同時に提出される。EFS-Webを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
膵酵素補充療法(PERT)は、膵酵素機能不全(PEI)の処置における使用が見出されている。膵炎、嚢胞性線維症、セリアック病、炎症性腸疾患および膵臓癌を含む様々な障害は、十二指腸内への膵酵素の減少した分泌の結果としてPEIをもたらし得る。これは、食物の消化不良、腸による脂肪、タンパク質、炭水化物およびビタミンの不十分な吸収をもたらし、栄養不良につながり得る。経口的に投与されるPERT処置が現在利用可能であるが、胃腸管内でのPERTの不十分な活性および/または現行の処置プロトコルに伴う多大な服薬の負担を原因とする患者による不十分な治療の遵守のために、一部の人々では状態が緩和されないことがあり得る。一部の事例では、脂肪吸収係数(coefficient of fat absorption)(CFA)および/または窒素吸収係数(coefficient of nitrogen absorption)(CNA)は、健康な患者のものより劣っており、体重減少および他の健康上の懸念をもたらす。したがって、改善されたPERT処置に対する必要性が当該技術分野に残っている。
本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたリパーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、および酸性(pH<7)条件を含む幅広いpH条件下での安定性を提供するように最適化されている。本発明は、治療および/または栄養目的のための、操作されたリパーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびリパーゼポリペプチドを作製するための方法も提供する。
いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、24/168/252/281、24/237/287/344、24/252、24/252/287、24/344、213/252/278/344、252/278/344、252/287/344および281から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、24M/168T/252V/281P、24M/237Q/287L/344S、24M/252V、24M/252V/287L、24M/344W、213S/252V/278L/344S、252V/278L/344W、252V/287L/344Sおよび281Pから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態において、組換えリパーゼは、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、組換えリパーゼは、F24M/S168T/M252V/G281P、F24M/A237Q/F287L/H344S、F24M/M252V、F24M/M252V/F287L、F24M/H344W、P213S/M252V/Y278L/H344S、M252V/Y278L/H344W、M252V/F287L/H344S、およびG281Pから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている。
93D、R293E、R293F、R293G、R293H、R293I、R293K、R293L、R293M、R293N、R293P、R293Q、R293S、R293T、R293V、R293W、R293Y、R296A、R296C、R296D、R296E、R296F、R296G、R296H、R296I、R296K、R296L、R296M、R296N、R296P、R296Q、R296S、R296T、R296V、R296W、R296Y、P303A、P303C、P303D、P303E、P303F、P303G、P303H、P303I、P303K、P303L、P303M、P303N、P303Q、P303R、P303S、P303T、P303V、P303W、P303Y、T334A、T334C、T334D、T334E、T334F、T334G、T334H、T334I、T334K、T334L、T334M、T334N、T334P、T334Q、T334R、T334S、T334V、T334W、T334Y、H344A、H344C、H344D、H344E、H344F、H344G、H344I、H344K、H344L、H344M、H344N、H344P、H344Q、H344R、H344S、H344T、H344V、H344W、H344Y、F373A、F373C、F373D、F373E、F373G、F373H、F373I、F373K、F373L、F373M、F373N、F373P、F373Q、F373R、F373S、F373T、F373V、F373W、F373Y、P385A、P385C、P385D、P385E、P385F、P385G、P385H、P385I、P385K、P385L、P385M、P385N、P385Q、P385R、P385S、P385T、P385V、P385W、およびP385Yから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。
本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたリパーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、および酸性(pH<7)条件を含む幅広いpH条件下での安定性を提供するように最適化されている。本発明は、治療目的のための、操作されたリパーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。いくつかの実施形態において、本発明のリパーゼ改変体は、PEI状態のPERT処置において使用が見出されている。いくつかの追加の実施形態において、リパーゼは、腸溶コーティングおよび/またはプロトンポンプ阻害剤(PPI)を必要としない形式で投与される。本発明は、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびリパーゼポリペプチドを作製するための方法も提供する。
別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、一般に、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。一般に、本明細書において使用される命名法ならびに以下に記載されている細胞培養、分子遺伝学、微生物学、生化学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験室手順は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。そのような技術は周知であり、当業者に周知の多数の教科書および参考文献に記載されている。標準的な技術またはその改変が、化学合成および化学分析のために使用される。上記および下記の両方の本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、論文および刊行物は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
