ES2435990T3

ES2435990T3 - Enzimas mejoradas

Info

Publication number: ES2435990T3
Application number: ES05762814T
Authority: ES
Inventors: Sybille Ebert; Hans-Peter Hohmann; Martin Lehmann; Nigel John Mouncey; Markus Wyss
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2004-07-07
Filing date: 2005-07-07
Publication date: 2013-12-26
Anticipated expiration: 2025-07-07
Also published as: WO2006003015A3; JP2008504833A; EP1814983B1; US7989189B2; WO2006003015A2; EA011257B1; KR20070041538A; BRPI0513061B8; CN101014705A; BRPI0513061A; JP5134953B2; EA200700287A1; CN101014705B; EP1814983A2; KR101227226B1; BRPI0513061B1; US20080193998A1

Abstract

Una GTP ciclohidrolasa II modificada seleccionada de Bacillus que muestra un incremento en la actividadespecífica de al menos alrededor de 10 % en comparación con la enzima no modificada correspondiente, en la quese han sustituido restos de aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 261, 270, 276, 279,308 y/o 347 de SEQ ID NO:2, conduciendo dichas sustituciones a restos de aminoácidos seleccionados del grupoque consiste en: (a) alanina en una posición que corresponde a la posición 261 de SEQ ID NO:2, (b) alanina en una posición que corresponde a la posición 270 de SEQ ID NO:2, (c) treonina en una posición que corresponde a la posición 276 de SEQ ID NO:2, (d) arginina en una posición que corresponde a la posición 279 de SEQ ID NO:2, (e) arginina en una posición que corresponde a la posición 308 de SEQ ID NO:2, y (f) isoleucina en una posición que corresponde a la posición 347 de SEQ ID NO:2.

Description

Enzimas mejoradas

La presente invención proporciona enzimas modificadas con actividad de GTP ciclohidrolasa II mayor que las enzimas de tipo salvaje respectivas. Las enzimas modificadas y polinucleótidos que las codifican se pueden usar para la producción de riboflavina, precursores de riboflavina, mononucleótido de flavina (FMN), dinucleótido de flavina y adenina (FAD), y sus derivados.

La riboflavina (vitamina B2) es sintetizada por todas las plantas y muchos microorganismos, pero no es producida por animales superiores. Debido a que es un precursor de coenzimas tales como el dinucleótido de flavina y adenina y el mononucleótido de flavina, que son necesarios en la oxidación enzimática de hidratos de carbono, la riboflavina es esencial para el metabolismo básico. En animales superiores, una insuficiencia de riboflavina puede provocar pérdida del cabello, inflamación de la piel, deterioro de la visión, e insuficiencia del crecimiento.

La manipulación mediante ingeniería de cepas de producción de riboflavina con mayores velocidades y rendimientos de producción de riboflavina se ha logrado en el pasado de muchas maneras diferentes. Por ejemplo, (1) se usó mutagénesis clásica para generar variantes con mutaciones aleatorias en el genoma del organismo de elección, seguido de la selección por mayor resistencia a análogos de purina y/o identificando una mayor producción de riboflavina. (2) Como alternativa, las enzimas terminales de la biosíntesis de riboflavina, es decir, las enzimas que catalizan la conversión de trifosfato de guanosina (GTP) y ribulosa-5-fosfato en riboflavina, estaban sobreexpresadas, dando como resultado también un mayor flujo hacia el producto diana. Sin embargo, en este último enfoque, la fuerte sobreexpresión de las proteínas de la biosíntesis de riboflavina impone una carga metabólica adicional en las células hospedantes, lo que, a su vez, puede inducir reacciones de respuesta de estrés y otros efectos negativos indeseables en la fisiología de las células.

Las enzimas requeridas que catalizan la biosíntesis de riboflavina a partir de trifosfato de guanosina (GTP) y ribulosa-5-fosfato están codificadas por cuatro genes (ribG, ribB, ribA, y ribH) en B. subtilis. Estos genes están situados en un operón, cuyo orden génico difiere del orden de las reacciones enzimáticas catalizadas por las enzimas. Por ejemplo, GTP ciclohidrolasa II, que cataliza la primera etapa en la biosíntesis de riboflavina, es codificada por el tercer gen en el operón, ribA. El gen ribA también codifica una segunda actividad enzimática, es decir, 3,4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato sintasa (DHBPS), que cataliza la conversión de ribulosa-5-fosfato a la unidad de cuatro carbonos 3,4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato (DHBP). La desaminasa y la reductasa son codificadas por el primer gen del operón, ribG. La penúltima etapa en la biosíntesis de la riboflavina está catalizada por lumazina sintasa, el producto del último gen rib, ribH. La riboflavina sintasa, que controla la última etapa de la ruta, es codificada por el segundo gen del operón, ribB. La función del gen situado en el extremo 3’ del operón rib es actualmente incierta; sin embargo, su producto génico no es necesario para la síntesis de riboflavina.

La transcripción del operón de riboflavina a partir del promotor ribP1 está controlada por un mecanismo de atenuación que implica una región líder reguladora situada entre ribP1 y ribG. Las mutaciones ribO en esta región líder dan como resultado la expresión desregulada del operón de riboflavina. La expresión desregulada también se observa en cepas que contienen mutaciones con cambio de sentido en el gen ribC. Se ha demostrado que el gen ribC codifica la flavina cinasa/FAD sintasa de B. subtilis (Mack, M., et al., J. Bacteriol., 180:950-955, 1998). Las mutaciones desregulantes reducen la actividad de flavocinasa del producto del gen ribC dando como resultado concentraciones intracelulares reducidas de mononucleótido de flavina (FMN), la molécula efectora del sistema regulador de riboflavina.

Recientemente, se modificó genéticamente mediante ingeniería a Bacillus subtilis para producir niveles elevados de riboflavina durante un ciclo de fermentación corto (patente U.S. nº 5.837.528). Este enfoque combinó selección clásica de mutantes genéticos y mejora de la fermentación con ingeniería genética de los genes biosintéticos de riboflavina desregulando e incrementando el nivel de expresión génica. En este sistema, la expresión de los genes rib se incrementó al mutar el gen ribC que codifica flavocinasa, enlazando los genes rib a promotores constitutivos fuertes, e incrementando el número de copias de los genes rib.

Como ya se ha discutido anteriormente, la sobreexpresión de los genes rib plantea una carga adicional en las cepas de producción, lo cual puede tener, potencialmente, un impacto negativo sobre la producción de precursores de riboflavina, fiboflavina, FMN, FAD, o sus derivados. A fin de eludir este defecto, es un objeto de la presente invención describir mutantes de GTP ciclohidrolasa II con actividad específica incrementada. El uso de tales enzimas mutantes en cepas de producción, ya sea solas o combinadas con mutantes mejorados de las otras proteínas Rib, permitirá mayores velocidades de flujo con menos carga o ninguna carga adicional sobre el metabolismo de las células.

Como se usa aquí, la expresión “GTP ciclohidrolasa II” puede incluir cualquier enzima que sea capaz de catalizar la conversión de GTP en 2,5-diamino-6-ribosilamino-4 (3H)-pirimidinona-5’-fosfato DRAPP). Es irrelevante si esta enzima es capaz de catalizar otras reacciones, como por ejemplo la conversión de ribulosa-5-fosfato en DHBP. Una “GTP ciclohidrolasa II” puede ser homóloga a una o más de las enzimas cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en la Figura 1 o en la Tabla 4. “Homóloga” se refiere a una GTP ciclohidrolasa II que es al menos alrededor de 50% idéntica, preferiblemente al menos alrededor de 60% idéntica, más preferiblemente al menos alrededor de 70%, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 80%, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 85%, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 90% o 95% idéntica, y lo más preferible al menos alrededor de 98% idéntica a una o más de las secuencias de aminoácidos como se muestran en la Figura 1 o en la Tabla 4.

La expresión “% de identidad”, como se conoce en la técnica, significa el grado de relación entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, como se determina mediante el emparejamiento entre cadenas de tales secuencias. La “identidad” se puede determinar fácilmente mediante métodos conocidos, por ejemplo con el programa BESTFIT (GCG Wisconsin Package, versión 10.2, Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, USA) usando los siguientes parámetros: penalización de creación de salto 8, penalización de extensión de salto 2 (parámetros por defecto).

“Enzima de tipo salvaje” o “GTP ciclohidrolasa II de tipo salvaje” puede incluir cualquier GTP ciclohidrolasa II homóloga a una cualquiera de las enzimas mostradas en la Figura 1 o en la Tabla 4 que se usa como punto de partida para diseñar mutantes con mayor actividad según la presente invención. “Tipo salvaje”, en el contexto de la presente invención, puede incluir tanto secuencias de GTP ciclohidrolasa II derivables de la naturaleza así como variantes de enzimas GTP ciclohidrolasa II sintéticas (en tanto que sean homólogas a una cualquiera de las secuencias mostradas en la Figura 1 o en la Tabla 4), si se pueden hacer más activas mediante cualquiera de las enseñanzas de la presente invención. Las expresiones “GTP ciclohidrolasa II de tipo salvaje” y “GTP ciclohidrolasa II no modificada” se usan aquí de forma intercambiable.

Un “mutante”, “enzima mutante”, o “GTP ciclohidrolasa II mutante”, puede incluir cualquier variante derivable de una enzima/ GTP ciclohidrolasa II de tipo salvaje dada (según la definición anterior) de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, y que es más activa que la enzima de tipo salvaje respectiva. Para el alcance de la presente invención, no es relevante cómo se obtiene el mutante o mutantes; tales mutantes se pueden obtener, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de saturación, mutagénesis al azar/evolución dirigida, mutagénesis química o por UV de todas las células/organismos, y otros métodos que son conocidos en la técnica. Estos mutantes también se pueden generar, por ejemplo, diseñando genes sintéticos, y/o se pueden producir mediante traducción in vitro (libre de células). Para ensayar la actividad específica, los mutantes se pueden (sobre)expresar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las expresiones “GTP ciclohidrolasa II mutante” y “GTP ciclohidrolasa II modificada” se usan aquí de forma intercambiable. Esto también se aplica a las expresiones “enzima mutante” y “enzima modificada”.

“Precursor de riboflavina” y “derivados de riboflavina, FMN o FAD”, en el contexto de esta invención de esta solicitud de patente, puede incluir cualquiera y todos los metabolitos que requieran como enzima intermedia GTP ciclohidrolasa II en su (bio)síntesis. En el contexto de esta solicitud de patente, es irrelevante si tales rutas (bio)sintéticas son naturales o no naturales (es decir, rutas que no se producen en la naturaleza, sino que están manipuladas biotecnológicamente mediante ingeniería). Preferiblemente, las rutas sintéticas son de naturaleza bioquímica. Los precursores de riboflavina y derivados de riboflavina, FMN o FAD, incluyen pero no se limitan a: DRAPP; 5-amino-6-ribosilamino-2,4(1H,3H)-pirimidindiona-5’-fosfato; 2,5-diamino-6-ribitilamino-4(3H)-pirimidinona5’-fosfato; 5-amino-6-ribitilamino-2,4(1H,3H)-pirimidindiona-5’-fosfato; 5-amino-6-ribitilamino-2,4(1H,3H)pirimidindiona; 6,7-dimetil-8-ribitilumazina (DMRL); y flavoproteínas. El término “riboflavina” también incluye derivados de riboflavina, tales como, por ejemplo, riboflavin-5-fosfato, y sus sales, tales como, por ejemplo, riboflavin-5-fosfato de sodio.

En general, es un objeto de la presente invención proporcionar una enzima que tiene actividad de GTP ciclohidrolasa II, estando dicha enzima modificada de tal manera que las propiedades catalíticas son más favorables (es decir, que muestran mayor actividad específica) que aquellas de la enzima GTP ciclohidrolasa II no modificada.

De este modo, la presente invención se refiere a una GTP ciclohidrolasa II modificada seleccionada de Bacillus, en la que

(i): la actividad específica de la enzima modificada aumenta en al menos alrededor de 10 % en comparación con la enzima no modificada correspondiente, y

(ii): la secuencia de aminoácidos de la enzima modificada comprende una o más sustituciones que incluyen 1, 2, 3, 4, 5, o 6 sustituciones en la posición o posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones 261, 270, 276, 279, 308 y/o 347 de SEC ID NO:2,

en la que dichas sustituciones conducen a restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:

(a): alanina en una posición que corresponde a la posición 261 de SEQ ID NO:2,

(b): alanina en una posición que corresponde a la posición 270 de SEQ ID NO:2,

(c): treonina en una posición que corresponde a la posición 276 de SEQ ID NO:2,

(d): arginina en una posición que corresponde a la posición 279 de SEQ ID NO:2,

(e): arginina en una posición que corresponde a la posición 308 de SEQ ID NO:2, y

(f): isoleucina en una posición que corresponde a la posición 347 de SEQ ID NO:2.

