KR20070041538A - 개선된 효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 증가된 특이적 활성을 나타내는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소, 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 개질된 효소를 제조하는 방법, 및 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, FMN, FAD, 또는 이의 1종 이상의 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

개선된 효소{IMPROVED ENZYMES}

본 발명은 각각의 야생형 효소에 비해 더 높은 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 활성을 갖는 개질된 효소를 제공한다. 개질된 효소 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, 플라빈 모노뉴클레오타이드(flavin mononucleotide: FMN), 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(flavin adenine dinucleotide: FAD), 및 이의 유도체의 제조를 위해 사용된다.

리보플라빈(바이타민 B2)은 모든 식물 및 많은 미생물에 의해 합성되지만, 고등 동물에 의해서는 생성되지 않는다. 이는 탄수화물의 효소적 산화에 필요한 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드 및 플라빈 모노뉴클레오타이드와 같은 조효소에 대한 전구체이기 때문에, 리보플라빈은 기초 대사에 필수적이다. 고등 동물의 경우, 리보플라빈 결핍은 탈모, 피부의 염증, 시력 악화, 및 성장 장애를 초래할 수 있다.

리보플라빈 생성 균주를 리보플라빈의 비율 및 수율이 증가하도록 조작함은 과거에 다양한 다수의 방식으로 달성되어 왔다. 예를 들면, (1) 고전적인 돌연변 이를 사용하여 선택된 유기체의 게놈이 무작위로 돌연변이된 변종들을 생성하고, 이후 퓨린 유사물질에 보다 내성을 갖도록 선택하고/하거나 리보플라빈의 증진된 생성에 대해 선별하였다. (2) 다르게는, 리보플라빈 생합성의 종결 효소, 즉 구아노신 트라이포스페이트(guanosine triphosphate: GTP) 및 리뷸로즈-5-포스페이트를 리보플라빈으로 전환시킴을 촉매화하는 효소를 과발현시켜, 표적 생성물을 보다 많이 유출시킨다. 그러나, 후자의 시도에서는, 리보플라빈 생합성 단백질의 강한 과발현이 숙주 세포에 추가의 대사적 부담을 부과하여, 세포 생리 기능에 대해 스트레스 응답 반응 및 기타 바람직하지 않은 부정적 영향을 유도할 수 있다.

구아노신 트라이포스페이트(GTP) 및 리뷸로즈-5-포스페이트로부터 리보플라빈의 생합성을 촉매화하는데 필요한 효소는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 4개의 유전자(ribG, ribB, ribA, 및 ribH)에 의해 암호화된다. 이들 유전자는 오페론(operon)에 위치하고, 이의 유전자 순서는 효소에 의해 촉매화되는 효소적 반응의 순서와는 상이하다. 예를 들면, 리보플라빈 생합성에서 제 1 단계를 촉매화하는 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 오페론에서 제 3 유전자인 ribA에 의해 암호화된다. ribA 유전자는 또한 제 2 효소 활성, 즉 리뷸로즈-5-포스페이트의 4-탄소 단위 3,4-다이하이드록시-2-부타논 4-포스페이트(DHBP)로의 전환을 촉매화하는 3,4-다이하이드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타아제(DHBPS)를 암호화한다. 데아미나아제 및 환원효소는 오페론의 제 1 유전자인 ribG에 의해 암호화된다. 리보플라빈 생합성에 있어서 끝에서 두번째 단계는 마지막 rib 유전자, ribH의 생성물인 루마진 신타아제에 의해 촉매화된다. 경로의 마지막 단계를 제어 하는 리보플라빈 신타아제는 오페론의 제 2 유전자인 ribB에 의해 암호화된다. rib 오페론의 3' 말단에 위치한 유전자의 기능은 현재 확실하지 않지만, 이의 유전자 산물은 리보플라빈 합성에 필요하지 않다.

ribP1 프로모터로부터 리보플라빈 오페론의 전사는 ribP1 및 ribG 사이에 위치한 조절 선도 영역을 포함하는 감쇠 기작에 의해 제어된다. 상기 선도 영역내의 ribO 돌연변이는 리보플라빈 오페론의 조절되지 않은 발현을 일으킨다. 조절되지 않은 발현은 또한 ribC 유전자에서 미스센스(missense) 돌연변이를 함유한 균주에서 관찰된다. ribC 유전자는 비. 서브틸리스의 플라빈 카이나아제/FAD 신타아제를 암호화하는 것으로 보여진다(맥(Mack, M.) 등의 문헌[J. Bacteriol., 180:950-955, 1998] 참조). 조절되지 않은 돌연변이는 ribC 유전자 산물의 플라보카이나아제 활성을 감소시켜, 리보플라빈 조절 시스템의 효과자 분자인 플라빈 모노뉴클레오타이드(FMN)의 세포내 농도를 감소시킨다.

최근에, 바실러스 서브틸리스는 단기간의 발효 주기 동안 리보플라빈을 높은 수율로 생성하도록 유전자적으로 조작되었다(미국 특허 제5,837,528호). 이러한 시도는 유전자 발현의 농도를 조절하지 않고 증가시킴으로써 리보플라빈 생합성 유전자를 유전자적으로 조작함에 의한 발효 개선 및 고전적인 유전적 돌연변이체 선택을 조합하였다. 이 시스템에서, rib 유전자의 발현은 플라보카이나아제 암호화 ribC 유전자를 돌연변이시키고, rib 유전자를 강한 구성(constitutive) 프로모터에 결합시키고, rib 유전자의 복제 수를 증가시킴으로써 증가된다.

이미 앞서 논의된 바와 같이, rib 유전자의 과발현은 생성 균주에 추가의 부 담을 부과하고, 이는 강력하게 리보플라빈 전구체, 리보플라빈, FMN, FAD 또는 이의 유도체의 생성에 부정적 영향을 미친다. 상기 단점을 피하기 위해, 특이적 활성이 증가된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 돌연변이체를 제공하는 것이 본 발명의 주제이다. 생성 균주에서 이러한 돌연변이체 효소를 단독으로 또는 다른 rib 단백질의 개선된 돌연변이체와 함께 사용하면 세포 대사에 추가의 부담을 거의 또는 전혀 주지 않으면서 보다 높은 유출 속도를 가능하게 할 것이다.

도 1은 SWISS-PROT 및 TrEMBL과 같은 표준 데이터베이스를 사용한 프로그램 블라스틴(BLASTIN)에 의해 밝혀진 92개의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 서열의 GCG 프로그램 패키지의 프로그램 파일업에 의해 계산된 다중 서열 배열을 나타낸다.

본원에서, "GTP 사이클로하이드롤라아제 II"는 GTP를 2,5-다이아미노-6-리보실아미노-4(3H)-피리미디논-5'-포스페이트(DRAPP)로 전환시킴을 촉매화할 수 있는 임의의 효소를 포함할 수 있다. 이는 이러한 효소가 추가의 반응, 예를 들면 리뷸로즈-5-포스페이트의 DHBP로의 전환을 촉매화할 수 있는지의 여부와는 무관하다. "GTP 사이클로하이드롤라아제 II"는 도 1 또는 표 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 1종 이상의 효소에 상동성이다. "상동성"은 도 1 또는 표 3에 제시된 바와 같은 1종 이상의 아미노산에 약 50% 이상 동일하고, 바람직하게는 약 60% 이상 동일하고, 보다 바람직하게는 약 70% 이상 동일하고, 보다 더 바람직하게는 약 80% 이상 동일하고, 더더욱 바람직하게는 약 85% 이상 동일하고, 보다 더 바람직하게는 약 90% 또는 95% 이상 동일하고, 가장 바람직하게는 약 98% 이상 동일한 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 의미한다.

당분야에 공지된 바와 같이 "% 동일성"이라는 용어는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 상관성의 정도(이는, 경우에 따라서, 이러한 일련의 서열들 사이의 부합성에 의해 결정됨)를 의미한다. "동일성"은 공지의 방법, 예를 들면 하기 매개변수를 사용하는 프로그램 베스트핏(BESTFIT)[GCG 위스콘신 패키지(Wisconsin Package), 버전 10.2, 악셀리스 인코포레이티드(Accelrys Inc.), 미국 캘리포니아주 92121-3752 산 디에고 9685 스크랜톤 로오드 소재]에 의해 쉽게 결정될 수 있다: 갭 생성 패널티(gap creation penalty) 8, 갭 연장 패널티(gap extension penalty) 2 (디폴트 매개변수).

"야생형 효소" 또는 "야생형 GTP 사이클로하이드롤라아제 II"는 본 발명에 따라 활성이 증가된 돌연변이체를 설계하기 위한 출발점으로서 사용되는 도 1 또는 표 3에 제시된 임의의 1종의 효소에 상동성인 임의의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 포함할 수 있다. 본 발명에서 "야생형"은 자연적으로 유도될 수 있는 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 서열, 뿐만 아니라 본 발명의 임의의 교시에 의해 보다 활성적일 수 있다면 합성 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소의 변이체(이들은 도 1 또는 표 3에 제시된 임의의 1종의 서열에 상동성이어야 함) 둘다를 포함한다. "야생형 GTP 사이클로하이드롤라아제 II" 및 "비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

"돌연변이체", "돌연변이체 효소", 또는 "돌연변이체 GTP 사이클로하이드롤라아제 II"는 본 발명의 교시에 따르며 각각의 야생형 효소에 비해 활성이 높은, 소정의 야생형 효소/GTP 사이클로하이드롤라아제 II로부터 유도가능한 임의의 변이체(상기 정의에 따름)를 포함할 수 있다. 본 발명의 범주에 있어서, 이는 돌연변이체(들)가 어떻게 수득되는 지와 무관하고: 이러한 돌연변이체는, 예를 들면 부위-지향된 돌연변이생성, 포화 돌연변이생성, 무작위 돌연변이생성/지향된 진화, 전체 세포/유기체의 화학적 또는 UV 돌연변이생성, 및 당분야에 공지된 기타 방법에 의해 수득될 수 있다. 이들 돌연변이체는 또한, 예를 들면 합성 유전자를 설계함으로써 생성되고/되거나 시험관내(세포-부재) 번역에 의해 제조될 수 있다. 특이적 활성을 시험하기 위해, 돌연변이체는 당분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 (과-)발현될 수 있다. "돌연변이체 GTP 사이클로하이드롤라아제 II" 및 "개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이는 또한 "돌연변이체 효소" 및 "개질된 효소"라는 용어에 적용된다.

본원에서 "리보플라빈 전구체" 및 "리보플라빈, FMN 또는 FAD의 유도체"는 이들의 (생-)합성에서 중간체 효소로서 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 필요로 하는 임의의 모든 대사산물(들)을 포함할 수 있다. 본원에서, 이는 이러한 (생-)합성 경로가 자연적인지 또는 비-자연적인지(즉, 자연적으로 초래되지 않지만 생명공학적으로 조작된 경로)와는 무관하다. 바람직하게는, 합성 경로는 자연적으로 생물화학적이다. 리보플라빈 전구체 및 리보플라빈, FMN 또는 FAD의 유도체로는, 한정되는 것은 아니지만, DRAPP; 5-아미노-6-리보실아미노-2,4(1H,3H)-피리미딘디온-5'-포스페이트; 2,5-다이아미노-6-리비틸아미노-4(3H)-피리미디논-5'-포스페이트; 5-아미노-6-리비틸아미노-2,4(1H,3H)-피리미딘디온-5'-포스페이트; 5-아미노-6-리비틸아미노-2,4(1H,3H)-피리미딘디온; 6,7-다이메틸-8-리비틸루마진(DMRL); 및 플라보단백질이 포함된다. "리보플라빈"이라는 용어는 또한 리보플라빈의 유도체, 예컨대 리보플라빈-5-포스페이트 및 이의 염, 예로서 소디움 리보플라빈-5-포스페이트를 포함한다.

일반적으로 본 발명의 목적은 촉매 특성이 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소에 비해 보다 바람직한(즉, 보다 높은 특이적 활성을 나타내는) 방식으로 개질된, GTP 사이클로하이드롤라아제 II 활성을 갖는 효소를 제공하는 것이다.

본 발명은 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 비해 보다 높은 (특이적) 활성을 나타내는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 관한 것으로, 여기서 (i) 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열은 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열과 비교할 경우 1개 이상의 돌연변이를 함유하고, (ii) 1개 이상의 돌연변이는 서열번호: 2에 제시된 바와 같은 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열의 위치 261, 270, 276, 279, 308 및 347에 상응하는 아미노산 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 위치에서 이루어진다.

따라서, 본 발명의 목적은 (i) 개질된 효소의 특이적 활성이 상응하는 비-개질된 효소에 비해 증가되고, (ii) 개질된 효소의 아미노산 서열이 서열번호: 2의 위치 261, 270, 276, 279, 308 및/또는 347에 상응하는 아미노산 위치(들) 상에서의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 돌연변이(들)를 비롯한 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함하는, 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 제공하는 것이다.

"1개 이상의 돌연변이"라는 용어는 비-개질된 효소에 비해 증가된 특이적 활성을 갖는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 유도하는, 상기 정의된 위치 상에서의 1개 이상의 돌연변이를 의미한다. 상기 정의된 개질된 효소는 비-개질된 효소에 비해 증가된 특이적 활성을 유도하는 상기 정의된 위치 상에서의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 돌연변이(들)로 이루어질 수 있지만, 또한 생성된 개질된 효소가 증가된 특이적 활성을 갖는 한 다른 위치에서의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 개질된 효소는 서열번호: 2에 제시된 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열의 위치 261, 270, 276, 279, 308 및/또는 347에 상응하는 아미노산 위치(들) 상에서의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 돌연변이(들)를 비롯한 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함한다. 상기 정의된 위치들 이외의 위치에서의 이러한 돌연변이의 예는 서열번호: 2의 아미노산 위치 196, 282, 및/또는 325에 상응하는 위치에서의 아미노산 돌연변이(들)이다.

본원에서, "특이적 활성"이라는 용어는, 예를 들면 리츠(Ritz) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 276, 22273-22277, 2001], 코흐(Koh) 등의 문헌[Mol. Gen. Genet. 251, 591-598, 1996], 또는 슈라멕(Schramek) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 276, 44157-44162, 2001]에 기재되거나 실시예 2에 상세히 기재된 바와 같은 적절히 한정된 반응 조건하에서의 야생형 및 돌연변이체 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소의 반응 속도를 나타낸다. "특이적 활성"은 정해진 온도에서 정해진 양의 단백질에 대하여 소정의 기간동안 소비된 기질 및/또는 생성된 산물의 양을 정의한다. 전형적으로, "특이적 활성"은 1분 동안 단백질 1mg당 소비된 기질 또는 생성된 산물의 μ몰로 표시된다. 전형적으로 μ몰/분은 U(= 단위)로 약자화된다. 따라서, μ몰/분/(단백질의 mg) 또는 U/(단백질의 mg)이라는 특이적 활성에 대한 단위 정의는 본 문헌 전체를 통해 상호교환적으로 사용된다. 본 발명에서 특이적 활성은 폴리펩타이드 쇄의 유사하거나, 바람직하게는 동일한 길이를 기준으로 비교되어야 함을 알아야 한다. 본 발명은, 예를 들면 융합 단백질의 형성을 통해 소정의 야생형 효소의 크기를 증가시켜 전체 효소의 겉보기 특이적 활성을 감소시킴으로써 문제를 회피하지는 않을 것이다.

본 발명에 따라, 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 상응하는 비-개질된 효소의 특이적 활성에 비해 높은 특이적 활성을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 특이적 활성은 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 비해 약 5%, 10%, 25%, 40%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상 증가된다(특이적 활성의 측정에 관하여서는 아래를 참조한다). 바람직하게는, 특이적 활성의 증가는 본원의 실시예 1에 기재된 실험 조건을 참조한다. 대략 0.004-0.02U/ml(바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 대략 40㎍/ml 또는 본원에 기재된 최적 돌연변이체의 경우 20㎍/ml에 상응함), 바람직하게는 대략 0.004U/ml의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 활성이 검정 혼합물에 존재하였고, 반응은 37℃에서 수행되었다.

