CN108660123A

CN108660123A - PslG蛋白或其编码序列在检测微生物数量方面的应用和方法

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Publication number: CN108660123A
Application number: CN201810154326.8A
Authority: CN
Inventors: 马旅雁; 王迪; 张妙坤; 赵天湖; 王世伟
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS; University of Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2018-02-22
Filing date: 2018-02-22
Publication date: 2018-10-16
Anticipated expiration: 2038-02-22
Also published as: CN108660123B

Abstract

本发明公开了PslG蛋白或其编码序列在检测微生物数量方面的应用和方法，具体为：本发明提供了胞外多聚物降解酶，特别是多糖水解酶PslG在检测生物被膜或含菌团的菌液的微生物数量方面的应用和方法。所述方法包括使用组合物抑制、分散或瓦解微生物形成的生物被膜或菌团，从而检测所述微生物的数量。所述组合物包括PslG蛋白。本发明还提供了所述PslG蛋白的氨基酸序列和编码基因序列。

Description

PslG蛋白或其编码序列在检测微生物数量方面的应用和方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及胞外多聚物降解酶，特别是多糖水解酶PslG在检测生物被膜或含菌团的菌液的微生物数量方面的应用和方法。

背景技术

生物被膜(biofilm)是指微生物在物体表面通过黏附生长并用自身分泌的胞外多聚物(extracellular polymeric substances,EPS)包裹所形成的高度组织化、系统化的多细胞群体结构，与人类的生产、生活息息相关。菌团(bacterial aggregate)是指微生物在液体中震荡培养时，由于菌体细胞被EPS包裹而形成的微生物聚集体,通常表现为菌液结团或絮凝现象。一些临床菌株，例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的皱褶型小菌落突变株(rugose small colony variants,RSCV)，由于胞外多糖Psl的大量合成，在液体培养的时候特别容易结团。其他假单胞菌属细菌，例如施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)也会在一些生长培养基中结团成絮凝状。在EPS的包裹下，菌团或生物被膜群体中的菌细胞很难被打散成游离的单细胞菌悬液，因此，直接使用常规的细胞计数方法进行测量是无法准确反映出样品的真实菌量的。需要一种准确、便捷的方法检测生物被膜或菌团中的微生物数量。

发明内容

本发明旨在提供胞外多聚物降解酶，特别是多糖水解酶PslG在检测生物被膜或含菌团的菌液中的微生物数量方面的应用和方法。

本发明的一个方面提供了一种PslG蛋白及其编码序列的用途。所述PslG蛋白及其编码序列用于抑制、分散或瓦解微生物形成的生物被膜或菌团，以检测所述微生物的数量。

在一些实施例中，所述PslG蛋白选自：(i)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白；(ii)将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、具有抑制、分散或瓦解所述生物被膜或所述菌团的能力的由(i)衍生的蛋白；或者(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示序列的同源性≥95％的具有抑制、分散或瓦解所述生物被膜或所述菌团的能力的蛋白。

在一些实施例中，所述PslG蛋白的编码序列选自：(1)编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；(3)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示序列的同源性≥95％的核苷酸序列；(4)将SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个核苷酸的核苷酸序列；或者(5)与(1)-(4)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明的另一个方面提供了一种检测微生物数量的方法。所述方法包括使用组合物分散或解离微生物形成的生物被膜或菌团，其中所述组合物包括PslG蛋白。所述方法还包括检测所述微生物的数量。微生物的计数包括但不限于下述方法：分光光度计光密度值(OD)测量法，菌落计数，血球计数版计数，流式细胞仪计数等

在一些实施例中，所述PslG蛋白选自：(i)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白；(ii)将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、具有抑制、分散或解离所述生物被膜或所述菌团的能力的由(i)衍生的蛋白；或者(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示序列的同源性≥95％的具有抑制、分散或解离所述生物被膜或所述菌团的能力的蛋白。