De este modo, la presente invención se refiere a una GTP ciclohidrolasa II modificada seleccionada de Bacillus que muestra un incremento en la actividad específica de al menos alrededor de 10 % en comparación con la enzima no modificada correspondiente, en la que se han sustituido restos de aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 261, 270, 276, 279, 308 y/o 347 de SEQ ID NO:2, conduciendo dichas sustituciones a restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:

La expresión “al menos una sustitución” significa una o más mutaciones en una posición como se define anteriormente que conduce a una GTP ciclohidrolasa II modificada que tiene mayor actividad específica en comparación con la enzima no modificada. Una enzima modificada como se describe anteriormente puede consistir en solamente 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 sustituciones en una posición como se define anteriormente que conduce a una mayor actividad específica en comparación con la enzima no modificada, pero también puede incluir otras mutaciones de aminoácidos en otras posiciones, en tanto que la enzima modificada resultante tenga actividad específica aumentada. De este modo, la enzima modificada comprende una o más sustituciones, incluyendo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 mutaciones, en una posición o posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 261, 270, 276, 279, 308 y/o 347 de la secuencia de aminoácidos de GTP ciclohidrolasa II de Bacillus subtilis como se muestra en SEC ID NO: 2. Los ejemplos de tales mutaciones en posiciones distintas de las definidas anteriormente son mutaciones de aminoácidos en una posición correspondiente a la posición de aminoácidos 196, 282, y/o 325 de SEC ID NO:2.

Como se usa aquí, la expresión “actividad específica” representa la velocidad de reacción de las enzimas GTP ciclohidrolasa II de tipo salvaje y mutantes en condiciones de reacción apropiadamente definidas como se describe, por ejemplo, en Ritz et al. (J. Biol. Chem. 276, 22273-22277, 2001), Koh et al. (Mol. Gen. Genet. 251, 591598,1996), o Schramek et al, (J. Biol, Chem. 276,44157-44162, 2001), o como se describe en detalle en el Ejemplo

2. La “actividad específica” define la cantidad de un sustrato consumido y/o producto producido en un período de tiempo dado y por cantidad definida de proteína a una temperatura definida. Típicamente, la “actividad específica” se expresa en !moles de sustrato consumido o producto formado por min. por mg de proteína. Típicamente, !mol/min. se abrevia mediante U (= unidad). Por lo tanto, las definiciones de unidad para actividad específica de !mol/min./(mg de proteína) o U/(mg de proteína) se usan de forma intercambiable a lo largo de este documento. Se entiende que en el contexto de la presente invención, la actividad específica se debe de comparar en base a una longitud similar,

o preferiblemente idéntica, de la cadena polipeptídica. La invención no se debe eludir incrementando el tamaño de una enzima de tipo salvaje dada a través de la formación, por ejemplo, de una proteína de fusión, reduciendo de ese modo la actividad específica aparente de la enzima global.

Según la presente invención, la GTP ciclohidrolasa II modificada muestra una actividad específica que es mayor en al menos alrededor de 10% que la de la enzima no modificada correspondiente. Preferiblemente, la actividad específica de la GTP ciclohidrolasa II modificada de la invención está incrementada en al menos alrededor de 25, 40, 60, 70, 80, 85, 90%, más preferiblemente al menos alrededor de 70%, en comparación con la GTP ciclohidrolasa II no modificada correspondiente (para la medición de la actividad específica, véase más abajo). Preferiblemente, incremento en la actividad específica se refiere a las condiciones experimentales descritas en el Ejemplo 1 de esta solicitud. Aproximadamente 0,004-0,02 U/ml (que corresponde a aproximadamente 40 !g/ml de GTP ciclohidrolasa II de Bacillus subtilis, o 20 !g/ml para los mejores mutantes descritos aquí), preferiblemente de forma aproximada 0,004 U/ml de actividad de GTP ciclohidrolasa II, estuvieron presentes en la mezcla de ensayo, y la reacción se llevó a cabo a 37ºC.

La secuencia de aminoácidos de la GTP ciclohidrolasa II modificada de la invención contiene al menos una sustitución como se define anteriormente, cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la GTP ciclohidrolasa II no modificada correspondiente.

La secuencia de aminoácidos de la GTP ciclohidrolasa II modificada contiene al menos una sustitución de aminoácido cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la GTP ciclohidrolasa II no modificada correspondiente, es decir, comprende una o más, incluyendo 1, 2, 3, 4, 5, o 6, sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones 261, 270, 276, 279, 308 y/o 347 de SEC ID NO:2, preferiblemente 2, 3, 4 ó 5 sustituciones de aminoácidos. De este modo, la enzima modificada contiene preferiblemente al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 sustituciones cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la GTP ciclohidrolasa II no modificada correspondiente.

En una realización, se proporciona una GTP ciclohidrolasa II modificada procedente de Bacillus, preferiblemente Bacillus subtilis, que muestra un incremento en la actividad específica de al menos alrededor de 10% en comparación con la enzima no modificada correspondiente, en la que se han sustituido los restos de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 261, 270, 276, 279, 308 y/o 347 de SEC ID NO:2, conduciendo dichas sustituciones a restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:

(a): alanina en una posición correspondiente a la posición 261 de SEC ID NO:2,

(b): alanina en una posición correspondiente a la posición 270 de SEC ID NO:2,

(c): treonina en una posición correspondiente a la posición 276 de SEC ID NO:2,

(d): arginina en una posición correspondiente a la posición 279 de SEC ID NO:2,

(e): arginina en una posición correspondiente a la posición 308 de SEC ID NO:2, y

(f): isoleucina en una posición correspondiente a la posición 347 de SEC ID NO:2.

En una realización, la enzima no modificada corresponde a GTP ciclohidrolasa II de Bacillus subtilis como se muestra en SEC ID NO:2. De este modo, la enzima modificada que tiene una mayor actividad específica en comparación con la enzima de tipo salvaje comprende una o más sustituciones, incluyendo 1, 2, 3, 4, 5, o 6, en las posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones 261, 270, 276, 279, 308 y/o 347 de SEC ID NO:2. En una realización adicional, la enzima modificada que tiene mayor actividad específica como se define anteriormente contiene una mutación o mutaciones de aminoácidos junto a las posiciones de aminoácidos como anteriormente, estando dicha mutación o mutaciones adicionales en una posición seleccionada del grupo que consiste en la posición 196, 282, 235 y cualquier combinación de las mismas, preferiblemente sustituciones de aminoácidos, más preferiblemente las sustituciones son Y196C (sustitución de tirosina por cisteína), A282T (sustitución de alanina por treonina) o F325Y (sustitución de fenilalanina por tirosina).

Una GTP ciclohidrolasa II no modificada puede ser cualquier GTP ciclohidrolasa II para la cual sea deseable incrementar la actividad específica. Las enzimas de GTP ciclohidrolasa II modificadas incluyen, pero no se limitan a, enzimas de GTP ciclohidrolasa II derivables de la naturaleza, tales como enzimas de origen eucariota o procariota, preferiblemente fúngico o bacteriano. Más preferiblemente, la enzima no modificada se selecciona de aquellas mostradas en la Figura 1 o en la Tabla 4, o que es homóloga a cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se muestra en la Figura 1 o en la Tabla 4, en particular seleccionadas del grupo que consiste en Ashbya, Saccharomyces, Eremothecium, Candida, Neurospora, Schizosaccharomyces, Archeoglobus, Streptomyces, Helicobacter, Escherichia, Corynebacterium, Thermotoga, Arabidopsis, Lycopersicum, Oryza, Alcaligenes, Pseudomonas, Dinococcus, Lactobacillus, Photobacterium y Bacillus y preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en Candida guilliermondii, Ashbya gossypii (Eremothecium ashbyii) (SEC ID NO:33), Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa, Schizosaccharomyces pombe, Archeoglobus fulgidus, Streptomyces coelicolor, Helicobacter pylori J99, Escherichia coli (SEC ID NO:35), Corynebacterium glutamicum (SEC ID NO:37), Bacillus amyloliquefaciens (SEC ID NO:39), Bacillus cereus (SEC ID NO:41), Bacillus halodurans (SEC ID NO:43), Thermotoga maritima, Arabidopsis thaliana, Lycopersicum exculentum, Oryza sativum, Alcaligenes eutrophus, cepa KT2440 de Pseudomonas putida, Corynebacterium efficiens, Deinococcus radiodurans, Lactobacillus plantarum, Photobacterium phosphoreum, cepa KT2440 de Pseudomonas putida (segundo gen) y Bacillus subtilis (SEC ID NO:2). Muy preferiblemente, la enzima no modificada se obtiene de Bacillus subtilis.

La GTP ciclohidrolasa II modificada de la invención se puede obtener mutando la GTP ciclohidrolasa II no modificada correspondiente. En una realización, la enzima no modificada corresponde a la GTP ciclohidrolasa II de

B. subtilis mostrada en SEC ID NO:2, y la enzima modificada comprende una o más sustituciones de aminoácidos, incluyendo 1, 2, 3, 4, 5, o 6, en las posiciones de los aminoácidos 261, 270, 276, 279, 308 y/o 347 de SEC ID NO:2, en la que la actividad específica de dicha enzima modificada está incrementada en comparación con la enzima no modificada, como se define aquí.

Preferiblemente, la al menos una sustitución es en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones 261, 279, 308 y 347 de la secuencia de aminoácidos de GTP ciclohidrolasa II de Bacillus subtilis como se muestra en SEC ID NO:2. De este modo, en una realización, la GTP ciclohidrolasa II modificada comprende una o más sustituciones, incluyendo 1, 2, 3 ó 4, en las posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones 261, 279, 308 y/o 347 de SEC ID NO:2. En una realización preferida, la enzima modificada se obtiene de B. subtilis y comprende las posiciones de aminoácidos sustituidas 261, 279, 308 y/o 347 como se muestra en SEC ID NO:2, correspondientes a los aminoácidos V261, Q279, K308, y M374, respectivamente.

En otra realización preferida, la al menos una sustitución es en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones 270, 279, 308 y 347 de la secuencia de aminoácidos de GTP ciclohidrolasa II de Bacillus subtilis como se muestra en SEC ID NO:2. De este modo, en una realización, la GTP ciclohidrolasa II modificada comprende una o más sustituciones, incluyendo 1, 2, 3 ó 4, en las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 270, 279, 308 y/o 347 de SEC ID NO:2. Preferiblemente, la enzima modificada se obtiene de B. subtilis, y comprende las posiciones de aminoácidos sustituidas 270, 279, 308 y/o 347 como se muestra en SEC ID NO:2, correspondientes a los aminoácidos G270, Q279, K308, y M374, respectivamente.

En una realización adicional preferida, la al menos una sustitución es en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 276, 279, 308 y 347 de la secuencia de aminoácidos de GTP ciclohidrolasa II de Bacillus subtilis como se muestra en SEC ID NO:2. De este modo, en una realización adicional, la GTP ciclohidrolasa II modificada comprende una o más sustituciones, incluyendo 1, 2, 3 ó 4, en las posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones 276, 279, 308 y/o 347 de la secuencia de aminoácidos de GTP ciclohidrolasa II de Bacillus subtilis como se muestra en SEC ID NO:2. Preferiblemente, la enzima modificada es obtenible de B. subtilis, y comprende las posiciones de aminoácidos sustituidas 276, 279, 308 y/o 347 como se muestra en SEC ID NO:2, correspondientes a los aminoácidos A276, Q279, K308, y M374, respectivamente.

Una GTP ciclohidrolasa II modificada puede comprender una o más sustituciones, incluyendo sólo una, en una posición de aminoácido como se define anteriormente, tal sustitución de aminoácido, puede incluir una sustitución en una posición de aminoácidos que corresponde a la posición 261, 270, 276, 279, 308, o 347 de la secuencia de aminoácidos de GTP ciclohidrolasa II de Bacillus subtilis como se muestra en SEC ID NO:2. El aminoácido presente en la GTP ciclohidrolasa II no modificada correspondiente a la posición 261 puede ser valina, el aminoácido presente en la GTP ciclohidrolasa II no modificada correspondiente a la posición 270 puede ser glicina, el aminoácido presente en la GTP ciclohidrolasa II no modificada correspondiente a la posición 276 puede ser alanina, el aminoácido presente en la GTP ciclohidrolasa II no modificada correspondiente a la posición 279 puede ser glutamina, el aminoácido presente en la GTP ciclohidrolasa II no modificada correspondiente a la posición 308 puede ser lisina, y el aminoácido presente en la GTP ciclohidrolasa II no modificada correspondiente a la posición 347 puede ser metionina.

El aminoácido en la secuencia de la GTP ciclohidrolasa II no modificada se cambia de manera que el aminoácido correspondiente a la posición 261 se cambia a alanina (por ejemplo V261A), el aminoácido correspondiente a la posición 270 se cambia a alanina (por ejemplo G270A), el aminoácido correspondiente a la posición 276 se cambia a treonina (por ejemplo A276T), el aminoácido correspondiente a la posición 279 se cambia a arginina (por ejemplo Q279A), el aminoácido correspondiente a la posición 308 se cambia a arginina (por ejemplo K308R), y el aminoácido correspondiente a la posición 347 se cambia a isoleucina (por ejemplo M374I). En una realización, la enzima modificada se obtiene de B. subtilis que comprende una sustitución de aminoácido en una posición de SEC ID NO:2 que se selecciona del grupo que consiste en la posición 261, 270, 276, 279, 308, y 347. Preferiblemente, la sustitución se selecciona del grupo que consiste en V261A, G270A, A276T, Q279R, K308R y M347I.