본 발명의 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열은 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열과 비교될 경우 상기 정의된 바와 같은 1개 이상의 돌연변이를 함유한다. 상기 돌연변이는 1개 이상의 부가, 결실 및/또는 치환일 수 있고, 바람직하게는 1개 이상의 아미노산 치환이고, 여기서 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열에 존재하는 소정의 아미노산이 본 발명의 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열에 존재하는 상이한 아미노산으로 대체된다. 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열은 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산과 비교될 경우 1개 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있고, 즉 서열번호: 2의 위치 261, 270, 276, 279, 308 및/또는 347 상에서의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 아미노산 치환(들), 바람직하게는 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 개질된 효소는 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II와 비교될 경우 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 치환을 함유하는 것이 바람직하다.

한 실시양태에서, (i) 개질된 효소의 특이적 활성이 상응하는 비-개질된 효소에 비해 증가되고, (ii) 개질된 효소의 아미노산 서열이 서열번호: 2의 위치 261, 270, 276, 279, 308 및/또는 347에 상응하는 아미노산 위치(들) 상에서의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 돌연변이(들)를 비롯한 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함하는, 바실러스, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스로부터 수득가능한 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II가 제공된다.

한 실시양태에서, 비-개질된 효소는 서열번호: 2에 제시된 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 상응한다. 따라서, 야생형 효소에 비해 특이적 활성이 증가된 개질된 효소는 서열번호: 2의 위치 261, 270, 276, 279, 308 및/또는 347에 상응하는 아미노산 위치(들) 상에서의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 돌연변이(들)를 비롯한 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 증가된 특이적 활성을 갖는 개질된 효소는 상기 정의된 아미노산 위치 이외의 아미노산 돌연변이(들)를 함유하고, 상기 추가의 돌연변이(들)는 위치 196, 282, 235, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치이고, 바람직하게는 아미노산 치환이며, 보다 바람직하게는 치환은 Y196C(티로신의 시스테인에 의한 대체), A282T(알라닌의 트레오닌에 의한 대체) 또는 F325Y(페닐알라닌의 티로신에 의한 대체)이다.

비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 특이적 활성의 증가가 요망되는 GTP 사이클로하이드롤라아제 II일 수 있다. 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소로는, 제한되는 것은 아니지만, 자연으로부터 유도되는, 예컨대 진핵생물 또는 원핵생물 기원, 바람직하게는 진균 또는 세균 기원의 효소와 같은 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소가 포함된다. 보다 바람직하게는, 비-개질된 효소는 도 1 또는 표 3에 제시된 효소, 또는 도 1 또는 표 3에 제시된 임의의 아미노산 서열과 상동성인 효소로부터 선택되고, 특히는 아쉬비아(Ashbya), 사카로마이세스(Saccharomyces), 에레모테시움(Eremothecium), 칸디다(Candida), 뉴로스포라(Neurospora), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 아르케오글로부스(Archeoglobus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 헬리코박터(Helicobacter), 에스케리치아(Escherichia), 코리네박테리움(Corynebacterium), 테르모토가(Thermotoga), 아라비돕시스(Arabidopsis), 라이코페르시컴(Lycopersicum), 오리자(Oryza), 알칼리게네스(Alcaligenes), 슈도모나스(Pseudomonas), 디노코쿠스(Dinococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 포토박테리움(Photobacterium) 및 바실러스(Bacillus)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 칸디다 구일리에르몬디(Candida guilliermondii), 아쉬비아 고시피(Ashbya gossypii)(에레모테시움 아쉬비이(Eremothecium ashbyii))(서열번호: 33), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아케오글로부스 풀지더스(Archeoglobus fulgidus), 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) J99, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)(서열번호: 35), 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)(서열번호: 37), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)(서열번호: 39), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)(서열번호: 41), 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans)(서열번호: 43), 테르모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 라이코페르시컴 에스쿨렌텀(Lycopersicum exculentum), 오리자 사티범(Oryza sativum), 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주 KT2440, 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium effciens), 다이노코쿠스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 포토박테리움 포스포레움(Photobacterium phosphoreum), 슈도모나스 푸티다 균주 KT2440(제 2 유전자) 및 바실러스 서브틸리스(서열번호: 2)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 비-개질된 효소는 바실러스 서브틸리스로부터 수득될 수 있다.

본 발명의 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 돌연변이시킴으로써 수득될 수 있다. 한 실시양태에서, 비-개질된 효소는 서열번호: 2에 제시된 비. 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 상응하고, 개질된 효소는 서열번호: 2의 아미노산 위치(들) 261, 270, 276, 279, 308 및/또는 347 상에서의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 돌연변이(들)를 비롯한 1개 이상의 아미노산 돌연변이(들)를 포함하고, 이때 상기 개질된 효소의 특이적 활성은 비-개질된 효소에 비해 증가된다.

바람직하게는, 1개 이상의 돌연변이는 서열번호: 2에 제시된 바와 같은 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열의 위치 261, 279, 308 및 347에 상응하는 아미노산 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 위치에서 일어난다. 따라서, 한 실시양태에서, 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 서열번호: 2의 위치 261, 279, 308, 및/또는 347에 상응하는 아미노산 위치(들) 상에서의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 돌연변이(들)를 비롯한 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 개질된 효소는 비. 서브틸리스로부터 수득가능하고, 아미노산 V261, Q279, K308, 및 M374에 각각 상응하는, 서열번호: 2에 제시된 바와 같은 돌연변이된 아미노산 위치 261, 279, 308, 및/또는 347을 포함한다.

또다른 바람직한 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 서열번호: 2에 제시된 바와 같은 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열의 위치 270, 279, 308 및 347에 상응하는 아미노산 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산 위치에서 일어난다. 따라서, 한 실시양태에서, 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 서열번호: 2의 위치 270, 279, 308, 및/또는 347에 상응하는 아미노산 위치(들) 상에서의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 돌연변이(들)를 비롯한 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함한다. 바람직하게는, 개질된 효소는 비. 서브틸리스로부터 수득가능하고, 아미노산 G270, Q279, K308, 및 M374에 각각 상응하는, 서열번호: 2에 제시된 바와 같은 돌연변이된 아미노산 위치 270, 279, 308, 및/또는 347을 포함한다.

추가의 바람직한 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 서열번호: 2에 제시된 바와 같은 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열의 위치 276, 279, 308 및 347에 상응하는 아미노산 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 위치에서 일어난다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 서열번호: 2에 제시된 바와 같은 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열의 위치 276, 279, 308, 및/또는 347에 상응하는 아미노산 위치(들) 상에서의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 돌연변이(들)를 비롯한 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함한다. 바람직하게는, 개질된 효소는 비. 서브틸리스로부터 수득가능하고, 아미노산 A276, Q279, K308, 및 M374에 각각 상응하는, 서열번호: 2에 제시된 바와 같은 돌연변이된 아미노산 위치 276, 279, 308, 및/또는 347을 포함한다.

바람직하게는, 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 1개 이상의 아미노산 돌연변이(들)는 1개 이상의 아미노산 치환(들)이다.

개질된 GTP 사이클로하드롤라아제 II는 상기 정의된 바와 같은 아미노산 위치 상에서의 단지 1개의 돌연변이를 비롯한 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함할 수 있고, 이러한 돌연변이, 특히 아미노산 치환은 서열번호: 2에 제시된 바와 같은 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열의 위치 261, 270, 276, 279, 308, 또는 347에 상응하는 아미노산 위치 상에서의 1개의 돌연변이를 포함할 수 있다. 위치 261에 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 존재하는 아미노산은 발린일 수 있고, 위치 270에 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 존재하는 아미노산은 글리신일 수 있으며, 위치 276에 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 존재하는 아미노산은 알라닌일 수 있고, 위치 279에 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 존재하는 아미노산은 글루타민일 수 있으며, 위치 308에 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 존재하는 아미노산은 라이신일 수 있고, 위치 347에 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 존재하는 아미노산은 메티오닌일 수 있다.

비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 서열중의 아미노산은, 위치 261에 상응하는 아미노산이 알라닌으로 변경되고(예: V261A), 위치 270에 상응하는 아미노산이 알라닌 또는 아르기닌으로 변경되고(예: G270A 및 G270R), 위치 276에 상응하는 아미노산이 트레오닌으로 변경되고(예: A276T), 위치 279에 상응하는 아미노산이 아르기닌으로 변경되고(예: Q279A), 위치 308에 상응하는 아미노산이 아르기닌으로 변경되고(예: K308R), 위치 347에 상응하는 아미노산이 아이소로이신으로 변경되도록(예: M374I) 바뀔 수 있다. 한 실시양태에서, 개질된 효소는 위치 261, 270, 276, 279, 308, 및 347로 이루어진 군으로부터 선택된, 서열번호: 2의 위치 상에서의 아미노산 치환을 포함하는 비. 서브틸리스로부터 수득될 수 있다. 바람직하게, 치환은 V261A, G270A, G270R, A276T, Q279R, K308R 또는 M347I이다.

개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 상기 정의된 바와 같은 아미노산 위치 상에서의 2개의 돌연변이를 비롯한 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함할 수 있고, 이러한 돌연변이, 특히 아미노산 치환은 상기 정의된 바와 같은 2개의 위치에 상응하는 아미노산 위치, 예를 들면 서열번호: 2에 제시된 바와 같은 위치 261/270, 261/276, 261/279, 261/308, 261/347, 270/276, 270/279, 270/308, 270/347, 276/279, 276/308, 276/347, 279/308, 279/347, 또는 308/347에 상응하는 조합된 위치 상에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예컨대, V261A/A276T, V261A/Q279R, V261A/K308R, V261A/M347I, G270A/Q279R, G270A/K308R, G270A/M347I, A276T/Q279R, A276T/K308R, 또는 A276T/M347I의 아미노산 치환이 바람직하고, 여기서 위치는 서열번호: 2의 아미노산 위치에 상응한다. 한 실시양태에서, 이러한 바람직한 치환은 비. 서브틸리스로부터 수득가능한 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 포함되고, 여기서 비-개질된 효소는 서열번호: 2에 상응한다. 바람직하게는, 서열번호: 2와 같은 개질된 비. 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 치환 V261A/A276T 또는 A276T/M347I를 포함한다.

개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 상기 정의된 바와 같은 아미노산 위치 상에서의 3개의 돌연변이를 비롯한 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함할 수 있고, 이러한 돌연변이, 특히 아미노산 치환은 상기 정의된 바와 같은 3개의 위치에 상응하는 아미노산 위치, 구체적으로 서열번호: 2에 제시된 바와 같은 위치 261/279/308, 261/279/347, 261/308/347, 270/279/308, 270/279/347, 270/308/347, 276/279/308, 276/308/347, 또는 276/279/347에 상응하는 조합된 위치 상에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예컨대, V261A/Q279R/K308R, V261A/K308R/M347I, V261A/Q279R/M347I, G270A/Q279R/K308R, G270A/K308R/M347I, G270A/Q279R/M347I, A276T/Q279R/K308R, A276T/K308R/M347I, 또는 A276T/Q279R/M347I의 아미노산 치환이 바람직하고, 여기서 위치는 서열번호: 2의 아미노산 위치에 상응한다. 한 실시양태에서, 이러한 바람직한 치환은 비. 서브틸리스로부터 수득가능한 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 포함되고, 여기서 비-개질된 효소는 서열번호: 2에 상응한다. 바람직하게는, 서열번호: 2와 같은 개질된 비. 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 치환 A276T/Q279R/M347I를 포함한다.

개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 상기 정의된 바와 같은 아미노산 위치 상에서의 4개의 돌연변이를 비롯한 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함할 수 있고, 이러한 돌연변이, 특히 아미노산 치환은 상기 정의된 바와 같은 4개의 위치에 상응하는 아미노산 위치, 구체적으로 서열번호: 2에 제시된 바와 같은 위치 261/279/308/347, 270/279/308/347, 또는 276/279/308/347에 상응하는 조합된 위치 상에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예컨대, V261A/Q279R/K308R/M347I, G270A/Q279R/K308R/M347I 또는 A276T/Q279R/K308R/M347I의 아미노산 치환이 바람직하고, 여기서 위치는 서열번호: 2의 아미노산 위치에 상응한다. 한 실시양태에서, 이러한 바람직한 치환은 비. 서브틸리스로부터 수득가능한 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 포함되고, 여기서 비-개질된 효소는 서열번호: 2에 상응한다. 바람직하게는, 서열번호: 2와 같은 개질된 비. 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 치환 A276T/Q279R/K308R/M347I를 포함한다.

표 1 또는 2(본문 참조)에 개시된 돌연변이의 조합이 가장 바람직하다. 이들 예에서 확인된 아미노산 위치는, 예를 들면 도 1 또는 표 3에 제시된 바와 같이, 상이한 기원의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소에 전달될 수 있다.

본 발명의 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는, 바람직하게는 그의 N- 또는 C- 말단에 외래 아미노산을 포함할 수 있다. "외래 아미노산"은 천연(자연적으로 발생된) GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 존재하지 않는 아미노산, 바람직하게는 천연 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 존재하지 않는 약 3개 이상, 약 5개 이상 또는 약 7개 이상의 인접 아미노산의 연장부(stretch)를 의미한다. 외래 아미노산의 바람직한 연장부는, 한정되는 것은 아니지만, 재조합적으로 생성된 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 정제를 용이하게 하는 "태그(tag)"를 포함한다. 이러한 태그의 예로는, 한정되는 것은 아니지만, "His₆" 태그, FLAG 태그, myc 태그 등이 포함된다. 특이적 활성을 계산하기 위해, 값은 이들 추가의 아미노산(상기 참조)에 대해 보정될 필요가 있다.

또다른 실시양태에서, 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열과 비교될 경우 1개 이상, 예를 들면 2개의 결실을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 결실은 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 N- 또는 C-말단 아미노산에 영향을 주고, 효소의 기능적 특성, 예를 들면 특이적 활성을 크게 감소시키지는 않는다.

개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소를 비롯한, 본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 단리된 형태로 제공될 수 있고, 바람직하게는 균질하게 정제된다. 본원에서, "단리된"이라는 용어는 물질이 그의 고유의 환경(예를 들면, 자연적으로 발생할 경우 자연 환경)으로부터 제거됨을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 미생물에 존재하는 자연적으로-발생된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된 것이 아니지만, 천연 시스템중 일부 또는 모든 공존하는 물질로부터 분리된, 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나, 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 부분일 수 있고, 여전히 벡터 또는 조성물이 그의 자연 환경의 일부가 아니도록 단리될 수 있다. 단리된 폴리펩타이드는 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상 순수하다. 순도는 당분야의 공지된 방법에 따라, 예를 들면 SDS-PAGE 및 후속적인 단백질 염색에 의해 결정될 수 있다. 이어, 단백질 밴드는 밀도측정계(densitometry)에 의해 정량화될 수 있다. 순도를 결정하는 추가의 방법은 통상의 기술 수준내에 속한다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본원에서 "폴리뉴클레오타이드"는 개질되지 않은 RNA 또는 DNA, 또는 개질된 RNA 또는 DNA일 수 있는 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는, 한정되는 것은 아니지만, 단일가닥 및 이중가닥 DNA, 단일가닥 및 이중가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA, 단일가닥 및 이중가닥 RNA, 단일가닥 및 이중가닥 영역의 혼합물일 수 있는 RNA, 단일가닥이거나, 보다 전형적으로는 이중가닥이거나, 단일가닥 및 이중가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드(hybrid) 분자를 포함한다. "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 1개 이상의 비통상적인 염기, 예컨대 이노신, 또는 1개 이상의 개질된 염기, 예컨대 트라이틸화된(tritylated) 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 바꿈으로써 쉽게 수득될 수 있다. 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소를 암호화하는 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 도 1 또는 표 3의 아미노산 서열, 특히는 서열번호: 2, 33, 35, 37, 39, 41, 및 43을 포함한다. 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 비한정적인 예는 서열번호: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 및 26에 제시되어 있다.

비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열내로 돌연변이를 도입하는 방법, 예를 들면 부가, 결실 및/치환은, 한정되는 것은 아니지만 부위-지향된 돌연변이생성 및 PCR-기재 방법을 포함한다.