在一些实施例中，所述方法还包括在检测微生物细胞数量之前，对微生物形成的生物被膜或菌团进行以下一种或多种处理：磁力搅拌、机械搅拌、涡旋震荡、超声波或组织匀浆。

在一些实施例中，所述使用所述组合物抑制或抑制、分散或解离所述生物被膜或所述菌团时，所述PslG蛋白的有效浓度为0.1nM-10μM。

在一些实施例中，所述使用所述组合物抑制、分散或解离所述生物被膜或所述菌团是在5-75℃的条件下进行的。

在一些实施例中，至少部分所述生物被膜或至少部分所述菌团是由铜绿假单胞菌形成的。

在一些实施例中，至少部分所述生物被膜或至少部分所述菌团是由施氏假单胞菌形成的。

通过上述技术方案，本发明具备以下的技术效果：通过PslG抑制、分散或瓦解生物被膜或菌团，将聚集在一起的微生物分散成游离细胞，从而实现用常规计数方法对生物被膜或菌团中的微生物的数量进行较为准确的测量。

附图说明

图1采用死活菌染色(SYTO9/PI)对PAO1与ΔpaaP在24h、36h和48h气-液界面形成的生物被膜中死活菌生物量的统计结果的示意图；

图2是利用PslG分散或瓦解PAO1与ΔpaaP在24h、36h和48h形成的生物被膜后，采用菌落形成单元(CFU)计数法对生物被膜中活菌数的统计结果的示意图。

图3是通过CFU计数法比较对照组、匀浆组及PslG处理组获得的PAO1生物被膜中活菌数的统计结果的示意图；

图4是采用含有PslG或不含PslG的Jensen培养基培养RSCV MJK8菌株后测量菌液OD值的统计结果的示意图；

图5是采用含有PslG或不含PslG的LBNS培养基培养MJK8菌株后测量菌液OD值的统计结果的示意图；

图6是对照组、匀浆组和PslG蛋白处理组的根据细菌总蛋白量绘制的24h生长曲线的比较图；

图7是对照组的根据OD₆₀₀和细菌总蛋白量绘制的24h生长曲线；

图8是匀浆组的根据OD₆₀₀和细菌总蛋白量绘制的24h生长曲线；

图9是PslG蛋白处理组在24h内根据OD₆₀₀和细菌总蛋白量绘制的生长曲线；以及

图10是采用含有PslG或不含PslG的KLG培养基培养A1501菌株后测量菌液OD 值的统计结果的示意图。

具体实施方式

本发明提供了胞外多聚物降解酶，特别是多糖水解酶PslG在检测生物被膜或菌团中的微生物数量方面的应用和方法。

本发明的第一个方面提供了一种PslG蛋白或其编码序列的用途。所述PslG蛋白或其编码序列可用于抑制、分散或解离微生物形成的生物被膜或菌团，以检测所述微生物的数量。

生物被膜或菌团是指被自分泌的EPS所包被(或包裹)的微生物。在一些实施例中，易形成生物被膜或菌团的微生物可以是细菌，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)、解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)等。胞外多聚物降解酶可以通过水解包被生物被膜或菌团的EPS，从而使细胞从聚集体变为游离细胞，便于通过常规计数方法进行细胞计数。PslG是胞外多聚物降解酶中的多糖水解酶，可显著降解多糖Psl。多糖是多种微生物所分泌的EPS中的重要成分，因此可利用PslG来水解多糖从而将生物被膜或菌团分散或解离为单细胞。所述常规计数方法可以包括血球计数法、CFU计数法、基于流式细胞仪的计数法、基于OD测量值的比浊计数法、基于细胞染色和图像分析的计数法、测定细胞总氮量或总炭量的方法等。

在一些实施例中，PslG蛋白可以是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中，PslG蛋白可以是将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、具有抑制、分散或瓦解所述生物被膜或所述菌团的能力的蛋白。在一些实施例中，PslG蛋白可以是氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示序列的同源性≥95％的具有抑制、分散或瓦解生物被膜或菌团的能力的蛋白。其中，优选地，所述同源性≥98％。例如，可以对SEQ ID NO:2所示的蛋白进行改造，从而增强抑制、分散或瓦解生物被膜或菌团的能力。示例性的改造方法可以包括增强所述蛋白与底物的结合能力，增强所述蛋白在高 pH环境或低pH环境的结构稳定性和催化活性，增强所述蛋白在高温或低温条件下的结构稳定性和催化活性等。