Una GTP hidrolasa II modificada puede comprender una o más sustituciones, incluyendo dos, en posiciones de aminoácidos como se definen anteriormente, tales sustituciones de aminoácidos, pueden incluir sustituciones en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dos de las posiciones como se definen anteriormente, por ejemplo combinaciones de posiciones que corresponden a las posiciones 261/270, 261/276, 261/279, 261/308, 261/347, 270/276, 270/279, 270/308, 270/347, 276/279, 276/308, 276/347, 279/308, 279/347, o 308/347 como se muestra en SEC ID NO:2. Se prefieren las sustituciones de aminoácidos tales como V261A/A276T, V261A/Q279R, V261A/K308R, V261A/M347I, G270A/Q279R, G270A/K308R, G270A/M347I, A276T/Q279R, A276T/K308R, o A276T/M347I, en las que las posiciones corresponden a las posiciones de aminoácidos de SEC ID NO:2. En una realización, tales sustituciones preferidas están comprendidas en una GTP ciclohidrolasa II modificada obtenible de

B. subtilis en la que la enzima no modificada corresponde a SEC ID NO:2. Preferiblemente, la GTP hidrolasa II de B. subtilis modificada como en SEC ID NO:2 comprende las sustituciones V261A/A276T o A276T/M347I.

Una GTP hidrolasa II modificada puede comprender una o más sustituciones, incluyendo tres, en posiciones de aminoácidos como se definen anteriormente, tales sustituciones de aminoácidos, pueden incluir sustituciones en las posiciones de aminoácidos que corresponden a tres de las posiciones como se definen anteriormente, en particular combinaciones de posiciones que corresponden a las posiciones 261/279/308, 261/279/347, 261/308/347, 270/279/308, 270/279/347, 270/308/347, 276/279/308, 276/308/347, o 276/279/347 como se muestra en SEC ID NO:2. Se prefieren las sustituciones de aminoácidos tales como V261A/Q279R/K308R, V261A/K308R/M347I, V261A/Q279R/M347I, G270A/Q279R/K308R, G270A/K308R/M347I, G270A/Q279R/M347I, A276T/Q279R/K308R, A276T/K308R/M347I, o A276T/Q279R/M347I, en las que las posiciones corresponden a las posiciones de aminoácidos de SEC ID NO:2. En una realización, tales sustituciones preferidas están comprendidas en una GTP ciclohidrolasa II modificada obtenible de B. subtilis en la que la enzima no modificada corresponde a SEC ID NO:2. Preferiblemente, la GTP hidrolasa II de B. subtilis modificada como en SEC ID NO:2 comprende las sustituciones A276T/Q279R/M347I.

Una GTP hidrolasa II modificada puede comprender una o más sustituciones, incluyendo cuatro, en posiciones de aminoácidos como se definen anteriormente, tales sustituciones de aminoácidos, pueden incluir sustituciones en las posiciones de aminoácidos que corresponden a cuatro de las posiciones como se definen anteriormente, en particular combinaciones de posiciones que corresponden a las posiciones 261/279/308/347, 270/279/308/347, or 276/279/308/347 como se muestra en SEC ID NO:2. Se prefieren las sustituciones de aminoácidos tales como V261A/Q279R/K308R/M347I, G270A/Q279R/K308R/M347I o A276T/Q279R/K308R/M347I, en las que las posiciones corresponden a las posiciones de aminoácidos de SEC ID NO:2. En una realización, tales sustituciones preferidas están comprendidas en una GTP ciclohidrolasa II modificada obtenible de B. subtilis en la que la enzima no modificada corresponde a SEC ID NO:2. Preferiblemente, la GTP hidrolasa II de B. subtilis modificada como en SEC ID NO:2 comprende las sustituciones A276T/Q279R/K308R/M347I.

Las más preferidas son las combinaciones de sustituciones descritas en la Tabla 1 ó 2 (véase más arriba). Las posiciones de aminoácidos identificadas en estos ejemplos se pueden transferir a enzimas de GTP ciclohidrolasa II de diferente origen, como por ejemplo se muestra en la Figura 1 o en la Tabla 4.

La GTP ciclohidrolasa II modificada de la invención puede comprender aminoácidos extraños, preferiblemente en su término N o C. “Aminoácidos extraños” significa aminoácidos que no están presentes en una GTP ciclohidrolasa II nativa (que aparece en la naturaleza), preferiblemente un tramo de al menos alrededor de 3, al menos alrededor de 5 o al menos alrededor de 7 aminoácidos contiguos que no están presentes en una GTP ciclohidrolasa II nativa. Los tramos preferidos de aminoácidos extraños incluyen, pero no se limitan a, “etiquetas” que facilitan la purificación de la GTP ciclohidrolasa II modificada producida recombinantemente. Los ejemplos de tales etiquetas incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta “His6”, una etiqueta FLAG, una etiqueta myc, y similar. Para el cálculo de la actividad específica, es necesario que los valores sean corregidos para estos aminoácidos adicionales (véase también anteriormente).

En otra realización, la GTP ciclohidrolasa II modificada puede contener una o más, por ejemplo dos, supresiones cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la GTP ciclohidrolasa II no modificada correspondiente. Preferiblemente, las supresiones afectan a los aminoácidos N o C-terminales de la GTP ciclohidrolasa II no modificada correspondiente, y no reducen significativamente las propiedades funcionales, por ejemplo la actividad específica, de la enzima.

Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención, incluyendo las enzimas GTP ciclohidrolasa II modificadas, se pueden proporcionar en forma aislada, y preferiblemente están purificadas hasta homogeneidad. Como se usa aquí, el término “aislada” significa que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un microorganismo vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector, y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición y todavía estar aislados por cuanto tal vector o composición no es parte de su entorno natural. Un polipéptido aislado es preferiblemente mayor que 80% puro, más preferiblemente mayor que 90% puro, incluso más preferiblemente mayor que 95% puro, lo más preferible mayor que 99% puro. La pureza se puede determinar según métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante SDS-PAGE y tinción proteica subsiguiente. Las bandas de proteínas se pueden cuantificar entonces mediante densitometría. Otros métodos para determinar la pureza están dentro del nivel de la pericia normal.

La invención se refiere además a un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una GTP ciclohidrolasa II modificada según la invención. “Polinucleótido”, como se usa aquí, se refiere a un polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido que puede ser ARN o ADN sin modificar, o ARN o ADN modificado. Los polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, ADN mono-o bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias, ARN mono- y bicatenario, y ARN que es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, más típicamente, bicatenarios,

: o una mezcla de regiones mono- y bicatenarias. El término “polinucleótido” incluye ADN o ARN que comprende una

: o más bases inusuales, por ejemplo inosina, o una o más bases modificadas, por ejemplo bases tritiladas.

El polinucleótido de la invención puede obtenerse fácilmente modificando una secuencia polinucleotídica que codifica una GTP ciclohidrolasa II no modificada. Los ejemplos de tales secuencias polinucleotídicas que codifican enzimas de GTP ciclohidrolasa II no modificadas incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de aminoácidos de la Figura 1 o en la Tabla 4, en particular las SEC ID NOs:2, 39, 41, y 43. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos que codifican enzimas de GTP ciclohidrolasa II modificadas según la invención se muestran en SEC ID NOs:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26.

Los métodos para introducir mutaciones, por ejemplo adiciones, supresiones y/o sustituciones, en la secuencia nucleotídica que codifica la GTP ciclohidrolasa II no modificada incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis dirigida al sitio y métodos a base de PCR.

Las secuencias de ADN de la presente invención se pueden construir partiendo de secuencias de ADN genómico o de ADNc que codifican enzimas GTP ciclohidrolasa II conocidas en el estado de la técnica, como están disponibles a partir de, por ejemplo, Genbank (Intelligenetics, California, USA), European Bioinformatics Institute (Hinston Hall, Cambridge, GB), NBRF (Georgetown University, Medical Centre, Washington DC, USA) y Vecbase (University of Wisconsin, Biotechnology Centre, Madison, Wisconsin, USA), o a partir de una información de secuencia descrita en la Figura 1 o en la Tabla 4 mediante métodos de mutagénesis in vitro [véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York]. Otra posibilidad de mutar una secuencia de ADN dada que también puede ser adecuada para la práctica de la presente invención es la mutagénesis usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN como material de partida se puede aislar mediante métodos conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning) a partir de las cepas/organismos respectivos. Sin embargo, se entiende que el ADN que codifica una GTP ciclohidrolasa II a construir/mutar según la presente invención también se puede preparar en base a una secuencia de ADN producida, por ejemplo mediante construcción de un gen sintético mediante métodos conocidos en la técnica (como se describe, por ejemplo, en el documento EP 747483).

El polinucleótido de la invención puede ser un polinucleótido aislado, es decir, un polinucleótido que está sustancialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, tales como, pero sin limitarse a, otro ADN y ARN cromosómico y extracromosómico. Para obtener polinucleótidos aislados, se pueden usar métodos de purificación de ácidos nucleicos convencionales, conocidos por la persona experta en la técnica. El término también abarca polinucleótidos recombinantes y polinucleótidos sintetizados químicamente.

En todavía otras realizaciones, la invención se refiere a un polinucleótido funcional en el que un promotor, un sitio de unión al ribosoma, si es necesario como en el caso de células bacterianas, y un terminador están operablemente enlazados con un polinucleótido según la invención. En todavía una realización adicional, la invención se refiere a un vector o plásmido que comprende tal polinucleótido. El vector o plásmido comprende preferiblemente al menos un gen marcador. La expresión “operablemente enlazado”, como se usa aquí, se refiere a la asociación de secuencias de ácidos nucleicos en un único fragmento de ácido nucleico de manera que la función de una se ve afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está operablemente enlazado con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia codificante, es decir, la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor. Las secuencias codificantes pueden estar operablemente enlazadas a secuencias reguladoras en orientación sentido o antisentido. El término “expresión” se refiere a la transcripción de una secuencia de ADN en ARNm y/o a la traducción de ARNm en una secuencia de aminoácidos. El término “sobreexpresión” significa la producción de un producto génico en un organismo modificado (por ejemplo, modificado mediante transformación o transfección) que excede los niveles de producción en el organismo no modificado correspondiente desregulando la expresión del gen y/o multiplicando el propio gen dentro del organismo.

Una vez que se han obtenido secuencias de ADN completas de la presente invención, se pueden integrar en vectores o se pueden introducir directamente en el genoma de un organismo hospedante mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en, por ejemplo, Sambrook et al. (s.a.) para (sobre)expresar en sistemas hospedantes apropiados el polipéptido codificado. Sin embargo, un experto en la técnica sabe que también las propias secuencias de ADN se pueden usar para transformar los sistemas hospedantes adecuados de la invención para obtener la (sobre)expresión del polipéptido codificado.

Las células hospedantes adecuadas pueden ser células eucariotas o procariotas. Los ejemplos de células hospedantes adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas tales como células de cianobacterias, estreptococos, estafilococos, enterococos, por ejemplo bacilos como, por ejemplo, Bacillus subtilis, o Streptomyces, como por ejemplo Streptomyces lividans o Streptococcus pneumoniae, E. coli como, por ejemplo cepas de E. coli K12, por ejemplo M15 o HB 101. Las células hospedantes pueden ser una célula fúngica, incluyendo células de levadura, tales como células de Aspergilli, por ejemplo Aspergillus niger o Aspergillus oryzae, Trichoderma, por ejemplo Trichoderma reesei, Ashbya, por ejemplo Ashbya gossypii, Eremothecium, por ejemplo Eremothecium ashbyii, Saccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Candida, por ejemplo Candida flareri, Pichia, por ejemplo Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, por ejemplo H. polymorpha (DSM 5215), y Kluyveromyces. Una célula hospedante adecuada se puede seleccionar además de células animales, incluyendo células de mamíferos, tales como por ejemplo CHO, COS, HeLa, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de insectos como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; y células vegetales tales como células de una gimnosperma o angiosperma.

Los vectores que se pueden usar para la expresión en hongos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento EP 420358, o por Cullen et al. (Bio/Technology 5, 369-376, 1987), Ward (en Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, Nueva York, 1991), Upshall et al. (Bio/Technology 5, 1301-1304, 1987), Gwynne et al. (Bio/Technology 5, 71-79, 1987), o Punt et al. (J. Biotechnol. 17, 19-34, 1991), y para levadura, por Sreekrishna et al. (J. Basic Microbiol. 28, 265-278, 1988; Biochemistry 28, 4117-4125, 1989), Hitzemann et al. (Nature 293, 717-722, 1981) o en los documentos EP 183070, EP 183071, EP 248227, o EP 263311. Los vectores adecuados que se pueden usar para la expresión en E. coli son conocidos en la técnica, como se describe por Sambrook et al. (s.a.). Los vectores que se pueden usar para la expresión en Bacilli son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en los documentos EP 207459 o EP 405370, por Yansura y Henner en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439-443 (1984), o por Henner, Le Grice y Nagarajan en Meth. Enzymol. 185, 199-228, 1990. Los vectores que se pueden usar para la expresión en H. polymorpha son conocidos en la técnica, como se describe, por ejemplo, en Gellissen et al., Biotechnology 9, 291-295, 1991.

