CN111718917B

CN111718917B - 一种热稳定细菌群体感应信号降解酶及其应用

Info

Publication number: CN111718917B
Application number: CN201910212558.9A
Authority: CN
Inventors: 张力群; 张俊威
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2039-03-20
Also published as: CN111718917A

Abstract

本发明公开了一种热稳定细菌群体感应信号降解酶及其应用。本发明提供了如下蛋白：SEQ ID No.1所示蛋白或其经一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加，或序列具99％、95％、90％、85％或者80％以上同源性且具相同功能的蛋白，或N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。本发明所提供的蛋白质为新型AHL内酯酶，能降解不同侧链长度和C3位置无取代基或不同取代基(羰基和羟基)多种类型的AHL信号分子，具良好的热稳定性和储存稳定性，且对蛋白酶有较强耐受性，其活性不受一些金属离子、EDTA和尿素影响；表达相应基因显著抑制动物病原细菌铜绿假单胞毒力因子产量和植物病原细菌果胶杆菌的致病性。

Description

一种热稳定细菌群体感应信号降解酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种热稳定细菌群体感应信号降解酶及其应用。

背景技术

群体感应(Quorum sensing，QS)是细菌通过产生、释放和感应小分子信号物质来感知群体密度的变化而调控相关基因的表达以适应环境的变化。一些革兰氏阴性细菌利用一种或多种N-酰基-高丝氨酸内酯(N-acyhomoserine lactone，AHL)作为信号分子，目前已发现至少56种AHL类型的QS信号分子。QS系统调控细菌的多种生物学功能，包括费氏弧菌的生物发光，铜绿假单胞毒性因子的产生，沙雷氏菌CRISPR-Cas介导的获得性免疫系统，嗜水气单胞菌生物膜和蛋白酶的产量和根癌土壤杆菌Ti质粒的结合转移等。其中，多种生物学功能与动植物病原细菌致病性密切相关。因此，淬灭QS系统是防治此类病害的一种策略。对细菌QS调控机制的干扰和破坏称为群体感应淬灭(Quorum Quenching,QQ)。QS淬灭剂包括QS淬灭酶和QS抑制化合物。前者通过酶解信号分子使其浓度不能达到临界阈值而破坏QS系统；后者通过抑制信号分子的合成或与信号分子竞争受体蛋白达到抑制QS系统的目的。与传统病害的化学防治相比，QS淬灭剂通过特异的抑制病原菌致病因子的表达达到防治病害的目地，这种淬灭群体感应机制对病原菌生长压力小，因此不易产生抗药性。目前，AHL信号降解酶基因aiiA已成功转入植物中，转基因植物对果胶杆菌引起的软腐病已表现出明显的抗性。此外，QS信号降解细菌还应用到污水处理中以减少生物膜的形成造成的管道堵塞，显示出群体感应淬灭潜在应用价值。

目前，已报道多种AHL信号分子降解酶，根据其降解机制主要分为三类：AHL内酯酶、AHL酰基转移酶和AHL氧化还原酶。AHL内酯酶通过水解AHL内酯键淬灭信号分子，而AHL酰基转移酶通过作用于AHL酰基侧链的酰胺键破坏信号分子。与AHL内酯酶、AHL酰基转移酶不同，AHL氧化还原酶通过氧化或还原AHL酰基侧链上氢原子使AHL信号分子部分或全部失活。已报道的AHL信号降解酶来源于多种生物，包括细菌、古菌、噬菌体、真菌、动物和植物。其中，多数QS淬灭酶来源于细菌，如来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.240B1)的AiiA，苍白杆菌(Ochrobactrum sp.T63)的AidH，节杆菌(Arthrobacter sp.IBN110)的AhlD，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1)的PvdQ等等。

发明内容

本发明的目的是提供一种热稳定细菌群体感应信号降解酶及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种蛋白质，命名为AidB，其编码基因命名为aidB。

本发明所要求保护的蛋白质为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在本发明的一个实施例中，所述蛋白质具体为将SEQ ID No.2的第1-816位(去除了终止密码子)所示DNA分子插入到pET-22b(+)载体的Nde I和Hind III之间后得到的重组载体所表达的蛋白质(C端带有6×His标签)。

第二方面，本发明要求保护编码前文第一方面所述蛋白质的核酸分子。

进一步，所述核酸分子为编码所述蛋白质的基因；所述基因是如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(B3)与(B1)-(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