本発明は、膵酵素機能不全の処置を含む様々な使用に適した操作されたリパーゼを提供する。いくつかの実施形態において、改善された特性を示す操作されたリパーゼは、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/もしくは868と少なくとも約85%、少なくとも約88%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、もしくは約100%のアミノ酸配列同一性と、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/もしくは868または配列番号2、94、350、442、540、646、758および/もしくは868と少なくとも85%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した1もしくはそれを超えるアミノ酸位置に(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれを超えるアミノ酸位置に)配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868と比較したアミノ酸残基差異とを有する。いくつかの実施形態において、1またはそれを超える位置における、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868と比較した残基差異は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 11、12、14、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれを超える保存的アミノ酸置換を含む。しかしながら、他の置換が本発明において使用が見いだされるので、本発明が保存的アミノ酸置換を有するリパーゼ改変体に限定されることは意図されない。いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/または5-1に列挙されるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、操作されたリパーゼポリペプチドは、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868を含む。
3D、R293E、R293F、R293G、R293H、R293I、R293K、R293L、R293M、R293N、R293P、R293Q、R293S、R293T、R293V、R293W、R293Y、R296A、R296C、R296D、R296E、R296F、R296G、R296H、R296I、R296K、R296L、R296M、R296N、R296P、R296Q、R296S、R296T、R296V、R296W、R296Y、P303A、P303C、P303D、P303E、P303F、P303G、P303H、P303I、P303K、P303L、P303M、P303N、P303Q、P303R、P303S、P303T、P303V、P303W、P303Y、T334A、T334C、T334D、T334E、T334F、T334G、T334H、T334I、T334K、T334L、T334M、T334N、T334P、T334Q、T334R、T334S、T334V、T334W、T334Y、H344A、H344C、H344D、H344E、H344F、H344G、H344I、H344K、H344L、H344M、H344N、H344P、H344Q、H344R、H344S、H344T、H344V、H344W、H344Y、F373A、F373C、F373D、F373E、F373G、F373H、F373I、F373K、F373L、F373M、F373N、F373P、F373Q、F373R、F373S、F373T、F373V、F373W、F373Y、P385A、P385C、P385D、P385E、P385F、P385G、P385H、P385I、P385K、P385L、P385M、P385N、P385Q、P385R、P385S、P385T、P385V、P385W、およびP385Yから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。
本発明は、本明細書に記載の操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製するために、遺伝子発現を制御する1またはそれを超える異種調節配列に機能的に連結される。対応するリパーゼポリペプチドを発現させるために、操作されたリパーゼポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞中に導入することができる。
、L292W、L292Y、R293A、R293C、R293D、R293E、R293F、R293G、R293H、R293I、R293K、R293L、R293M、R293N、R293P、R293Q、R293S、R293T、R293V、R293W、R293Y、R296A、R296C、R296D、R296E、R296F、R296G、R296H、R296I、R296K、R296L、R296M、R296N、R296P、R296Q、R296S、R296T、R296V、R296W、R296Y、P303A、P303C、P303D、P303E、P303F、P303G、P303H、P303I、P303K、P303L、P303M、P303N、P303Q、P303R、P303S、P303T、P303V、P303W、P303Y、T334A、T334C、T334D、T334E、T334F、T334G、T334H、T334I、T334K、T334L、T334M、T334N、T334P、T334Q、T334R、T334S、T334V、T334W、T334Y、H344A、H344C、H344D、H344E、H344F、H344G、H344I、H344K、H344L、H344M、H344N、H344P、H344Q、H344R、H344S、H344T、H344V、H344W、H344Y、F373A、F373C、F373D、F373E、F373G、F373H、F373I、F373K、F373L、F373M、F373N、F373P、F373Q、F373R、F373S、F373T、F373V、F373W、F373Y、P385A、P385C、P385D、P385E、P385F、P385G、P385H、P385I、P385K、P385L、P385M、P385N、P385Q、P385R、P385S、P385T、P385V、P385W、およびP385Yから選択される少なくとも1つの置換または置換の組を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている。
