CN102181405A - 一种重组病毒及利用该病毒生产l-天冬酰胺酶ⅱ的方法 - Google Patents

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本发明涉及一种重组病毒及利用该病毒生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法，属于生物科学技术领域。本发明的目的是提供一种重组病毒，该病毒具有多角体基因和L-天冬酰胺酶Ⅱ基因，因此可通过将该重组病毒转移到家蚕中生产出以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，再通过多角体进行分离纯化L-天冬酰胺酶Ⅱ，该重组病毒在家蚕体内具有表达水平高的特点，通过多角体进行分离纯化得到的L-天冬酰胺酶Ⅱ具有纯度高的特点。

Description

一种重组病毒及利用该病毒生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法
技术领域
本发明涉及一种重组质粒，属于生物科学技术领域。
背景技术
L-天冬酰胺酶Ⅱ，能专一性地催化L-天冬酞胺水解生成L-天冬氨酸和氨。它是一种重要的蛋白类抗肿瘤药物，在临床上广泛用于淋巴瘤和儿童急性淋巴细胞白血病(ALL )的治疗, 还可用于黑素肉瘤、霍金森病、胰腺癌等疾病的治疗。目前, L-天冬酰胺酶Ⅱ的生产大多采用以大肠杆菌为宿主的基因工程菌,在生产上存在着生产水平低和分离纯化步骤繁多两方面问题。
发明内容
本发明的目的提供一种重组病毒，该病毒具有多角体基因和L-天冬酰胺酶Ⅱ基因，因此可通过将该重组病毒转移到家蚕中生产出以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，再通过多角体进行分离纯化L-天冬酰胺酶Ⅱ，该重组病毒在家蚕体内具有表达水平高的特点，通过多角体进行分离纯化得到的L-天冬酰胺酶Ⅱ具有纯度高的特点。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种重组病毒，它是通过以下方法制备的：
①以家蚕杆状病毒DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得具有BamHⅠ酶切位点和EcorⅠ酶切位点的扩增产物polh；以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得具有BamHⅠ酶切位点和Hind Ⅲ的扩增产物asp；
②将polh通过BamHⅠ和EcorⅠ俩酶切位点双酶切克隆至pFastbac1质粒，制得重组质粒pFastbac1-polh；将asp 通过BamHⅠ和Hind Ⅲ俩酶切位点双酶切克隆至pFastBacHTB质粒,制得重组质粒pFastBacHTB-asp；
③以重组质粒pFastBacHTB-asp为模板，以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得具有EcoRⅠ酶切位点和Hind Ⅲ酶切位点的扩增产物tev-asp；
④将tev-asp通过EcoRⅠ和Hind Ⅲ俩酶切位点克隆至pFastbac1-polh质粒，制得重组质粒pFastbac1-polh-asp；
⑤将重组质粒pFastbac1-polh-asp在大肠杆菌Bm DH10Bac中转化，并在含有抗生素的环境中培养，然后通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，再从该阳性菌斑中抽提质粒DNA；再将该质粒DNA转染家蚕细胞BmN细胞，转染后分离培养基上清液，获得含有家蚕杆状病毒的多角体蛋白基因和大肠杆菌的L-天冬酰胺酶Ⅱ基因的重组病毒；
SEQ ID No.1：AGGGATCCatgccgaattattcatac；
SEQ ID No.2：CCGAATTCatacgccggaccagtgaa；
SEQ ID No.3：GAGGGATCCGAAAACCTGTATTTTCAG；
SEQ ID No.4：GGAAGCTTTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT；
SEQ ID No.5：GAGGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAG。
本发明的另一个目的在于提供一种利用上述病毒生产和提纯L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法。
一种利用上述病毒生产和提纯L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法：用上述病毒感染家蚕，在该家蚕的BmN细胞中，分离得到以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，然后通过纯化所述多角体蛋白来纯化所述以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，再通过TEV酶酶切去除以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ的多角体蛋白，制得纯净的L-天冬酰胺酶Ⅱ。
本发明所实现的技术效果如下:
本发明将多角体蛋白基因和大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因中间以TEV酶酶切位点对应的核苷酸连接构建成融合基因，通过转移载体在Bm DH10Bac中与BmBacmid同源重组形成含有多角体蛋白基因和大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因的重组BmBacmid，通过转染家蚕细胞BmN所获得的重组病毒恢复了多角体基因，因而在观察病毒感染的细胞时，会看到多角体。这种表达系统不仅可以获得更多的融合大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ，而且蛋白可以通过多角体来纯化，简化了纯化的流程。通过TEV酶酶切去除多角体蛋白，获得纯的大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ。
利用本发明提供的含有多角体蛋白基因和大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因的重组杆状病毒可以把家蚕做为生物反应器，大量地生产大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ。家蚕生物反应器有以下几个优点：①高效表达：多角体基因和p10基因有非常强大的启动子能驱动靶基因的高水平表达，可以达到细胞总蛋白的25%左右，家蚕幼虫体内表达外源基因，表达效率可高于培养细胞10－100倍，每头蚕的表达量可达毫克级。②表达产物稳定：蚕体中有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定。③安全性好：杆状病毒仅是昆虫或节肢动物的病毒，对人畜无毒无害。