SEQ ID No.1(AidB蛋白)由272个氨基酸组成。SEQ ID No.2(aidB基因)由819个核苷酸组成，编码SEQ ID No.1所示蛋白质。

第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述表达盒由启动子、所述基因和转录终止序列顺次连接而成。

所述重组载体可为重组克隆载体也可为重组表达载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体为将所述基因插入到pET-22b(+)载体的多克隆位点(如Nde I和Hind III)处后得到的重组质粒。在本发明的另一个实施例中，所述重组载体为将所述基因插入到pBBR1MCS-2载体的多克隆位点(如BamH I和Xba I)处后得到的重组质粒。

第四方面，本发明要求保护第一方面所述蛋白质在作为细菌群体感应信号降解酶中的应用。

第五方面，本发明要求保护第一方面所述蛋白质或第二方面所述核酸分子或第三方面所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备具有细菌群体感应信号降解酶活性的产品中的应用。

第六方面，本发明要求保护第一方面所述蛋白质或第二方面所述核酸分子或第三方面所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用：

(a1)制备能够降解N-酰基-高丝氨酸内酯(AHLs)的产品，或者降解AHLs；

(a2)制备能够降低植物病原细菌致病性的产品，或者降低植物病原细菌致病性；

(a3)制备能够降低动物病原细菌毒力因子产量的产品，或者降低动物病原细菌毒力因子产量。

进一步地，在(a1)中，所述AHLs的侧链长度为C6-C12，C3位置无取代基或取代基为羰基或羟基。

更进一步地，所述AHLs可为如下中任一种或任几种：

C6-HSL，全称为N-己酰-L-高丝氨酸内酯，英文全称为N-hexanoyl-L-homoserinelactone(sigma，货号为56395)；

3OXO-C6-HSL，全称为N-3-羰基己酰-DL-高丝氨酸内酯，英文全称为N-(β-Ketocaproyl)-DL-homoserine lactone(sigma，货号为K3255)；

3OH-C8-HSL，全称为N-3-羟基辛酰-DL-高丝氨酸内酯，英文全称为N-(3-Hydroxyoctanoyl)-DL-homoserine lactone(sigma，货号为61698)；

3OXO-C8-HSL，全称为N-3-羰基辛酰-DL-高丝氨酸内酯，英文全称为N-(3-Oxooctanoyl)-DL-homoserine lactone(sigma，货号为O1639)；

3OXO-C12-HSL，全称为N-3-羰基十二酸-L-高丝氨酸内酯，英文全称为N-(3-Oxododecanoyl)-L-homoserine lactone(sigma，货号为O9139)。

进一步地，在(a2)中，所述植物病原细菌可为软腐果胶杆菌。

在本发明中，所述软腐果胶杆菌具体为软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum subsp.carotovorum)Z3-3。

进一步地，在(a3)中，所述动物病原细菌可为铜绿假单胞菌。

在本发明中，所述铜绿假单胞菌具体为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1。

第七方面，本发明要求保护第一方面所述蛋白质或第二方面所述核酸分子或第三方面所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用：

(b1)制备能够抑制铜绿假单胞菌合成绿脓菌素的产品，或者抑制铜绿假单胞菌合成绿脓菌素；

(b2)制备能够抑制铜绿假单胞菌以游动性(swimming)和/或群集运动(swarming)方式运动的产品，或者抑制铜绿假单胞菌以游动性和/或群集运动方式运动。

在前文所述应用中，所述降低植物病原细菌致病性、所述降低动物病原细菌毒力因子产量、所述抑制铜绿假单胞菌合成绿脓菌素和所述抑制铜绿假单胞菌以游动性和/或群集运动方式运动，均是通过降解所述铜绿假单胞菌中的AHLs实现的。

在本发明中，前文所有所述的产品均可为药物或试剂盒等。

实验证明，本发明所提供的AidB为新型的AHL内酯酶。它能够降解不同侧链长度和C3位置无取代基或者不同取代基(羰基和羟基)多种类型的AHL信号分子。该信号降解酶具有良好的热稳定性和储存稳定性，并且对一些蛋白酶有较强的耐受性。AidB发挥AHL降解活性的最适温度和最适pH值分别为60℃和9.0，其降解AHL的活性不受一些金属离子、EDTA和尿素的影响。表达aidB基因显著抑制动物病原细菌铜绿假单胞毒力因子产量和植物病原细菌果胶杆菌的致病性。