本発明は、以下に記載されるものを含むがこれらに限定されない様々な組成物およびフォーマットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、薬学的およびその他の組成物、例えば、栄養補助食品および/または栄養補助剤における使用に適した操作されたリパーゼポリペプチドを提供する。
以下の実施例(実験および達成された結果を含む)は、例示のみを目的として提供されており、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
以下の実験の開示では、以下の略語が適用される:ppm(百万分率);M(モル濃度);mM(ミリモル濃度)、uMおよびμM(マイクロモル濃度);nM(ナノモル濃度);mol(モル);gmおよびg(グラム);mg(ミリグラム);ugおよびμg(マイクログラム);Lおよびl(リットル);mlおよびmL(ミリリットル);cm(センチメートル);mm(ミリメートル);umおよびμm(マイクロメートル);sec(秒);min(分);hおよびhr(時間);U(単位);MW(分子量);rpm(毎分回転数);℃(摂氏度);CDS(コード配列);DNA(デオキシリボ核酸);RNA(リボ核酸);E.coli W3110(Coli Genetic Stock Center [CGSC]、New Haven,CTから入手可能な、一般的に使用される実験用E.coli株);EPI(膵外分泌機能不全);LIPおよびlip(リパーゼ);btLIP(B.thermoamylovorans)リパーゼ);HPLC(高圧液体クロマトグラフィー);ms(質量分析または質量分光測定法);SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動);PES(ポリエーテルスルホン);ACN(アセトニトリル);IPA(イソプロピルアルコール);IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド);PMBS(硫酸ポリミキシンB);NADPH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸);LB(ルリアブロス);PBS(リン酸緩衝食塩水);MeOH(メタノール);TAG(トリオレイン);DAG(ジオレイン);MAG(モノオレイン);OA(オレイン酸);FIOPCおよびFIOP(陽性対照に対する倍数改善(fold improvement));HTP(高スループット);CAV(セル加速器電圧;コリジョンセル加速器電圧);CE(衝突エネルギー);RF(無線周波数);Sinclair(Sinclair Research、およびSinclair Bio Resources、Auxvasse、MO);Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO);Pall Corp.(Pall,Corp.,Pt.Washington、NY);Millipore(Millipore,Corp.,Billerica MA);Difco(Difco Laboratories,BD Diagnostic Systems,Detroit,MI);Molecular Devices(Molecular Devices,LLC,Sunnyvale,CA);Kuhner(Adolf Kuhner、AG、Basel、Switzerland);Applied Biosystems(Applied Biosystems、Life Technologies、Corp.,Grand Island、NYの一部)、Agilent(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara、CA);RAPIDFIRE(登録商標)MS(RAPIDFIRE(登録商標)質量分析器、Agilent);Thermo Scientific(ThermoFisher Scientific,Waltham,MAの一部);Gibco(ThermoFisher Scientific);Pierce(Pierce Biotechnology(現在は、Thermo Fisher Scientificの一部)、Rockford、IL);ThermoFisher Scientific(Thermo Fisher Scientific,Waltham、MA);Corning(Corning,Inc.,Palo Alto、CA);AbbVie(AbbVie,Inc.,North Chicago、IL);およびBio-Rad(Bio-Rad Laboratories,Hercules、CA)。
細菌リパーゼ遺伝子の取得および発現ベクターの構築
Bacillus thermoamylovoransリパーゼ(配列番号2)をコードするDNA配列をE.coliでの発現のためにコドン最適化し、E.coli発現ベクターpCK110900ベクター系(例えば、米国特許第7,629,157号、米国特許第9,714,437号および米国特許出願公開第2006/0195947号を参照、これらはすべて、参照により本明細書に組み入れられる)またはpJV110900ベクター系(例えば、米国特許出願公開第2017/213758号を参照、同じく参照により本明細書に組み入れられる)にクローニングした。しかしながら、本発明がいかなる特定のベクターにも限定されることは意図されていない。さらに、いくつかの実施形態においては、抗菌剤耐性マーカーを欠く発現ベクターが使用される。W3110由来のE.coli株中に、プラスミド構築物を形質転換した。当業者に周知の定向進化技術を使用して、このプラスミド構築物からの遺伝子改変体(例えば、米国特許第8,383,346号、国際公開第2010/144103号を参照)およびその誘導体のライブラリを作製した。
哺乳動物リパーゼ遺伝子の取得、発現ベクターの構築ならびにHTP増殖および活性スクリーニング
表1中の哺乳動物リパーゼをコードする遺伝子(配列番号1、3、5、7、9および11)を、Saccharomyces cerevisiaeにおける発現のためにコドン最適化した。リパーゼの分泌発現のために、S.cerevisiae接合因子アルファ(MFα)シグナルペプチドを成熟形態のリパーゼに遺伝的に融合させた。国際公開第2016/105889号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、これらの酵母株をHTPで増殖させた。これらの酵母培養物からの上清を、実施例3に記載されているとおりの活性についてアッセイした。これらのリパーゼから得られた活性を表2-1に示す。