在一些实施例中，所述PslG蛋白的编码序列可以选自编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，所述PslG蛋白的编码序列可以选自SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。在一些实施例中，所述PslG蛋白的编码序列可以选自核苷酸序列与SEQID NO:1所示序列的同源性≥95％的核苷酸序列，其中，优选地，所述同源性≥98％。在一些实施例中，所述PslG蛋白的编码序列可以选自将SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个核苷酸的核苷酸序列，其中，优选地，1-30个，更优选地，1-10个。在一些实施例中，所述PslG蛋白的编码序列可以选自与以上任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明的另一方面公开了一种检测微生物数量的方法。所述方法包括使用组合物抑制、分散或解离微生物形成的生物被膜或菌团，所述组合物包括PslG蛋白。所述方法还包括检测所述微生物的数量。

在一些实施例中，所述组合物可以包括PslG蛋白和其他胞外多聚物降解酶等。生物被膜或菌团的形成可能与多种多糖有关。例如，铜绿假单胞菌生物被膜的形成与Psl、Pel和海藻酸三种多糖密切相关。所述组合物可以包括PslG蛋白、水解Pel的蛋白以及水解海藻酸的蛋白等。

在一些实施例中，所述组合物可以包括PslG蛋白或其活性片段、合适的载体、助剂等一种或多种的组合。所述活性片段可以是PslG蛋白的一部分，具有抑制、分散或解离生物被膜或菌团的能力。所述载体可以是溶解PslG蛋白的溶剂或溶液，例如水或盐溶液。所述助剂可以包括缓冲剂、pH调节剂、能增强PslG蛋白抑制、分散或解离生物被膜或菌团的能力的激动剂等一种或多种的组合。

在一些实施例中，所述组合物可以是液体、固体或半固体。例如，液体形式的组合物可以是溶液。固体形式的组合物可以是片状物、粉末、微粒、纳米微粒等。半固体形式的组合物可以是悬浮液、乳状物、膏状物等。

在一些实施例中，所述方法还包括在检测微生物细胞数量之前，对微生物形成的生物被膜或菌团进行以下一种或多种处理：磁力搅拌、机械搅拌、涡旋震荡、超声波或组织匀浆。上述处理方式可与所述用组合物抑制、分散或解离微生物形成的生物被膜或菌团的步骤相结合，从而促进将生物被膜或菌团分散或解离成单细胞菌悬液，以检测微生物细胞的数量。

在一些实施例中，使用所述组合物抑制、分散或解离所述生物被膜或所述菌团时，所述PslG蛋白的有效浓度为0.1nM-10μM。优选地，所述PslG蛋白的有效浓度为0.1nM至500nM。更优选地，所述PslG蛋白的有效浓度为5-100nM。例如，PslG蛋白的有效浓度可以是25nM(参见实施例4)、50nM(参见实施例1)、100nM(参见实施例3)。

在一些实施例中，使用所述组合物抑制、分散或解离所述生物被膜或所述菌团是在5- 75℃的条件下进行的。优选地，所述条件可以是10-60℃。更优选地，所述条件可以是15-50℃。例如，所述条件可以是30℃(参见实施例1)。

在一些实施例中，至少部分所述菌团是由施氏假单胞菌形成的。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以便本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不对本发明构成限定。应当理解的是，对于本领域的技术人员来说，在了解本发明的原理后，可以在不背离该原理的情况下，进行各种形式和细节上的改变以实施本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

菌株与培养基

PAO1菌株为野生型铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，参考文献为Genetic recombination in Pseudomonas aeruginosa.J Gen Microbiol,1955.13(3):p.572-81。

ΔpaaP菌株为铜绿假单胞菌的PaAP缺失突变株，缺失的基因在铜绿假单胞菌基因组上位点为PA2939(www.pseudomonas.com)，ΔpaaP的构建参考文献为Precision-engineering the Pseudomonas aeruginosa genome with two-step allelicexchange.Nat Protoc,2015.10(11):p. 1820-41。敲除质粒为pEX18AP，参考文献为Abroad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision ofchromosomally-located DNA sequences:application for isolation of unmarkedPseudomonas aeruginosa mutants.Gene,1998.212(1):p.77-86。所用引物SEQ ID NO： 3(Up-F：AGAATT GAGGTTCTCG TCTTCAGG)，SEQ ID NO：4(Up-R：GATCTGGCTGGCGCTCTTCTGCATGTGAGGCGATGATC GATAAGC)，SEQ ID NO：5 (Down-F：GCTTATCGATCATCGCCTCACATGCAGAAGAGCGCCA GCCAGATC)，SEQ ID NO：6(Down-R：GTCAAGCTTCTGCTGGTCTGTAGCGAGGAC)。