본 발명의 DNA 서열은 당분야에 공지된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소를 암호화하는 게놈 또는 cDNA 서열로부터 출발하여 작성될 수 있고, 예를 들면 진뱅크(Genbank)(미국 캘리포니아주 인텔리제네틱스 소재), 유로피언 바이오인포매틱스 인스티튜트(European Bioinformatics Institute)(영국 캠브릿지 힌스톤 홀 소재), NBRF(미국 워싱턴 디씨 메디칼 센터 조지타운 유니버서티 소재) 및 벡베이스(Vecbase)(미국 위스콘신주 매디슨 바이오테크놀로지 센터 유니버서티 오브 위스콘신 소재)로부터 입수가능하거나, 도 1 또는 표 3에 개시된 서열 정보로부터 시험관내 돌연변이생성의 방법에 의해(예를 들면, 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York] 참조) 수득된다. 본 발명의 실행을 위해 또한 바람직한 소정의 DNA 서열을 돌연변이시키는 또다른 가능성은 폴리머라아제 쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)을 사용함에 의한 돌연변이생성이다. 출발 물질로서의 DNA는 당분야에 공지되고, 예를 들면 샘브룩 등의 문헌[Molecular Cloning]에 기재된 방법에 의해 개개의 균주/유기체로부터 단리될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따라 작성되고/돌연변이된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하는 DNA는 공지된 DNA 서열을 기초로 하여, 예를 들면 당분야에 공지된 방법(예를 들면, 유럽 특허 제EP 747483호에 기재된 바와 같음)에 의해 합성 유전자의 작성에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 즉 한정되는 것은 아니지만 다른 염색체 DNA 및 RNA, 및 염색체외 DNA 및 RNA와 같은 다른 핵산 서열이 실질적으로 존재하지 않는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 당분야의 숙련가에게 공지된 통상의 핵산 정제 방법이 단리된 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해 사용될 수 있다. 이 용어는 또한 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드를 내포한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 프로모터, 박테리아 세포의 경우 필요에 따라 리보좀-결합 부위 및 종결자(terminator)가 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 기능성 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 플라스미드에 관한 것이다. 벡터 또는 플라스미드는 바람직하게는 1종 이상의 마커 유전자를 포함한다. 본원에서 "작동적으로 연결된"이라는 용어는 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편상에 핵산 서열이 회합됨을 지칭한다. 예를 들면, 프로모터는 이것이 암호화 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 경우, 즉 암호화 서열이 프로모터의 전사 제어하에 있는 경우 암호화 서열과 작동적으로 연결된다. 암호화 서열은 센스 또는 안티-센스 배향으로 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. "발현"이라는 용어는 DNA 서열의 mRNA로의 전사 및/또는 mRNA의 아미노산 서열로의 번역을 나타낸다. "과-발현"이라는 용어는 유전자의 발현을 조절하지 않고/않거나 유기체의 유전자 자체의 내부를 증식시킴으로써 상응하는 비-개질된 유기체에서의 생성 수준을 초과하는 개질된 유기체(예를 들면 형질변환 또는 유전자도입에 의해 개질됨)에서의 유전자 산물의 생성을 의미한다.

일단 본 발명의 완성 DNA 서열이 수득되면, 이들은 당분야에 공지되고, 예를 들면 샘브룩 등의 상기 문헌에 기재된 방법에 의해 숙주 유기체의 게놈으로 직접 도입되거나 벡터내로 조립될 수 있어서 적절한 숙주 시스템에서 암호화된 폴리펩타이드를 (과-)발현할 수 있다. 그러나, 당분야의 숙련가라면 DNA 서열 자체가 본 발명의 적합한 숙주 시스템을 형질변환시키기 위해 사용되어 암호화된 폴리펩타이드를 (과-)발현시킬 수 있음을 알 것이다.

적합한 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포의 예로는, 한정되는 것은 아니지만 박테리아 세포, 예를 들면 시아노박테리아, 스트렙토코시(streptococci), 스타필로코시(staphylococci), 엔테로코시(enterococci), 예컨대 바실러스, 예로서 바실러스 서브틸리스, 또는 스트렙토마이세스, 예컨대 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 이. 콜라이, 예컨대 이. 콜라이 Kl2 균주, 예로서 Ml5 또는 HB 101이 포함된다. 숙주 세포는 효모 세포, 예컨대 아스퍼길리(Aspergill), 예로서 아스퍼길러스 니거(Aspergillus niger) 또는 아스퍼길러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 트리코데마(Trichoderma), 예로서 트리코데마 리사이(Trichoderma reesei), 아쉬비아, 예로서 아쉬비아 고시피(Ashbya gossypii), 에레모테시움(Eremothecium), 예로서 에레모테시움 아쉬비(Eremothecium ashbyii), 사카로마이세스, 예로서 사카로마이세스 세레비지아에, 칸디다, 예로서 칸디다 플라레리(Candida flareri), 피치아(Pichia), 예로서 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세뉼라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 예로서 에이치. 폴리오파(H. polymorpha)(DSM 5215), 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)의 세포를 비롯한 진균 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 추가로 포유동물 세포, 예컨대 CHO, COS, HeLa, 3T3, BHK, 293, CV-1을 비롯한 동물 세포, 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포와 같은 곤충 세포, 및 식물 세포, 예컨대 겉씨식물 및 속씨식물의 세포로부터 선택될 수 있다.

진균류에서 발현시키기 위해 사용될 수 있는 벡터는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면 유럽 특허 제EP 420358호 또는 쿨렌(Cullen) 등의 문헌[Bio/Technology 5, 369-376, 1987], 와드(Ward)의 문헌[in Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York, 1991], 업쉘(Upshall) 등의 문헌[Bio/Technology 5, 1301-1304, 1987], 그윈(Gwynne) 등의 문헌[Bio/Technology 5, 71-79, 1987], 또는 푼트(Punt) 등의 문헌[J. Biotechnol. 17, 19-34, 1991]에 기재되어 있고, 효모의 경우는 스리크리쉬나(Sreekrishna) 등의 문헌[J. Basic Microbiol. 28, 265-278, 1988; Biochemistry 28, 4117- 4125, 1989], 히체만(Hitzemann) 등의 문헌[Nature 293, 717-722, 1981], 또는 유럽 특허제EP 183070호, 제EP 183071호, 제EP 248227호, 또는 제EP 263311호에 기재되어 있다. 이. 콜라이에서 발현시키기 위해 사용될 수 있는 적합한 벡터는 샘브룩 등의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 당분야에 공지되어 있다. 바실러스에서 발현시키기 위해 사용될 수 있는 벡터는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면 유럽 특허 제EP 207459호 또는 제EP 405370호, 얀수라(Yansura) 및 헤너(Henner)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439-443 (1984)], 또는 헤너, 레 그리스(Le Grice) 및 나가라잔(Nagarajan)의 문헌[Meth. Enzymol. 185, 199-228, 1990]에 기재되어 있다. 에이치. 폴리모파에서 발현시키기 위해 사용될 수 있는 벡터는, 예를 들면 겔리센(Gellissen) 등의 문헌[Biotechnology 9, 291-295, 1991]에 기재된 바와 같이 당분야에 공지되어 있다.

이러한 벡터는 이미 조절 요소, 예컨대 프로모터를 동반하거나, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 이러한 요소를 함유하도록 유전자조작될 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터 요소는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면 트리코데마 리사이의 경우 cbhl- 또는 pki1-프로모터이고, 아스퍼길러스 오리자에의 경우 amy-프로모터이며, 아스퍼길러스 니거의 경우 glaA-, alcA-, aphA-, tpiA-, gpdA- 및 pkiA-프로모터이다. 효모에서 발현시키기 위해 사용될 수 있는 적합한 프로모터 요소는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면 사카로마이세스 세레비지아에에서 발현시키기 위해서는 pho5- 또는 gap-프로모터이고, 피치아 파스토리스의 경우 aox1-프로모터이며, 에이치. 폴리모파의 경우 FMD- 또는 MOX 프로모터이다.

박테리아 발현을 위해 적합한 프로모터 및 벡터는, 예를 들면 기아코미니(Giacomini) 등의 문헌[Gene 144, 17-24, 1994]에 기재된 합성 프로모터, 바실러스 서브틸리스로부터의 vegI 프로모터 또는 강한 박테리오파지 T5 프로모터를 포함한다. 적합한 플라스미드에 의해, 또는 GTP 사이클로하이드롤라아제 II-암호화 DNA 서열의 염색체 DNA로의 조립을 통해, 청구된 (돌연변이체) GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소를 박테리아에서 발현시키기 위한 적합한 교시내용을 많은 곳, 예컨대 미국 특허 제6,322,995호에서 찾아볼 수 있다.

따라서, 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드를 박테리아, 진균류, 동물 또는 식물 숙주에서 발현시키기 위한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 이러한 형질변환된 박테리아 또는 진균류, 동물 또는 식물 숙주 또한 본 발명의 대상이다.

추가로 본 발명은 (a) 본 발명의 숙주를, 이러한 숙주 세포에서 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 발현을 허용하는 조건하에 적합한 배지중에서 배양하는 단계; 및 (b) 생성물(리보플라빈, 리보플라빈 전구체, FMN, FAD, 또는 이의 1종 이상의 유도체)을 배지로부터 선택적으로 분리하는 단계를 포함하는, 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, FMN, FAD, 또는 이의 1종 이상의 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

이러한 방법은 다음의 생성물중 1종 이상의 생명공학적 제조를 위해 사용될 수 있다: 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, FMN, FAD, 또는 이의 1종 이상의 유도체. 이러한 유도체는 플라보단백질을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 적합한 숙주 세포를 유전적 및 대사적으로 조작하는 방법은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 유사하게는, 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, FMN, FAD, 또는 이의 1종 이상의 유도체에 (잠재적으로) 적합한 제조 방법은 미소 화학 생합성 및 제조의 분야에 공지되어 있다.

본 발명에 따른 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, FMN, FAD, 또는 이의 1종 이상의 유도체의 생명공학적 제조 방법은 상기 기재된 바와 같은 전체-세포 발효 공정에 한정되지만, 또한 예를 들면 원심분리 또는 여과, 또는 단리된 효소에 의한 재구성 반응 경로에 의해, 예를 들면 투과된 숙주 세포, 조질 세포 추출물, 세포 잔여물로부터 정화된 세포 추출물을 사용할 수 있다. 또한, 이러한 공정의 조합은 본 발명의 범주에 속한다. 세포-부재 생합성의 경우(예컨대, 재구성된 반응 경로에 의함), 단리된 효소가 숙주 세포에 의해 제조되고 이로부터 단리되는지, 시험관내 전사/번역에 의해 제조되고 단리되는지, 또는 다른 수단에 의해 제조되고 단리되는지는 무관하다.

추가로 본 발명은 (a) 본 발명의 숙주 세포를, 본 발명의 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 발현을 허용하는 조건하에 배양하는 단계; 및 (b) 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 세포 또는 배지로부터 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소는 적합한 발현 시스템을 포함하는 유전적으로 조작된 숙주 세포로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드의 재조합형 생성을 위해, 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터나 플라스미드를 혼입하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 숙주 세포내로 도입함은 당분야에 공지된 표준 방법, 예컨대 인산칼슘 유전자도입, DEAE-덱스트란 매개된 유전자도입, 미소주입, 양이온 지질-매개된 유전자도입, 전기천공, 형질도입, 탄도 도입(ballistic introduction) 및 감염에 의해 수행될 수 있다.

매우 다양한 발현 시스템이 본 발명의 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 벡터로는, 무엇 보다도, 상기 기재된 벡터가 포함된다. 일반적으로, 숙주에서 폴리뉴클레오타이드를 유지, 증식 또는 발현하고/하거나 폴리펩타이드를 발현하기에 적합한 임의의 시스템 또는 벡터는 이와 관련된 발현을 위해 사용될 수 있다.

진핵세포에서의 재조합 발현 시스템에서, 번역된 단백질을 소포체의 루멘(lumen), 세포벽과 세포막사이의(periplasmic) 공간 또는 세포외 환경으로 분비하기 위해, 적합한 분비 신호가 발현된 폴리펩타이드내로 혼입될 수 있다. 이러한 신호는 폴리펩타이드에 내생성이거나, 이들은 이종성 신호일 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈(phosphocellulose) 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피를 비롯한 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수되고 정제될 수 있다. 단백질 재접힘(refolding)을 위한 공지된 기법은, 폴리펩타이드가 단리 및/또는 정제동안 변성될 경우 활성 형태를 재생하기 위해 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소는, 예를 들면 펜(Pen) 등의 문헌[Bio/Technology 11, 811-814, 1994] 또는 유럽 특허 제EP 449375호에 기재된 바와 같은 방법에 따라 식물에서, 바람직하게는 예를 들면 유럽 특허 제EP 449376호에 기재된 종자에서 발현될 수 있다. 프로모터 및 종결자의 몇몇 적합한 예로는 노팔린(nopaline) 신타아제(nos), 옥토핀(octopine) 신타아제(ocs) 및 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 유전자로부터의 것들이 포함된다. 사용될 수 있는 유효한 식물 프로모터의 한 유형은 고등(high-level) 식물 프로모터이다. 이러한 프로모터는, 본 발명의 유전자 서열과 작동적으로 연결될 경우, 본 발명의 유전자 산물의 발현을 촉진시킬 수 있어야 한다. 본 발명에 사용될 수 있는 고등 식물 프로모터로는, 예를 들면 대두로부터의 리뷸로즈-1,5-비스포스페이트 카복실라아제의 작은 서브유닛(ss)의 프로모터, 및 엽록소 a/b 결합 단백질의 프로모터가 포함된다.

본 발명의 단백질의 상업적 생성이 요구될 경우, 다양한 배양 방법론이 적용될 수 있다. 예를 들면, 재조합 미생물 숙주로부터 과발현된 특이적 유전자 산물의 대규모 제조는 회분(batch) 또는 연속 배양 방법에 의해 달성될 수 있다. 회분 및 유가(fed-batch) 배양 방법은 통상적인 것으로서 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면 토마스(Thomas D. Brock)의 문헌[Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 제 2 판 (1989)], 시나우어(Sinauer)의 문헌[Associates, Inc., Sunderland, Mass.], 또는 데쉬판데(Deshpande)의 문헌[Appl. Biochem. Biotechnol. 36, 227- 234, 1992]에 기재되어 있다. 연속 배양 공정을 위한 영양분 및 성장 인자의 조절 방법, 뿐만 아니라 생성물 형성률을 최대화하기 위한 기법은 미생물 산업 분야에 공지되어 있고, 다양한 방법이 브록의 상기 문헌에 상세히 기재되어 있다.

발효 배지는 추가로 적합한 탄소 기질을 함유할 수 있다. 적합한 기질은, 한정되는 것은 아니지만, 단당류, 예컨대 글루코즈 및 프럭토즈, 올리고당류, 예컨대 락토즈 또는 수크로즈, 다당류, 예컨대 전분 또는 셀룰로즈 또는 이의 혼합물, 및 재생성 공급원료로부터의 정제되지 않은 혼합물을 포함한다. 본 발명에서 사용된 탄소원은 매우 다양한 탄소 함유 기질을 포함할 수 있고, 유기체의 선택에 의해서만 한정될 것임을 이해해야 한다.

추가로, 본 발명은 (a) 바람직하게는 증가되어야 하는 특이적 활성을 갖는 제 1 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계; (b) 1개 이상의 돌연변이(들)를 폴리뉴클레오타이드 서열로 도입하여 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드 서열이 제 1 GTP 사이클로하이드롤라아제 II와 비교될 경우 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함하는 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화도록 하는 단계(여기서, 1개 이상의 돌연변이(들)는 서열번호: 2의 위치 261, 270, 276, 279, 308 및/또는 347에 상응하는 아미노산 위치(들) 상에서의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 돌연변이(들)를 포함함); (c) 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드를 벡터나 플라스미드에 선택적으로 삽입하는 단계; (d) 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터나 플라스미드를 적합한 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (e) 숙주 세포를 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 발현을 허용하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 특이적 활성이 증가된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 제조하는 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 (a) 바람직하게는 증가되어야 하는 특이적 활성을 갖는 제 1 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계; (b) 특이적 활성에 영향을 주는 위치를 제공하는 단계; (c) (b)에서 정의된 바와 같은 야생형 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 소정의 아미노산의 대체를 위한 최적의 아미노산을 정의하고, 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드 서열이 새로운 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하도록 (b)에서 정의된 위치에서 (a)의 폴리뉴클레오타이드 서열내로 1개 이상의 돌연변이를 도입하는 단계; (d) 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드를 벡터나 플라스미드에 선택적으로 삽입하는 단계; (e) 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터나 플라스미드를 적합한 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (f) 숙주 세포를, 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 발현을 허용하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 특이적 활성이 증가된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 제조하는 방법을 제공함을 포함한다.