リパーゼ改変体のハイスループット(HTP)増殖およびスクリーニング条件
リパーゼ改変体の増殖およびスクリーニングについて行った実験を以下に記載する。
選択を加えた、1%グルコースを含有するLB寒天プレート上に播種することによって、形質転換されたE.coli細胞を選択した。37℃で一晩インキュベートした後、1%グルコースおよび選択を追加補充した180μl/ウェルのLBで満たされた96ウェルの浅い平底プレート(NUNC(商標)、Thermo-Scientific)のウェル中にコロニーを配置した。振盪インキュベータ(200rpm、30℃、相対湿度85%;Kuhner)内で18~20時間、培養物を一晩増殖させた。選択化合物(例えば、クロラムフェニコール)を追加補充した380μLのTerrific Brothで満たされたCOSTAR(登録商標)96ウェル深プレート中に、一晩増殖試料(20μL)を移した。振盪インキュベータ(250rpm、30℃、85%相対湿度;Kuhner)中で135分間、プレートをインキュベートした。次いで、無菌水中の40μLの10mM IPTGでリパーゼ改変体の発現を誘導し、振盪インキュベータ(250rpm、30℃、85%相対湿度;Kuhner)中で一晩、培養物を20~24時間インキュベートした。遠心分離(4000rpm×20分)によって細胞をペレット化し、上清を廃棄し、細胞を分析前に-80℃で凍結した。
まず、200~400μLの溶解緩衝液(1×PBS、1mg/mlリゾチームおよび0.5mg/ml硫酸ポリミキシンB)を細胞ペレットに添加した。細胞ペレットおよび緩衝液を室温で1.5~2時間穏やかに振盪し、本明細書に記載されている様々なHTPアッセイにおいて清澄化された溶解物を使用する前に遠心分離した(4000rpm×5分)。SDS-PAGEによるこれらの溶解物の分析は、btLIPの予想MWと一致する約45kDaの見かけのMWで過剰発現されたタンパク質の存在を明らかにした。
オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、btLIP改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLの溶解物と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。反応を600μLのACN:IPA(1:3)でクエンチし、遠心分離で清澄化し、アセトニトリル中55%IPAの均一濃度流で実行するC18 POROSHELL(登録商標)5μm 150mmカラムで分離して、214nmのオレイン酸、ジオレイン、モノオレインおよびトリオレインを検出した。あるいは、クエンチした反応物を清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。以下の実施例において、「チャレンジなしの活性」とは、以下のアッセイ方法の説明に記載されているように、外的前処理/チャレンジなしで行われたリパーゼ活性決定を指す。
37℃~65℃でのインキュベーション後に、btLIP改変体の活性を決定した。まず、100μLの清澄化された溶解物を96ウェルBioRad Hard-Shell PCR薄壁マイクロタイタープレート(#hsp9601;BioRad)のウェルに添加した。プレートを密封し、分析前にサーモサイクラー中で、37℃~65℃で1時間インキュベートした。オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLの溶解物と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。600μLのACN:IPA(1:3)で反応をクエンチし、清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。結果を実施例4の表に示す。
胃の環境をシミュレートするためにペプシンとのインキュベーション後にbtLIP改変体の活性を決定した。まず、90μLの100mMクエン酸ナトリウム、1.5mg/mLペプシン(P7000 Sigma)を含むまたは含まない2.5mgTAG pH2.0~5.0、および10μLの清澄化された溶解物を96ウェル丸底マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3798;Corning)のウェルに添加した。プレートを密封し、分析前に振盪(THERMOTRON(登録商標)シェーカーHT Infors AJ185、400rpm、行程1インチ)しながら37℃で1時間インキュベートした。オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLのペプシン反応混合物と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。600μLのACN:IPA(1:3)で反応をクエンチし、清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。結果を実施例4の表に示す。
下部腸の環境をシミュレートするために、キモトリプシンおよびトリプシンとのインキュベーション後にbtLIP改変体の活性を決定した。まず、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3798;Corning)のウェルに、50μLのプロテアーゼミックス(0.01~100mg/mlキモトリプシン(C4129、Sigma)、0.01~100mg/mlトリプシン(T7409、Sigma)、0~30μLの、100mMリン酸ナトリウムpH6.5~7.0中の20mMタウロコール酸ナトリウム、および50μLの清澄化された溶解物を加えた。プレートを密封し、分析前に振盪(THERMOTRON(登録商標)シェーカーHT Infors AJ185、400rpm、行程1インチ)しながら37℃で1時間インキュベートした。オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLのプロテアーゼ反応混合物と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。600μLのACN:IPA(1:3)で反応をクエンチし、清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。結果を実施例4の表に示す。