附图说明

图1为AidB蛋白的纯化。1：蛋白Marker；2：纯化后的AidB蛋白(带有6×His标签)。

图2为UPLC分析AidB降解产物。

图3为AidB蛋白的稳定性。A：热稳定性；B：储存稳定性；C：蛋白酶抗性。

图4为AidB最适活性条件。A：最适温度；B：最适pH值；C：金属离子，EDTA，尿素，SDS对AidB活性的影响。

图5为AidB信号分子降解谱。

图6为aidB基因表达对软腐果胶杆菌Z3-3生物学性状及致病性影响。A：生长和AHL信号产量；B：致病性。

图7为aidB基因表达对铜绿假单胞PAO1毒力因子的影响。A：生长和AHL信号产量；B和C：绿脓菌素产量；D：运动能力。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

β-半乳糖苷酶活性检测报告菌株Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4)：记载在“GuiYing Mei,XiaoXue Yan,Ali Turak,et al.AidH,an alpha/beta-hydrolasefold family member from an Ochrobactrum sp.strain,is a novel N-acylhomoserinelactonase.Applied&Environmental Microbiology.2010”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

pBBR1MCS-2载体：记载在“GuiYing Mei,XiaoXue Yan,Ali Turak,et al.AidH,analpha/beta-hydrolase fold family member from an Ochrobactrum sp.strain,is anovel N-acylhomoserine lactonase.Applied&Environmental Microbiology.2010”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。。

软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)Z3-3：记载在“GuiYing Mei,XiaoXue Yan,Ali Turak,et al.AidH,an alpha/beta-hydrolase foldfamily member from an Ochrobactrum sp.strain,is a novel N-acylhomoserinelactonase.Applied&Environmental Microbiology.2010”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1：“Shan Yu,Qing Wei,TianhuZhao,et al.A Survival Strategy for Pseudomonas aeruginosa That UsesExopolysaccharides To Sequester and Store Iron To Stimulate Psl-DependentBiofilm Formation.Applied and Environmental Microbiology.2016”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

实施例1、本发明细菌群体感应信号降解酶的制备及功能鉴定

本发明所提供的细菌群体感应信号降解酶命名为AidB，其编码基因命名为aidB，来源于包西氏菌(Bosea sp.)。AidB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，aidB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.2编码SEQ ID No.1所示蛋白质。

一、AidB蛋白的表达和纯化

制备SEQ ID No.2所示DNA分子(即aidB基因)。以SEQ ID No.2所示DNA分子为模板，以AidB-F和AidB-R为引物，扩增得到两端分别带有酶切位点Nde I和Hind III的aidB基因。

AidB-F：5’-TATCAGTGCATATGGATCAGAAATCACGTCGCATCG-3’；

AidB-R：5’-ACTAAGCTTGGCCGGGATCAGCTCATAGC-3’。

将扩增片段进行Nde I和Hind III双酶切，胶回收酶切产物，与经过同样双酶切的pET-22b(+)载体骨架大片段相连，得到重组表达载体pET-22b-AidB。重组表达载体pET-22b-AidB的结构描述为：将SEQ ID No.2所示DNA分子(即aidB基因)插入到pET-22b(+)载体的酶切位点Nde I和Hind III之间后得到的重组质粒。

将重组表达载体pET-22b-AidB通过热激转化转入大肠杆菌BL21。转化子接种至LB培养基(蛋白胨，10g/L、酵母提取物，5g/L、NaCl，5g/L，pH＝7.2)中，待菌株浓度生长至OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入终浓度为100μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG,生工生物工程股份有限公司，货号：A600168)诱导蛋白表达，18℃225rpm振荡培养10h。4000rpm离心8min收集菌体，取25mL预冷悬浮缓冲液(20mM Tris-Cl，150mM NaCl，10mM咪唑，pH＝8.0)，加入5mM苯甲脒和1mM苯甲基磺酰氟的蛋白酶抑制剂，重新悬浮菌体，用超声波细胞破碎仪破碎细胞(90W，12min，间隔5s)。4℃12000rpm离心15min，将上清液转移至新的离心管中，加入1mL用漂洗缓冲液(20mM Tris-Cl，150mM NaCl，20mM咪唑，pH＝8.0)漂洗过活化HisPur^TMNi-NTA珠子(Thermo Scientific^TM，货号：25214)，4℃结合2h。将带有滤膜的柱子放置于4℃并用漂洗缓冲液平衡3个柱体积，加入上清液与珠子混合物，再用2个柱体积漂洗缓冲液漂洗结合有蛋白的珠子。最后，用洗脱缓冲液(20mM Tris-Cl，150mM NaCl，250mM咪唑，pH＝8.0)洗脱蛋白。通过8％聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化蛋白分析。结果显示，纯化AidB-His₆蛋白大小约为30kDa(图1)，大小与氨基酸序列预测一致。