한 실시양태에서, 전술된 단계 (c) 또는 방법은 포화된 돌연변이생성을 통해 수행된다. 그러나, 이는 증가된 특이적 활성을 갖는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 수득하기 위해 야생형 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 소정의 위치에서 아미노산을 대체해야 하는 아미노산을 정의하기 위한 유일한 방법이 아님을 이해해야 한다.

전술된 바와 같이, 예를 들면 포화된 돌연변이생성을 통해, 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II로부터 특이적 활성이 증가된 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제의 제조는, 한정되는 것은 아니지만, 도 1 또는 표 3에 제시된 바와 같은 비-개질된 단백질, 특히는 서열번호: 2, 33, 35, 37, 39, 41, 및 43에 의해 식별된 단백질들, 예를 들면 바실러스 서브틸리스 또는 아쉬비야 고시피의 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 단백질로부터의 돌연변이된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 단백질의 제조를 포함한다. PCR 반응에 사용되는 프라이머는, 하나의 프라이머, 예컨대 센스 프라이머가 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있고, 나머지 프라이머, 예컨대 안티센스 프라이머가 야생형 뉴클레오타이드 서열을 함유하도록 한다. 이들 프라이머 쌍 및 야생형 ribA의 게놈 DNA를 갖는 PCR은, 사용된 프라이머의 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열에 근거하여, 소정의 위치에서 특정 돌연변이를 수반하는 PCR 생성물을 만들어 낸다. 표준 방법, 예컨대 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트[퀴아겐(Qiagen)]를 사용하여 생성된 PCR 생성물을 정제한 후, DNA를 제한 효소, BamBI 및 EcoRI으로 절단하고, 적합한 벡터, 예컨대 pQE60내로 결찰시키고, GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 대해 음성인 균주내로 형질변환시킨다. 이러한 균주의 일예는 pREP4를 포함한 이. 콜라이 균주 Rib7(리처(Richter) 등의 문헌[J. Bacteriol. 175, 4045-4051, 1993])이다. DNA 서열화에 의한 정확한 서열의 확인후, 돌연변이된 RibA는 정제되고, 상기 기재된 바와 같이 특징화될 수 있다. 아쉬비아 고시피가 증가된 특이적 활성을 갖는 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 생성을 위해 사용될 경우, 포화된 돌연변이생성은 서열번호: 2와 같은 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 각각의 잔기 V261, G270, A276, Q279, K308 및 M347(이는 후자의 효소의 특이적 활성에 영향을 주는 것으로 보임)에 상응하는 아미노산 잔기/위치 T126, G135, A141, L144, N182 및 I221에서 수행되어야 한다(표 3 참조).

이 방법의 바람직한 실시양태는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 플라스미드, 숙주 세포, 및 본원에 기재된 방법의 바람직한 실시양태에 상응한다. 제 1 및 제 2 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 및 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 각각 상응한다(상기 참조).

본 발명의 목적은 전술된 바와 같은 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하는 핵산 서열, 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함한 벡터, 바람직하게는 발현 벡터, 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터에 의해 형질변형된 숙주 세포, 앞서 기재된 바와 같은 숙주 세포가 적합한 배양 조건하에 배양되고 GTP 사이클로하이드롤라아제 II가 이러한 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 당분야에 공지된 방법에 의해 단리되는 본 발명의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 제조 방법, 및 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터에 의해 형질변형되고/되거나 이러한 폴리뉴클레오타이드가 그의 염색체(들)내로 안정하게 조립된 숙주 세포에 기초하여 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, FMN, FAD, 또는 이의 1종 이상의 유도체를 생명공학적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 (i) 본 발명의 특이적 돌연변이중 1개 이상을 수반하는 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하고, 본 발명의 특이적으로 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소의 임의의 DNA 서열에 의해 표준 조건하에 하이브리드화된 DNA 서열, 또는 (ii) 본 발명의 특이적 돌연변이중 1개 이상을 수반하는 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하지만, 유전자 코드의 퇴화로 인하여 하이브리드화되지 않으나, 본 발명의 특이적으로 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소의 임의의 DNA 서열에 의해 표준 조건하에 하이브리드화된 DNA 서열과 정확히 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열, 또는 (iii) 폴리펩타이드 단편의 활성 특성을 유지하는 상기 DNA 서열의 단편인 DNA 서열을 제공하는 것이다.

본 발명에서 하이브리드화를 위한 "표준 조건"은, 특이적 하이브리드화 신호를 검출하기 위해 당분야의 숙련가에 의해 일반적으로 사용되고, 샘브룩 등의 문헌["Molecular Cloning", 제 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, New York]에 기재되어 있는 조건, 또는 바람직하게는 소위 엄격한(stringent) 하이브리드화 및 비-엄격한 세척 조건, 또는 보다 바람직하게는 소위 엄격한 하이브리드화 및 엄격한 세척 조건(이는 당분야의 숙련가에게 공지되고 샘브룩 등의 상기 문헌에 기재됨)을 의미한다. 엄격한 하이브리드화 조건의 특정 예는 50% 폼아마이드, 5 x SSC(150mM NaCl, 15mM 트리스소디움 시트레이트), 50mM 인산나트륨(pH 7.6), 5 x 덴하르트의 용액(Denhardt's solution), 10% 덱스트란 설페이트, 및 20㎍/ml의 변성되고 전단된 연어 정자 DNA를 포함한 용액중에서 42℃에서 하룻밤(예컨대 15시간) 항온처리한 후, 0.1 x SSC중에서 약 65℃에서 하이브리드화 지지체를 세척하는 것이다.

추가로, 본 발명의 목적은 본 발명의 구체적으로 기재된 DNA 서열을 기초로 설계된 PCR 프라이머에 의한 소위 폴리머라아제 쇄 반응 방법("PCR")에 의해 수득될 수 있는 DNA 서열을 제공하는 것이다. 이렇게 수득된 DNA 서열은, 설계되어진 효소와 적어도 동일한 돌연변이를 갖고 필적할만한 활성 특성을 나타내는 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소를 암호화함을 알아야 한다.

본원에 기재된 발명의 다양한 실시양태는 상호 조합될 수 있다.

도 1은 구체적으로, 칸디다 구일리에르몬디, 아쉬비아 고시피, 사카로마이세스 세레비지아에, 뉴로스포라 크라사, 쉬조사카로마이세스 폼베, 아카에오글로부스 풀지더스, 스트렙토마이세스 코엘리콜러, 헬리코박터 필로리 J99, 헬리코박터 필로리, 피로코쿠스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus), 테르모토가 마리티마, 클라미디아 뮤리다룸(Chlamydia muridarum), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미디아 카비아에(Chlamydia caviae) GPIC, 아라비돕시스 탈리아나, 라이코페르시컴 에스쿨렌텀, 오리자 사티바(Oryza sativa), 알칼리게네스 유트로퍼스, 나이제리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)(혈청군(serogroup) A), 나이제리아 메닌기티디스(혈청군 B, 2개의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소), 슈도모나스 푸티다(2개의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소), 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae)(2개의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소), 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)(하에모필러스 악티노마이세템코미탄스(Haemophilus actinomycetemcomitans)), 하에모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 에스케리치아 콜라이, 에스케리치아 콜라이 06, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 부크네라 아피디콜라(Buchnera aphidicola)(아종: 아시르토시폰 피슘(Acyrthosiphon pisum))(아시르토시폰 피슘 공생 박테리아), 부크네라 아피디콜라(아종: 쉬자피스 그라미늄(Schizaphis graminum)), 위글스워티아 글로시니디아 브레비팔피스(Wigglesworthia glossinidia brevipalpis), 부크네라 아피디콜라(아종: 바이존기아 피스타시아에(Baizongia pistaciae)), 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 투베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 코리네박테리움 에피시엔스, 코리네박테리움 글루타미컴, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)(브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)(스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis)), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 클로스트리디움 아세토부틸리컴(Clostridium acetobutylicum), 푸조박테리움 누클레아텀(Fusobacterium nucleatum), 아나바에나(Anabaena) 종, 시네코시스티스(Synechocystis) 종, 시네코코쿠스 엘론가투스(Synechococcus elongatus)(테르모시네코코쿠스 엘론가투스(Thermosynechococcus elongatus)), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 세레우스, 바실러스 할로듀란스, 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 클로로비움 테피둠(Chlorobium tepidum), 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 다이노코쿠스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans), 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus), 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii), 리조비움 에틀리(Rhizobium etli), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 슈도모나스 글루마에(Pseudomonas glumae), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 포토박테리움 포스포레움(Photobacterium phosphoreum), 아조스피릴룸 브라실렌세(Azospirillum brasilense), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti)(시노르히조비움 멜리로티(Sinorhizobium meliloti)), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 리조비움 로티(Rhizobium loti)(메소르히조비움 로티(Mesorhizobium loti)), 니트로조모나스 유로파에아(Nitrosomonas europaea), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)(슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)), 잔토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis), 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 비브리오 파라하에몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 비브리오 피쉐리(Vibrio fischeri), 쉐와넬라 오나이덴시스(Shewanella oneidensis), 포토박테리움 포스포레움(Photobacterium phosphoreum), 포토박테리움 라이오그나티(Photobacterium leiognathi), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 데할로스피릴룸 물티보란스(Dehalospirillum multivorans), 자이렐라 파스티디오사(Xylella fastidiosa))의 서열 배열을 나타낸다. 번호매김은 만들어진 배열과 관련된다. 일부 아미노산 서열은 아쉬비아 고시피, 스트렙토마이세스 코엘리콜러, 헬리코박터 필로리 J99, 헬리코박터 필로리, 아라비돕시스 탈리아나, 알칼리게네스 유트로퍼스, 나이제리아 메닌기티디스(혈청군 A), 나이제리아 메닌기티디스(혈청군 B), 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 시린가에, 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(하에모필러스 악티노마이세템코미탄스), 하에모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 파스퇴렐라 물토시다, 에스케리치아 콜라이, 에스케리치아 콜라이 06, 살모넬라 티피뮤리움, 예르시니아 페스티스, 부크네라 아피디콜라(아종: 아시르토시폰 피슘)(아시르토시폰 피슘 공생 박테리아), 부크네라 아피디콜라(아종: 쉬자피스 그라미늄), 위글스워티아 글로시니디아 브레비팔피스, 부크네라 아피디콜라(아종: 바이존기아 피스타시아에), 슈도모나스 글루마에, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 또는 포토박테리움 포스포레움으로부터의 효소와 같은 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 활성만을 갖는 효소를 암호화한다. 비. 서브틸리스로부터의 RibA 효소와 같은 다른 효소는, 또한 DHBP 신타아제 활성을 갖는 도메인을 함유한다. 비. 서브틸리스로부터의 RibA의 아미노산 서열은 밑줄 그어져 있다. 특이적 활성에 긍적적 효과를 갖는 것으로 밝혀진 아미노산 잔기(아미노산 잔기 261, 270, 276, 279, 308, 347) 및 비. 서브틸리스로부터의 RibA의 단백질분해효소 감수성에 긍정적 효과를 갖는 것으로 밝혀진 아미노산 잔기(196)에 상동성이고/등가이고 하기 실시예에 논의된 위치는 볼드체로 기재되어 있다. 이들의 위치에 대해 사용되는 번호매김은 비. 서브틸리스 야생형 아미노산 서열에 따라 이루어 진다. 도면은 사용된 서열의 명칭으로 시작하고, 데이터베이스 수납 번호, 및 서열의 근원 유기체(괄호안)가 기재되어 있다.

하기 비한정적인 실시예는 추가로 본 발명을 예시한다.

실시예 1: GTP 사이클로하이드롤라아제 II 활성의 측정 및 특이적 활성의 결정

GTP 사이클로하이드롤라아제 II 활성을 측정하기 위해 사용된 효소적 검정은 리츠(Ritz) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 276, 22273-22277, 2001]으로부터 응용되었다. 최종 검정 완충액은 50mM 트리스/HCl, pH 8.5, 10mM MgCl₂, 7.5mM 머캅토에탄올, 2.5mM GTP 및 0.1mg/ml 소혈청 알부민을 함유하였다. 정제후(실시예 5 참조), 효소를 50mM 트리스/HCl, pH 8.5, 10 mM MgCl₂, 7.5mM 머캅토에탄올, 및 10% 글리세롤이 함유된 완충액에 유지시켰다. 기질을 효소에 첨가하고, 310nm(여기서 GTP는 전혀 흡수를 나타내지 않음)에서의 흡수를 20분 내지 30분에 걸쳐 수행하였다. 최 종 반응 혼합물은, 표 1 또는 표 2에 제시된 바와 같은 돌연변이체중 하나 또는 비. 서브틸리스로부터의 0.02 내지 0.04mg/ml의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 함유하였다. DRAPP에 대한 6.28[mM^-1cm^-1]의 흡수 계수를 활성화 계산에 사용하였다. 단백질 측정을 바이오-래드(Bio-Rad)로부터의 프로테인 어세이(Protein Assay)[목록 번호: 500-0002, 바이오-래드 래보레이토리즈 아게(Bio-Rad Laboratories AG), 스위스 체하-4153 라이나흐 넨츨린게르벡 2 소재]에 의해 수행하였다.

상기 제시된 "특이적 활성"의 정의에 따라, 1유닛은 상기 기재된 조건하에 1분당 1μ몰 DRAPP의 형성을 촉매화 하는 RibA의 양이다. 특이적 활성은 상기 기재된 조건하에 1분당 1mg의 RibA에 의해 형성된 DRAPP의 양이다. 전술된 정의를 사용하여, 비. 서브틸리스의 His₆-태깅된 RibA 단백질의 특이적 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 활성은 0.115U/mg이었다.

실시예 2: 효소 검정의 품질에 대한 시험

최적 검정은 다수의 요건, 예컨대 효소 농도에 대한 선형성 및 시간에 대한 선형성을 만족시켜야 한다. 실시예 1에 기재된 조건 및 22㎍ 효소를 사용하여, 310nm에서의 흡수의 증가를 25분에 걸쳐 수행하였다. 검정이 효소 농도에 대해 선형인 범위에서 시험하기 위해, 증가된 효소 농도(0-40㎍ His₆-태깅된 RibA)에 대한 검정의 의존성을 시험하였다. 검정에 따르면, 25분에 걸쳐 비. 서브틸리스로부터의 His₆-태깅된 RibA의 0 내지 40㎍ 사이에서 선형이었다.

이후, 비. 서브틸리스로부터의 His₆-태깅된 RibA의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 활성의 GTP 농도에 대한 의존성을 시험하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같은 조건을 사용하였다. 그러나, GTP 농도는 0.05 내지 2.5mM의 최종 농도로 다양하였다. 데이터에 따르면 GTP에 대한 K _m 값은 0.07mM이고, 비. 서브틸리스로부터의 His₆-태깅된 RibA 효소의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 활성에 대하여 특이적 활성은 37℃에서 약 115mU/mg 단백질이었다. 본 실시예의 실험으로부터, GTP 사이클로하이드롤라아제 II 활성 검정이 실제로는 시간 및 효소(GTP 사이클로하이드롤라아제 II) 농도에 대해 선형이고, 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 위한 주어진 조건하에 2.5mM의 GTP 농도가 효소의 특이적 활성의 신뢰성 높은 측정을 허용하기 위해 최적임을 알 수 있었다.