37℃~65℃でのインキュベーション後に、btLIP改変体の活性を決定した。まず、100μLの清澄化された溶解物を96ウェルBioRad Hard-Shell PCR薄壁マイクロタイタープレート(#hsp9601;BioRad)のウェルに添加した。プレートを密封し、胃チャレンジより前にサーモサイクラー中で、37℃~65℃で1時間インキュベートした。次に、胃の環境をシミュレートするために、ペプシンとともにbtLIP改変体をインキュベートした。まず、3.0mg/mLペプシン(P7000 Sigma)を含む50μLの100mMクエン酸ナトリウムpH2.0~5.0、および50μLの熱処理された溶解物を96ウェル丸底マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3798;Corning)のウェルに添加した。プレートを密封し、分析前に振盪(THERMOTRON(登録商標)シェーカーHT Infors AJ185、400rpm、行程1インチ)しながら37℃で1時間インキュベートした。次に、下部腸の環境をシミュレートするために、btLIP改変体をキモトリプシンおよびトリプシンとともにインキュベートした。この工程では、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3798;Corning)のウェルに、100μLのプロテアーゼミックス(0.01~100mg/mlキモトリプシン[C4129;Sigma]、および0.01~100mg/mlトリプシン[T7409;Sigma])、0~30μLの、100mMリン酸ナトリウムpH6.5~7.0中の20mMタウロコール酸ナトリウム、および100μLの熱処理された、胃チャレンジされた溶解物を加えた。プレートを密封し、分析前に振盪(THERMOTRON(登録商標)シェーカーHT Infors AJ185、400rpm、行程1インチ)しながら37℃で1時間インキュベートした。オレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの存在量の経時的変化によってオレイン酸、ジオレインおよびモノオレインの形成を測定することによって、改変体活性を決定した。このアッセイのために、90μLの100mMリン酸ナトリウムおよび2.5μLトリオレインpH7.0を10μLの胃腸反応と混合し、ポリアクリラート96ウェルマイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート#3635;Corning)のウェルに添加し、37℃で30分~1時間インキュベートした。600μLのACN:IPA(1:3)で反応をクエンチし、清澄化し、10μLを190μLの50:50 IPA:MeOH中に希釈し、1分間振盪し、次いで10μLを190μLの50:25:25 H2O:IPA:MeOH中に添加することによって再度希釈した。次いで、RAPIDFIRE(登録商標)MSによって試料を分析した。結果を実施例4の表に示す。
リパーゼ改変体に対するスクリーニング結果
相同体多様性および飽和変異誘発から生成された改変体を、実施例3に記載されているようにいくつかの異なる条件下でスクリーニングした。(配列番号2と比べた)結果を表4-1に示す。この表では、アミノ酸差異は配列番号2と比較して示されている。
配列番号868に対する個々の変異改変体のスクリーニング結果
配列番号2とは異なる24の位置での部位飽和変異誘発を通じて、配列番号868上に単一の点変異を構築した。実施例3に記載されるような様々な前処理に供した後、これらの改変体をリパーゼ活性についてアッセイした。各改変体は三連で試験され、配列番号868および配列番号2の両方に関する活性データの分析が表5-1に列挙されている。
ミニブタにおける膵外分泌機能不全の外科的モデルの検証
膵管結紮によってミニブタにおいて膵外分泌機能不全(EPI)の外科的モデルを作製した。手術の7日前から開始し、実験全体を通して継続して、3~4月齢の雌のSINCLAIR(商標)ミニブタに、高脂肪食(HFD;10:1w/wでBERTOLLI(登録商標)オリーブ油と混合したSinclair標準食S-9)を1日1回与えた。手術前の3連続日ならびに手術後15、16および17日目に、24時間にわたる総糞便排出を収集した。便の正味重量の約1.5倍の体積の蒸留水を添加し、ホモジナイズし、3×50mLのアリコートに分割し、分析まで-20℃で凍結することによって、その後の分析のために、各動物からの毎日の総糞便収集物を調製した。糞便試料中で、脂肪吸収係数(CFA;改変されたVan de Kamer法による;Van de Kamer,in Seligson(ed),Standard Methods of Clinical Chemistry,volume 2,Academic Press,New York,NY[1958],pp.34-39参照)および窒素吸収係数(CNA;燃焼法によるVario Max CN機器によるKjeldahl総窒素;Watsonら、in Petersら(eds.)Recommended Methods of Manure Analysis,Univ.of Wisconsin Cooperative Extension Publishing,Publication No.A3769.Madison WI.[2003],p.18-24参照)を測定し、手術前および手術後にパーセント変化を評価することによって、モデルを検証した。手術前に、健康なミニブタのCFAおよびCNAは、それぞれ91.3%±1.1SEMおよび84.2%±1.2SEMであった。手術後に、CFAは53.2%減少し(p<0.0001、n=11)、CNAは28.7%減少し(p<0.0001、n=11)、したがってEPI研究に関して、この外科的モデルが有効であることが確認された。
CREON(登録商標)Pancrelipaseと比較した、配列番号868のインビボ特徴づけ
現在の標準治療(CREON(登録商標)pancrelipase;AbbVie,Inc.)と比較して操作されたリパーゼ改変体(配列番号868)を評価するために、EPIの検証されたSINCLAIR(商標)ミニブタ外科的モデル(雌、4~5月齢)をインビボ研究へと進めた。投与の少なくとも8日前に開始して、3.9オンスカップ1カップの甘味無添加のアップルソースと組み合わせたHFD(10:1w/wの、BERTOLLI(登録商標)無刺激オリーブ油と混合したSinclair標準S-9食)を1日1回動物に与えた。投与日の間、摂取前に食事性脂肪とのエクスビボでのリパーゼ相互作用を最小限に抑えるために、食事は各動物に対して逐次に調製した。手短に言えば、まず、清潔な給餌ボウル中にHFDを調製した。酸性pHは早期酵素活性化に対して保護したので、次に、酵素(それぞれ258,000Uおよび252,000Uのリパーゼに相当した、0.5gの凍結乾燥された配列番号868粉末、または7×36,000UのCREON(登録商標)pancrelipaseカプセルからプールされた5.6gのミクロスフェア)を3.9オンスカップ1カップの甘味無添加のアップルソース中に混合した。一食あたりに投与された酵素の単位は、USPリパーゼアッセイ(米国薬局方および国民医薬品集(USP42-NF37)Rockville,MD:United States Pharmacopeial Convention;2016;uspnf.com/uspnf/document/GUID-AC788D41-90A2-4F36-A6E7-769954A9ED09_1_en-USからインターネット上で入手可能)によって決定されたリパーゼの比活性および食事中に提供された総算出脂肪に基づいた。