二、AidB催化机制解析

用反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0)配制490μL浓度为16μg/mL的AidB蛋白溶液，加入10μL 100mM C6-HSL溶液，30℃孵育3h。以10mM NaOH处理作为阳性对照(参考文献“Yates EA,Philipp B,Buckley C,et al.N-acylhomoserine Lactones UndergoLactonolysis in a pH-,Temperature-,and Acyl Chain Length-Dependent MannerDuring Growth of Yersinia Pseudotuberculosis and PseudomonasAeruginosa.Infect Immun.2002 Oct；70(10):5635-46.”)，以只加等量C6-HSL信号分子作为空白对照。反应结束，用等体积乙酸乙酯萃取，蒸干后，加入100μL甲醇溶剂。超高压液相色谱(UPLC，Agilent 1290)分析，条件为，色谱柱：4.6by 150mm，Agilent TC-18；进样量：5μL；检测器：紫外，210nm；柱温度：25℃；流速：0.7mL/min；流动相：甲醇/水(vol/vol，0-8min：20％-50％甲醇，9-10min：50％-40％甲醇，11-18min：40％甲醇)。结果显示，AidB降解产物中显示两个峰，分别在保留时间10.99min和11.92min。而已知NaOH处理C6-HSL后会打开高丝氨酸内酯环产生N-酰基-高丝氨酸(C6-HS)。检测NaOH处理C6-HSL的降解产物发现，在相同实验条件下，C6-HS保留时间为10.99min与AidB降解产物中第一个峰的保留时间一致。而标准AHL保留时间为11.92min与AidB降解产物中第二个峰的保留时间一致。具体如图2所示。比对以上结果可知：AidB为内酯酶。通过催化C6-HSL内酯键断裂产生C6-HS。

三、AidB的稳定性

为明确AidB蛋白的稳定性情况，分别对其热稳定性、储存稳定性和蛋白酶抗性进行检测。

热稳定性实验：用反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0)配制浓度为2μg/mL的AidB蛋白溶液，取190μL蛋白溶液分别置于30℃-90℃(10℃一个间隔)30min。冷却至室温后，分别加入10μL浓度为1μM的3OXO-C8-HSL溶液，混匀后，30℃反应30min。以在相同条件下，30℃处理时AidB信号降解活性定义为100％。

储存稳定性实验：用ddH₂O配制两份0.5μg/mL AidB蛋白溶液，分别保存于4℃和室温条件下，每隔24h分别取10μL蛋白溶液加入180μL反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0)，再加入10μL 1μM 3OXO-C8-HSL溶液，混匀后，30℃反应30min。以已知AHL信号降解酶AidH作对照(AidH的具体制备方法及鉴定数据参见“GuiYing Mei,XiaoXue Yan,Ali Turak,etal.AidH,an alpha/beta-hydrolase fold family member from an Ochrobactrumsp.strain,is a novel N-acylhomoserine lactonase.Applied&EnvironmentalMicrobiology.2010”一文)。以在相同条件下，AidB和AidH第一天信号降解活性定义为100％。

蛋白酶抗性实验：用反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0)配制0.5μg/mL AidB蛋白溶液，取185μL蛋白溶液，分别加入5μL 25mg/mL蛋白酶溶液(胰蛋白酶，货号：A003708；糜蛋白酶，货号：A600307；木瓜蛋白酶，货号：A501612，以上产品均购买自生工生物工程股份有限公司)，37℃处理1h。再分别加入10μL 1μM 3OXO-C8-HSL溶液，混匀后，30℃反应30min。以在相同条件下，未加蛋白酶处理AidB信号降解活性定义为100％，即CK。

以上AHL降解实验结束后，立即加入等体积的乙酸乙酯抽提实验中未被降解的3OXO-C8-HSL信号分子，蒸干后，溶于50μL无水甲醇。通过报告菌Agrobacteriumtumefaciens NTL4(pZLR4)β-半乳糖苷酶活性测定反应未被降解3OXO-C8-HSL信号分子活性。具体步骤为(下文AHL产量检测方法同此)：