실시예 3: 바실러스 서브틸리스로부터의 게놈 DNA의 단리

비. 서브틸리스를 30℃에서 송아지고기를 우린 육즙(Veal Infusion Broth) [벡턴 딕킨슨(Becton Dickinson) 제품, 미국 매릴랜드주 21152 스파크스 소재]중에서 하룻밤 성장시켰다. 1.5ml의 배양액을 1.5ml 관에 옮기고 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 0.5ml의 현탁 완충액(50mM 트리스/HCl, pH 7.5, 50mM Na₂EDTA, 15% 수크로즈 및 1mg/ml의 신선하게 첨가된 리소자임)에 재현탁시켰다. 실온에서 10분간 항온처리한 후, 1㎕의 다이에틸옥시다이포메이트를 첨가하였다. 이어서, 10㎕의 10% SDS 용액을 첨가하고, 관을 여러번 거꾸로 뒤집었다. 관을 5분 동안 70℃에서 항온처리하여 박테리아 DNA를 방출시켰다. 50㎕의 5M 아세트산칼륨을 첨가하고, 관을 얼음위에서 냉각시키고, 45분 동안 여기에 방치하였다. 이후, 샘플을 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 새로운 1.5ml 관에 옮기고, 이를 실온에서 에탄올로 충전시켰다(1.5ml까지). 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 버리고, DNA 펠릿을 건조시켰다. 이어서, DNA를 70% 및 96% 에탄올로 세척하고, 10mM 트리스/HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 및 10㎍/ml RNase A에 용해시켰다.

실시예 4: 비. 서브틸리스 및 이의 돌연변이체로부터 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 및 DHBP 신타아제를 암호화하는 ribA 를 발현시키기 위한 발현 플라스미드의 작성

GTP 사이클로하이드롤라아제 II 및 DHBP 신타아제를 암호화하는 비. 서브틸리스의 ribA 유전자(서열번호: 1)의 클로닝을 PCR로 수행하였다. 비. 서브틸리스의 게놈 DNA를 실시예 3에 따라 단리하였다. ribA 유전자의 돌연변이된 형태를 암호화하는 주형 또는 상기 DNA 100ng을, 프라이머 RibA 1S(서열번호: 27) 및 RibA 1AS(서열번호:28)를 사용하는 PCR에 사용하였다. 하기 PCR 조건을 사용하였다: 2 μM의 각각의 프라이머, 0.2mM의 각각의 뉴클레오타이드, 2.5U의 교정(proof-reading) DNA 폴리머라아제[스트라타젠(Stratagene), 네덜란드 1101 씨비 암스테르담 추이두스트 게바우 캘리포니아 소재], 및 DNA 폴리머라아제와 함께 공급될 경우 적절한 완충액중 100ng의 게놈 DNA.

온도는 다음과 같이 조절하였다:

단계 1: 95℃에서 3분

단계 2: 95℃에서 30초

단계 3: 52℃에서 30초

단계 4: 72℃에서 60초

단계 2 내지 4를 30회 반복하였다.

1.3kb의 PCR 생성물을 PCR 2를 위한 주형으로서 사용하였고, 여기서 프라이머 RibA 1S는 프라이머 RibA 2S(서열번호: 29)로 대체되었다. 비. 서브틸리스 RibA (서열번호: 4)의 N-말단 His₆-태깅된 버전을 암호화하는, 상기 반응의 PCR 생성물(서열번호: 3)을 아가로즈 겔 전기이동에 의해 분리하고, 겔로부터 용출시키고, EcoRI 및 BamHL로 분해하고, EcoRI 및 BamHL로 분해된 벡터 pQE60[키아겐 아게(Qiagen AG), 독일 힐덴 소재]내로 결찰시켰다. 플라스미드를 pQE60ribANhis로 칭하였다.

실시예 5: 야생형 및 돌연변이체 효소의 특징화

돌연변이된 효소의 생성을 상기 기재되고 당분야의 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 수행하였다. 추가로 조사된 비. 서브틸리스로부터의 RibA의 돌연변이체를 표 1에 나타내었다. 모든 돌연변이체 유전자를 실시예 4에 기재된 바와 같이 pQE60 벡터내로 클로닝하였다. 모든 최종 구조물은 N-말단 His₆-태그를 함유하였다.

RibA 돌연변이체 효소를 실시예 4의 플라스미드로부터 발현시키고, 문헌["The QiaExpressionist" 독일 힐덴 퀴아겐, 2001년 3월, 제 5 판]에 기재된 바와 같이 정제하였다. 정제된 효소(RibA 돌연변이체)의 효소 특성을 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 분석하였다. 표 2는 RibA 돌연변이체(표 1 참조)의 특이적 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 활성을 비. 서브틸리스의 야생형 RibA의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 활성과 비교한다. 실시예 4에 기재된 바와 같이 RibA의 N-말단 His₆-태깅된 효소를 사용하여 활성을 측정하였다. 숫자는 서열번호: 2에서의 각각의 아미노산 위치를 한정한다.

괄호안의 아미노산 대체는 돌연변이체의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 대해 영향을 주지 않을 것이다. 아미노산 교환 Y196C는 RibA의 단백질분해효소 감수성을 감소시킨다.

실시예 6: 보다 높은 특이적 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 활성을 나타내는 RibA 돌연변이체를 과발현하는 재조합 비. 서브틸리스 균주의 작성

하기 실시예에서, 우선 RibA Y196C,A276T,A282T(PCR III), RibA Y196C,A276T,Q279R,A282T,K308R,M347I(구조물 C), 및 RibA Y196C,A276T,Q279R,A282T,K308R,F325Y,M347I(구조물 E)의 돌연변이된 ribA 폴리뉴클레오타이드 서열을 강한 구성 프로모터 P _vegI 이 함유된 벡터내로 도입하고, 이어서 추가로 이. 콜라이내에서 조작하였다. 폴리뉴클레오타이드 서열 및 플랭킹(flanking) 벡터 서열을 갖고 천연의 항체반응 능력을 갖는 비. 서브틸리스 미생물의 형질전환에 의해 돌연변이된 ribA를 과발현하는 비. 서브틸리스 균주를 생성하였다. 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 폴리뉴클레오타이드 서열 및 B. 서브틸리스 균주를 작성하였다. 예를 들면, 샘브룩 등의 문헌[Molecular Cloning. A Laboratory Manual (제 2 판), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], 및 하우드(Harwood) 및 커팅(Cutting)의 문헌[Molecular Biology Methods for Bacillus, John Wiley 및 Sons (1990)]을 참조한다.

돌연변이된 ribA를 증폭시키기 위해, 전체 ribA 암호화 서열이 포함된 1.2-kb DNA 단편을, 돌연변이체 PCR III, 구조물 C 또는 구조물 E, 및 RibANde+1(서열번호: 30) 및 RibA4AS(서열번호: 31)를 프라이머로서 함유하는 플라스미드로부터의 DNA를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다.

PCR 반응을 위한 반응 조건은 95℃에서 1분 동안 30회의 변성, 52℃에서 1분 동안의 풀림(annealing), 및 72℃에서 2분 동안의 연장(extension)으로 이루어졌다. Pfu Turbo DNA 폴리머라아제(스트라타젠, 네덜란드 1101 씨비 암스테르담 추이두스트 게바우 캘리포니아 소재)를 사용하여 PCR-생성된 오차를 최소화시켰다. PCR 생성물을 퀴아퀵 PCR 정제 키트(퀴아겐 제품)로 정제하고, NdeI 및 BamHI로 이중으로 분해하였다. 분해된 PCR 생성물을 pXI16 벡터(이는 비. 서브틸리스로부터의 강한 구성 P _vegI 프로모터의 바로 아래에 폴리뉴클레오타이드 서열을 클로닝하기 위한 적합한 제한 부위로 구성됨)내로 클로닝하였다(휴엠벨린(Huembelin) 등의 문헌[J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 1-7, 1999]). pXI16 벡터는 또한 비. 투린기엔시스(B. thuringiensis)로부터의 cryT 전사 종결자, 이중-교차에 의한 비. 서브틸리스 게놈내로의 상동성 재조합을 위한 sacB 플랭킹 서열, 및 에리트로마이신-내성 마커를 함유한다. 돌연변이된 ribA를 함유한 각각의 플라스미드를 DNA 서열화에 의해 확인하였다.

각각의 플라스미드를 ApaI로 분해하여 P _vegI 프로모터로부터 스페이서 영역을 제거하고, 재-결찰시키고, 다시 FspI로 분해하고, 천연의 항체반응 능력을 갖는 비. 서브틸리스 1012 세포내로 형질변형시켰다. 형질변형체를 최종 농도가 2㎍/ml이 되도록 에립트로마이신이 함유된 TBAB 플레이트[트립토즈 블러드 아가 베이스(Tryptose Blood Agar Base), 벡턴 딕킨슨, 미국 매릴랜드주 21152 스파크스 소재] 상에서 선택하였다. DNA 서열화는 돌연변이된 ribA 폴리뉴클레오타이드 서열이 이들 균주에서 정확함을 입증하였다. 리보플라빈의 과생산을 실시예 7에 따라 시험하였다.

P _vegI 프로모터에 의해 유도된 돌연변이된 ribA 폴리뉴클레오타이드 서열을 일반화된 형질도입에 의해 리보플라빈 과생산 비. 서브틸리스 균주 RB50::(pRF69)_n::(pRF93)_m(이는 퍼킨스(Perkins) 등의 문헌[J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22:8-18 (1999)]에 개시되어 있음)내로 도입하였다. 박테리오파지 PBS1을 사용하는 표준 기법을 하우드 및 커팅의 문헌[Molecular Biology Methods for Bacillus, John Wiley and Sons (1990)]에 따라 이용하였다. 형질도입체를 최종 농도가 2㎍/ml이 되도록 에립트로마이신이 함유된 TBAB 플레이트 상에서 선택하였다. 형질변형체를 PCR 분석 및 DNA 서열화로 검토하여 돌연변이된 ribA 폴리뉴클레오타이드 서열의 정확한 삽입을 입증하였다.

실시예 7: 특이적 활성이 증가된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 사용한 리보플라빈의 개선된 생성

GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 특이적 활성에 영향을 주는 돌연변이의 생체내 효과를 시험하기 위해, 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II(RibA) 돌연변이체 PCR III, 구조물 C, 또는 구조물 E를 리보플라빈 과생산 비. 서브틸리스 균주, 예컨대 균주 RB50::(pRF69)_n::(pRF93)_m(퍼킨스 등의 문헌[J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 8-18, 1999] 참조)내로, 예를 들면 sacB 유전자 좌에 도입하였다. 리보플라빈의 생성을, ribA 유전자에서의 돌연변이의 존재 또는 부재에 의해서만 상이한 비. 서브틸리스의 2가지 재조합 균주에서 직접적으로 비교하였다. 바실러스 균주의 배양을 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다.

실시예 8: 리보플라빈 생성을 평가하기 위한 배양 조건

리보플라빈 생성을, P _vegI 프로모터에 의해 유도된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 돌연변이체 PCR III, 구조물 C, 또는 구조물 E가 sacB 유전자 좌에 조립된 리보플라빈 과생산 비. 서브틸리스 균주, 예컨대 균주 RB50::(pRF69)_n::(pRF93)_m(실시예 6 참조)의 유가 배양으로 시험하였다. 균주의 발효를 유럽 특허 제EP 405370호에 개시된 바와 같이 수행하였다.

실시예 9: 리보플라빈 측정을 위한 분석 방법

리보플라빈을 측정하기 위해 하기 분석 방법을 사용하였다(브레첼(Bretzel) 등의 문헌[J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 19-26, 1999] 참조).

크로마토그래피 시스템은 2상 펌프, 칼럼 자동온도 조절기 및 냉각된 자동샘플채취기가 구비된 휴렛-패커드(Hewlett-Packard) 1100 시스템이었다. 다이오드 어레이 검출기 및 형광 검출기 둘다를 직렬로 사용하였다. 2개의 신호를 기록하였다: 280nm에서의 UV, 및 여기 446nm, 방출 520nm에서의 형광 미량.

스테인레스-스틸 수펠코실(Supelcosil) LC-8-DB 칼럼(150 x 4.6mm, 3㎛ 입자 크기)을 가드 카트리지(guard cartridge)와 함께 사용하였다. 이동상은 100mM 아세트산(A) 및 메탄올(B) 이었다. 하기 계획에 따라 구배 용출을 사용하였다:

칼럼 온도를 20℃로 설정하였고, 유동 속도는 1.0ml/분이었다. 수행 시간은 25분이었다.

발효 샘플을 희석하고, 여과하고, 추가의 처리없이 분석하였다. 리보플라빈을 외부 표준물과 비교하여 정량화하였다. 계산을 280nm에서의 UV 신호에 기초하였다. 플루카(Fluka)(스위스 9471 부흐스 소재)로부터 구입한 리보플라빈을 표준 물질(순도 ≥ 99.0%)로서 사용하였다.

실시예 10: 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 상동성인 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소에서의 상응하는 잔기의 확인

표준 데이터베이스, 예컨대 SWISS-PROT 및 TrEMBL을 사용하는 프로그램 블라스틴에 의해 발견된 92개의 상이한 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소의 복합 아미노산 서열 배열(도 1 참조)을, 하기 매개변수를 사용하는 프로그램 "파일업"[GCG 위스콘신 패키지, 버전 10.2, 악셀리스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 92121-3752 산 디에고 9685 스크랜톤 로오드 소재]에 의해 계산하였다: 갭 생성 패널티 8, 갭 연장 페널티 2, 및 블로섬(blosum)62.cmp 매트릭스(디폴트 매개변수).

본 발명에서 상동성 GTP 사이클로하이드롤라아제 II는 도 1에 제시된 임의의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 아미노산 서열과 서열 유사성을 나타낼 수 있다. 도 1은 92개의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 아미노산 서열의 복합 서열 배열을 제공하고, 바실러스 서브틸리스로부터의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 서열은 밑줄 그어져 있다. 도 1은 단지 일예를 제시하는 것으로 모든 공지된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소의 완전한 집합체를 의미하는 것은 아니다. 상동성 잔기, 즉 아미노산 서열 배열에서 동일한 위치에 위치한(즉, 예를 들면 도 1에서 동일한 칼럼내에 위치한) 상이한 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 효소의 잔기는 각각의 단백질의 3D 구조에서 유사하게 위치되고, 각각의 단백질에서 필적할만한 기능을 구조적으로 및 기능적으로 충족시킬 것으로 기대된다. 실시예에서 논의된 비. 서브틸리스로부터의 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 잔기에 상동성인 아미노산 잔기는 도 1에서 볼드체로 강조되어 있고, 비. 서브틸리스 아미노산 서열에서 각각의 위치는 배열의 각 칼럼위에 부가되어 있다.

특이적 아미노산 위치, 즉 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열(서열번호: 2)의 특이적 활성에 긍정적 영향을 주는 것으로 밝혀진 아미노산 잔기(아미노산 잔기 261, 270, 276, 279, 308, 347)에 상동성인/등가인 위치에 상응하는 92개의 상이한 유기체의 아미노산 잔기가 표 3에 요약되어 있고, 여기서 왼쪽 칼럼중의 숫자는 유기체(도 1에 따름)를 한정하고, 사용된 서열의 이름으로 시작하여, 데이터베이스 수납 번호, 및 서열의 근원 유기체(괄호안)가 기재되어 있다.