利用本发明提供的含有多角体蛋白基因和大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因的重组杆状病毒可以更简便地纯化大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ。
具体实施方式
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
①．根据家蚕杆状病毒多角体基因序列，设计polh引物，引物设计如下：上游引物polh-F:AGGGATCCatgccgaattattcatac(下划线表示BamHⅠ酶切位点) SEQ ID No.1；下游引物polh-R:CCGAATTCatacgccggaccagtgaa(下划线表示EcoRⅠ酶切位点) SEQ ID No.2；
根据大肠杆菌JM109基因组DNA序列，设计大肠杆菌JM109 L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（asp）引物，引物设计如下：上游引物asp-F: CGGGATCCATGTTACCCAATATCACCAT(下划线表示BamHⅠ酶切位点) SEQ ID No.3；下游引物asp-R:GGAAGCTTTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT(下划线表示HindⅢ酶切位点) SEQ ID No.4；
②．PCR扩增
以家蚕杆状病毒DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制取具有BamHⅠ酶切位点和EcorⅠ酶切位点的扩增产物polh；具体的PCR反应参数设计为：94℃预变性5min，94℃变性1min，60℃复性40s，72℃延伸 1min，30个循环；
以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制取具有BamHⅠ酶切位点和Hind Ⅲ的扩增产物asp；具体的PCR反应参数设计为：94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃复性40s，72℃延伸 1min，30个循环；
待反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，同时切胶回收目的片段；
③．将polh通过BamHⅠ和EcorⅠ俩酶切位点双酶切克隆至pFastbac1质粒，制得重组质粒pFastbac1-polh；将asp 通过BamHⅠ和Hind Ⅲ俩酶切位点双酶切克隆至pFastBacHTB质粒,制得重组质粒pFastBacHTB-asp；
④．以重组质粒pFastBacHTB-asp为模板，以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得具有EcoRⅠ酶切位点和Hind Ⅲ酶切位点的扩增产物tev-asp；具体的PCR反应参数设计为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃复性40s，72℃延伸 1min，30个循环；
⑤．将tev-asp通过EcoRⅠ和Hind Ⅲ俩酶切位点克隆至pFastbac1-polh质粒，制得重组质粒pFastbac1-polh-asp。
⑥．将重组转移载体pFastbac1-polh-asp转化Bm DH10Bac,在含有卡那霉素50μg/mL，庆大霉素7μg/mL，四环素10μg/mL，IPTG  40μg/mL，X一gal 100μg/mL的培养板上培养过夜，翌日通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，随后从阳性菌斑从抽提杆粒DNA，该杆粒DNA即为重组病毒的基因组。将此DNA转染家蚕细胞BmN。准备杆粒DNA/脂质体复合物，溶液A:取重组Bacmid(5-10μg)，加入无血清Bm细胞培养基补充体积至100μL;溶液B:取脂质体8μL，加入92μL无血清Bm细胞培养基。将溶液A和溶液B混匀，室温静置15min。取生长良好的BmN细胞，用无血清昆虫Bm培养基培养基洗2～3次，加入800μL无血清的Bm细胞培养基后，再加入准备好的质粒DNA/脂质体复合物200μL。28℃继续培养4h后，加1mL含有20%血清的Bm细胞培养基继续培养。28℃继续培养120小时后，在光学显微镜下观察多角体的形成。分离培养基上清液，获得含有多角体蛋白基因和大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因的重组病毒。
⑦．将获得的重组病毒感染BmN细胞，72小时后收集感染的细胞，分离得到以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，然后通过纯化所述多角体蛋白来纯化所述以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，再通过TEV酶酶切去除以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ的多角体蛋白，制得纯净的L-天冬酰胺酶Ⅱ。
L-天冬酰胺酶Ⅱ活性分析
L-天冬酰胺酶Ⅱ一个单位的酶活性定义为能使底物每分钟释放切1μmol氨的酶量。
相关蛋白质浓度的测定方法采用BCA法。
活性使用奈氏试剂(the Nessler reagent)来检测L-天冬酰胺酶Ⅱ的活性。标准浓度样品为己知浓度的硫酸铵。为排除杆状病毒自身的影响，以BmBacPAK6为对照。具体步骤如下:将上述收集的细胞悬浮在2mL PBS中，与冰上超声波破碎。破碎条件为：强度70，每超声15s，于冰中静置15s，如此反复20次。超声完毕后于4℃条件下，12000rpm，离心15min，收集上清于冰上备用。将100μL的上清与终浓度为0.25%的底物L-Asn(溶于100mM PBS，PH 8.0)混合，在37℃的水浴中孵育15min，立即用终浓度5%的三氯醋酸溶液终止反应。加入奈氏试剂，室温反应15min后于450nm波长下读取吸收值以检测酶反应释放出的氨。经计算在家蚕细胞BmN中表达的重组大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ活性为5940U/mg。这比在大肠杆菌中的表达量高。由于家蚕幼虫体内表达外源基因表达效率可高于培养细胞10－100倍，每头蚕的表达量可达毫克级，因此它为在医学和治疗领域上的应用开辟了广阔的前景。