Cualquiera de tales vectores ya poseen elementos reguladores, por ejemplo promotores, o los polinucleótidos de la presente invención se pueden manipular mediante ingeniería para que contengan tales elementos. Los elementos promotores adecuados que se pueden usar son conocidos en la técnica, y son, por ejemplo, para Trichoderma reesei, el promotor cbh1 o pki1, para Aspergillus oryzae el promotor amy, y para Aspergillus niger, el promotor glaA, alcA, aphA, tpiA, gpdA y pkiA. Los elementos promotores adecuados que se pueden usar para la expresión en levadura son conocidos en la técnica, y son, por ejemplo, el promotor pho5 o gap para la expresión en Saccharomyces cerevisiae, y por ejemplo el promotor aox1 para Pichia pastoris, o el promotor FMD o MOX para H. polymorpha.

Los promotores y vectores adecuados para la expresión bacteriana incluyen, por ejemplo, un promotor sintético descrito por Giacomini et al. (Gene 144, 17-24, 1994), el promotor vegI de Bacillus subtilis, o el promotor T5 de bacteriófago fuerte. Las enseñanzas apropiadas para la expresión de las enzimas GTP ciclohidrolasa II (mutantes) reivindicadas en bacterias, ya sea mediante plásmidos apropiados o a través de la integración de secuencias de ADN que codifican GTP ciclohidrolasa II en el ADN cromosómico, se pueden encontrar en muchos lugares, por ejemplo la patente US nº 6.322.995.

En consecuencia, los vectores que comprenden un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente para la expresión de dichos polinucleótidos en hospedantes bacterianos, fúngicos, animales o vegetales, y tales hospedantes bacterianos o fúngicos, animales o vegetales transformados también son un objeto de la presente invención.

La invención se refiere además a un método para producir riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o uno

o más de sus derivados, que comprende:

(a): cultivar la célula hospedante de la invención en un medio adecuado en condiciones que permitan la expresión en dicha célula hospedante de la GTP ciclohidrolasa II modificada; y

(b): opcionalmente separar el producto (riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o uno o más de sus derivados) del medio.

Tal método se puede usar para la producción biotecnológica de uno o más de los siguientes productos: riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o uno o más de sus derivados. Tales derivados pueden incluir flavoproteínas.

Los métodos de manipulación genética y metabólica mediante ingeniería de células hospedantes adecuadas según la presente invención son conocidos por la persona experta en la técnica. De forma similar, los métodos de purificación (potencialmente) adecuados para riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o uno o más de sus derivados, son bien conocidos en el campo de la biosíntesis química fina y de la producción.

Se entiende que los métodos para la producción biotecnológica de un producto de riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o uno o más de sus derivados según la presente invención no están limitados a procedimientos de fermentación de células completas como se describe anteriormente, sino que también pueden usar, por ejemplo, células hospedantes permeabilizadas, extractos celulares brutos, extractos celulares aclarados de restos celulares mediante, por ejemplo, centrifugación o filtración, o incluso rutas de reacción reconstituidas con enzimas aisladas. También las combinaciones de tales procedimientos están dentro del alcance de la presente invención. En el caso de la biosíntesis libre de células (tal como con rutas de reacción reconstituidas), es irrelevante si las enzimas aisladas se han preparado mediante y aislado de una célula hospedante, mediante transcripción/traducción in vitro, o todavía por otros medios.

La invención se refiere además a un método para producir una GTP ciclohidrolasa II modificada de la invención, que comprende:

(a): cultivar una célula hospedante de la invención en condiciones que permitan la expresión de la GTP ciclohidrolasa II modificada de la invención; y

(b): recuperar la GTP ciclohidrolasa II modificada a partir de células o a partir del medio.

Las enzimas de GTP ciclohidrolasa II modificadas de la invención se pueden preparar a partir de células hospedantes manipuladas genéticamente mediante ingeniería que comprenden sistemas de expresión apropiados.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células hospedantes se pueden manipular genéticamente mediante ingeniería para incorporar polinucleótidos o vectores o plásmidos de la invención. La introducción de un polinucleótido o vector en la célula hospedante se puede efectuar mediante métodos estándar conocidos en la técnica, tales como transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, introducción balística e infección.

Para producir las enzimas de GTP ciclohidrolasa II modificadas de la invención, se puede usar una gran variedad de sistemas de expresión. Tales vectores incluyen, entre otros, los descritos más arriba. Generalmente, a este respecto, para la expresión, se puede usar cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en un hospedante.

En sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, para la secreción de una proteína traducida a la luz del retículo endoplásmico, al espacio periplásmico o al medio extracelular, se pueden incorporar en el polipéptido expresado señales de secreción apropiadas. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido, o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la invención se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxiapatita, y cromatografía de líquidos de altas prestaciones. Cuando el polipéptido se desnaturaliza durante el aislamiento y/o purificación, para regenerar la conformación activa se pueden emplear técnicas bien conocidas para el replegamiento proteico.

Las enzimas de GTP ciclohidrolasa II de la presente invención también se pueden expresar en plantas según métodos como se describen, por ejemplo, por Pen et al. en Bio/Technology 11, 811-814, 1994 o en el documento EP 449375, preferiblemente en semillas, como se describe, por ejemplo, en el documento EP 449376. Algunos ejemplos adecuados de promotores y terminadores incluyen aquellos de los genes de nopalina sintasa (nos), de octopina sintasa (ocs) y del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Un tipo de promotor vegetal eficiente que se puede usar es un promotor vegetal de alto nivel. Tales promotores, en enlazamiento operable con las secuencias genéticas de la presente invención, deberían ser capaces de promover la expresión de un producto génico de la presente invención. Los promotores vegetales de alto nivel que se pueden usar en esta invención incluyen el promotor de la subunidad pequeña (ss) de la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa, por ejemplo de haba de soja, y el promotor de la proteína de unión a clorofila a/b.

Cuando se desea una producción comercial de las actuales proteínas, se puede aplicar una variedad de metodologías de cultivo. Por ejemplo, la producción a gran escala de un producto génico específico, sobreexpresado a partir de un hospedante microbiano recombinante, se puede lograr tanto mediante metodologías de cultivo discontinuas o continuas. Los métodos de cultivo discontinuos o alimentado discontinuo son habituales y bien conocidos en la técnica, y los ejemplos se han descrito por Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edición (1989), Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass., o Deshpande, Appl. Biochem. Biotechnol. 36, 227-234, 1992. Los métodos para modular nutrientes y factores de crecimiento para procesos de cultivo continuos, así como las técnicas para maximizar la velocidad de formación de productos, son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial, y en Brock, más arriba, se detalla una variedad de métodos.

Los medios de fermentación pueden contener además sustratos de carbono adecuados. Los sustratos adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, monosacáridos tales como glucosa o fructosa, oligosacáridos tales como lactosa

o sacarosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa, o sus mezclas, y mezclas sin purificar a partir de materias primas renovables. Se contempla que la fuente de carbono utilizada en la presente invención puede englobar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono, y sólo estará limitada por la elección del organismo.

La invención se refiere además a un método para la preparación de una GTP ciclohidrolasa II que tiene una mayor actividad específica, que comprende las siguientes etapas:

(a): proporcionar un polinucleótido que codifica una primera GTP ciclohidrolasa II con una actividad específica que se va a incrementar en al menos alrededor de 10%;

(b): introducir una o más sustituciones en la secuencia polinucleotídica de manera que la secuencia polinucleotídica modificada codifica una GTP ciclohidrolasa II modificada seleccionada de Bacillus que muestra un incremento en la actividad específica de al menos alrededor de 10% en comparación con la enzima no modificada correspondiente, en la que se han sustituido restos de aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 261, 270, 276, 279, 308 y/o 347 de SEC ID NO:2, conduciendo por ejemplo a sustituciones a restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:

(f): isoleucina en una posición correspondiente a la posición 347 de SEC ID NO:2

(c): insertar opcionalmente el polinucleótido modificado en un vector o plásmido;

(d): introducir el polinucleótido o el vector o plásmido en una célula hospedante adecuada; y

(e): cultivar la célula hospedante en condiciones que permiten la expresión de la GTP ciclohidrolasa II modificada.

En una realización, la etapa (c) o el método descrito anteriormente se lleva a cabo vía mutagénesis saturada. Sin embargo, se entiende que éste puede no ser el único camino para definir el aminoácido que debería sustituir un aminoácido en una posición dada de la GTP ciclohidrolasa II de tipo salvaje a fin de obtener una GTP ciclohidrolasa II modificada con mayor actividad específica, como se define aquí.

La preparación de una GTP ciclohidrolasa II modificada que tiene mayor actividad específica a partir de una GTP ciclohidrolasa II no modificada como se describe anteriormente, por ejemplo vía mutagénesis saturada, incluye, pero no se limita a, la preparación de proteínas de GTP ciclohidrolasa II mutadas a partir de proteínas no modificadas como la Figura 1 o en la Tabla 4, en particular aquellas identificadas mediante SEC ID NOs:2, 39, 41, y 43, tales como por ejemplo las proteínas de GTP ciclohidrolasa II no modificadas de Bacillus subtilis. Los cebadores usados para la reacción de PCR son tales que un cebador, por ejemplo el cebador sentido, puede contener una secuencia nucleotídica mutada, y el otro cebador, por ejemplo el cebador antisentido, puede contener la secuencia nucleotídica de tipo salvaje. La PCR con estos pares de cebadores y ADN genómico del ribA de tipo salvaje puede dar como resultado un producto de PCR que posee la mutación particular en una posición dada, dependiendo de la secuencia nucleotídica mutada del cebador usado. Tras la purificación de los productos de la PCR resultantes usando métodos estándar como, por ejemplo, el kit de purificación mediante PCR QIAquick (Qiagen), el ADN se puede cortar con enzimas de restricción tales como BamHI y EcoRI, se puede ligar en un vector adecuado, por ejemplo pQE60, y se puede transformar en una cepa que es negativa para GTP ciclohidrolasa II. Un ejemplo de tal cepa es la cepa Rib7 de E. coli (Richter et al., J. Bacteriol. 175, 4045-4051, 1993) que contiene el plásmido pREP4. Tras la continuación de la secuencia correcta mediante secuenciación de ADN, la RibA mutada se puede purificar y caracterizar como se describe anteriormente.

Las realizaciones preferidas de este método corresponden a las realizaciones preferidas de la GTP ciclohidrolasa II modificada, los polinucleótidos que la codifican, los vectores y plásmidos, las células hospedantes, y los métodos descritos aquí. La GTP ciclohidrolasa II primera y segunda corresponden a la GTP ciclohidrolasa II no modificada y modificada, respectivamente (véase más arriba).

Es un objeto de la presente invención proporcionar un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una GTP ciclohidrolasa II modificada como se describe anteriormente, un vector, preferiblemente un vector de expresión, que comprende tal polinucleótido, una célula hospedante que se ha transformado mediante tal polinucleótido o vector, un procedimiento para la preparación de una GTP ciclohidrolasa II de la presente invención, en el que la célula hospedante como se describe anteriormente se cultiva en condiciones de cultivo adecuadas y la GTP ciclohidrolasa II se aísla de tal célula hospedante o del medio de cultivo mediante métodos conocidos en la técnica, y un procedimiento para la producción biotecnológico de riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o uno o más derivados de los mismos, basado en una célula hospedante que se ha transformado mediante tal polinucleótido o vector, y/o que puede tener integrado de forma estable tal polinucleótido en su cromosoma o cromosomas.

Además, es un objeto de la presente invención proporcionar una secuencia de ADN que se puede obtener mediante el método denominado de reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”) mediante cebadores de PCR diseñados en base a las secuencias de ADN descritas específicamente de la presente invención. Se entiende que las secuencias de ADN así obtenidas codifican enzimas de GTP ciclohidrolasa II con al menos la misma distribución que aquellas a partir de las que se diseñan, y muestran propiedades de actividad comparables.

Las diversas realizaciones de la invención descritas aquí se pueden combinar de forma cruzada.