MJK8菌株为临床来源的易凝絮的RSCV铜绿假单胞菌菌株，参考文献为Pseudomonas aeruginosa rugose small colony variants have adaptions thatlikely promote persistence in the cystic fibrosis lung.J.Bacteriol.191:3492-3503。

A1501菌株为野生型施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，参考文献为Nitrogen fixation island and rhizosphere competence traits in the genome ofroot-associated Pseudomonas stutzeri A1501.PNAS,2008vol.105(21)7564-7569。

LBNS固体培养基的制备使用了5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、15g琼脂粉以及1000ml蒸馏水。

LBNS液体培养基的制备使用了5g酵母提取物、10g胰蛋白胨以及1000ml蒸馏水。

LD固体培养基的制备使用了5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、2.5g NaCl、15g琼脂粉以及1000ml蒸馏水。

LD液体培养基的制备使用了5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、2.5g NaCl以及1000ml蒸馏水。

Jensen液体培养基(pH 7.3)的制备使用了5g NaCl、2.51g K₂HPO₄、15.56g L-谷氨酸单钠盐、2.81g缬氨酸、1.32g苯丙氨酸、13.87g葡萄糖、0.165g MgSO₄·7H₂O、0.105mgCaCl₂·2H₂O、5.5μg FeSO₄·7H₂O、12μg ZnSO₄·7H₂O以及1000ml蒸馏水。

KLG液体培养基(pH6.8)中含有0.87g/L KH₂PO₄、1.67g/L K₂HPO₄、0.48g/L NaCl、0.29g/L MgSO₄·7H₂O、0.005g/L Na₂MoO₄·H₂O、0.072g/L ZnSO₄·7H₂O,0.003g/L H₃BO₃、0.07g/L CaCl₂·2H₂O、0.01g/L FeCl₃·6H₂O、0.25g/L MnSO₄·H₂O、0.014g/L CoSO₄·7H₂O、5.4ml C₃H₅NaO₃(65％)以及20mM谷氨酸钠。

实施例1、多糖水解酶PslG可用于生物被膜中的活菌定量计算

将铜绿假单胞菌PAO1和PaAP缺失突变株ΔpaaP接种至在LB固体培养基平板上，在37℃下静置培养过夜；从完成上述步骤的平板上挑取PAO1和ΔpaaP的单克隆，接种至LB液体培养基，在37℃下200rpm振荡培养过夜；取10μl的PAO1和ΔpaaP过夜菌液分别接种到1ml到Jensen培养基中，加到1×1×4cm四孔玻璃小室(Chambered#1.5 German CoverglassSystem,Nunc Inc.)中30℃静置培养24h、36h和48h。

PAO1和ΔpaaP生物被膜死活菌染色的步骤如下：染色前，将小室中的培养液轻柔吸出使生物被膜缓慢落于小室底部的盖玻片上，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗生物被膜一次；选用LIVE/DEAD^TM BacLight^TM Bacterial Viability Kits(Molecular Probes,Invitrogen)，用 SYTO9/Propidium Iodide(PI)(终浓度均为5μM)荧光染料避光染色15min后重悬于PBS缓冲液中。使用100μg/ml的TRITC-HHA(Tetramethylrhodamin conjugatedHippeastrum Hybrid Amaryllis)对Psl基质避光染色2h。

生物被膜的图像获取与处理步骤如下：采用 FV-1000激光共聚焦显微镜 63×/1.3objective物镜观察拍照。SYTO9的激发波长为488nm，PI和TRITC-HHA的激发波长为543nm。得到的照片用COMSTAT软件包进行定量分析。

