CN103146726A - 一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶agluOP及其在毕赤酵母中的高效表达方法。所述优化的α-葡萄糖苷酶基因核苷酸序列如SEQ ID No1所示。所述基因构建到毕赤酵母表达载体并与二硫键异构酶基因转化入毕赤酵母中共表达，在3L罐上诱导110h后酶活达力可到10.1U/mL，是优化前的2.9倍，可用于α-葡萄糖苷酶的工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法，属于酶工程技术领域。
技术背景
α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)，又称α-D-葡萄糖苷水解酶，来源广泛，能催化水解低聚糖类生成葡萄糖，在动物、植物、微生物的糖类代谢中具有重要的生理功能。其中来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的α-葡萄糖苷酶（AGL）不仅具有水解活性，还具有良好的转苷能力，即从麦芽糖的非还原末端切开α-1,4糖苷键并将游离出的葡萄糖残基转移到其他糖类底物形成α-1,6糖苷键，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖（简称IMOs，主要包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等)。由于IMOs能够促进人体内益生菌的生长繁殖，具有防龋齿、降低胆固醇等作用，已广泛应用在食品和医药行业。
P.pastoris表达系统是一种应用广泛的高效表达外源蛋白的真核表达系统，它不仅克服了E.coli等原核表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、易形成不溶性包涵体等缺陷，而且弥补了昆虫细胞及哺乳类细胞等真核表达系统操作复杂、产业化生产成本昂贵的不足。目前提高外源蛋白在P.pastoris中表达量主要有增加目的基因拷贝数，选择强启动子，密码子优化，共表达分子伴侣以及发酵优化等策略。
发明人前期的研究中以A.niger CICIM F0620总RNA为模板，通过RT-PCR获得α-葡萄糖苷酶cDNA，并在P.pastoris KM71中表达，3L罐表达量为3.51U/mL，较野生型及其它基因工程菌有明显提高，但表达水平仍不足以满足生产需求。因此，进一步提高该酶的表达量对工业化生产α-葡萄糖苷酶是相对有利的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种黑曲霉α葡萄糖苷酶基因，用毕赤酵母偏爱密码子替代稀有密码子，共改变了728个碱基，涉及222个密码子，GC含量由50.0%下降到44.2％。
具体而言，以NCBI数据库中A.niger CBS513.88的α-葡萄糖苷酶序列(NCBI登录号：4991096)为基础根据毕赤酵母密码子偏爱性对原始基因进行了密码子优化，优化后基因agluOP核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。优化后基因转化入毕赤酵母KM71菌中在3L罐上甲醇诱导110h后酶活达力到8.2U/mL，是密码子优化前的2.3倍。
本发明还提供一种表达优化后agluOP基因的方法，通过共表达二硫键异构酶PDI改善酵母细胞内的折叠环境，实现黑曲霉α-葡萄糖苷酶的高效表达。
所述优化后基因agluOP人工合成后与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接，酶切鉴定和序列测定获得了重组表达质粒pPIC9K-agluOP并转化入毕赤酵母KM71菌中。
pPICZA-pdi重组载体含有二硫键异构酶PDI基因，为本实验前期构建，详见Zhang J,Wu D,Chen J,Wu J(2011)Enhancing functional expression ofβ-glucosidase in Pichia pastoris byco-expressing protein disulfide isomerase.Biotechnology and Bioprocess Engineering16(6):1196-1200。
采用二硫键异构酶与agluOP基因共表达的方法，在3L罐上甲醇诱导110h后酶活达力到10.1U/mL，是共表达前的1.2倍，为α-葡萄糖苷酶的工业化生产奠定基础。
有益效果：本发明公开了一种密码子优化后的黑曲霉α-葡萄糖苷酶及其在毕赤酵母中的高效表达方法。所述基因构建到毕赤酵母表达载体并与二硫键异构酶基因转化入毕赤酵母中共表达，在3L罐上诱导110h后酶活达力可到10.1U/mL，是优化前的2.9倍，可用于α-葡萄糖苷酶的工业化生产。
附图说明
图1菌落PCR核酸电泳图（M1为核酸分子量标准，1代表pdi基因）
图2为本发明优化的agluOP基因的SDS-PAGE分析，其中M为蛋白分子量标准，1为表达的黑曲霉α葡萄糖苷酶蛋白
图3为本发明优化的agluOP基因与PDI在3L罐共表达的发酵酶活曲线
具体实施方式
本发明未注明的实验方法如酵母感受态的制备及其电转化，发酵培养基配方见Invitrogen公司的毕氏酵母操作手册。
实施例1：本例说明α-葡糖糖苷酶的密码子优化过程。
1、AGL基因的优化及合成：
以NCBI数据库中A.niger CBS513.88的α-葡萄糖苷酶序列(NCBI登录号：4991096)为基础，通过Graphical Codon Usage Analyser(http://gcua.schoedl.de/)分析其密码子使用频率，使用DNAWorks软件对黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因序列进行优化。DNAMAN用于分析目的基因限制性内切酶位点。优化后基因交由上海生工生物有限公司合成。我们的策略是用偏爱密码子替代稀有密码子，共改变了728个碱基，涉及222个密码子，GC含量由50.0%下降到44.2％，合成序列与原序列的同源性为74.0%。
优化后α-葡萄糖苷酶基因agluOP核苷酸序列如SEQ ID No1所示。
2、密码子优化后基因的克隆，筛选：
根据黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因序列，采用Primer Premier软件方法设计引物如下所示(NotI酶切位点由下划线标出)：
上引物：5’-ATTAATGCGGCCGCGTCCACCACTGCCCCTTCG-3’
下引物：5’-AGCACTAGCGGCCGCCCATTCCAATACCCAGTTTTCC-3’