Figura 1: Alineamiento de múltiples secuencias calculado mediante el programa PILEUP del paquete de programa GCG de 92 secuencias de GTP ciclohidrolasa II encontradas por el programa BLASTN usando bases de datos estándar como SWISS-PROT y TrEMBL (Candida guilliermondii, Ashbya gossypii, Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa, Schizosaccharomyces pombe, Archaeoglobus fulgidus, Streptomyces coelicolor, Helicobacter pylori J99, Helicobacter pylori, Pyrococcus furiosus, Thermotoga maritima, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachomatis, Chlamydia caviae GPIC, Arabidopsis thaliana, Lycopersicum esculentum, Oryza sativa, Alcaligenes eutrophus, Neisseria meningitidis (serogrupo A), Neisseria meningitidis (serogrupo B, dos enzimas de GTP ciclohidrolasa II), Pseudomonas putida (dos enzimas de GTP ciclohidrolasa II), Pseudomonas syringae (dos enzimas de GTP ciclohidrolasa II), Actinobacillus actinomycetemcomitans (Haemophilus actinomycetemcomitans), Haemophilus influenzae, Pasteurella multocida, Escherichia coli, Escherichia coli O6, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, Buchnera aphidicola (subsp. Acyrthosiphon pisum) (Acyrthosiphon pisum bacteria simbiótica), Buchnera aphidicola (subsp. Schizaphis graminum), Wigglesworthia glossinidia brevipalpis, Buchnera aphidicola (subsp. Baizongia pistaciae), Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes (Brevibacterium ammoniagenes), Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Lactococcus lactis (Streptococcus lactis), Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Clostridium acetobutylicum, Fusobacterium nucleatum, Anabaena spec., Synechocystis spec., Synechococcus elongatus (Thermosynechococcus elongatus), Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus halodurans, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Chlorobium tepidum, Aquifex aeolicus, Leptospira interrogans, Deinococcus radiodurans, Bacteroides thetaiotaomicron, Caulobacter crescentus, Coxiella burnetii, Rhizobium etli, Lactobacillus plantarum, Pseudomonas glumae, Streptomyces avermitilis, Photobacterium phosphoreum, Azospirillum brasilense, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium meliloti (Sinorhizobium meliloti), Brucella melitensis, Brucella suis, Rhizobium loti (Mesorhizobium loti), Nitrosomonas europaea, Ralstonia solanacearum (Pseudomonas solanacearum), Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio cholerae, Vibrio fischeri, Shewanella oneidensis, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi, Pseudomonas aeruginosa, Dehalospirillum multivorans, Xylella fastidiosa). La numeración se refiere al alineamiento realizado. Algunas de las secuencias de aminoácidos codifican una enzima que tiene justo la actividad de GTP ciclohidrolasa II como las enzimas de Ashbya gossypii, Streptomyces coelicolor, Helicobacter pylori J99, Heliobacter pylori, Arabidopsis thaliana, Alcaligenes eutrophus, Neisseria meningitidis (serogrupo A), Neisseria meningitidis (serogrupo B), Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Actinobacillus actinomycetemcomitans (Haemophilus actinomycetemcomitans), Haemophilus influenzae, Pasteurella multocida, Escherichia coli, Escherichia coli 06, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, Buchnera aphidicola (subsp. Acyrthosiphon pisum) (Acyrthosiphon pisum bacteria simbiótica), Buchnera aphidicola (subsp. Schizaphis graminum), Wigglesworthia glossinidia brevipalpis, Buchnera aphidicola (subsp. Baizongia pistaciae), Pseudomonas glumae, Streptomyces avermitilis, o Photobacterium phosphoreum. Otras enzimas como la enzima RibA de B. subtilis contienen, además, un dominio que tiene actividad de DHBP sintasa. La secuencia de aminoácidos de RibA procedente de B. subtilis está subrayada. Las posiciones que son homólogas/equivalentes a los restos de aminoácidos encontrados que tienen un efecto positivo sobre la actividad específica (restos de aminoácidos 261, 270, 276, 279, 308, 347) y sobre la sensibilidad a proteasas (196) de RibA de B. subtilis, y que se discuten en uno de los siguientes ejemplos, están en letras negritas. La numeración usada para esas posiciones se realiza según la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de B. subtilis. La figura comienza con el nombre de las secuencias usadas, el número de acceso de la base de datos, y entre paréntesis el organismo fuente de la secuencia.

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran adicionalmente la invención.

Ejemplo 1: Medida de la actividad de GTP ciclohidrolasa II y determinación de la actividad específica

La actividad enzimática usada para medir la actividad de GTP ciclohidrolasa II se adaptó de (J. Biol. Chem. 276, 22273-22277, 2001). El tampón de ensayo final contenía 50 mM de Tris/HCl, pH 8,5, 10 mM de MgCl2, 7,5 mM de mercaptoetanol, 2,5 mM de GTP y 0,1 mg/ml de seroalbúmina bovina. Tras la purificación (véase el Ejemplo 5), la enzima se mantuvo en un tampón que contiene 50 mM de Tris/HCl, pH 8,5, 10 mM de MgCl2, 7,5 mM de mercaptoetanol, y 10% de glicerol. El sustrato se añadió a la enzima, y se siguió durante 20-30 min. la absorción a 310 nm, a la que GTP no muestra absorción. La mezcla de reacción final contenía entre 0,02 y 0,04 mg/ml de GTP ciclohidrolasa II procedente de B. subtilis o uno de los mutantes como se muestra en la Tabla 1 ó 2. Para el cálculo de la actividad, se usó un coeficiente de absorción de 6,28 [mM-1 cm1] para DRAPP. La determinación de proteínas se realizó con el ensayo de proteínas de Bio-Rad (número de Catálogo 500-0002, Bio-Rad Laboratories AG, Nenzlingerweg 2, CH-4153 Reinach, Suiza).

Según la definición de “actividad específica” dada anteriormente, una unidad es la cantidad de RibA que cataliza la formación de 1 !mol de DRAPP por minuto en las condiciones como se describe anteriormente. La actividad específica es la actividad de DRAPP que se forma por 1 mg de RibA por minuto en las condiciones como se describe anteriormente. Usando las definiciones mencionadas anteriormente, la actividad específica de GTP ciclohidrolasa II de la proteína RibA etiquetada con His6 de B. subtilis fue 0,115 U/mg.

Ejemplo 2: Ensayo de la calidad del ensayo enzimático

Un ensayo óptimo debería cumplir un número de requisitos, tal como linealidad con la concentración enzimática y linealidad con el tiempo. Usando las condiciones descritas en el Ejemplo 1 y 22 !g de enzima, se siguió durante 25 min. el incremento en la absorción a 310 nm. Para ensayar en qué intervalo el ensayo es lineal con la concentración enzimática, se ensayó la dependencia del ensayo con la concentración enzimática creciente (0-40 !g de RibA etiquetada con His6). El ensayo demostró ser lineal a lo largo de 25 min. y entre 0 y 40 !g de RibA etiquetada con His6 de B. subtilis.

Tras esto, se ensayó la dependencia de la actividad de GTP ciclohidrolasa II de RibA etiquetada con His6 de B. subtilis sobre la concentración de GTP. Se usaron las condiciones como se describe en el Ejemplo 1. Sin embargo, la concentración de GTP varió de 0,05 a 2,5 mM de concentración final. Los datos indican un valor Km para GTP de 0,07 mM, y una actividad específica de alrededor de 115 mU/mg de proteína a 37ºC para la actividad de GTP ciclohidrolasa II de la enzima RibA etiquetada con His6 de B. subtilis. Los experimentos de este ejemplo mostraron que el ensayo de actividad de GTP ciclohidrolasa II es, de hecho, lineal con el tiempo y con la concentración de enzima (GTP ciclohidrolasa II), y que, en las condiciones dadas para GTP ciclohidrolasa II de Bacillus subtilis, una

concentración de GTP de 2,5 mM puede ser óptima para permitir medidas fiables de la actividad específica de la enzima.

Ejemplo 3: Aislamiento de ADN genómico a partir de Bacillus subtilis

Se hizo crecer B. subtilis a 30ºC en caldo de infusión de ternera lechal (Becton Dickinson, Sparks, MD 21152, USA) toda la noche. Se transfirieron 1,5 ml de cultivo a un tubo de 1,5 ml y se centrifugó. El pelete celular se resuspendió en 0,5 ml de tampón de suspensión (50 mM de Tris/HCl, pH 7,5, 50 mM de Na2EDTA, 15% de sacarosa y 1 mg/ml de lisozima recientemente añadida). Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadió 1 !l de dietiloxidiformiato. Después, se añadieron 10 !l de disolución de SDS al 10% y el tubo se invirtió varias veces. El tubo se incubó durante 5 min. a 70ºC para liberar el ADN bacteriano. Se añadieron 50 !l de acetato de potasio 5 M, el tubo se enfrió en hielo y se dejó allí durante 45 min. Después de esto, la muestra se centrifugó durante 30 min. a 4ºC. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de 1,5 ml, que se llenó (hasta 1,5 ml) con etanol a temperatura ambiente. Después de 5 min. de centrifugación, el sobrenadante se desechó y el pelete de ADN se secó. Después, el ADN se lavó con etanol al 70% y al 96%, y se disolvió en 10 mM de Tris/HCl, pH 7,5, 1 mM de EDTA, y 10 μg/ml de RNase A.

Ejemplo 4: Construcción de los plásmidos de expresión para expresar ribA que codifica GTP ciclohidrolasa II y DHBP sintasa a partir de B. subtilis y sus mutantes

La clonación del gen ribA (SEC ID NO:1) de B. subtilis que codifica la GTP ciclohidrolasa II y la DHBP sintasa se realizó mediante PCR. El ADN genómico de B. subtilis se aisló según el Ejemplo 3. 100 ng de este ADN o de un molde que codifica una forma mutada del gen ribA se usaron para una PCR usando los cebadores RibA 1S (SEC ID NO:27) y RibA 1AS (SEC ID NO:28). Se usaron las siguientes condiciones de PCR: 2 !M de cada cebador, 0,2 mM de cada nucleótido, 2,5 U de una ADN polimerasa de corrección (Stratagene, Gebouw California, 1101 CB Amsterdam Zuidoost, Países Bajos), y 100 ng de ADN genómico en el tampón apropiado según se suministra junto con la ADN polimerasa.

La regulación de la temperatura fue la siguiente:

Etapa 1: 3 min. a 95ºC

Etapa 2: 30 s a 95ºC

Etapa 3: 30 s a 52ºC

Etapa 4: 60 s a 72ºC

Las etapas 2 a 4 se repitieron 30 veces.

El producto de la PCR de 1,3 kb se usó como molde para PCR 2, en la que el cebador RibA 1S se sustituyó por el cebador RibA 2S (SEC ID NO:29). El producto PCR de esta reacción (SEC ID NO:3), que codifica una versión Nterminalmente etiquetada con His6 de RibA de B. subtilis (SEC ID NO:4), se separó mediante electroforesis en gel de agarosa, se eluyó del gel, se digirió con EcoRI y BamHI, y se ligó en el vector pQE60 digerido con EcoRI y BamHI (Qiagen AG, Hilden, Alemania). El plásmido se denominó pQE60ribANhis.

Ejemplo 5: Caracterización de las enzimas de tipo salvaje y mutantes

La generación de enzimas mutadas se llevó a cabo usando métodos descritos anteriormente y que son conocidos por la persona experta en la técnica. Los mutantes de RibA de B. subtilis que se investigaron adicionalmente se representan en la Tabla 1. Todos los genes mutantes se clonaron en un vector pQE60 como se describe en el Ejemplo 4. Todos los constructos finales contenían una etiqueta de His6 N-terminal.

Tabla 1: Mutantes de Rib A como se definen mediante los intercambios de aminoácidos en comparación con la proteína RibA de tipo salvaje de B. subtilis (el número define las posiciones de aminoácidos respectivas en SEC ID NO:2)

Mutante: SEC ID NO (ADN) SEC ID NO (proteína)

RibA M347I: 9 10

RibA G270R: 23 24

RibA K220E,G270A: 19 20

RibA Y196C,A276T,A282T (PCR III): 11 12

RibA Y196C,A276T: 5 6

Mutante: SEC ID NO (ADN) SEC ID NO (proteína)

RibA Y196C,V261A: 7 8

RibA Y196C,V261A,A276T: 25 26

RibA Y196C,A276T,A282T,M347I: 13 14

RibA Y196C,A276T,Q279R,A282T, M347I: 15 16

RibA Y196C,A276T,Q279R,A282T, K308R,M347I (constructo C): 17 18

RibA Y196C,A276T,Q279R,A282T, K308R,F325Y,M347I (constructo E): 21 22

Las enzimas mutantes de RibA se expresaron a partir de los plásmidos del Ejemplo 4 y se purificaron como se describe en “The QiaExpressionist", Qiagen, Hilden, Alemania, Marzo de 2001, 5ª edición. Las propiedades enzimáticas de las enzimas purificadas (mutantes de RibA) se analizaron como se describe en los Ejemplos 1 y 2.

5 La Tabla 2 compara las actividades específicas de GTP ciclohidrolasa II de los mutantes de RibA (véase la Tabla 1) con la de la GTP ciclohidrolasa II de la RibA de tipo salvaje de B. subtilis. La actividad se midió usando las versiones enzimáticas etiquetadas con His6 N-terminalmente de RibA como se describe en el Ejemplo 4. Los números definen las posiciones de aminoácidos respectivas en SEC ID NO:2.

10 Tabla 2: Comparación de las actividades específicas de GTP ciclohidrolasa II de RibAs de B. subtilis mutadas y de tipo salvaje (WT) (todas etiquetadas con His6 N-terminalmente)

Mutaciones: Actividad específica (en % con respecto a RibA de tipo salvaje)

WT: 100

M347I: 120

G270R: 140

G270A,(K220E): 160

(Y196C),A276T,(A282T): 160

(Y196C),A276T: 160

(Y196C),V261A: 160

(Y196C),V261A,A276T: 160

(Y196C),A276T,(A282T),M347I: 180

(Y196C),A276T,Q279R, (A282T),M347I: 185

(Y196C),A276T,Q279R,(A282T),K308R, M347I: 201

(Y196C),A276T,Q279R,(A282T),K308R,(F325Y),M347I: 200

Las sustituciones de aminoácidos entre paréntesis no tienen muy probablemente efecto sobre la actividad de GTP ciclohidrolasa II de los mutantes. El intercambio de aminoácidos Y196C reduce la sensibilidad de RibA a las proteasas.