PAO1和ΔpaaP生物被膜的PslG处理与CFU计数的步骤如下：用PslG处理前，先将小室中的培养液轻柔吸出使生物被膜缓慢落于小室底部的盖玻片上，用PBS洗生物被膜一次；加入200μl 50nM PslG(溶解在PBS中)，30℃静置培养30min；用移液枪将处理好的生物被膜吹吸均匀，用PBS进行10倍梯度稀释后，点到LB无抗平板上；37℃过夜培养后，记录菌落数量，计算生物被膜中的活菌数量。

生物被膜通过死活菌染色(Live/Dead staining)后采用激光共聚焦显微镜观测拍摄，根据荧光信号计算生物被膜的生物量和死活菌比例。本实验对比了死活菌染色与利用多糖水解酶PslG处理生物被膜后进行常规活菌计数后的结果，如图1和图2所示。生物被膜中的菌体用SYTO9/PI标记，通过荧光强度计算生物被膜生物量。如图1所示，在24h，ΔpaaP突变株与PAO1生物被膜生物量相差不大；但是在36h和48h，ΔpaaP生物量显著低于PAO1。同时，与PAO1相比，ΔpaaP生物被膜中有大量死菌，并且死菌比例在培养时间内急剧升高。 PslG能够水解生物被膜中的Psl多糖，从而瓦解生物被膜并使细菌成为单细胞游离态。如图 2所示，实验采用PslG处理PAO1与ΔpaaP经24h、36h和48h培养后形成的生物被膜，随后用CFU计数法对生物被膜中活菌数进行了统计。如图2所示，在36h和48h，ΔpaaP生物被膜中活菌数目显著低于PAO1，与SYTO9/PI标记生物被膜死活菌结果相一致。

本实施例说明可以利用PslG处理生物被膜，通过CFU计数法准确计算生物被膜中的活菌数。

实施例2、PslG处理与组织匀浆处理后计算生物被膜活菌数的比较

将铜绿假单胞菌PAO1接种至在LBNS固体培养基平板上，在37℃下静置培养过夜；从完成上述步骤的平板上挑取PAO1单克隆，接种至LBNS液体培养基，在37℃下 200rpm振荡培养过夜；将过夜的培养液用PBS洗一次，然后以1:100(V:V)的接种量接种于Jensen液体培养基中，在24孔培养板中在30℃下静止培养24小时以在气液交界处形成生物被膜；用移液器吸走菌膜下的菌液，用PBS清洗生物被膜两次，去除浮游状态的菌体，得到生物被膜态菌样品；生物被膜重悬于PBS缓冲液中，分为对照组、匀浆组和PslG 处理组。匀浆组先用无菌1ml玻璃匀浆器推拉匀浆三次；PslG处理组加入PslG至终浓度 50nM，在30℃下静置处理1h。用移液器将处理好的生物被膜吹吸均匀，涡旋震荡后，用 PBS进行10倍梯度稀释，点到LB无抗平板上；37℃过夜培养后，记录菌落数量，计算生物被膜中的活菌数量。

本实施例比较了用组织匀浆法分散生物被膜和用PslG处理后进行活菌计数的结果。如图3所示，生物被膜经PslG处理后与匀浆法相比，显著增加了活菌计数方法监测出的菌数。本实施例说明PslG处理对生物被膜的分散或瓦解效果比组织匀浆法更好，能更为准确的体现生物被膜中的活菌数量。

实施例3、PslG处理临床来源的易结团(或絮凝)的铜绿假单胞MJK8菌株的菌液及该方法对OD值测量的影响

用PslG处理MJK8菌株的菌液的步骤如下：将MJK8菌株接种至LBNS固体培养基平板上，37℃静置培养过夜；从完成上述步骤的平板上挑取MJK8单克隆，接种至LBNS液体培养基，在37℃下200rpm振荡培养过夜；将过夜的培养液用PBS洗一次，然后按照1：50(V:V)将菌液接种到含有100nM PslG的Jensen培养基和不含PslG的Jensen培养基中；或者按照1:50(V:V)将菌液接种到含有100nM PslG的LBNS液体培养基和不含PslG的 LBNS液体培养基中。接种后，在37℃下200rpm振荡培养。分别在3h、6h取菌液样品，用分光光度计在600nm下对菌液进行OD值测量。