1.将报告菌A.tumefaciens NTL4(pZLR4)接种于ABM基本培养基中，加入终浓度为30μg/mL硫酸庆大霉素(生工生物工程股份有限公司，货号：A620217)，30℃160rpm培养至OD₆₀₀≈0.8。

液体ABM培养基：20×盐溶液5mL、20×缓冲液5mL、10g/100mL甘露醇水溶液2mL、无菌水88mL。20×盐溶液：NH₄Cl 20g/L、KCl 3g/L、MgSO₄·7H₂O 6g/L、CaCl₂·2H₂O 0.2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，余量为水，pH＝7.2。20×缓冲液：NaH₂PO₄ 23g/L、K₂HPO₄60g/L，余量为水，pH＝7.0。

2.将2μL待测样品加至300μL报告菌A.tumefaciens NTL4(pZLR4)中，30℃孵育3h。

3. 12000rpm离心5min收集菌体，加入100μL ddH₂O重新悬浮菌体，再依次加入900μL Z buffer(60mM Na₂HPO₄·12H₂O,40mM NaH₂PO4·2H₂O,1mM MgSO₄·7H₂O,10mM KCl,50mMβ-mercaptoethanol,pH＝7.0)、40μL氯仿、20μL 1g/L SDS，混匀后，30℃孵育10min。

4.再加入200μL 4mg/mL邻硝基酚-β-半乳糖苷溶液，放于30℃孵育，等到溶液变为黄色时，加入200μL 1M Na₂CO₃终止反应，记录反应时间。12000rpm离心15min，取上清液测定在420nm处的吸光值。

5.未被降解的3OXO-C8-HSL信号分子量以β-半乳糖苷酶活强弱表示。β-半乳糖苷酶活1U＝(1000×OD₄₂₀)/(T×V×OD₆₀₀)，T为反应时间(min)，V报告菌体积(μL)，OD₆₀₀为报告菌在600nm处的吸光值，OD₄₂₀为反应后样品上清液在420nm处的吸光值。

热稳定性实验表明，AidB是一种热稳定信号分子降解酶。在经过30℃-70℃热处理后，AidB还能保持较高的AHL降解活性，其中在60℃热处理后，AidB的AHL降解活性最高(图3中A)。储存稳定性实验表明，AidB在4℃或者室温条件下能够保持较长时间的稳定稳定性。当AidB储存于ddH₂O中，在4℃保存20天或者室温保存16天后，其AHL降解活性无明显降低(图3中B)。同时，蛋白酶抗性实验表明，AidB对胰蛋白酶(trypsin)、糜蛋白酶(chymotrypsin)和木瓜蛋白酶(papain)三种蛋白酶表现出较强的抗性。AidB经蛋白酶37℃处理1h后，其AHL降解活性分别达到102％、108％和106％(图3中C)。以上结果表明：AidB是一个高稳定性的蛋白。

四、AidB最适条件

酶的活性受到多种因素(温度、pH值、金属离子等)的影响。为探究AidB发挥AHL降解活性的最适条件，分别检测了温度、pH值、金属离子(Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺)、EDTA、SDS和尿素对其信号降解活性的影响。

最适温度：用反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0)配制0.5μg/mL AidB蛋白溶液，取190μL蛋白溶液分别置于0℃-90℃(10℃一个间隔)预孵育10min，在相应孵育温度下分别加入10μL 1μM 3OXO-C8-HSL溶液，于30℃反应30min。以已知AHL信号降解酶AidH作对照。以在相同条件下，30℃时AidB、AidH各自信号降解活性定义为100％。

最适pH值：配制pH＝4.0-9.0缓冲液溶液(CH₃COOH/CH₃COONa，pH＝4.0-5.0；Na₂HPO₃/NaH₂PO₃，pH＝6.0-7.0；Tris-HCl，pH＝8.0-9.0)。取180μL pH＝4.0-9.0缓冲溶液，分别加入10μL 10μg/mL AidB蛋白溶液和10μL 1μM 3OXO-C8-HSL溶液，混匀后，30℃反应30min。以在30℃、pH＝8.0条件下AidB信号降解活性定义为100％。