将PCR扩增得到的优化后DNA片段纯化后和质粒pPIC9K同时用Not I酶切连接得到pPIC9K-agluOP。酶切验证质粒片段大小正确后进行基因测序。重组质粒Bgl II酶切线性化后转化进P.pichia细胞KM71(His-,Muts)中。挑取在MD平板上长出的转化子，点种于YPD/G418平板筛选多拷贝转化子，G418浓度筛选梯度依次为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL。重组子命名为P.pastoris KM71/pPIC9K-agluOP。
实施例2：本例说明重组P.pastoris KM71/pPIC9K-agluOP菌株3L罐发酵培养
吸取200μL的甘油管菌液接种于装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，30°C、200r/min培养16～20h，将上述培养液以10%接种量接入装液量为0.8L的3L发酵罐（BIOFLO,America），以25%氨水控制pH5，培养温度30℃，通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在20%左右，当溶氧迅速上升，表明培养基中的甘油已经耗尽，开始指数流加甘油补料液，当菌体浓度达到115.2g/L时，停止补料，溶氧再次反弹后，继续保持基质匮乏状态约1h后，开始诱导阶段，设置诱导温度26℃，添加2%甲醇，待重组P.pastoris适应甲醇，溶氧开始下降后，通过甲醇电极（FC2002,华东理工大学）分别维持甲醇浓度1%，诱导α-葡萄糖苷酶表达，诱导110h后，酶活达到最大为8.2U/mL。
实施例3：本例说明P.pastoris二硫键异构酶pdi基因的共表达
本实验室前期构建的重组表达载体pPICZA-pdi经Sac I单酶切线性化后电转至P.pastorisKM71/pPIC9K-agluOP中，由于细胞中已经含有G418抗性基因并整合到染色体上的pPIC9K载体，转化子能够在基础培养基上生长。为了提高筛选效率，将上述感受态细胞涂布于含0.5mg/mL G418抗性浓度的MD平板，然后挑取单菌落点种于含梯度Zeocin抗性的YPD平板。Zeocin抗性梯度为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL。用牙签挑取2mg/mL Zeocin抗性平板上的单菌落接种于10mL YPD培养基，30°C培养过夜，接甘油管保藏。然后取1mL菌体离心洗涤，加入50uL无菌水水浴煮沸10min，离心吸取上清。以上清为模板，采用AOX1上下游引物，进行菌落PCR。重组P.pastoris的菌落PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证，可见约1500bp左右的条带，由图1可得，表达载体pPICZA-pdi成功导入P.pastorisKM71/pPIC9K-agluOP中。菌落PCR引物设计如下：
上引物：AATTGCGACTGGTTCCAATTG
下引物：TTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG（反向引物）进行菌落PCR扩增，反应条件为：95°C3min，94°C45s，56°C30s，72°C2min，30个循环，72°C10min，10°C保存。PCR产物经1%核酸电泳验证。
重组子命名为P.pastoris KM71/pPIC9K-agluOP/pPICZαA-pdi。
实施例4：本例说明重组P.pastoris KM71/pPIC9K-agluOP/pPICZA-pdi
菌株3L罐发酵培养
吸取200μL的甘油管菌液接种于装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，30°C、200r/min培养16～20h，将上述培养液以10%接种量接入装液量为0.8L的3L发酵罐（BIOFLO,America），以25%氨水控制pH5，培养温度30℃，通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在20%左右，当溶氧迅速上升，表明培养基中的甘油已经耗尽，开始指数流加甘油补料液，当菌体浓度达到115.2g/L时，停止补料，溶氧再次反弹后，继续保持基质匮乏状态约1h后，开始诱导阶段，设置诱导温度26℃，添加2%甲醇，待重组P.pastoris适应甲醇，溶氧开始下降后，通过甲醇电极（FC2002,华东理工大学）分别维持甲醇浓度1%，诱导α-葡萄糖苷酶表达。诱导110h后，酶活达到最大为10.1U/mL（图3），取7μL发酵上清液SDS-PAGE进行检测，结果参见图2，实现了α-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的高表达。
实施例5：本例说明α-葡萄糖苷酶基因在毕氏酵母表达产物的酶活测定
利用分光光度法。反应液体积为1mL，包括50μL酶液，50μL底物(10mmol/L pNPG)和900μL0.1mol/L pH5.5的醋酸钠缓冲液。50℃，405nm处，反应15min后加入1mL1mol/L预冷的Na2CO3溶液中止反应并显色，记录吸光值。酶活力单位定义：在上述分析条件下，每分钟催化产生1μmol pNP的酶量为一个活力单位。
Claims (5)
1.一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因，其特征在于其基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种表达权利要求1所述基因的方法，其特征在于，将二硫键异构酶基因与权利要求1所述α-葡萄糖苷酶基因agluOP在毕赤酵母中共表达。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤如下：
1）将agluOP基因和质粒pPIC9K同时用Not I酶切连接得到pPIC9K-agluOP；
2）重组质粒经过Bgl II酶切线形化后转化进P.pastoris；
3）pPICZA-pdi经Sac I单酶切线性化后电转至P.pastoris/pPIC9K-agluOP中，挑选转化子。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，将感受态细胞涂布于含0.5mg/mL G418抗性浓度的MD平板，然后挑取单菌落点种于含梯度Zeocin抗性的YPD平板。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述毕赤酵母为P.pastorisKM71。
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