Ejemplo 6: Construcción de cepas de B. subtilis recombinantes que sobreexpresan mutantes de RibA que muestran una mayor actividad específica de GTP ciclohidrolasa II

En el siguiente ejemplo, las secuencias polinucleotídicas de RibA mutado de Y196C,A276T,A282T (PCR III), RibA Y196C,A276T,Q279R,A282T,K308R,M347I

(constructo C), y RibA Y196C,A276T,Q279R,A282T,K308R,F325Y,M347I (constructo E) se introdujeron en primer lugar en un vector que contiene el promotor constitutivo fuerte PvegI, y después se manipularon posteriormente en E. coli. La transformación de un microorganismo de B. subtilis competente natural con la secuencia polinucleotídica y las secuencias del vector de flanqueo da como resultado una cepa de B. subtilis que sobreexpresa el ribA mutado. Para la construcción de la secuencia polinucleotídica y de las cepas de B. subtilis se usaron técnicas estándar de ADN recombinante. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2ª Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), y Harwood y Cutting, Molecular Biology Methods for Bacillus, John Wiley and Sons (1990).

Para amplificar el ribA mutado, se amplificó mediante PCR, usando ADN procedente de un plásmido que contiene los mutantes PCR III, constructo C o constructo E, y como cebadores RibANde+1 (SEC ID NO:30) y RibA4AS (SEC ID NO:31), un fragmento de ADN de 1,2 kb que contiene toda la secuencia codificante de ribA.

Las condiciones de reacción para la reacción de PCR consistieron en 30 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 1 min., recombinación a 52ºC durante 1 min., y extensión a 72ºC durante 2 min. Para minimizar los errores generados por la PCR, se usó la Pfu Turbo DNA polymerase (Stratagene, Gebouw California, 1101 CB Amsterdam Zuidoost, Países Bajos). Los productos de la PCR se purificaron usando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen), y se digirieron doblemente usando NdeI y BamHI. Los productos de la PCR digeridos se clonaron en el vector pXI16 (Huembelin et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 1-7, 1999), que consiste en enzimas de restricción adecuadas para la clonación de secuencias polinucleotídicas inmediatamente en dirección 3’ del promotor constitutivo fuerte Pvegl de B. subtilis. El vector pXI16 también contiene el terminador transcripcional cryT procedente de B. thuringiensis, las secuencias de flanqueo de sacB para la recombinación homóloga en el genoma de B. subtilis mediante un suceso de doble intercambio genético, y un marcador de resistencia a eritromicina. El hecho de que cada plásmido contuviese el ribA mutado se confirmó mediante secuenciación de ADN.

Cada plásmido se digirió con ApaI para eliminar la región espaciadora del promotor Pvegl, se religó y se digirió nuevamente con FspI, y se transformó en células de B. subtilis 1012 competentes naturales. Los transformantes se seleccionaron en placas TBAB (triptosa sangre agar base, Becton Dickinson, Sparks, MD 21152, USA) que contiene eritromicina a una concentración final de 2 !g/ml. La secuenciación de ADN verificó que las secuencias polinucleotídicas de ribA mutadas fueron correctas en estas cepas. La sobreproducción de riboflavina se ensayó según el Ejemplo 7.

Las secuencias polinucleotídicas de ribA mutadas conducidas por el promotor Pvegl se introdujeron en la cepa RB50::(pRF69)n::(pRF93)m de B. subtilis que sobreproduce riboflavina, que se ha descrito en Perkins et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22:8-18 (1999), mediante transducción generalizada. Las técnicas estándar usando el PBS 1 bacteriófago se emplearon según Harwood y Cutting, Molecular Biology Methods for Bacillus, John Wiley and Sons (1990). Los transductantes se seleccionaron en placas de TBAB que contienen eritromicina hasta una concentración final de 2 !g/ml. Los transformantes se comprobaron mediante análisis de PCR y secuenciación de ADN, para verificar la inserción correcta de la secuencia polinucleotídica de ribA mutada.

Ejemplo 7: Producción mejorada de riboflavina usando una GTP ciclohidrolasa II con actividad específica incrementada

Para ensayar el efecto in vivo de mutaciones que afectan a la actividad específica de GTP ciclohidrolasa II, se introdujeron los mutantes de GTP ciclohidrolasa II (RibA) de Bacillus subtilis PCR III, constructo C, o constructo E en cepas de B. subtilis que sobreproducen riboflavina, tales como la cepa RB50::(pRF69)n::(pRF93)m (Perkins et al, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 8-18, 1999), por ejemplo en el locus de sacB. La producción de riboflavina se comparó directamente en dos cepas recombinantes de B. subtilis que difieren solamente por la presencia o ausencia de las mutaciones en el gen ribA. El cultivo de las cepas de Bacillus se realizó como se describe en el Ejemplo 8.

Ejemplo 8: Condiciones de cultivo para evaluar la producción de riboflavina

La producción de riboflavina se ensayó en cultivos alimentados-discontinuos de la cepa RB50::(pRF69)n::(pRF93)m de B. subtilis que sobreproduce riboflavina, en la que los mutantes de GTP ciclohidrolasa II PCR III, constructo C, o constructo E conducidos por el promotor Pvegl se integraron en el locus de sacB (véase el Ejemplo 6). La fermentación de las cepas se realizó como se describe en el documento EP 405370.

Ejemplo 9: Métodos analíticos para la determinación de riboflavina

Para la determinación de riboflavina, se puede usar el siguiente método analítico (Bretzel et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 19-26, 1999).

El sistema cromatográfico fue un sistema Hewlett-Packard 1100 equipado con una bomba binaria, un termostato de columna y un automuestreador enfriado. Se usó en línea tanto un detector de conjunto de diodos como un detector de fluorescencia. Se registraron dos señales, UV a 280 nm y traza de fluorescencia a excitación de 446 nm, emisión 520 nm.

50 Se usó una columna de acero inoxidable Supercosil LC-8-DB (150 x 4,6 mm, tamaño de partículas 3 !m) junto con un cartucho de guarda. Las fases móviles fueron 100 mM de ácido acético (A) y metanol (B). Se usó una elución en

gradiente según el siguiente esquema:

Tiempo [min.]: %A %B

0: 98 2

6: 98 2

15: 50 50

25: 50 50

La temperatura de la columna se ajustó a 20ºC, y el caudal fue 1,0 ml/min. El tiempo del experimento fue 25 min. Las muestras de fermentación se diluyeron, se filtraron y se analizaron sin tratamiento adicional. La riboflavina se cuantificó mediante comparación con un patrón externo. Los cálculos se basan en la señal de UV a 280 nm. Como material estándar, se usó riboflavina adquirida de Fluka (9471 Buchs, Suiza) (pureza ; 99,0%).

Ejemplo 10: Identificación de los restos correspondientes en las enzimas de GTP ciclohidrolasa II que son homólogos a GTP ciclohidrolasa II de Bacillus subtilis

Un alineamiento de múltiples secuencias de aminoácidos de 92 enzimas diferentes de GTP ciclohidrolasa II encontrado por el programa BLASTN usando bases de datos estándar tales como SWISS-PROT y TrEMBL (véase la Figura 1) se calculó con el programa “PILEUP” (GCG Wisconsin Package, versión 10.2, Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, USA) usando los siguientes parámetros: penalización de creación de salto 8, penalización de extensión de salto 2, y matriz blosum62.cmp (parámetros por defecto).

Una GTP ciclohidrolasa II homóloga en el contexto de la presente invención puede mostrar similitud de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de GTP ciclohidrolasa II mostradas en la Figura 1. La Figura 1 proporciona un ejemplo de un alineamiento de múltiples secuencias de 92 secuencias de aminoácidos de GTP ciclohidrolasa II, estando subrayada la secuencia de la GTP ciclohidrolasa II procedente de Bacillus subtilis. La Figura 1 sirve justamente como ejemplo y no pretende ser una colección completa de todas las enzimas de GTP ciclohidrolasa II conocidas. Se espera que los restos homólogos, es decir, restos de las diferentes enzimas de GTP ciclohidrolasa II que están localizadas en la misma posición en el alineamiento de las secuencias de aminoácidos (es decir, están localizadas en la misma columna en, por ejemplo, la Figura 1), estén similarmente colocados en la estructura tridimensional de cada proteína y satisfagan en cada proteína una función comparable por estructura y por función. Los restos de aminoácidos homólogos a los restos de aminoácidos de la GTP ciclohidrolasa II procedente de B. subtilis que se discuten en los Ejemplos están subrayados en negrita en la Figura 1, y la posición respectiva en la secuencia de aminoácidos de B. subtilis está añadida encima de la columna respectiva del alineamiento.

Los restos de aminoácidos de 92 organismos diferentes que corresponden a posiciones de aminoácidos específicas, es decir, posiciones que son homólogas/equivalentes a los restos de aminoácidos que se encuentra que tienen un efecto positivo sobre la actividad específica (restos de aminoácidos 261, 270, 276, 279, 308, 347) de la secuencia de aminoácidos de GTP ciclohidrolasa II de Bacillus subtilis (SEC ID NO:2), se resumen en la Tabla 4, en la que el número en la columna de la izquierda define el organismo (según la Fig. 1), comenzando con el nombre de la secuencia usada, el número de acceso de la base de datos, y entre paréntesis el organismo fuente de la secuencia:

(1): gch2_bacsu: SWISS-PROT: gch2_bacsu (Bacillus subtilis)

(2): gch2_cangu: geneseqp:aay69776 (Candida guilliermondii)

(3): gch2_ashgo: TrEMBL: CAA02912: (Ashbya gossypii (Eremothecium gosypii))

(4): gch2_yeast: SWISS-PROT: gch2_yeast (Saccharomyces cerevisiae)

(5): gch2_neucr: TrEMBL: Q871B3 (Neurospora crassa)

(6): gch2_schpo: TrEMBL: Q9P7M9 (Schizosaccharomyces pombe)

(7): gch2_arcfu: SWISS-PROT: gch2_arcfu (Archaeoglobus fulgidus)

(8): gch2_strco: SWISS-PROT: gch2_strco (Streptomyces coelicolor)

(9): gch2_helpj: SWISS-PROT: gch2_helpj (Helicobacter pylori J99)

(10): gch2_helpy: SWISS-PROT: gch2_helpy (Heliobacter pylori)

(11): gch2_pyrfu: TrEMBL: Q8U4L7 (Pyrococcus furiosus)

(12): gch2_thema: SWISS-PROT: gch2_thema (Thermotoga maritima)

(13): gch2_chlmu: SWISS-PROT: gch2_chlmu (Chlamydia muridarum)

(14): gch2_chltr: SWISS-PROT: gch2_chltr (Chlamydia trachomatis)

(15): gch2_chlca: TrEMBL: AAP05635 (Chlamydia caviae GPIC)

(16): gch2_chlpn: SWISS-PROT: gch2_chlpn (Chlamydia pneumoniae)

(17): gch2_arath: SWISS-PROT: gch2_arath (Arabidopsis thaliana)

(18): gch2_lyces: TrEMBL: CAC09119 (Lycopersicum esculentum)

(19): gch2_orysa: TrEMBL: AAO72560 (Oryza sativum)

(20): gch2_alceu: TrEMBL: Q9F184 (Alcaligenes eutrophus)

(21): gch2_neima: SWISS-PROT: gch2_neima (Neisseria meningitidis (serogrupo A))

(22): gch2_neimb: SWISS-PROT: gch2_neimb (Neisseria meningitidis (serogrupo B))

(23): gch2_psepk: SWISS-PROT: gch2_psepk (Pseudomonas putida (cepa KT2440))

(24): gch2_psesm: SWISS-PROT: gch2_psesm (Pseudomonas syringae (pv. tomate ))

(25): gch2_actac: TrEMBL: Q9JRR0 (Actinobacillus actinomycetemcomitans (Haemophilus actinomycetemcomitans))

(26): gch2_haein: SWISS-PROT: gch2_pasmu gch2_haein (Haemophilus influenzae)

(27): gch2_pasmu: SWISS-PROT: (Pasteurella multocida)

(28): gch2_ec06: TrEMBL: Q8FHU5 (Escherichia coli 06)

(29): gch2_ecoli: SWISS-PROT: gch2_ecoli (Escherichia coli)

(30): gch2_salty: TrEMBL: Q8XFY7 (Salmonella typhimurium)

(31): gch2_yerpe: TrEMBL: Q8ZEF0 (Yersinia pestis)

(32): gch2_bucai: SWISS-PROT: gch2_bucai (Buchnera aphidicola (subsp. Acyrthosiphon pisum) (Acyrthosiphon pisum bacteria simbiótica))

(33): gch2_bucap: SWISS-PROT: gch2_bucap (Buchnera aphidicola (subsp. Schizaphis graminum))

(34): gch2_wigbr: SWISS-PROT: gch2_wigbr (Wigglesworthia glossinidia brevipalpis)

(35): gch2_bucbp: SWISS-PROT: gch2_wigbr (Buchnera aphidicola (subsp. Baizongia pistaciae))