金属离子、EDTA、SDS和尿素对AidB信号降解活性的影响：用反应缓冲液(50mMTris-HCl，pH＝8.0)配制0.5μg/mL AidB蛋白溶液，取185μL蛋白溶液分别加入5μL辅因子(40mM金属离子、40mM EDTA、40mM尿素和40g/L)SDS)，放于4℃孵育1h。再加入10μL 1μM3OXO-C8-HSL溶液，混匀后，30℃反应30min。以在pH＝8.0和30℃条件下，不添加任何辅因子时AidB信号降解活性定义为100％，即CK。

以上实验中未被降解3OXO-C8-HSL提取和检测方法见上文。

结果表明：AidB在0℃-70℃保持较高的AHL降解活性，在60℃时降解活性最高(图4中A)。在pH＝4.0-9.0范围内，AidB的降解活性随着pH值的升高而升高，当pH值为9.0时，其降解活性达到最高(图4中B)。在经过金属离子、尿素和EDTA处理后，AHL降解活性不受影响。而SDS可使AidB完全丧失降解活性(图4中C)。综上所述，AidB作用的最适温度和最适pH值分别为60℃和9.0，并且其AHL降解活性不受检测金属离子、尿素和EDTA的影响。

五、AidB信号分子降解谱

为检测AidB信号降解特异性，利用不同种类的AHL信号(C6-HSL，3OXO-C6-HSL，3OXO-C8-HSL，3OH-C8-HSL，3OXO-C12-HSL)作为底物。用反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0)配制0.5μg/mL AidB蛋白溶液，取190μL蛋白溶液分别加入10μL不同种类的信号分子(20mM C6-HSL、200μM 3OXO-C6-HSL、5μM 3OXO-C8-HSL、20μM 3OH-C8-HSL、20μM 3OXO-C12-HSL)，混匀后，30℃反应30min。以不加AidB作为对照。未被降解3OXO-C8-HSL提取和检测方法见上文。

结果表明：与已报道的AHL内酯酶类似，AidB拥有较广的AHL信号降解谱，对多种信号分子包括长链、短链以及C3位置上不同取代基(羰基或羟基或无取代基)的信号分子都有较高的降解活性(图5)。

六、aidB基因生物学功能分析

1、aidB基因表达对软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum)致病性的影响

P.carotovorum致病性受自身QS系统的严格调控，为探究aidB基因表达对其致病性的影响。本实验以SEQ ID No.2所示DNA分子为模板，以AidB-F1和AidB-R1为引物，扩增得到两端分别带有酶切位点BamHI和XbaI的aidB基因。

AidB-F1：

5’-TATGGATCCGGAGGTTTAA-ATGGATCAGAAATCACGTCGCA-3’；

AidB-R1：5’-ATATCTAGATCAGGCCGGGATCAGCTCATA-3’。

将扩增片段进行BamHI和XbaI双酶切，胶回收酶切产物，与经过同样双酶切的广宿主质粒pBBR1MCS-2，构成P_lac::aidB融合表达质粒pBBR1MCS2-AidB。重组质粒pBBR1MCS2-AidB的结构描述为：将“GGAGGTTTAA+SEQ ID No.2”所示DNA分子(即aidB基因)插入到pBBR1MCS-2载体的酶切位点BamHI和XbaI之间后得到的重组质粒。

将重组质粒pBBR1MCS2-AidB和空质粒pBBR1MCS-2分别导入P.carotovorumsubsp.carotovorum Z3-3菌株。将菌株Z3-3(pBBR1MCS2-AidB)和Z3-3(pBBR1MCS-2)接种于LB培养基，28℃180rpm培养24h，12000rpm离心3min收集菌体，用新鲜LB培养基重新悬浮菌体并调节OD₆₀₀＝1.0。取30μL重新悬浮菌液接种于30mL LB的三角瓶中，28℃180rpm培养，每隔2h取样测定菌液浓度(OD₆₀₀)和AHL产量(提取和检测方法见上文)。将马铃薯用70％酒精表面消毒后切成相同大小和厚度组织切片，取5μL重新悬浮菌液接种于切片中央，放于保湿的保鲜盒中，28℃培养48h。取大白菜中层叶片，用70％酒精表面消毒后，用灭菌牙签在中央位置刺伤，并在伤口分别接种5μL重新悬浮菌液，放于保湿的保鲜盒中，28℃培养72h。