本实施例在LBNS培养基和Jensen培养基中，比较了PslG处理对OD₆₀₀读数的影响。结果分别如图4和图5所示，PslG处理组的OD₆₀₀读数明显高于对照组。本实施例说明使用含有PslG的培养基可显著提高培养一段时间后菌液测得的OD值，从而说明PslG处理可提高用OD值法测量菌数的效果。

实施例4、易结团(或絮凝)菌菌悬液的PslG处理与匀浆处理结果

将铜绿假单胞菌临床菌株MJK8接种至在LBNS固体培养基平板上，37℃静置培养过夜；从完成上述步骤的平板上挑取MJK8单克隆，接种至LBNS液体培养基，在37℃下200rpm振荡培养过夜。

PslG处理的步骤如下：将上述过夜的培养液用PBS洗一次，然后以1:50(V:V)的接种量接种于Jensen液体培养基中，PslG处理组添加终浓度为25nM的PslG，然后在37℃下以200rpm的速度振荡培养，每隔3小时，取样测量OD₆₀₀值和细菌总蛋白，直至第24小时。

匀浆处理的步骤如下：将上述过夜的培养液用PBS洗一次，然后以1:50(V:V)的接种量接种于Jensen液体培养基中，每隔3h，取1ml菌液样品于玻璃匀浆器抽拉处理三次后测量OD₆₀₀值和细菌总蛋白，直至第24h。

对照组的处理步骤如下：将上述过夜的培养液用PBS洗一次，然后以1:50(V:V)的接种量接种于Jensen液体培养基中，每隔3小时取样测量OD₆₀₀值和细菌总蛋白，直至第24h。

其中，测量细菌总蛋白使用BCA(bicinchonininc acid)法，步骤如下：取100μl菌液离心去掉上清液，收集菌体后用100ul的PBS缓冲液洗一次，重悬在100μl的PBS缓冲液中；将重悬菌液于液氮与37℃水浴反复冻融三次；在4℃下用离心机以14000rpm转速离心15分钟，把上清液转移到新的离心管中；在上一步得到的上清液中取25μl用BCA试剂盒(BCA Protein Assay Kit)测蛋白浓度；用0.5mg/ml BSA蛋白(牛血清白蛋白)绘制标准曲线Y＝1.148X+0.0407,R2＝0.9901。再根据公式计算所有样品中蛋白质浓度。

由于易结团(或絮凝)菌振荡培养时菌细胞相互结团，导致无法准确读取OD₆₀₀值，因此通常采用测量细菌总蛋白浓度的方法来替代常规的OD₆₀₀值来得到生长曲线。本实验比较了匀浆处理和PslG处理后测量OD₆₀₀与测量总蛋白浓度所得的生长曲线。如图6所示，对照组，匀浆组和PslG蛋白处理组三组进行总蛋白量(BCA法)测定所得的生长曲线图非常相近。OD₆₀₀所得的生长曲线与总蛋白量所得的生长曲线的比较如图7-9所示，对照组两个曲线差距最大(图7)，PslG处理组两个曲线重合度最高(图9)，匀浆组的两个曲线也较相似 (图8)。

本实施例表明将PslG加入到易结团(或絮凝)的菌的培养液后，可用常规读取OD₆₀₀值的方法测定生长曲线。

实施例5、PslG处理也可显著提高易结团(或絮凝)的施氏假单胞菌A1501的OD₆₀₀测量值

用PslG处理A1501菌株的菌液的步骤如下：将A1501菌株接种至LD固体培养基平板上，30℃静置培养过夜；从完成上述步骤的平板上挑取MJK8单克隆，接种至LD液体培养基，在30℃下以200rpm振荡的条件下培养过夜；将过夜的培养液用PBS洗一次，然后按照1：50(V:V)将菌液接种到含有100nM PslG的KLG培养基和不含PslG的KLG培养基中，在30℃下以200rpm的速度振荡培养；接种后分别在3h、6h、30h取菌液样品，用分光光度计在600nm下对菌液进行OD值测量。

如图10所示，在A1501培养液中加入PslG也增大了培养液OD₆₀₀的读数。本实施例说明PslG处理方法也适用于施氏假单胞菌形成的菌团，可以改善用OD值法测量施氏假单胞菌菌数的效果。

本领域的技术人员应当理解，以上实施例仅为说明本发明，而不对本发明构成限制。凡在本发明的精神和原则内所作的任何修改、等同替换和变动等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> PslG蛋白或其编码序列在检测微生物数量方面的应用和方法