(1) gch2_bacsu: SWISS-PROT: gch2_bacsu (바실러스 서브틸리스)

(2) gch2_cangu: geneseqp:aay69776 (칸디다 구일리에르몬디)

(3) gch2_ashgo: TrEMBL: CAA02912: (아쉬비아 고시피(에레모테시움 고시피))

(4) gch2_yeast: SWISS-PROT: gch2_yeast (사카로마이세스 세레비지아에)

(5) gch2_neucr: TrEMBL: Q871B3 (뉴로스포라 크라사)

(6) gch2_schpo: TrEMBL: Q9P7M9 (쉬조사카로마이세스 폼베)

(7) gch2_arcfu: SWISS-PROT: gch2_arcfu (아카에오글로부스 풀지더스)

(8) gch2_strco: SWISS-PROT: gch2_strco (스트렙토마이세스 코엘리콜러)

(9) gch2_helpj: SWISS-PROT: gch2_helpj (헬리코박터 필로리 J99)

(10) gch2_helpy: SWISS-PROT: gch2_helpy (헬리코박터 필로리)

(11) gch2_pyrfu: TrEMBL: Q8U4L7 (피로코쿠스 퓨리오서스)

(12) gch2_thema: SWISS-PROT: gch2_thema (테르모토가 마리티마)

(13) gch2_chlmu: SWISS-PROT: gch2_chlmu (클라미디아 뮤리다룸)

(14) gch2_chltr: SWISS-PROT: gch2_chltr (클라미디아 트라코마티스)

(15) gch2_chlca: TrEMBL: AAP05635 (클라미디아 카비아에 GPIC)

(16) gch2_chlpn: SWISS-PROT: gch2_chlpn (클라미디아 뉴모니아에)

(17) gch2_arath: SWISS-PROT: gch2_arath (아라비돕시스 탈리아나)

(18) gch2_lyces: TrEMBL: CAC09119 (라이코페르시컴 에스쿨렌텀)

(19) gch2_orysa: TrEMBL: AAO72560 (오리자 사티범)

(20) gch2_alceu: TrEMBL: Q9F184 (알칼리게네스 유트로퍼스)

(21) gch2_neima: SWISS-PROT: gch2_neima (나이제리아 메닌기티디스 (혈청군 A))

(22) gch2_neimb: SWISS-PROT: gch2_neimb (나이제리아 메닌기티디스 (혈청군 B))

(23) gch2_psepk: SWISS-PROT: gch2_psepk (슈도모나스 푸티다 (균주 KT2440))

(24) gch2_psesm: SWISS-PROT: gch2_psesm (슈도모나스 시린가에(pv. 토마토))

(25) gch2_actac: TrEMBL: Q9JRR0 (악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(하에모필러스 악티노마이세템코미탄스))

(26) gch2_haein: SWISS-PROT: gch2_pasmu gch2_haein (하에모필러스 인플루엔자에)

(27) gch2_pasmu: SWISS-PROT: (파스퇴렐라 물토시다)

(28) gch2_ecO6: TrEMBL: Q8FHU5 (에스케리치아 콜라이 O6)

(29) gch2_ecoli: SWISS-PROT: gch2_ecoli (에스케리치아 콜라이)

(30) gch2_salty: TrEMBL: Q8XFY7 (살모넬라 티피뮤리움)

(31) gch2_yerpe: TrEMBL: Q8ZEF0 (예르시니아 페스티스)

(32) gch2_bucai: SWISS-PROT: gch2_bucai (부크네라 아피디콜라(아종: 아시르토시폰 피슘) (아시르토시폰 피슘 공생 박테리움))

(33) gch2_bucap: SWISS-PROT: gch2_bucap (부크네라 아피디콜라(아종: 쉬자피스 그라미늄))

(34) gch2_wigbr: SWISS-PROT: gch2_wigbr (위글스워티아 글로시니디아 브레비팔피스)

(35) gch2_bucbp: SWISS-PROT: gch2_wigbr (부크네라 아피디콜라(아종: 바이존기아 피스타시아에))

(36) gch2_mycle: TrEMBL: Q9CCP4 (마이코박테리움 레프라에)

(37) gch2_myctu: SWISS-PROT: gch2_myctu (마이코박테리움 투베르큘로시스)

(38) gch2_coref: TrEMBL: Q8FT57 (코리네박테리움 에피시엔스)

(39) gch2_corgl: GENESEQP: AAB79913 (코리네박테리움 글루타미컴)

(40) gch2_coram: SWISS-PROT: gch2_coram (코리네박테리움 암모니아게네스(브레비박테리움 암모니아게네스))

(41) gch2_staau: TrEMBL: Q8NW14 (스타필로코쿠스 아우레우스(균주 MW2))

(42) gch2_staep: GENESEQP: ABP40248 (스타필로코쿠스 에피더미디스)

(43) gch2_actpl: SWISS-PROT: gch2_actpl (악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에)

(44) gch2_lacla: TrEMBL: Q9CGU7 (락토코쿠스 락티스(아종: 락티스)(스트렙토코쿠스 락티스))

(45) gch2_stcag: TrEMBL: Q8E658 (스트렙토코쿠스 아갈락티아에 (혈청형 III))

(46) gch2_stcpn: TrEMBL: Q8DRF1 (스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (균주 ATCC BAA-255 / R6))

(47) gch2_cloac: TrEMBL: Q97LG9 (클로스트리디움 아세토부틸리컴)

(48) gch2_fusnu: TrEMBL: Q8RIR1 (푸조박테리움 누클레아텀(아종: 누클레아텀))

(49) gch2_anasp: TrEMBL: Q8RIR1 (아나바에나 종(균주 PCC 7120))

(50) gch2_syny3: SWISS-PROT: gch2_syny3 (시네코시스티스 종(균주 PCC 6803))

(51) gch2_synel: TrEMBL: Q8DI64 시네코코쿠스 엘론가투스(테르모시네코코쿠스 엘론가투스)

(52) gch2_bacam: SWISS-PROT: gch2_bacam (바실러스 아밀로리퀘파시엔스)

(53) gch2_bacce: TrEMBL: AAPl1030 (바실러스 세레우스 ATCC 14579)

(54) gch2_bacha: TrEMBL: Q9KCL5 (바실러스 할로듀란스)

(55) gch2_clope: TrEMBL: Q8XMX0 (클로스트리디움 페르프린겐스)

(56) gch2_clote: TrEMBL: Q897Q8 (클로스트리디움 테타니)

(57) gch2_chlte: TrEMBL: Q8KC35 (클로로비움 테피둠)

(58) gch2_aquae: SWISS-PROT: gch2_aquae (아퀴펙스 아에올리쿠스)

(59) gch2_lepin: TrEMBL: Q8F701 (렙토스피라 인테로간스)

(60) gch2_deira: TrEMBL: Q9RXZ9 (다이노코쿠스 라디오듀란스)

(61) gch2_bacth: TrEMBL: Q8A528 (박테로이데스 테타이오타오미크론)

(62) gch2_caucr: TrEMBL: Q9A9S5 (카울로박터 크레센투스)

(63) gch2_coxbu: TrEMBL: AAO90191 (콕시엘라 부르네티 RSA 493)

(64) gch2_rhiet: TrEMBL: Q8KL38 (리조비움 에틀리)

(65) gch2_lacpl: TrEMBL: Q88X17 (락토바실러스 플란타룸)

(66) gch2_psegl: TrEMBL: Q8RS38 (슈도모나스 글루마에)

(67) gch2_strav: TrEMBL: BAC71833 (스트렙토마이세스 아베르미틸리스)

(68) gch2_phopo: SWISS-PROT: gch2_phopo (포토박테리움 포스포레움)

(69) gch2_azobr: SWISS-PROT: gch2_azobr (아조스피릴룸 브라실렌세)

(70) gch2_agrtu: TrEMBL: Q8UHC9 (아그로박테리움 투메파시엔스(균주 C58 / ATCC 33970))

(71) gch2_rhime: TrEMBL: Q92RH2 (리조비움 멜리로티(시노르히조비움 멜리로티))

(72) gch2_brume: TrEMBL: Q8YFL5 (브루셀라 멜리텐시스)

(73) gch2_brusu: TrEMBL: Q8G298 (브루셀라 수이스)

(74) gch2_rhilo: TrEMBL: Q985Z3 (리조비움 로티(메소르히조비움 로티))

(75) gch2_braja: TrEMBL: Q89RZ7 (브라디르히조비움 자포니컴(Bradyrhizobium japonicum))

(76) gch2_niteu: TrEMBL: CAD86468 (니트로조모나스 유로파에아 ATCC 19718)

(77) gch2_ralso: TrEMBL: Q8Y1H7 (랄스토니아 솔라나세아룸(슈도모나스 솔라나세아룸))

(78) gch2_neime: TrEMBL: Q9JZ77 (나이제리아 메닌기티디스(혈청군 B, 발견된 제 2 효소))

(79) gch2_xanax: TrEMBL: Q8PPD7 (잔토모나스 악소노포디스(pv. 시트리))

(80) gch2_xanca: TrEMBL: Q8PCM8 (잔토모나스 캄페스트리스(pv. 캄페스트리스))

(81) gch2_vibpa: TrEMBL: Q87RU5 (비브리오 파라하에몰리티쿠스)

(82) gch2_vibvu: TrEMBL: Q8DF98 (비브리오 불니피쿠스)

(83) gch2_vibch: TrEMBL: Q9KPU3 (비브리오 콜레라에)

(84) gch2_vibfi: TrEMBL: Q8G9G5 (비브리오 피쉐리)

(85) gch2_sheon: TrEMBL: Q8EBP2 (쉐와넬라 오나이덴시스)

(86) gch2_phoph: TrEMBL: Q8G9H7 (포토박테리움 포스포레움)

(87) ribb_phole: TrEMBL: Q93E93 (포토박테리움 라이오그나티)

(88) gch2_psepu: TrEMBL: Q88GB1 (슈도모나스 푸티다(균주 KT2440, 발견된 제 2 효소))

(89) gch2_psesy: TrEMBL: Q882G0 (슈도모나스 시린가에(pv. 토마토, 발견된 제 2 효소))

(90) gch2_pseae: TrEMBL: Q9HWX4 (슈도모나스 아에루기노사)

(91) ribb_dehmu: SWISS-PROT: ribb_dehmu (데할로스피릴룸 물티보란스)

(92) gch2_xylfa: TrEMBL: Q87D69 (자이렐라 파스티디오사(균주 테메쿨라(Temecula)1 / ATCC 700964))