实验结果显示，aidB基因表达对菌株Z3-3的生长没有影响，同时在菌株Z3-3(pBBR1MCS2-AidB)中始终未检测到信号产生(图6中A)，说明aidB基因的表达能明显够降解菌株Z3-3合成的信号分子。致病性实验表明，aidB基因表达的菌株Z3-3(pBBR1MCS2-AidB)与空质粒菌株相比病斑明显减小(图6中B和表1)，说明aidB基因的表达能显著降低病原菌Z3-3的致病能力。

表1软腐果胶杆菌Z3-3在植物上的致病性

2、aidB基因表达对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)毒力因子的影响

P.aeruginosa拥有两套AHL介导的QS系统，其多种毒性因子的表达受QS系统调控。为明确aidB基因表达对其毒性因子的影响，本实验将重组质粒pBBR1MCS2-AidB和空质粒pBBR1MCS-2分别导入P.aeruginosa PAO1，分别测定重组菌株生长、AHLs信号产量、绿脓菌素和运动能力。将菌株分别接种于LB培养基，37℃180rpm培养24h，12000rpm离心3min收集菌体，用新鲜LB培养基重新悬浮菌体并调节OD₆₀₀＝1.0。取30μL重新悬浮菌液接种于30mLLB的三角瓶中，28℃180rpm培养，每隔3h取样测定菌液浓度(OD₆₀₀)、AHL产量(提取和检测方法见上文)和绿脓菌素的产量。其中绿脓菌素产量测定方法如下：取1mL菌液12000rpm离心3min，将上清液转移至新的离心管中，加入600μL氯仿，混匀萃取。12000rpm离心5min，将有机相转移至新离心管，再加入200μL 200mM盐酸，颠倒混匀后，12000rpm离心5min，用分光光度计检测水相在520nm处的吸光值。运动性测定实验：取2μL重悬浮菌液分别点在游动性平板(10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，3g/L琼脂糖)或群集运动平板(8g/L营养肉汤，5g/L葡萄糖，5g/L琼脂)中央，37℃培养24h-28h。

实验结果表明，aidB基因表达对菌株PAO1的生长没有影响。而在菌株PAO1(pBBR1MCS2-AidB)中始终未检测到信号产生，说明aidB基因的表达能明显够降解菌株PAO1合成的信号分子(图7中A)。菌株PAO1(pBBR1MCS2-AidB)检测不到绿脓菌素的合成(图7中B和C)，说明aidB基因的表达抑制绿脓菌素的合成。运动性实验表明，aidB基因的表达显著抑制PAO1游动性和群集运动(图7中D)。综上，aidB基因通过降解AHLs信号分子的合成而抑制P.aeruginosa毒力因子的产量。

<110> 中国农业大学

<120> 一种热稳定细菌群体感应信号降解酶及其应用

<130> GNCLN190334

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 272

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Asp Gln Lys Ser Arg Arg Ile Gly Ala Tyr Glu Val Ser Ile Leu