<130> 20526-0002CN00

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcacgta agggactcta tctgggcggc agcgcgctgc tgctcgccgt ggtactgctg 60

ctggtgttct gggggcgtcc cgccgacgcc gagatccagg tactgaaggc gcctcgcgcg 120

gtggtctgga aagacttcct cggggtcaac gcgcagttcc tctggttcag cccggagcgt 180

tacaacaagc agatcgaccg cctgcaggac ctggggctgg agtgggtgcg cctggacctg 240

cactgggacc gcctggaaac cgccgaggac cagtaccagc tggcctccct cgaccagttg 300

gtcaaagatc tcgaggcgcg ccagctgaag tcggtgttct acctggtcgg ctcggcccgc 360

ttcatcacca ccgcgccgtt ctactcgccc ttccaggacc agtatccgcc gcgcgacccg 420

gaagtcttcg cccggcgcat ggcgatgctc tcgcagcgct acccgagcgt ggccgcctgg 480

caggtatgga acgagcccaa cctgatcggc ttctggcggc ccaaggccga cccggaaggc 540

tacgccaagc tgctccaggc cagcaccatc gccctgcgca tggtcgaccc ggagaagccg 600

gtggtttccg ccggcatggc cttcttcagc gagatgcccg acggccgcac catgttcgac 660

gccctcggcc acctgggcgt ggagagcctc ggcaccatcg ccacctacca cccctatacc 720

cagttgccgg aaggcaacta cccgtggaac ctggacttcg tctcccacgc caaccagatc 780

aaccgcgccc tgcgcaacgc cggcgtgccg gcgatctgga gcaccgagtg gggctggtcg 840

gcctacaagg ggccgaagga gttgcaggac atcattggcg tcgaaggcca ggccgactac 900

gtgctgcgtc gcctggcgct gatgagtgcg ctggactacg accggatctt cctcttcacc 960

ctcagcgatc tcgaccagcg cgccagcgtg cgcgaccgcg actacggcct gctcgacctg 1020

gacgccaacc ccaagccggt ctacctggcc ctgcaacgct tcctcaaggt caccgggccg 1080

aagctgcgcc cggccgaccc gccggtcacc gaggacctgc ccgacggttc cttcagcatc 1140

ggctggaccc gcgaggacgg tcgcaacgtc tggctgttct ggtcggcccg cggcggcaac 1200

gtgcgcctgc cgaagctcaa ggaggccacc ctgcacgatc cgctcagcgg caaggtcacg 1260

cccttgagcg gcagcgacgg cctggaagtc ccggtgaagt ccagcctgca gatgctggtc 1320

tgggagtga 1329

<210> 2

<211> 412

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Ile Gln Val Leu Lys Ala Pro Arg Ala Val Val Trp Lys Asp Phe