次いで、リパーゼ-アップルソース混合物をHFDに移し、迅速に混合した。最後に、次の調製に進む前に、給餌ボウルを直ちに動物に与えた。2時間後、給餌ボウルを取り除いた。動物は30分またはそれ未満に食事全体を消費した。群あたりのミニブタの数を最大化するために(n=3)、クロスオーバー設計を使用した。この研究には、各10日間の投与期の間に8日間の「ウォッシュアウト」(1日1回のHFD+酵素なしのアップルソース)を組み込んだ。投与開始直前ならびに各期の9、10および11日での投与の24時間後に、3日連続、総糞便を収集した。便の正味重量の約1.5倍の体積の蒸留水を各1日の全便収集物に添加し、ホモジナイズし、3×50mLに分割し、分析するまで-20℃で凍結し、残りを廃棄することによって、便試料を調製した。上記のモデル検証について記載したように、分析を完了した。CREON(登録商標)pancrelipaseおよび配列番号868はいずれも、CFAを手術前のベースラインと有意に異ならない値まで同様に改善した。
配列番号868のインビボ用量応答の特徴づけ
さらなるインビボ配列番号868用量応答研究のために、EPIの検証されたSINCLAIR(商標)ミニブタ外科モデル(雌、4~6月齢)を使用した。HFDおよび給餌レジメン、リパーゼ混合プロトコル、糞便試料の収集および調製、ならびに分析は上記と同じであった。術前値(92.8%+/-3.2SD、n=8)と比較して、投与直前に測定された術後CFAは39.9%+/-13.2SD(p<0.0001、n=8)に減少した。配列番号868を、以前の研究と橋渡しするために258,000U(0.5gの凍結乾燥された粉末)で投与し、低用量有効性を評価するために86,000U(167mg)および29,000U(55.5mg)で投与した。評価した全ての用量は、用量依存的にCFAにプラスの効果をもたらした。高用量から低用量まで、CFA値は、投与前と比較して、それぞれ81.3%+/-3.9SD(p<0.0001、n=3)、74%+/-3.6SD(p<0.0001、n=3)および65.5%+/-3.7SD(p<0.0001、n=2)に増加した。
Claims (47)
- 配列番号2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号94、350、442、540、646、758および/または868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、2、3、4、22、27/46/97/136/149/385、27/46/385、27/70/136/231/385、27/136/323/385、27/149、27/149/385、27/385、34、38、41、44、46/70、46/149/183/231/385、48、70、73、73/305、82、82/94/101/194/199、82/94/199、83、85、87、89、92、94、96、97/149/385、135、136/385、140、141、142、144、146、149、149/231/385、151、174、175、178、181、183/385、189、194、194/199、195、195/231/385、199、199/213、210、212、213、213/330、216、218、219、226、231/385、238、247、250、270、274、281、292、296、300、308、330、338、379および385から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号94に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、3/4/96/296/300、3/292/296、4、4/11/149/292/296/300、4/96/149/231/296/300、4/96/149/292/296/300、4/96/219/296、4/96/231/296/300、4/96/292/296/300、4/149/174、4/174/219/292/296、4/231/296/300、27、27/34/82、27/73/82/218、27/89、27/89/178、27/89/218、27/218、34/73/218、34/82、34/218、73/82、73/82/183、94/146/175、96/149/174/292/296、96/149/231/292/296、96/149/292/296、96/174/219/231/292/296、96/231/296、146/175/189/281、149/174/292/296、149/174/300、149/219/231/292/296/300、149/231/292/296、149/231/292/296/300、149/296、149/296/300、174/231、174/296、218、231、231/292/296、231/292/296/300、231/296、231/300、292/296、292/296/300、296および296/300から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号94を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号350に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、4、4/27/189/300、4/70、4/102、4/137、4/175/189/218、4/175/189/300、4/175/218/224、4/175/218/373、4/185、4/189/218/373、4/193、4/218/300/369/373、4/228、4/233、4/243、4/271、4/303、4/334、4/336、4/375、25、27/82/174/175/189/218/300/369/373、27/82/174/175/218/300/369、27/82/174/175/218/300/373/382、27/82/174/218/300/373、27/189/218/373、28、33、99、102、104、134、153、174/175/189、174/373、175/189/218/300/373、175/189/373、175/218、175/218/382、189/218/300/373、191、193、231、233、243、293、303、331、336、339、368および373から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号350を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