1 5 10 15

His Asp Gly Val Phe Glu Ala Ala Leu Asp Val Leu Ile His Ala Arg

20 25 30

Gly Glu Ala Ala Arg Asp Glu Ala Val Ala Arg Trp Gly Lys Pro Lys

35 40 45

Val Ser Ile Val Val Asn Cys Phe Ala Leu Lys Gly Pro Asp Gly Ile

50 55 60

Thr Leu Val Asp Ala Gly Thr Gly Pro Ser Trp Gly Glu Ala Met Gly

65 70 75 80

His Ala Pro Ala Ala Met Ala Ala Ile Gly Ile Ala Pro Glu Gln Val

85 90 95

Glu Arg Val Leu Ile Thr His Leu His Gly Asp His Ala Leu Gly Leu

100 105 110

Phe Asp Gly Asp Arg Ala Arg Phe Pro Asn Ala Glu Ile Ile Val Pro

115 120 125

Glu Ala Asp Phe Gly Tyr Phe Gly Asp Glu Ala Asn Arg Ala Arg Thr

130 135 140

Pro Glu Lys Lys Gln Gly Gly Phe Ala Ile Ala Ala Thr Leu Lys Lys

145 150 155 160

His Tyr Ala Gly Arg Ile Arg Ser Val Thr Gly Glu Ala His Pro Gly

165 170 175

Ile Thr Leu Ile Pro Leu Pro Gly His Thr Phe Gly His Ser Gly Tyr

180 185 190

Leu Ile Glu Gly Gln Asp Glu Ser Leu Leu Leu Trp Gly Asp Ala Leu

195 200 205

His Leu Ser Asp Leu Gln Ala Ser Val Pro Glu Ile Gly Phe Val Tyr

210 215 220

Asp Phe Asp Ala Ala Ser Ala Leu Ala Ser Arg Arg Ala Ile Leu Glu

225 230 235 240

Gln Ala Ala Arg Glu Gly Trp Leu Val Ser Gly Gly His Val Glu Gly

245 250 255

Phe Arg Arg Val Val Arg Lys Gly Ser Gly Tyr Glu Leu Ile Pro Ala

260 265 270

<210> 2

<211> 819

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atggatcaga aatcacgtcg catcggcgcc tatgaggttt cgatcctgca cgacggcgtc 60

ttcgaagcag cgctcgacgt gctgatccat gcccgcggcg aagctgcccg cgacgaggcg 120

gtcgcgcgct ggggcaagcc gaaggtcagt atcgtggtca attgcttcgc actgaagggc 180

cccgacggca tcaccttggt cgatgccggc accggcccgt cctggggcga ggcgatgggc 240

cacgcgcctg ccgccatggc ggctatcggg attgcgcccg aacaggtgga gagggtcctg 300

atcacccatc tccatggcga ccatgcgctc ggcctcttcg atggcgaccg cgcccgcttt 360

cccaatgccg agatcatcgt gcccgaagcc gatttcggct acttcggcga cgaggccaat 420

cgcgcgcgga cgccggagaa gaagcagggc ggcttcgcca tcgctgcaac gctcaagaag 480

cactatgccg gccgcatccg cagcgtgacc ggcgaggcgc atcccggcat cacgctcatc 540

cccctgcccg gccatacctt cggccacagt ggctatctga tcgaaggcca agacgagagc 600

ctgctgctct ggggcgatgc gctgcatctg tccgatctgc aggcttcggt ccccgagatc 660

ggcttcgtct atgatttcga cgccgcgagc gcgcttgcct cccgccgcgc catcctggag 720

caagccgcgc gcgaaggctg gctcgtctcg ggcggccatg tcgagggttt ccggcgtgtc 780

gtcaggaagg gctcgggcta tgagctgatc ccggcctga 819

Claims

1.蛋白质，为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为基因；所述基因是如下任一所述的DNA分子：

（B1）SEQ ID No.2所示的DNA分子；

（B2）在严格条件下与（B1）限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

（B3）与（B1）-（B2）限定的DNA序列具有80%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。

5.权利要求1所述蛋白质在作为细菌群体感应信号降解酶中的应用。

6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述表达盒、重组载体或重组菌在制备具有细菌群体感应信号降解酶活性的产品中的应用。

7.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述表达盒、重组载体或重组菌在如下任一中的应用：

（a1）制备能够降解N-酰基-高丝氨酸内酯的产品，或者降解N-酰基-高丝氨酸内酯；

（a2）制备能够降低植物病原细菌致病性的产品，或者降低植物病原细菌致病性；

（a3）制备能够降低动物病原细菌毒力因子产量的产品；

在（a2）中，所述植物病原细菌为软腐果胶杆菌；

在（a3）中，所述动物病原细菌为铜绿假单胞菌。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：（a2）中所述降低植物病原细菌致病性是通过降解所述植物病原细菌中的N-酰基-高丝氨酸内酯实现的；

（a3）中所述降低动物病原细菌毒力因子产量是通过降解所述动物病原细菌中的N-酰基-高丝氨酸内酯实现的。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述N-酰基-高丝氨酸内酯的侧链长度为C6-C12，C3位置无取代基或取代基为羰基或羟基。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述N-酰基-高丝氨酸内酯为如下中任一种或任几种：C6-HSL、3OXO-C6-HSL、3OXO-C8-HSL、3OH-C8-HSL、3OXO-C12-HSL。

11.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述表达盒、重组载体或重组菌在如下任一中的应用：

（b1）制备能够抑制铜绿假单胞菌合成绿脓菌素的产品；

（b2）制备能够抑制铜绿假单胞菌以游动性和/或群集运动方式运动的产品。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：（b1）中所述抑制铜绿假单胞菌合成绿脓菌素是通过降解所述铜绿假单胞菌中的N-酰基-高丝氨酸内酯实现的；

（b2）中所述抑制铜绿假单胞菌以游动性和/或群集运动方式运动是通过降解所述铜绿假单胞菌中的N-酰基-高丝氨酸内酯实现的。