(36): gch2_mycle: TrEMBL: Q9CCP4 (Mycobacterium leprae)

(37): gch2_myctu: SWISS-PROT: gch2_myctu (Mycobacterium tuberculosis)

(38): gch2_coref: TrEMBL: Q8FT57 (Corynebacterium efficiens)

(39): gch2_corgl: GENESEQP: AAB79913 (Corynebacterium glutamicum)

(40): gch2_coram: SWISS-PROT: gch2_coram (Corynebacterium ammoniagenes (Brevibacterium ammoniagenes))

(41): gch2_staau: TrEMBL: Q8NW14 (Staphylococcus aureus (cepa MW2))

(42): gch2_staep: GENESEQP: ABP40248 (Staphylococcus epidermidis)

(43): gch2_actpl: SWISS-PROT: gch2_actpl (Actinobacillus pleuropneumoniae)

(44): gch2_lacla: TrEMBL: Q9CGU7 (Lactococcus lactis (subsp. lactis) (Streptococcus lactis))

(45): gch2_stcag: TrEMBL: Q8E658 (Streptococcus agalactiae (serotipo III))

(46): gch2_stcpn: TrEMBL: Q8DRF1 (Streptococcus pneumoniae (cepa ATCC BAA-255/R6))

(47): gch2_cloac: TrEMBL: Q97LG9 (Clostridium acetobutylicum)

(48): gch2_fusnu: TrEMBL: Q8RIR1 (Fusobacterium nucleatum (subsp. nucleatum))

(49): gch2_anasp: TrEMBL: Q8RIR1 (Anabaena sp. (cepa PCC 7120))

(50): gch2_syny3: SWISS-PROT: gch2_syny3 (Synechocystis sp. (cepa PCC 6803))

(51): gch2_synel: TrEMBL: Q8DI64 Synechococcus elongatus (Thermosynechococcus elongatus)

(52): gch2_bacam: SWISS-PROT: gch2_bacam (Bacillus amyloliquefaciens)

(53): gch2_bacce: TrEMBL: AAP11030 (Bacillus cereus ATCC 14579)

(54): gch2_bacha: TrEMBL: Q9KCL5 (Bacillus halodurans)

(55): gch2_clope: TrEMBL: Q8XMX0 (Clostridium perfringens)

(56): gch2_clote: TrEMBL: Q897Q8 (Clostridium tetani)

(57): gch2_chlte: TrEMBL: Q8KC35 (Chlorobium tepidum)

(58): gch2_aquae: SWISS-PROT: gch2_aquae (Aquifex aeolicus)

(59): gch2_lepin: TrEMBL: Q8F701 (Leptospira interrogans)

(60): gch2_deira: TrEMBL: Q9RXZ9 (Deinococcus radiodurans)

(61): gch2_bacth: TrEMBL: Q8A528 (Bacteroides thetaiotaomicron)

(62): gch2_caucr: TrEMBL: Q9A9S5 (Caulobacter crescentus)

(63): gch2_coxbu: TrEMBL: AAO90191 (Coxiella burnetii RSA 493)

(64): gch2_rhiet: TrEMBL: Q8KL38 (Rhizobium etli)

(65): gch2_lacpl: TrEMBL: Q88X17 (Lactobacillus plantarum)

(66): gch2_psegl: TrEMBL: Q8RS38 (Pseudomonas glumae)

(67): gch2_strav: TrEMBL: BAC71833 (Streptomyces avermitilis)

(68): gch2_phopo: SWISS-PROT: gch2_phopo (Photobacterium phosphoreum)

(69): gch2_azobr: SWISS-PROT: gch2_azobr (Azospirillum brasilense)

(70): gch2_agrtu: TrEMBL: Q8UHC9 (Agrobacterium tumefaciens (cepa C58 / ATCC 33970))

(71): gch2_rhime: TrEMBL: Q92RH2 (Rhizobium meliloti (Sinorhizobium meliloti))

(72): gch2_brume: TrEMBL: Q8YFL5 (Brucella melitensis)

(73): gch2_brusu: TrEMBL: Q8G298 (Brucella suis)

(74): gch2_rhilo: TrEMBL: Q985Z3 (Rhizobium loti (Mesorhizobium loti))

(75): gch2_braja: TrEMBL: Q89RZ7 (Bradyrhizobiumjaponicum)

(76): gch2_niteu: TrEMBL: CAD86468 (Nitrosomonas europaea ATCC 19718)

(77): gch2_ralso: TrEMBL: Q8Y1H7 (Ralstonia solanacearum (Pseudomonas solanacearum))

(78): gch2_neime: TrEMBL: Q9JZ77 (Neisseria meningitidis (serogrupo B, segunda enzima encontrada))

(79): gch2_xanax: TrEMBL: Q8PPD7 (Xanthomonas axonopodis (pv. citri))

(80): gch2_xanca: TrEMBL: Q8PCM8 (Xanthomonas campestris (pv. campestris))

(81): gch2_vibpa: TrEMBL: Q87RU5 (Vibrio parahaemolyticus)

(82): gch2_vibvu: TrEMBL: Q8DF98 (Vibrio vulnificus)

(83): gch2_vibch: TrEMBL: Q9KPU3 (Vibrio cholerae)

(84): gch2_vibfi: TrEMBL: Q8G9G5 (Vibrio fischeri)

(85): gch2_sheon: TrEMBL: Q8EBP2 (Shewanella oneidensis)

(86): gch2_phoph: TrEMBL: Q8G9H7 (Photobacterium phosphoreum) 5 (87) ribb_phole: TrEMBL: Q93E93 (Photobacterium leiognathi)

(88): gch2_psepu: TrEMBL: Q88GB1 (Pseudomonas putida (cepa KT2440, segunda enzima encontrada))

(89): gch2_psesy: TrEMBL: Q882G0 (Pseudomonas syringae (pv. Tomate, segunda enzima encontrada))

(90): gch2_pseae: TrEMBL: Q9HWX4 (Pseudomonas aeruginosa)

(91): ribb_dehmu: SWISS-PROT: ribb_dehmu (Dehalospirillum multivorans) 10 (92) gch2_xylfa: TrEMBL: Q87D69 (Xylella fastidiosa (cepa Temecula1 / ATCC 700964))

Tabla 4: Posiciones/restos de aminoácidos que corresponden a las posiciones V261, G270, A276, Q279, K308, y M347 de RibA de B. subtilis como en SEC ID NO:2. Los números en la columna de la izquierda se refieren a los diferentes organismos (véase anteriormente).

SEC ID NO ADN; proteína

(1): V261 G270 A276 Q279 K308 M347 1; 2

(2): T181 G190 A196 L199 N228 I267

(3): T126 G135 A141 L144 N182 I221 32; 33

(4): N153 G162 A168 L171 N211 V250

(5): T255 G264 A270 L273 N305 I344

(6): T176 G185 A191 L194 N223 I262

(7): V139 G248 A254 M257 K287 I326

(8): A73 G82 A88 Q91 A121 V160

(9): A60 G69 A75 R78 A106 M145

(10): A60 G69 A75 R78 A106 M145

(11): T151 G160 A166 T169 E297 I336

(12): V245 G254 F260 Y263 S291 V330

(13): V267 G276 A282 Y285 A315 V354

(14): I267 G276 A282 Y285 A315 V354

(15): I272 G281 A287 Y290 A320 I359

(16): I272 G281 A287 Y290 A320 I359

(17): I91 G100 S106 Q109 N139 M178

(18): I299 G308 A314 Q317 N347 M386

(19): I295 G304 A310 L313 N343 M382

(20): V61 G70 A76 K79 R109 V148

(21): A60 G69 A75 A78 H107 V146

(22): A60 G69 A75 A78 H107 V146

(23): A59 G68 A74 A77 E106 L145

(24): A59 G68 A74 A77 E106 L145

(25): A61 G70 A76 A79 S108 I147

(26): A61 G70 A76 A79 S108 V147

(27): A61 G70 A76 A79 S108 V147

(28): A80 G89 A95 Q98 A127 V166

(29): A59 G68 A74 Q77 A106 V145 34; 35

SEC ID NO ADN; proteína

(30): A59 G68 A74 H77 A106 V145

(31): A59 G68 A74 R77 A106 V145

(32): A57 G66 S72 R75 A104 I143

(33): A59 G68 A74 R77 S106 I145

(34): A59 G68 A74 H77 S106 I145

(35): A60 G69 A75 E78 A107 I146

(36): V279 G288 A294 M297 Q327 M366

(37): V269 G278 A284 M287 Q317 M356

(38): V281 G290 S296 M299 Q329 I368

(39): V273 G282 S288 L291 Q321 L360 36; 37

(40): V274 G283 S289 I292 S322 A361

(41): I259 G268 S274 Y277 E305 I344

(42): I263 G272 S276 Y279 E309 I348

(43): A264 G273 A279 Q282 E311 I350

(44): A262 G271 A277 K280 S309 L348

(45): V261 G270 A276 Q279 H308 I347

(46): V261 G270 A276 M279 H308 L347

(47): V264 G273 A279 A282 M311 V350

(48): I261 G270 A276 R279 N308 I347

(49): A301 R310 A316 M319 S348 I387

(50): A265 R274 A280 M283 S312 I351

(51): A267 R276 A282 M285 S315 1353

(52): V261 G270 A276 Q279 R308 M347 38; 39

(53): V260 G269 A275 Q278 K307 L346 40; 41

(54): V264 G273 A279 Q282 K311 M350 42; 43

(55): V244 G253 A259 K262 K291 I330

(56): A265 G274 A280 A283 N312 I351

(57): T267 G276 A282 M285 N314 M353

(58): V270 R279 A285 M288 E317 M356

(59): 1263 G272 A278 M281 N310 M349

(60): A269 G278 A284 A287 A316 L355

(61): I265 G274 A281 M283 K314 M351

(62): A260 G269 S276 Q278 A307 V346

(63): V265 G274 A280 E283 A311 I350

(64): A283 G292 A298 A301 S330 V369

(65): V262 G271 A277 K280 A309 V348

(66): V70 G79 S85 L88 R117 V156

(67): V66 G75 A81 R84 A112 L151

SEC ID NO ADN; proteína

(68): G61 G70 T76 I79 K108 I147

(69): L250 G259 A265 E268 R297 V336

(70): V264 - Y274 K277 K304 I340

(71): V264 - I274 R277 K304 I340

(72): V264 - I275 R278 R305 I345

(73): V264 - 1275 R278 R305 I345

(74): V264 - I274 A277 - I340

(75): I261 - V271 H274 - I330

(76): L262 S271 A277 V280 D303 M338

(77): L285 S294 A300 A303 Q327 M362

(78): F263 S271 A277 H280 D303 L336

(79): L262 G271 A277 A280 R304 L339

(80): L262 G271 A277 A280 R304 L339

(81): V261 S271 A277 R280 R303 M343

(82): L261 S271 A277 R280 R303 M343

(83): L261 S271 A277 R280 R303 M343

(84): I261 S271 A277 R280 K303 M343

(85): L260 S270 A276 R279 K302 M343

(86): I262 - A275 R278 K301 M341

(87): 1262 - A275 R278 Q301 I339

(88): L262 N272 A278 K281 R305 L342

(89): L262 N272 A278 R281 R305 L342

(90): L262 R270 A276 K279 H303 M339

(91): L269 Y276 A282 Y285 - I324

(92): L230 G239 S245 T248 G277 I316

Los ejemplos mostrados en la Tabla 4 sirven como ilustración del principio. Los restos correspondientes se pueden determinar para todas las otras secuencias de aminoácidos de GTP ciclohidrolasa II que son homólogas a una cualquiera de las secuencias mostradas en la Figura 1 o en la Tabla 4.

5 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> DSM IP Assets B.V.