号442に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、26、33、33/174/193/243、33/174/334、33/175/218/303、33/175/218/334/339、33/193、34、38、46、48、70/271/293/334、144、174、174/175/193、174/175/218/339、174/193/303/375、174/193/375、174/218/233/271/293/303、174/218/271/303、175/193/218/233/243/375、175/193/218/243、175/218/375、181、189、193、193/218/243、193/271/303/334、193/293/303、194、195、199、210、218、218/243、218/243/303/334、218/303、225、238、274、281および330から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号442を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号540に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、34/38/174/193/195/243/281/303/330、34/38/174/225/303、34/38/174/303/345、34/174、34/174/193/195/243/281、34/174/193/195/303/330、34/193/195/225/243、34/193/243/303/330、34/281/330、38、38/174/193/195/243/330、38/174/193/225/274/283/303/330、38/174/193/303、38/174/195/281/330、38/174/225/243/281/330、38/174/281、38/174/281/303、38/174/281/303/345、38/193/195/225/303/345、38/195/243/303、38/195/281/303/330、38/195/281/330、38/195/303、49、49/51/98/252/311、49/51/123/252/344、49/98/120/252/344、49/120/252/344、49/123/252/344、49/123/264/344、49/123/311、49/252/344、49/311/344、49/344、51、51/252/344、51/344、98、98/344、123/252/344、129、160、161、174/193/195/225、174/193/303/330、174/195/225/281/303/330/345、174/195/243/281/345、174/195/281/303、174/225/243/281/303/345、174/281/330、174/303、195/225/303/330、252、268および344から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号540を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号646に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、11/16/67/168/180/287、11/16/237/241/287、11/67/168/287、16/67/154/168/237/241/287、16/67/237/287/291、16/168/177、24、24/278、34/49/161/193/243/344、34/49/161/193/344、34/49/161/243/344、34/49/161/252/268/344、34/49/193/243/252/344、34/49/193/344、34/49/243/252、34/49/252/268/344、34/161/193/243/252/268、34/161/193/243/268/344、34/161/193/243/344、34/161/193/252/268/344、34/161/193/252/344、34/161/193/268/344、34/161/243/281/344、34/161/344、34/193/243/252/344、34/193/252/268/344、34/193/268/281、34/252/268/281/344、34/252/344、49/161/193/243/252/344、49/161/193/252/281/344、49/161/243/252/344、49/193/197/243/252/281/344、49/193/243/252/344、49/193/243/344、49/243/344、67/154/237/287、67/168/237、67/168/237/287、67/177/237、154/237/286/287、154/286/287、161/193/252/344、161/193/344、161/344、168/237、186/187/278、193/243/281/344、193/252/268/344、193/252/281/344、237、237/287/291および281/344から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号646を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号758に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、24/168/252/281、24/237/287/344、24/252、24/252/287、24/344、213/252/278/344、252/278/344、252/287/344および281から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号758を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号868に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、24、24/38/49/70/149/161/174/175/189/193/225/231/243/252/271/287/292/293/296/303/334/344/373/385、38、49、70、149、161、174、175、189、193、225、231、243、252、271、287、292、293、296、303、334、344、373および385から選択される1またはそれを超える位置に少なくとも1つの