1 5 10 15

Leu Gly Val Asn Ala Gln Phe Leu Trp Phe Ser Pro Glu Arg Tyr Asn

20 25 30

Lys Gln Ile Asp Arg Leu Gln Asp Leu Gly Leu Glu Trp Val Arg Leu

35 40 45

Asp Leu His Trp Asp Arg Leu Glu Thr Ala Glu Asp Gln Tyr Gln Leu

50 55 60

Ala Ser Leu Asp Gln Leu Val Lys Asp Leu Glu Ala Arg Gln Leu Lys

65 70 75 80

Ser Val Phe Tyr Leu Val Gly Ser Ala Arg Phe Ile Thr Thr Ala Pro

85 90 95

Phe Tyr Ser Pro Phe Gln Asp Gln Tyr Pro Pro Arg Asp Pro Glu Val

100 105 110

Phe Ala Arg Arg Met Ala Met Leu Ser Gln Arg Tyr Pro Ser Val Ala

115 120 125

Ala Trp Gln Val Trp Asn Glu Pro Asn Leu Ile Gly Phe Trp Arg Pro

130 135 140

Lys Ala Asp Pro Glu Gly Tyr Ala Lys Leu Leu Gln Ala Ser Thr Ile

145 150 155 160

Ala Leu Arg Met Val Asp Pro Glu Lys Pro Val Val Ser Ala Gly Met

165 170 175

Ala Phe Phe Ser Glu Met Pro Asp Gly Arg Thr Met Phe Asp Ala Leu

180 185 190

Gly His Leu Gly Val Glu Ser Leu Gly Thr Ile Ala Thr Tyr His Pro

195 200 205

Tyr Thr Gln Leu Pro Glu Gly Asn Tyr Pro Trp Asn Leu Asp Phe Val

210 215 220

Ser His Ala Asn Gln Ile Asn Arg Ala Leu Arg Asn Ala Gly Val Pro

225 230 235 240

Ala Ile Trp Ser Thr Glu Trp Gly Trp Ser Ala Tyr Lys Gly Pro Lys

245 250 255

Glu Leu Gln Asp Ile Ile Gly Val Glu Gly Gln Ala Asp Tyr Val Leu

260 265 270

Arg Arg Leu Ala Leu Met Ser Ala Leu Asp Tyr Asp Arg Ile Phe Leu

275 280 285

Phe Thr Leu Ser Asp Leu Asp Gln Arg Ala Ser Val Arg Asp Arg Asp

290 295 300

Tyr Gly Leu Leu Asp Leu Asp Ala Asn Pro Lys Pro Val Tyr Leu Ala

305 310 315 320

Leu Gln Arg Phe Leu Lys Val Thr Gly Pro Lys Leu Arg Pro Ala Asp

325 330 335

Pro Pro Val Thr Glu Asp Leu Pro Asp Gly Ser Phe Ser Ile Gly Trp

340 345 350

Thr Arg Glu Asp Gly Arg Asn Val Trp Leu Phe Trp Ser Ala Arg Gly

355 360 365

Gly Asn Val Arg Leu Pro Lys Leu Lys Glu Ala Thr Leu His Asp Pro

370 375 380

Leu Ser Gly Lys Val Thr Pro Leu Ser Gly Ser Asp Gly Leu Glu Val

385 390 395 400

Pro Val Lys Ser Ser Leu Gln Met Leu Val Trp Glu

405 410

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agaattgagg ttctcgtctt cagg 24

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatctggctg gcgctcttct gcatgtgagg cgatgatcga taagc 45

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcttatcgat catcgcctca catgcagaag agcgccagcc agatc 45

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcaagcttc tgctggtctg tagcgaggac 30

Claims

1.一种PslG蛋白或其编码序列的用途，其特征在于，用于抑制、分散或瓦解微生物形成的生物被膜或菌团，以检测所述微生物的数量。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PslG蛋白选自：

(i)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白；

(ii)将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、具有抑制、分散或瓦解所述生物被膜或所述菌团的能力的由(i)衍生的蛋白；或者

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示序列的同源性≥95％的具有抑制、分散或瓦解所述生物被膜或所述菌团的能力的蛋白。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述PslG蛋白的编码序列选自：

(1)编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(3)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示序列的同源性≥95％的核苷酸序列；

(4)将SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个核苷酸的核苷酸序列；或者

(5)与(1)-(4)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

4.一种检测微生物数量的方法，其特征在于，所述方法包括：

使用组合物抑制、分散或解离微生物形成的生物被膜或菌团，从而检测所述微生物细胞的数量，所述组合物包括PslG蛋白。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PslG蛋白选自：

(i)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白；

(ii)将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、具有抑制、分散或解离所述生物被膜或所述菌团的能力的由(i)衍生的蛋白；或者

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示序列的同源性≥95％的具有抑制、分散或解离所述生物被膜或所述菌团的能力的蛋白。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在检测所述微生物细胞的数量之前，对微生物形成的生物被膜或菌团进行以下一种或多种处理：磁力搅拌、机械搅拌、涡旋震荡、超声波或组织匀浆。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述使用所述组合物抑制、分散或解离所述生物被膜或所述菌团时，所述PslG蛋白的有效浓度为0.1nM-10μM。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述使用所述组合物抑制、分散或解离所述生物被膜或所述菌团是在5-75℃的条件下进行的。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，至少部分所述生物被膜或至少部分所述菌团是由铜绿假单胞菌形成的。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，至少部分所述生物被膜或至少部分所述菌团是由施氏假单胞菌形成的。