표 3에 제시된 예는 원리를 예시하는 것이다. 상응하는 잔기는 도 1 또는 표 3에 제시된 임의의 서열에 상동성인 모든 다른 GTP 사이클로하이드롤라아제 II 아미노산 서열에 대해 결정될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> Improved enzymes <130> 22257 <160> 43 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1197 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 atgtttcatc cgatagaaga agcactggac gctttaaaaa aaggcgaagt catcatcgtt 60 gtagatgatg aagacagaga aaatgaagga gactttgtgg ctcttgccga gcatgcaacg 120 ccggaagtca ttaactttat ggcgacacat gggagaggac tgatctgcac gccgctcagt 180 gaggaaatcg cagacaggct tgatcttcac cctatggttg agcataatac agactctcac 240 cacactgcat ttaccgtaag catagaccat cgtgaaacga agacaggtat cagcgctcaa 300 gaaagatctt ttaccgttca agcattgctg gacagcaaat ccgtgccatc tgattttcag 360 cgtccggggc acatttttcc actgattgcg aaaaaaggag gtgtcctgaa aagagcgggc 420 catacagaag ctgctgttga tcttgctgaa gcttgtggat ctccaggagc cggcgtcatt 480 tgtgaaatta tgaatgaaga cggaacgatg gcgagagtgc ctgagctcat tgaaattgcg 540 aaaaagcatc aattaaaaat gatcaccatt aaggatttga ttcaataccg ttacaatctg 600 acaacacttg tcgagcgtga agttgacatt acgctgccta ctgattttgg gacatttaag 660 gtttatggat acacaaatga ggtagatgga aaagagcatg tcgcatttgt gatgggagat 720 gtgccgttcg gagaagaacc ggtattggtc cgggtgcatt cagaatgtct cacaggtgac 780 gtgtttggct ctcatcgctg tgattgcgga ccgcagctgc acgccgcgct gaaccaaatt 840 gccgcagaag gccgtggagt gctcctgtac ttgcgccaag aaggacgagg catcggttta 900 atcaataaat taaaagctta taagcttcag gaacaaggct atgacaccgt agaagccaat 960 gaggcgcttg gattcttgcc ggatcttcgc aactatggca tcggagcaca aattttacgc 1020 gacctcggtg tccggaatat gaagcttttg acgaataatc cgcgaaaaat cgcaggcctt 1080 gaaggctacg gactcagtat ttcagaaaga gtgccgcttc aaatggaggc gaaagaacac 1140 aataaaaaat atttgcaaac caaaatgaac aagctaggtc atttacttca tttctaa 1197 <210> 2 <211> 398 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 2 Met Phe His Pro Ile Glu Glu Ala Leu Asp Ala Leu Lys Lys Gly Glu 1 5 10 15 Val Ile Ile Val Val Asp Asp Glu Asp Arg Glu Asn Glu Gly Asp Phe 20 25 30 Val Ala Leu Ala Glu His Ala Thr Pro Glu Val Ile Asn Phe Met Ala 35 40 45 Thr His Gly Arg Gly Leu Ile Cys Thr Pro Leu Ser Glu Glu Ile Ala 50 55 60 Asp Arg Leu Asp Leu His Pro Met Val Glu His Asn Thr Asp Ser His 65 70 75 80 His Thr Ala Phe Thr Val Ser Ile Asp His Arg Glu Thr Lys Thr Gly 85 90 95 Ile Ser Ala Gln Glu Arg Ser Phe Thr Val Gln Ala Leu Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Ser Val Pro Ser Asp Phe Gln Arg Pro Gly His Ile Phe Pro Leu 115 120 125 Ile Ala Lys Lys Gly Gly Val Leu Lys Arg Ala Gly His Thr Glu Ala 130 135 140 Ala Val Asp Leu Ala Glu Ala Cys Gly Ser Pro Gly Ala Gly Val Ile 145 150 155 160 Cys Glu Ile Met Asn Glu Asp Gly Thr Met Ala Arg Val Pro Glu Leu 165 170 175 Ile Glu Ile Ala Lys Lys His Gln Leu Lys Met Ile Thr Ile Lys Asp 180 185 190 Leu Ile Gln Tyr Arg Tyr Asn Leu Thr Thr Leu Val Glu Arg Glu Val 195 200 205 Asp Ile Thr Leu Pro Thr Asp Phe Gly Thr Phe Lys Val Tyr Gly Tyr 210 215 220 Thr Asn Glu Val Asp Gly Lys Glu His Val Ala Phe Val Met Gly Asp 225 230 235 240 Val Pro Phe Gly Glu Glu Pro Val Leu Val Arg Val His Ser Glu Cys 245 250 255 Leu Thr Gly Asp Val Phe Gly Ser His Arg Cys Asp Cys Gly Pro Gln 260 265 270 Leu His Ala Ala Leu Asn Gln Ile Ala Ala Glu Gly Arg Gly Val Leu 275 280 285 Leu Tyr Leu Arg Gln Glu Gly Arg Gly Ile Gly Leu Ile Asn Lys Leu 290 295 300 Lys Ala Tyr Lys Leu Gln Glu Gln Gly Tyr Asp Thr Val Glu Ala Asn 305 310 315 320 Glu Ala Leu Gly Phe Leu Pro Asp Leu Arg Asn Tyr Gly Ile Gly Ala 325 330 335 Gln Ile Leu Arg Asp Leu Gly Val Arg Asn Met Lys Leu Leu Thr Asn 340 345 350 Asn Pro Arg Lys Ile Ala Gly Leu Glu Gly Tyr Gly Leu Ser Ile Ser 355 360 365 Glu Arg Val Pro Leu Gln Met Glu Ala Lys Glu His Asn Lys Lys Tyr 370 375 380 Leu Gln Thr Lys Met Asn Lys Leu Gly His Leu Leu His Phe 385 390 395 <210> 3 <211> 1239 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 3 atgagaggat ctcaccatca ccatcaccat gggatcgatc atatgtttca tccgatagaa 60 gaagcactgg acgctttaaa aaaaggcgaa gtcatcatcg ttgtagatga tgaagacaga 120 gaaaatgaag gagactttgt ggctcttgcc gagcatgcaa cgccggaagt cattaacttt 180 atggcgacac atgggagagg actgatctgc acgccgctca gtgaggaaat cgcagacagg 240 cttgatcttc accctatggt tgagcataat acagactctc accacactgc atttaccgta 300 agcatagacc atcgtgaaac gaagacaggt atcagcgctc aagaaagatc ttttaccgtt 360 caagcattgc tggacagcaa atccgtgcca tctgattttc agcgtccggg gcacattttt 420 ccactgattg cgaaaaaagg aggtgtcctg aaaagagcgg gccatacaga agctgctgtt 480 gatcttgctg aagcttgtgg atctccagga gccggcgtca tttgtgaaat tatgaatgaa 540 gacggaacga tggcgagagt gcctgagctc attgaaattg cgaaaaagca tcaattaaaa 600 atgatcacca ttaaggattt gattcaatac cgttacaatc tgacaacact tgtcgagcgt 660 gaagttgaca ttacgctgcc tactgatttt gggacattta aggtttatgg atacacaaat 720 gaggtagatg gaaaagagca tgtcgcattt gtgatgggag atgtgccgtt cggagaagaa 780 ccggtattgg tccgggtgca ttcagaatgt ctcacaggtg acgtgtttgg ctctcatcgc 840 tgtgattgcg gaccgcagct gcacgccgcg ctgaaccaaa ttgccgcaga aggccgtgga 900 gtgctcctgt acttgcgcca agaaggacga ggcatcggtt taatcaataa attaaaagct 960 tataagcttc aggaacaagg ctatgacacc gtagaagcca atgaggcgct tggattcttg 1020 ccggatcttc gcaactatgg catcggagca caaattttac gcgacctcgg tgtccggaat 1080 atgaagcttt tgacgaataa tccgcgaaaa atcgcaggcc ttgaaggcta cggactcagt 1140 atttcagaaa gagtgccgct tcaaatggag gcgaaagaac acaataaaaa atatttgcaa 1200 accaaaatga acaagctagg tcatttactt catttctaa 1239 <210> 4 <211> 412 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 4 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ile Asp His Met Phe 1 5 10 15 His Pro Ile Glu Glu Ala Leu Asp Ala Leu Lys Lys Gly Glu Val Ile 20 25 30 Ile Val Val Asp Asp Glu Asp Arg Glu Asn Glu Gly Asp Phe Val Ala 35 40 45 Leu Ala Glu His Ala Thr Pro Glu Val Ile Asn Phe Met Ala Thr His 50 55 60 Gly Arg Gly Leu Ile Cys Thr Pro Leu Ser Glu Glu Ile Ala Asp Arg 65 70 75 80 Leu Asp Leu His Pro Met Val Glu His Asn Thr Asp Ser His His Thr 85 90 95 Ala Phe Thr Val Ser Ile Asp His Arg Glu Thr Lys Thr Gly Ile Ser 100 105 110 Ala Gln Glu Arg Ser Phe Thr Val Gln Ala Leu Leu Asp Ser Lys Ser 115 120 125 Val Pro Ser Asp Phe Gln Arg Pro Gly His Ile Phe Pro Leu Ile Ala 130 135 140 Lys Lys Gly Gly Val Leu Lys Arg Ala Gly His Thr Glu Ala Ala Val 145 150 155 160 Asp Leu Ala Glu Ala Cys Gly Ser Pro Gly Ala Gly Val Ile Cys Glu 165 170 175 Ile Met Asn Glu Asp Gly Thr Met Ala Arg Val Pro Glu Leu Ile Glu 180 185 190 Ile Ala Lys Lys His Gln Leu Lys Met Ile Thr Ile Lys Asp Leu Ile 195 200 205 Gln Tyr Arg Tyr Asn Leu Thr Thr Leu Val Glu Arg Glu Val Asp Ile 210 215 220 Thr Leu Pro Thr Asp Phe Gly Thr Phe Lys Val Tyr Gly Tyr Thr Asn 225 230 235 240 Glu Val Asp Gly Lys Glu His Val Ala Phe Val Met Gly Asp Val Pro 245 250 255 Phe Gly Glu Glu Pro Val Leu Val Arg Val His Ser Glu Cys Leu Thr 260 265 270 Gly Asp Val Phe Gly Ser His Arg Cys Asp Cys Gly Pro Gln Leu His 275 280 285 Ala Ala Leu Asn Gln Ile Ala Ala Glu Gly Arg Gly Val Leu Leu Tyr 290 295 300 Leu Arg Gln Glu Gly Arg Gly Ile Gly Leu Ile Asn Lys Leu Lys Ala 305 310 315 320 Tyr Lys Leu Gln Glu Gln Gly Tyr Asp Thr Val Glu Ala Asn Glu Ala 325 330 335 Leu Gly Phe Leu Pro Asp Leu Arg Asn Tyr Gly Ile Gly Ala Gln Ile 340 345 350 Leu Arg Asp Leu Gly Val Arg Asn Met Lys Leu Leu Thr Asn Asn Pro 355 360 365 Arg Lys Ile Ala Gly Leu Glu Gly Tyr Gly Leu Ser Ile Ser Glu Arg 370 375 380 Val Pro Leu Gln Met Glu Ala Lys Glu His Asn Lys Lys Tyr Leu Gln 385 390 395 400 Thr Lys Met Asn Lys Leu Gly His Leu Leu His Phe 405 410 <210> 5 <211> 1239 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 5 atgagaggat ctcaccatca ccatcaccat gggatcgatc atatgtttca tccgatagaa 60 gaagcactgg acgctttaaa aaaaggcgaa gtcatcatcg ttgtagatga tgaagacaga 120 gaaaatgaag gagactttgt ggctcttgcc gagcatgcaa cgccggaagt cattaacttt 180 atggcgacac atgggagagg actgatctgc acgccgctca gtgaggaaat cgcagacagg 240 cttgatcttc accctatggt tgagcataat acagactctc accacactgc atttaccgta 300 agcatagacc atcgtgaaac gaagacaggt atcagcgctc aagaaagatc ttttaccgtt 360 caagcattgc tggacagcaa atccgtgcca tctgattttc agcgtccggg gcacattttt 420 ccactgattg cgaaaaaagg aggtgtcctg aaaagagcgg gccatacaga agctgctgtt 480 gatcttgctg aagcttgtgg atctccagga gccggcgtca tttgtgaaat tatgaatgaa 540 gacggaacga tggcgagagt gcctgagctc attgaaattg cgaaaaagca tcaattaaaa 600 atgatcacca ttaaggattt gattcaatgc cgttacaatc tgacaacact tgtcgagcgt 660 gaagttgaca ttacgctgcc tactgatttt gggacattta aggtttatgg atacacaaat 720 gaggtagatg gaaaagagca tgtcgcattt 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<212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 26 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ile Asp His Met Phe 1 5 10 15 His Pro Ile Glu Glu Ala Leu Asp Ala Leu Lys Lys Gly Glu Val Ile 20 25 30 Ile Val Val Asp Asp Glu Asp Arg Glu Asn Glu Gly Asp Phe Val Ala 35 40 45 Leu Ala Glu His Ala Thr Pro Glu Val Ile Asn Phe Met Ala Thr His 50 55 60 Gly Arg Gly Leu Ile Cys Thr Pro Leu Ser Glu Glu Ile Ala Asp Arg 65 70 75 80 Leu Asp Leu His Pro Met Val Glu His Asn Thr Asp Ser His His Thr 85 90 95 Ala Phe Thr Val Ser Ile Asp His Arg Glu Thr Lys Thr Gly Ile Ser 100 105 110 Ala Gln Glu Arg Ser Phe Thr Val Gln Ala Leu Leu Asp Ser Lys Ser 115 120 125 Val Pro Ser Asp Phe Gln Arg Pro Gly His Ile Phe Pro Leu Ile Ala 130 135 140 Lys Lys Gly Gly Val Leu Lys Arg Ala Gly His Thr Glu Ala Ala Val 145 150 155 160 Asp Leu Ala Glu Ala Cys Gly Ser Pro Gly Ala Gly Val Ile Cys Glu 165 170 175 Ile Met Asn Glu Asp Gly Thr Met Ala Arg Val Pro Glu Leu Ile Glu 180 185 190 Ile Ala Lys Lys His Gln Leu Lys Met Ile Thr Ile Lys Asp 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ggccatttgc tgaacaaata a 591 <210> 35 <211> 196 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 35 Met Gln Leu Lys Arg Val Ala Glu Ala Lys Leu Pro Thr Pro Trp Gly 1 5 10 15 Asp Phe Leu Met Val Gly Phe Glu Glu Leu Ala Thr Gly His Asp His 20 25 30 Val Ala Leu Val Tyr Gly Asp Ile Ser Gly His Thr Pro Val Leu Ala 35 40 45 Arg Val His Ser Glu Cys Leu Thr Gly Asp Ala Leu Phe Ser Leu Arg 50 55 60 Cys Asp Cys Gly Phe Gln Leu Glu Ala Ala Leu Thr Gln Ile Ala Glu 65 70 75 80 Glu Gly Arg Gly Ile Leu Leu Tyr His Arg Gln Glu Gly Arg Asn Ile 85 90 95 Gly Leu Leu Asn Lys Ile Arg Ala Tyr Ala Leu Gln Asp Gln Gly Tyr 100 105 110 Asp Thr Val Glu Ala Asn His Gln Leu Gly Phe Ala Ala Asp Glu Arg 115 120 125 Asp Phe Thr Leu Cys Ala Asp Met Phe Lys Leu Leu Gly Val Asn Glu 130 135 140 Val Arg Leu Leu Thr Asn Asn Pro Lys Lys Val Glu Ile Leu Thr Glu 145 150 155 160 Ala Gly Ile Asn Ile Val Glu Arg Val Pro Leu Ile Val Gly Arg Asn 165 170 175 Pro Asn Asn Glu His Tyr Leu Asp Thr Lys Ala Glu Lys Met Gly His 180 185 190 Leu Leu 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ctggttcgag tccactctga gtgcttgact ggtgatgttt ttggatcccg gcgctgcgac 840 tgtggacagc agctgcacga gtctttgcgc ctgatccagg aagctggtcg gggagtagtg 900 gtgtacatgc gtgggcatga gggacgaggc attggtctgc tcgccaagct acgcgcctac 960 caactccagg atgaaggtgc cgacaccgtc gatgccaacc tcgcacttgg tcttccagcc 1020 gatgcccgcg aatttggcac cagcgcccag attctctacg acttgggtgt gcgctcgctc 1080 aacttgatca gcaacaaccc agccaagaag gtgggacttg aaggccacgg catttccatt 1140 gccagccgaa cccccatccc tgttgctgtt catgaagaca atgttcgata cctgaaaacc 1200 aagcgtgacc gcatgggaca tgacctccca gatgtcgcac tgtgggaaca agagcaccca 1260 gaaaactaa 1269 <210> 37 <211> 422 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 37 Val Ser Glu His Glu Gln Ala His Ser Gln Leu Asp Ser Val Glu Glu 1 5 10 15 Ala Ile Ala Asp Ile Ala Ala Gly Lys Ala Val Val Val Val Asp Asp 20 25 30 Glu Asp Arg Glu Asn Glu Gly Asp Ile Ile Phe Ala Ala Glu Leu Ala 35 40 45 Thr Pro Glu Leu Val Ala Phe Met Val Arg Tyr Ser Ser Gly Tyr Ile 50 55 60 Cys Ala Pro Leu Thr Ala Lys Asp Ala Asp Arg Leu Asp Leu 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agactcgcat 240 gagaccgcgt ttacagtcag cattgaccac aagctgacaa aaacgggaat cagcgctcag 300 gaacgttcct ttacgattca ggcgcttttg gacgaagaat ctgtgcctgg cgattttcag 360 cgtccgggtc atatttttcc cttaatagca aaaaaaggag gcgtcctgaa gcgggcgggc 420 cacacggaag cagccgttga cctggcaaaa gcatgcggtt ctcaaggagc ggacgtcatt 480 tgtgaaatta tgaatgaaga cggcacaatg gcgagagtgc ctgagattag cgagattgcg 540 aaaagccacc agctgaaaat gattacgata aaagacttaa tagaataccg ctacaacatt 600 acaacacttg tgaacagaga agttgacatt acgctgccga ctgacttcgg cacgttccgg 660 gtttacggat atacaaacga ggtggacgga aaagaacatc tcgcctttgt catgggcgat 720 gtcccgttta acagcggacc cgttcttgtc agagtgcact cagaatgcct gaccggcgat 780 gtgtttgcat cccaccgctg tgattgcggg cctcagcttc atgccgcgtt gcgccaaatt 840 gccgaagaag gccgcggcgt tctattgtat ttgcgtcagg aaggcagagg aatcggtctc 900 atcaataagc tgaaagcgta tcgattgcag gaacaagggt acgacacggt tgaagcgaac 960 gaagcgctcg gctttctgcc tgacttgcgc aactatggca tcggcgccca gattctccgc 1020 gatttagggg ttcagcatat gaaactttta accaataacc cccggaaaat cgccggcctt 1080 gaagggtacg gactaagcat ttcagatcgg gtgccgcttc aaatggaagc gagtgagcac 1140 aacaagcagt atttacaaac caaaatgaaa aaactcggac acttgcttca tttctaa 1197 <210> 39 <211> 398 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 39 Met Phe His Pro Ile Glu Glu Ala Leu Glu Ala Leu Lys Lys Gly Glu 1 5 10 15 Val Ile Ile Val Val Asp Asp Glu Asp Arg Glu Asn Glu Gly Asp Phe 20 25 30 Val Ala Leu Ala Glu His Ala Thr Pro Glu Val Val Asn Phe Met Ala 35 40 45 Thr His Gly Arg Gly Leu Ile Cys Thr Pro Leu Ser Glu Asp Ile Ala 50 55 60 Gly Arg Leu Asp Leu His Pro Met Val Asp His Asn Thr Asp Ser His 65 70 75 80 Glu Thr Ala Phe Thr Val Ser Ile Asp His Lys Leu Thr Lys Thr Gly 85 90 95 Ile Ser Ala Gln Glu Arg Ser Phe Thr Ile Gln Ala Leu Leu Asp Glu 100 105 110 Glu Ser Val Pro Gly Asp Phe Gln Arg Pro Gly His Ile Phe Pro Leu 115 120 125 Ile Ala Lys Lys Gly Gly Val Leu Lys Arg Ala Gly His Thr Glu Ala 130 135 140 Ala Val Asp Leu Ala Lys Ala Cys Gly Ser Gln Gly Ala Asp Val Ile 145 150 155 160 Cys Glu Ile Met Asn Glu Asp Gly Thr Met 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His Asn Lys Gln Tyr 370 375 380 Leu Gln Thr Lys Met Lys Lys Leu Gly His Leu Leu His Phe 385 390 395 <210> 40 <211> 1194 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 40 atgtttcatc gtattgaaga agctctagaa gatttaaaaa aaggtaaagt cgttatcgta 60 tgtgatgatg aaaaccgaga aaatgaaggc gattttattg ctttagcaga gtacattaca 120 ccagaaacaa taaattttat gattacacat ggccgtggtc tcgtttgtgt accgattacg 180 gaaggatacg cagaacgtct acaattagaa ccaatggtat ctcataatac agattcacat 240 catactgcgt ttacagtgag cattgaccat gtctctacaa caacagggat tagcgctcac 300 gaacgtgcaa ctacgataca agaattgtta aaccccgcat caaaaggtgc tgatttcaat 360 cgacctggac atatctttcc attaattgcg aaagaaggcg gtgtcctgcg tcgtgcaggt 420 catacagaag ctgctgttga tttagcaaag ctatgcggtg ccgaaccagc tggagttatt 480 tgcgagatta taaatgagga cggcacgatg gcacgtgtac ctgatttaat agaatgcgca 540 aaacaatttg atataaaaat gattacaata gaagatttaa ttgcttaccg ccgccatcat 600 gaaacacttg tgacgagaga agcggaaatt acattaccta cagatttcgg tactttccac 660 gcaattggct attctaactc attagatacg aaagaacata tcgcacttgt aaaaggtgat 720 atttcaacag gtgaaccggt acttgtacgt gttcattctg aatgcttaac aggagatgta 780 ttcggttcac atcgctgcga ttgcggacca caactccatg cagcacttgc tcaaattgag 840 cgtgaaggaa aaggtgttct tctttatatg aggcaagaag gaagaggcat tgggcttctt 900 aataagcttc gtgcttataa attacaagaa gaaggattcg atactgtaga agcaaatgaa 960 aaactcggct tccctgctga tcttcgtgat tacggtatcg gtgctcaaat attaaaagat 1020 ttaggtttac agagtttacg attattaacg aataacccaa gaaaaattgc tggcttacaa 1080 ggttacgatt tagaagtagt cgagcgtgta ccgttgcaaa tgccagcaaa agaagagaat 1140 aaatcgtatt tacaaacgaa agtaaacaaa ttaggacact tactaaactt ataa 1194 <210> 41 <211> 397 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 41 Met Phe His Arg Ile Glu Glu Ala Leu Glu Asp Leu Lys Lys Gly Lys 1 5 10 15 Val Val Ile Val Cys Asp Asp Glu Asn Arg Glu Asn Glu Gly Asp Phe 20 25 30 Ile Ala Leu Ala Glu Tyr Ile Thr Pro Glu Thr Ile Asn Phe Met Ile 35 40 45 Thr His Gly Arg Gly Leu Val Cys Val Pro Ile Thr Glu Gly Tyr Ala 50 55 60 Glu Arg Leu Gln Leu Glu Pro Met Val Ser His Asn Thr Asp Ser His 65 70 75 80 His Thr Ala Phe Thr Val Ser Ile Asp His Val Ser Thr Thr Thr Gly 85 90 95 Ile Ser Ala His Glu Arg Ala Thr Thr Ile Gln Glu Leu Leu Asn Pro 100 105 110 Ala Ser Lys Gly Ala Asp Phe Asn Arg Pro Gly His Ile Phe Pro Leu 115 120 125 Ile Ala Lys Glu Gly Gly Val Leu Arg Arg Ala Gly His Thr Glu Ala 130 135 140 Ala Val Asp Leu Ala Lys Leu Cys Gly Ala Glu Pro Ala Gly Val Ile 145 150 155 160 Cys Glu Ile Ile Asn Glu Asp Gly Thr Met Ala Arg Val Pro Asp Leu 165 170 175 Ile Glu Cys Ala Lys Gln Phe Asp Ile Lys Met Ile Thr Ile Glu Asp 180 185 190 Leu Ile Ala Tyr Arg Arg His His Glu Thr Leu Val Thr Arg Glu Ala 195 200 205 Glu Ile Thr Leu Pro Thr Asp Phe Gly Thr Phe His Ala Ile Gly Tyr 210 215 220 Ser Asn Ser Leu Asp Thr Lys Glu His Ile Ala Leu Val Lys Gly Asp 225 230 235 240 Ile Ser Thr Gly Glu Pro Val Leu Val Arg Val His Ser Glu Cys Leu 245 250 255 Thr Gly Asp Val Phe Gly Ser His Arg Cys Asp Cys Gly Pro Gln Leu 260 265 270 His Ala Ala Leu Ala Gln Ile Glu Arg Glu Gly Lys Gly Val Leu Leu 275 280 285 Tyr Met Arg Gln Glu Gly Arg Gly Ile Gly Leu Leu Asn Lys Leu Arg 290 295 300 Ala Tyr Lys Leu Gln Glu Glu Gly Phe Asp Thr Val Glu Ala Asn Glu 305 310 315 320 Lys Leu Gly Phe Pro Ala Asp Leu Arg Asp Tyr Gly Ile Gly Ala Gln 325 330 335 Ile Leu Lys Asp Leu Gly Leu Gln Ser Leu Arg Leu Leu Thr Asn Asn 340 345 350 Pro Arg Lys Ile Ala Gly Leu Gln Gly Tyr Asp Leu Glu Val Val Glu 355 360 365 Arg Val Pro Leu Gln Met Pro Ala Lys Glu Glu Asn Lys Ser Tyr Leu 370 375 380 Gln Thr Lys Val Asn Lys Leu Gly His Leu Leu Asn Leu 385 390 395 <210> 42 <211> 1215 <212> DNA <213> Bacillus halodurans <400> 42 atggacaaaa agctatttga tccgattgaa gaagcaatat atgaattaat gcaaggtcga 60 gtcgtgatcg tttgtgatga tgaggatcgg gaaaacgaag gggattttgt agcccttgct 120 gaaaaagcaa caccagaagt gattaacttc atgatcacgc atggccgtgg tctcgtttgc 180 acgccaatca cggaagagcg ggcaaaggaa ttagatcttg tccccatggt ggaccataat 240 accgatcccc atggtacggc gtttaccgtc agcattgatc atcaaatgac gaccacagga 300 atttctgccc atgaacgggc tatgacgatt caggcgttaa ttgataagaa aacgaaaaag 360 caccacttca aacgaccagg tcacattttc cccctaatag cgaaaaacgg aggagtactc 420 cgacgggccg gtcatacaga agcggccgtt gatctagctc gtttgtcagg cgctgagccg 480 gcaggggtta tttgtgaaat cattaaagaa gatggttcaa tggcacgagt tcctgatttg 540 cgaaaaatcg ccgatcagtt tgaactgaag atgatcacaa ttaaagattt aatcgaatat 600 cgtcaccgta aagacaagct tgtcaagcgt gaagtagata tttccttacc gacggatttc 660 ggctcattcc gtgcaatcgg ttatacagat gtcattgatg gaaaagagag tgtcgcttta 720 gtgaaaggac agattgttga aggtgaacca acactcgttc gtgttcactc cgaatgttta 780 acaggtgatg tgttcggttc tcaccgttgc gattgtggcc cacaactcca ggcagctctc 840 acacaaatcg agcaacaagg caaagggata ctcctttata tgcgtcaaga gggtcgtggt 900 atcggtctca tgaataagtt gaaggcatac aagcttcaag aagaaggcta tgatactgta 960 gaagcaaatg agaaattagg ctttcctgct gatcttcggg actatggaat gggcgcgcaa 1020 attttacgcg acttaggtgt gtcaaaaatg cgcctcctta caaacaatcc gcgaaaaatt 1080 acgggcttga aagggtatgg ccttgaagtg gttgaacggg tgccgctcca attacctcat 1140 aacaaagata atgagcgcta tttgaaaaca aagcacgaaa agttaggaca tctgctaaat 1200 tttactcatt cgtaa 1215 <210> 43 <211> 404 <212> PRT <213> Bacillus halodurans <400> 43 Met Asp Lys Lys Leu Phe Asp Pro Ile Glu Glu Ala Ile Tyr Glu Leu 1 5 10 15 Met Gln Gly Arg Val Val Ile Val Cys Asp Asp Glu Asp Arg Glu Asn 20 25 30 Glu Gly Asp Phe Val Ala Leu Ala Glu Lys Ala Thr Pro Glu Val Ile 35 40 45 Asn Phe Met Ile Thr His Gly Arg Gly Leu Val Cys Thr Pro Ile Thr 50 55 60 Glu Glu Arg Ala Lys Glu Leu Asp Leu Val Pro Met Val Asp His Asn 65 70 75 80 Thr Asp Pro His Gly Thr Ala Phe Thr Val Ser Ile Asp His Gln Met 85 90 95 Thr Thr Thr Gly Ile Ser Ala His Glu Arg Ala Met Thr Ile Gln Ala 100 105 110 Leu Ile Asp Lys Lys Thr Lys Lys His His Phe Lys Arg Pro Gly His 115 120 125 Ile Phe Pro Leu Ile Ala Lys Asn Gly Gly Val Leu Arg Arg Ala Gly 130 135 140 His Thr Glu Ala Ala Val Asp Leu Ala Arg Leu Ser Gly Ala Glu Pro 145 150 155 160 Ala Gly Val Ile Cys Glu Ile Ile Lys Glu Asp Gly Ser Met Ala Arg 165 170 175 Val Pro Asp Leu Arg Lys Ile Ala Asp Gln Phe Glu Leu Lys Met Ile 180 185 190 Thr Ile Lys Asp Leu Ile Glu Tyr Arg His Arg Lys Asp Lys Leu Val 195 200 205 Lys Arg Glu Val Asp Ile Ser Leu Pro Thr Asp Phe Gly Ser Phe Arg 210 215 220 Ala Ile Gly Tyr Thr Asp Val Ile Asp Gly Lys Glu Ser Val Ala Leu 225 230 235 240 Val Lys Gly Gln Ile Val Glu Gly Glu Pro Thr Leu Val Arg Val His 245 250 255 Ser Glu Cys Leu Thr Gly Asp Val Phe Gly Ser His Arg Cys Asp Cys 260 265 270 Gly Pro Gln Leu Gln Ala Ala Leu Thr Gln Ile Glu Gln Gln Gly Lys 275 280 285 Gly Ile Leu Leu Tyr Met Arg Gln Glu Gly Arg Gly Ile Gly Leu Met 290 295 300 Asn Lys Leu Lys Ala Tyr Lys Leu Gln Glu Glu Gly Tyr Asp Thr Val 305 310 315 320 Glu Ala Asn Glu Lys Leu Gly Phe Pro Ala Asp Leu Arg Asp Tyr Gly 325 330 335 Met Gly Ala Gln Ile Leu Arg Asp Leu Gly Val Ser Lys Met Arg Leu 340 345 350 Leu Thr Asn Asn Pro Arg Lys Ile Thr Gly Leu Lys Gly Tyr Gly Leu 355 360 365 Glu Val Val Glu Arg Val Pro Leu Gln Leu Pro His Asn Lys Asp Asn 370 375 380 Glu Arg Tyr Leu Lys Thr Lys His Glu Lys Leu Gly His Leu Leu Asn 385 390 395 400 Phe Thr His Ser