置換または置換の組を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号868を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7および/または5-1に示される少なくとも1つの位置に少なくとも1つの変異を含み、前記位置は、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868を参照して付番されている、請求項1に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより熱安定性が高い、請求項1~11のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、酸性pHレベルでより安定である、請求項1~12のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、タンパク質分解に対してより耐性である、請求項1~13のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下においてより活性である、請求項1~14のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、配列番号2、94、350、442、540、646、758および/または868のリパーゼより、少なくとも1つの胆汁酸塩の存在下においてより活性である、請求項1~15のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが精製されている、請求項1~16のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記組換えリパーゼが、参照配列と比較して、i)増強された触媒活性;ii)酸pHに対する増加した耐容性;iii)pH3.5に対する増加した耐容性;iv)pH3に対する増加した耐容性;v)少なくとも1つのプロテアーゼに対する増加した耐容性;vi)少なくとも1つの胆汁酸塩に対する増加した耐容性;vii)増加した耐熱性;またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)およびvii)のいずれかの組み合わせから選択される少なくとも1つの改善された特性を示す、請求項1~17のいずれか一項に記載の組換えリパーゼ。
- 前記参照配列が、配列番号2、94、350、442、540、646、758および868から選択される、請求項18に記載の組換えリパーゼ。
- 請求項1~19のいずれか一項に記載の少なくとも1つの組換えリパーゼを含む組成物。
- 請求項1~19のいずれか一項に記載の少なくとも1つの組換えリパーゼをコードする組換えポリヌクレオチド配列。
- 前記ポリヌクレオチド配列がコドン最適化されている、請求項21に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
- 請求項21および/または22に記載の少なくとも1つの組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 前記組換えポリヌクレオチド配列が、制御配列に機能的に連結されている、請求項23に記載の発現ベクター。
- 前記制御配列がプロモーターである、請求項23または24に記載の発現ベクター。
- 前記プロモーターが異種プロモーターである、請求項25に記載の発現ベクター。
- 請求項23~26のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が真核生物または原核生物である、請求項27に記載の宿主細胞。
- 組換えポリヌクレオチドによってコードされる組換えリパーゼが産生される条件下で、請求項27または28に記載の宿主細胞を培養することを含む、組換えリパーゼを産生する方法。
- 前記リパーゼを回収する工程をさらに含む、請求項29に記載の方法。
- 前記リパーゼを精製する工程をさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 請求項20に記載の組成物を含む、膵機能不全の処置のための薬学的組成物。
- 薬学的に許容され得る担体および/または賦形剤をさらに含む、請求項32に記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1つのプロテアーゼおよび少なくとも1つのアミラーゼから選択される少なくとも1つの追加の酵素をさらに含む、請求項32および/または33に記載の組成物。
- リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼ活性を含有する膵臓抽出物をさらに含む、請求項32および/または33に記載の組成物。
- 前記組成物が、ヒトへの非経口注射もしくは注入、皮下注射、吸入または皮膚適用に適している、請求項32~35のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物がヒトへの経口投与に適している、請求項32~35のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物が腸溶コーティングをさらに含む、請求項37に記載の薬学的組成物。
- 被験体の膵機能不全の症状を処置および/または予防するための方法であって、膵機能不全を有する被験体を提供すること、および請求項32~38のいずれか一項に記載の薬学的組成物を前記被験体に提供することを含む、方法。
- 膵機能不全の前記症状が改善される、請求項39に記載の方法。
- 前記被験体が、膵機能不全の前記症状を示す被験体によって必要とされる食事より、その脂質含有量がより制限されていない食事を食べることができる、請求項39および/または40に記載の方法。
- 前記被験体が乳児または小児である、請求項39~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験体が成体または若年成体である、請求項39~41のいずれか一項に記載の方法。
- 医薬として使用するための、請求項1~19のいずれか一項に記載の組換えリパーゼまたは請求項20および32~38のいずれか一項に記載の組成物。
- 栄養補助剤として使用するための、請求項1~19のいずれか一項に記載の組換えリパーゼまたは請求項20および32~38のいずれか一項に記載の組成物。
- 膵機能不全の症状の処置または予防において使用するための、請求項1~19のいずれか一項に記載の組換えリパーゼまたは請求項20および32~38のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項20および32~38のいずれか一項に記載の組成物の使用。
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