Claims (2)

1.一种重组病毒，其特征在于它是通过以下方法制备的：
①以家蚕杆状病毒DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得具有BamHⅠ酶切位点和EcorⅠ酶切位点的扩增产物polh；以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得具有BamHⅠ酶切位点和Hind Ⅲ的扩增产物asp；
②将polh通过BamHⅠ和EcorⅠ俩酶切位点双酶切克隆至pFastbac1质粒，制得重组质粒pFastbac1-polh；将asp 通过BamHⅠ和Hind Ⅲ俩酶切位点双酶切克隆至pFastBacHTB质粒,制得重组质粒pFastBacHTB-asp；
③以重组质粒pFastBacHTB-asp为模板，以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得具有EcoRⅠ酶切位点和Hind Ⅲ酶切位点的扩增产物tev-asp；
④将tev-asp通过EcoRⅠ和Hind Ⅲ俩酶切位点克隆至pFastbac1-polh质粒，制得重组质粒pFastbac1-polh-asp；
⑤将重组质粒pFastbac1-polh-asp在大肠杆菌Bm DH10Bac中转化，并在含有抗生素的环境中培养，然后通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，再从该阳性菌斑中抽提质粒DNA；再将该质粒DNA转染家蚕细胞BmN细胞，转染后分离培养基上清液，获得含有家蚕杆状病毒的多角体蛋白基因和大肠杆菌的L-天冬酰胺酶Ⅱ基因的重组病毒；
SEQ ID No.1：AGGGATCCatgccgaattattcatac；
SEQ ID No.2：CCGAATTCatacgccggaccagtgaa；
SEQ ID No.3：GAGGGATCCGAAAACCTGTATTTTCAG；
SEQ ID No.4：GGAAGCTTTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT；
SEQ ID No.5：GAGGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAG。
2.利用权利要求1所述病毒生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法，其特征在于：用上述病毒感染家蚕，在该家蚕的BmN细胞中，分离得到以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，然后通过纯化所述多角体蛋白来纯化所述以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，再通过TEV酶酶切去除以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ的多角体蛋白，制得纯净的L-天冬酰胺酶Ⅱ。
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