<120> Enzimas mejoradas

<130> 22257

<160> 43 10 <170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1197

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

<210> 2

<211> 398

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 2

<210> 3

<211> 1239

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 3

<210> 4

<211> 412

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 4

<210> 5

<211> 1239

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 5

<210> 6

<211> 412

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 6

<210> 7

<211> 1239

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 7

<210> 8

<211> 412

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 8

<210> 9

<211> 1239

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 9

<210> 10

<211> 412

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 10

<210> 11

<211> 1239

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 11

<210> 12

<211> 412

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 12

<210> 13

<211> 1239

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 13

<210> 14

<211> 412

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 14

<210> 15

<211> 1239

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 15

<210> 16

<211> 412

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 16

<210> 17

<211> 1239

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 17

<210> 18

<211> 412

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 18

<210> 19

<211> 1239

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 19

<210> 20

<211> 412

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 20

<210> 21

<211> 1239

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 21

<210> 22

<211> 412

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 22

<210> 23

<211> 1239

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 23

<210> 24

<211> 412

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 24

<210> 25

<211> 1239

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 25

<210> 26

<211> 412

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador RibA 1S

<400> 27

10 <210> 28

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15 <223> Cebador RibA 1AS

<400> 28 tataattgga tccttagaaa tgaagtaaat gacctagc 38

<210> 29

<211> 54 20 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador RibA 2S

<400> 29

attaatgaat tcattaaaga ggagaaatta actatgagag gatctcacca tcac 54

<210> 30 <211>31

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Cebador RibANde+1

<400> 30 ggagggtttc atatgtttca tccgatagaa g 31

10 <210>31 <211>21

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15 <223> Cebador RibA4AS

<400> 31 taattaagct tggatcctta g 21

<210> 32

<211> 906 20 <212> ADN

<213> Ashbya gossypii

<400> 32

<210> 33

<211> 301

<212> PRT

<213> Ashbya gossypii

<400> 33

<210> 34

<211> 591

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<400> 34

<210> 35

<211> 196

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 35

<210> 36

<211> 1269

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 36

<210> 37

<211> 422

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 37

<210> 38

<211> 1197

<212> ADN

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 38

<210> 39

<211> 398

<212> PRT

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 39

<210> 40

<211> 1194

<212> ADN

<213> Bacillus cereus

<400> 40

<210>41

<211> 397

<212> PRT

<213> Bacillus cereus

<400> 41

<210> 42

<211> 1215

<212> ADN

<213> Bacillus halodurans

<400> 42

<210> 43

<211> 404

<212> PRT

<213> Bacillus halodurans

<400> 43

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una GTP ciclohidrolasa II modificada seleccionada de Bacillus que muestra un incremento en la actividad específica de al menos alrededor de 10 % en comparación con la enzima no modificada correspondiente, en la que se han sustituido restos de aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 261, 270, 276, 279, 308 y/o 347 de SEQ ID NO:2, conduciendo dichas sustituciones a restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:

(a)

alanina en una posición que corresponde a la posición 261 de SEQ ID NO:2,

(b)

alanina en una posición que corresponde a la posición 270 de SEQ ID NO:2,

(c)

treonina en una posición que corresponde a la posición 276 de SEQ ID NO:2,

(d)

arginina en una posición que corresponde a la posición 279 de SEQ ID NO:2,

(e)

arginina en una posición que corresponde a la posición 308 de SEQ ID NO:2, y

(f)

isoleucina en una posición que corresponde a la posición 347 de SEQ ID NO:2.
2.

Una GTP ciclohidrolasa II modificada según la reivindicación 1, que comprende mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en V261A, G270A, A276T, Q279R, K308R, y M347I, en la que dichas posiciones corresponden a las posiciones respectivas de SEC ID NO:2.
3.

Una GTP ciclohidrolasa II modificada según la reivindicación 2, seleccionada de Bacillus subtilis.
4.

Una GTP ciclohidrolasa II modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una combinación de mutaciones 276T/279R/308R/347I, en la que las posiciones corresponden a las posiciones respectivas de SEC ID NO:2.
5.

La GTP ciclohidrolasa II modificada según la reivindicación 1, en la que la secuencia de la GTP ciclohidrolasa II no modificada se selecciona del grupo que consiste en las secuencias ID NOs:2, 39, 41, y 43.
6.

Un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una GTP ciclohidrolasa II modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7.

El polinucleótido que codifica la GTP ciclohidrolasa II modificada según la reivindicación 6, seleccionándose dicho polinucleótido del grupo que consiste en las secuencias ID NOs:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26.
8.

Una célula hospedante que comprende un polinucleótido según la reivindicación 6 ó 7.
9.

La célula hospedante según la reivindicación 8, que se selecciona de Bacillus.
10.

Un procedimiento para producir riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o un derivado de los mismos, que comprende:

(a)

cultivar la célula hospedante según la reivindicación 8 ó 9 en un medio adecuado; y

(b)

opcionalmente separar riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o un derivado de los mismos, del medio.
11.

Un procedimiento para la producción de riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o un derivado de los mismos, que comprende:

(a)

proporcionar una célula hospedante seleccionada de Bacillus que comprende una GTP ciclohidrolasa II modificada según la reivindicación 1;

(b)

cultivar dicha célula hospedante en un medio adecuado, y

(c)

opcionalmente separar riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o un derivado de los mismos, del medio.
12.

Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en el que la célula hospedante se selecciona de Bacillus subtilis.
13.

El uso de una GTP ciclohidrolasa II modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un polinucleótido según la reivindicación 7, para incrementar la producción de riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o un derivado de los mismos.

Figura 1 gch2_cangu: geneseqp:aay69776 (Candida guilliermondii) gch2_ashgo: TrEMBL: CAA02912: (Ashbya gossypii (Eremothecium gosypii)) gch2_yeast: SWISS-PROT: gch2_yeast (Saccharomyces cerevisiae) gch2_neucr: TrEMBL: Q871B3 (Neurospora crassa) gch2_schpo: TrEMBL: Q9P7M9 (Schizosaccharomyces pombe) gch2_arcfu: SWISS-PROT: gch2_arcfu (Archaeoglobus fulgidus) gch2_strco: SWISS-PROT: gch2_strco (Streptomyces coelicolor) gch2_helpj: SWISS-PROT: gch2_helpj (Helicobacter pylori J99) gch2_helpy: SWISS-PROT: gch2_helpy (Heliobacter pylori) gch2_pyrfu: TrEMBL: Q8U4L7 (Pyrococcus furiosus) gch2_thema: SWISS-PROT: gch2_thema (Thermotoga maritima) gch2_chlmu: SWISS-PROT: gch2_chlmu (Chlamydia muridarum) gch2_chltr: SWISS-PROT: gch2_chltr (Chlamydia trachomatis) gch2_chlca: TrEMBL: AAP05635 (Chlamydia caviae GPIC) gch2_chlpn: SWISS-PROT: gch2_chlpn (Chlamydia pneumoniae) gch2_arath: SWISS-PROT: gch2_arath (Arabidopsis thaliana) gch2_lyces: TrEMBL: CAC09119 (Lycopersicum esculentum) gch2_orysa: TrEMBL: AA072560 (Oryza sativum) gch2_alceu: TrEMBL: Q9F184 (Alcaligenes eutrophus) gch2_neima: SWISS-PROT: gch2_neima (Neisseria meningitidis (serogrupo A)) gch2_neimb: SWISS-PROT: gch2_neimb (Neisseria meningitidis (serogrupo B)) gch2_psepk: SWISS-PROT: gch2_psepk (Pseudomonas putida (cepa KT2440)) gch2_psesm: SWISS-PROT: gch2_psesm (Pseudomonas syringae (pv. tomate )) gch2_actac: TrEMBL: Q9JRR0 (Actinobacillus actinomycetemcomitans (Haemophilus actinomycetemcomitans)) gch2_haein: SWISS-PROT: gch2_pasmu gch2_haein (Haemophilus influenzae) gch2_pasmu: SWISS-PROT: (Pasteurella multocida) gch2_ec06: TrEMBL: Q8FHU5 (Escherichia coli 06) gch2_ecoli: SWISS-PROT: gch2_ecoli (Escherichia coli) gch2_salty: TrEMBL: Q8XFY7 (Salmonella typhimurium) gch2_yerpe: TrEMBL: Q8ZEF0 (Yersinia pestis) _ gch2_bucai: SWISS-PROT: gch2_bucai (Buchnera aphidicola (subsp. Acyrthosiphon pisum) (Acyrthosiphon pisum

bacteria simbiótica )) gch2_bucap: SWISS-PROT: gch2_bucap (Buchnera aphidicola (subsp. Schizaphis graminum)) gch2_wigbr: SWISS-PROT: gch2_wigbr (Wigglesworthia glossinidia brevipalpis) gch2_bucbp: SWISS-PROT: gch2_wigbr (Buchnera aphidicola (subsp. Baizongia pistaciae)) gch2_mycle: TrEMBL: Q9CCP4 (Mycobacterium leprae)

gch2_myctu: SWISS-PROT: gch2_myctu (Mycobacterium tuberculosis) gch2_coref: TrEMBL: Q8FT57 (Corynebacterium efficiens) gch2_corgl: GENESEQP: AAB79913 (Corynebacterium glutamicum) gch2_coram: SWISS-PROT: gch2_coram (Corynebacterium ammoniagenes (Brevibacterium ammoniagenes)) gch2_staau: TrEMBL: Q8NW14 (Staphylococcus aureus (cepa MW2)) gch2_staep: GENESEQP: ABP40248 (Staphylococcus epidermidis) gch2_actpl: SWISS-PROT: gch2_actpl (Actinobacillus pleuropneumoniae) gch2_lacla: TrEMBL: Q9CGU7 (Lactococcus lactis (subsp. lactis) (Streptococcus lactis)) gch2_stcag: TrEMBL: Q8E658 (Streptococcus agalactiae (serotipo III)) gch2_stcpn: TrEMBL: Q8DRF1 (Streptococcus pneumoniae (cepa ATCC BAA-255 / R6)) gch2_cloac: TrEMBL: Q97LG9 (Clostridium acetobutylicum) gch2_fusnu: TrEMBL: Q8RIR1 (Fusobacterium nucleatum (subsp. nucleatum)) gch2_anasp: TrEMBL: Q8RIR1 (Anabaena sp. (cepa PCC 7120)) gch2_syny3: SWISS-PROT: gch2_syny3 (Synechocystis sp. (cepa PCC 6803)) gch2_synel: TrEMBL: Q8DI64 Synechococcus elongatus (Thermosynechococcus elongatus) gch2_bacam: SWISS-PROT: gch2_bacam (Bacillus amyloliquefaciens) gch2_bacsu: SWISS-PROT: gch2_bacsu (Bacillus subtilis) gch2_bacce: TrEMBL: AAP11030 (Bacillus cereus ATCC 14579) gch2_bacha: TrEMBL: Q9KCL5 (Bacillus halodurans) gch2_clope: TrEMBL: Q8XMX0 (Clostridium perfringens) gch2_clote: TrEMBL: Q897Q8 (Clostridium tetani) gch2_chlte: TrEMBL: Q8KC35 (Chlorobium tepidum) gch2_aquae: SWISS-PROT: gch2_aquae (Aquifex aeolicus) gch2_lepin: TrEMBL: Q8F701 (Leptospira interrogans) gch2_deira: TrEMBL: Q9RXZ9 (Deinococcus radiodurans) gch2_bacth: TrEMBL: Q8A528 (Bacteroides thetaiotaomicron) gch2_caucr: TrEMBL: Q9A9S5 (Caulobacter crescentus) gch2_coxbu: TrEMBL: AA090191 (Coxiella burnetii RSA 493) gch2_rhiet: TrEMBL: Q8KL38 (Rhizobium etli) gch2_lacpl: TrEMBL: Q88X17 (Lactobacillus plantarum) gch2_psegl: TrEMBL: Q8RS38 (Pseudomonas glumae) gch2_strav: TrEMBL: BAC71833 (Streptomyces avermitilis) gch2_phopo: SWISS-PROT: gch2_phopo (Photobacterium phosphoreum) gch2_azobr: SWISS-PROT: gch2_azobr (Azospirillum brasilense) gch2_agrtu: TrEMBL: Q8UHC9 (Agrobacterium tumefaciens (cepa C58 / ATCC 33970)) gch2_rhime: TrEMBL: Q92RH2 (Rhizobium meliloti (Sinorhizobium meliloti)) gch2_brume: TrEMBL: Q8YFL5 (Brucella melitensis)

gch2_brusu: TrEMBL: Q8G298 (Brucella suis) gch2_rhilo: TrEMBL: Q985Z3 (Rhizobium loti (Mesorhizobium loti)) gch2_braja: TrEMBL: Q89RZ7 (Bradyrhizobium japonicum) gch2_niteu: TrEMBL: CAD86468 (Nitrosomonas europaea ATCC 19718)

5 gch2_ralso: TrEMBL: Q8Y1H7 (Ralstonia solanacearum (Pseudomonas solanacearum)) gch2_neime: TrEMBL: Q9JZ77 (Neisseria meningitidis (serogrupo B, segunda enzima encontrada)) gch2_xanax: TrEMBL: Q8PPD7 (Xanthomonas axonopodis (pv. citri)) gch2_xanca: TrEMBL: Q8PCM8 (Xanthomonas campestris (pv. campestris)) gch2_vibpa: TrEMBL: Q87RU5 (Vibrio parahaemolyticus)

10 gch2_vibvu: TrEMBL: Q8DF98 (Vibrio vulnificus) gch2_vibch: TrEMBL: Q9KPU3 (Vibrio cholerae) gch2_vibfi: TrEMBL: Q8G9G5 (Vibrio fischeri) gch2_sheon: TrEMBL: Q8EBP2 (Shewanella oneidensis) gch2_phoph: TrEMBL: Q8G9H7 (Photobacterium phosphoreum)

15 ribb_phole: TrEMBL: Q93E93 (Photobacterium leiognathi) gch2_psepu: TrEMBL: Q88GB1 (Pseudomonas putida (cepa KT2440, segunda enzima encontrada)) gch2_psesy: TrEMBL: Q882G0 (Pseudomonas syringae (pv. Tomate, segunda enzima encontrada)) gch2_pseae: TrEMBL: Q9HWX4 (Pseudomonas aeruginosa) ribb_dehmu: SWISS-PROT: ribb_dehmu (Dehalospirillum multivorans)

20 gch2_xylfa: TrEMBL: Q87D69 (Xylella fastidiosa (cepa Temeculal / ATCC 700964))