Claims (24)

1. (i) 개질된 효소의 특이적 활성이 상응하는 비-개질된 효소에 비해 증가하고, (ii) 개질된 효소의 아미노산 서열이 서열번호: 2의 위치 261, 270, 276, 279, 308 및/또는 347에 상응하는 아미노산 위치(들) 상에서의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 돌연변이(들)를 비롯한 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함하는, 개질된 구아노신 트라이포스페이트(guanosine triphosphate: GTP) 사이클로하이드롤라아제 II.
2. 제 1 항에 있어서,

   개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II가 상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 비해 약 10% 이상 더 높은 특이적 활성을 나타내는, 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   1개 이상의 돌연변이(들)가 1개 이상의 치환(들)인 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II.
4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,

   상응하는 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 아미노산 서열이 도 1에 열거된 서열, 특히는 아쉬비아(Ashbya), 사카로마이세스(Saccharomyces), 에레모테시 움(Eremothecium), 칸디다(Candida), 뉴로스포라(Neurospora), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 아르케오글로부스(Archeoglobus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 헬리코박터(Helicobacter), 에스케리치아(Escherichia), 코리네박테리움(Corynebacterium), 테르모토가(Thermotoga), 아라비돕시스(Arabidopsis), 라이코페르시컴(Lycopersicum), 오리자(Oryza), 알칼리게네스(Alcaligenes), 슈도모나스(Pseudomonas), 디노코쿠스(Dinococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 포토박테리움(Photobacterium) 및 바실러스(Bacillus)로 이루어진 군으로부터 기원된 서열로부터 선택되는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II.
5. 제 4 항에 있어서,

   비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 서열이 서열번호: 2, 33, 35, 37, 39, 41 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II.
6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,

   서열번호: 2의 위치 261에 상응하는 아미노산 위치 상에서의 돌연변이, 바람직하게는 발린의 알라닌에 의한 대체를 포함하는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II.
7. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,

   서열번호: 2의 위치 270에 상응하는 아미노산 위치 상에서의 돌연변이, 바람직하게 는 글리신의 알라닌 또는 아르기닌에 의한 대체를 포함하는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II.
8. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,

   서열번호: 2의 위치 276에 상응하는 아미노산 위치 상에서의 돌연변이, 바람직하게는 알라닌의 트레오닌에 의한 대체를 포함하는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II.
9. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,

   서열번호: 2의 위치 279에 상응하는 아미노산 위치 상에서의 돌연변이, 바람직하게는 글루타민의 아르기닌에 의한 대체를 포함하는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II.
10. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,

    서열번호: 2의 위치 308에 상응하는 아미노산 위치 상에서의 돌연변이, 바람직하게는 라이신의 아르기닌에 의한 대체를 포함하는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II.
11. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,

    서열번호: 2의 위치 347에 상응하는 아미노산 위치 상에서의 돌연변이, 바람직하게 는 메티오닌의 아이소로이신에 의한 대체를 포함하는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II.
12. 제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 따른 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
13. 제 12 항에 있어서,

    개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 서열번호: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드.
14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,

    프로모터(promoter), 리보좀(ribosome)-결합 부위 및 종결자(terminator) 서열에 작동적으로 결합되고(operably-linked), 전사적으로 기능성인 폴리뉴클레오타이드.
15. 제 12 항 내지 제 14 항중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 플라스미드.
16. 제 15 항에 있어서,

    1종 이상의 마커(maker) 유전자를 추가로 포함하는 벡터 또는 플라스미드.
17. 제 12 항 내지 제 14 항중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
18. 제 17 항에 있어서,

    박테리아 세포, 진균류 세포, 동물 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
19. 제 18 항에 있어서,

    바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 칸디다 플라레리(Candida flareri), 에레모테시움 아쉬비이(Eremothecium ashbyii), 아쉬비아 고시피(Ashbya gossypii), 및 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
20. (a) 제 17 항 내지 제 19 항중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 적합한 배지중에서 배양하는 단계; 및

    (b) 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, 플라빈 모노뉴클레오타이드(flavin mononucleotide: FMN), 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(flavin adenine dinucleotide: FAD), 또는 이의 유도체를 배지로부터 선택적으로 분리하는 단계를 포함하는,

    리보플라빈, 리보플라빈 전구체, FMN, FAD, 또는 이의 유도체를 제조하는 방법.
21. (a) 제 17 항 내지 제 19 항중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 군집을 적합한 배지중에서 배양하는 단계; 및

    (b) 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 세포 또는 배지로부터 선택적으로 회수하는 단계를 포함하는,

    제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 따른 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 제조하는 방법.
22. (a) GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계;

    (b) 1개 이상의 돌연변이(들)를 폴리뉴클레오타이드 서열내로 도입하여, 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드 서열이 비-개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II에 비하여 높은 특이적 활성을 갖고, 서열번호: 2의 위치 261, 270, 276, 279, 308 및/또는 347에 상응하는 아미노산 위치(들) 상에서의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 돌연변이(들)를 비롯한 1개 이상의 돌연변이(들)를 포함하는 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하도록 하는 단계;

    (c) 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드를 프로모터, 리보좀-결합 부위 및 종결자와 선택적으로 기능적으로 연결시키거나, 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드를 벡터나 플라스미드에 삽입하는 단계;

    (d) 폴리뉴클레오타이드, 전사적으로 기능성인 폴리뉴클레오타이드, 또는 벡터나 플라스미드를 적합한 숙주 세포내로 도입하는 단계; 및

    (e) 숙주 세포를 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 발현을 허용하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는,

    특이적 활성이 증가된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 제조하는 방법.
23. 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, FMN, FAD, 또는 이의 유도체의 생성을 증가시키기 위한, 제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 따른 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II, 또는 제 12 항 내지 제 14 항중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드의 용도.
24. (a) 바람직하게는 증가되어야 하는 특이적 활성을 갖는 제 1 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계;

    (b) 특이적 활성에 영향을 주는 위치를 제공하는 단계;

    (c) (b)에서 정의된 바와 같은 야생형 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 소정의 아미노산의 대체를 위한 최적의 아미노산을 정의하고, 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드 서열이 새로운 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 암호화하도록 (b)에서 정의된 위치에서 (a)의 폴리뉴클레오타이드 서열내로 1개 이상의 돌연변이(들)를 도입하는 단계;

    (d) 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드를 벡터나 플라스미드에 선택적으로 삽입하는 단계;

    (e) 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터나 플라스미드를 적합한 숙주 세포내로 도입하는 단계; 및

    (f) 숙주 세포를 개질된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II의 발현을 허용하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는,

    특이적 활성이 증가된 GTP 사이클로하이드롤라아제 II를 제조하는 방법.

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