CN102676476B - 酶活性及热稳定性被提高的葡聚糖酶 - Google Patents

Abstract

一种酶活性及热稳定性被提高的葡聚糖酶，其包含将Fsβ-葡聚糖酶第18位置的缬氨酸突变为酪氨酸及第203位置的色氨酸突变为酪氨酸的氨基酸序列。

Description

酶活性及热稳定性被提高的葡聚糖酶

技术领域

本发明涉及一种葡聚糖酶，特别涉及一种β-1，3-1，4-葡聚糖酶。

背景技术

β-葡聚糖(β-Glucan)普遍存在于麦类(如大麦、小麦、燕麦)和谷类植物胚芽细胞壁中，β-葡聚糖是一种黏性物质，由约1200个β-D-葡萄糖基以不同的比例的β-1，3和β-1，4糖苷键连接而形成的长链多糖体。β-葡聚糖通过氢键紧密排列，形成不可溶的多糖体，如果要将自然界广泛存在的β-葡聚糖转变为可利用的能量，则必需依赖β-葡聚糖酶。β-1，3-1，4-葡聚糖酶(β-1，3-1，4-Glucanase)为半纤维素水解酶，可专一地水解邻近β-1，3键的β-1，4糖苷键，主要产物为纤维三糖及纤维四糖。目前已发现多种微生物能分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶，如芽孢杆菌、瘤胃真菌、嗜热厌氧纤维水解菌等。

β-葡聚糖酶在工业上的应用十分广泛，如啤酒酿造、动物饲料添加及食品加工等。举例来说，在啤酒酿造加入β-葡聚糖酶可以降低麦汁粘度、改善麦汁混浊度，并提高啤酒过滤速度及增加批次滤酒量。在动物饲料中添加β-葡聚糖酶可以帮助动物分解麦类的成份(大麦、小麦及燕麦)，增加饲料中营养物质的利用率，促进动物的消化吸收和生长发育，进而解决单胃家禽动物因肠胃道寄生细菌缺乏可分解此类多醣聚合物的β-葡聚糖酶，而造成的吸收困难与消化排泄问题。然而针对不同工业的应用，葡聚糖酶也需有符合其不同的适用条件与范围，例如高耐热性、高活性及耐酸碱性等，如此在工业应用上才更有其商业价值及竞争性。因此，找出符合不同工业上所需的酶蛋白也是目前学术及产业界持续努力的目标。

在许多相关的研究中，为了得到更佳的酶，除了从自然界中筛选合适的酶基因之外，另一个途径就是将现有产业化的酶蛋白再加以进行基因改造，以符合不同产业的需要。现今改造酶蛋白主要有两大策略，其一是随机突变或是将酶基因随机排列，再在特定的作用条件下，筛选出更符合其作用条件的酶蛋白。此策略的好处是无须深入研究酶的结构或作用机制，而是直接在特定的条件下随机去找出更好的酶蛋白，但其缺点是需要大量的人力以及时间去进行大量的筛选，并且此方法也需要有很好的大量筛选方法来配合。另一种改造策略则是通过研究酶的三维结构与作用机制以找出对于酶活性或特性具有关键性的氨基酸，并针对这些特定氨基酸进行定点突变并测试，进而得到功能性更强的改造酶蛋白。此策略的优点是不需花费时间与人力在大量的蛋白突变与筛选的步骤，但需要先了解此酶的蛋白结构以及其作用机制，如此才能找出具有改造潜力的特定氨基酸。

因此，本发明通过改造基因而改良葡聚糖酶的活性及热稳定性，并相对地降低制造成本，进而有效地提高葡聚糖酶在工业上的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于改造现有的葡聚糖酶，利用结构分析及点突变技术，有效地提高葡聚糖酶的作用活性及热稳定性而增加葡聚糖酶的产业价值，并且大幅降低成本。

为达上述目的，本发明的一个较广义实施方式是提供一种葡聚糖酶，其包含将序列号2的第18位置的缬氨酸(Valine)突变为酪氨酸(Tyrosine)及第203位置的色氨酸(Tryptophan)突变为酪氨酸(Tyrosine)的氨基酸序列。其中，编码所述的序列号2所表示的氨基酸序列的基因是筛选自沙斯诺金纤维分解菌(Fibrobactersuccinogenes)的Fsβ-葡聚糖酶基因，所述的葡聚糖酶为β-1，3-1，4-葡聚糖酶，且所述的葡聚糖酶具有序列号8的氨基酸序列。

为达上述目的，本发明的另一个较广义实施方式是提供一种葡聚糖酶，其包含将序列号2第203位置的色氨酸(Tryptophan)突变为酪氨酸(Tyrosine)的氨基酸序列。其中，编码所述的序列号2所表示的氨基酸序列的基因系筛选自沙斯诺金纤维分解菌(Fibrobactersuccinogenes)的Fsβ-葡聚糖酶基因，该葡聚糖酶为β-1，3-1，4-葡聚糖酶，且所述的葡聚糖酶具有序列号6的氨基酸序列。

为达上述目的，本发明的另一个实施方式是提供一种葡聚糖酶，其包含将序列号2第18位置的缬氨酸(Valine)突变为酪氨酸(Tyrosine)的氨基酸序列。其中，编码所述的序列号2所表示的氨基酸序列的基因是筛选自沙斯诺金纤维分解菌(Fibrobactersuccinogenes)的Fsβ-葡聚糖酶基因，所述的葡聚糖酶为β-1，3-1，4-葡聚糖酶，且所述的葡聚糖酶具有序列号4的氨基酸序列。

附图说明

图1为编码野生型Fsβ-葡聚糖酶的全长的核苷酸及由此推导的氨基酸序列。

图2为定点突变所采用的引物。

图3为编码V18Y突变型酶蛋白的全长的核苷酸及由此推导的氨基酸序列。

图4为编码W203Y突变型酶蛋白的全长的核苷酸及由此推导的氨基酸序列。

图5为编码V18Y/W203Y突变型酶蛋白的全长的核苷酸及由此推导的氨基酸序列。

图6为野生型与突变型酶蛋白的热稳定性试验结果比较。

图7为野生型及突变型酶蛋白的活性检测结果比较。

图8为V18Y/W203Y突变型酶蛋白与纤维二糖结合的复合体三维立体结构。

图9为V18Y/W203Y突变型酶蛋白与纤维二糖结合的局部结构示意图。

图10为V18Y/W203Y突变型酶蛋白的局部结构示意图。

具体实施方式

本发明的特征与优点的实施例将在本文得以详述。应该理解的是本发明在不同实施方式下会有各种变化，但是所述的变化并不脱离本发明的保护范围，而且，其中的说明和附图是在本质上对本发明加以说明，而并非限制本发明。

为了增加葡聚糖酶的工业应用价值，本发明从沙斯诺金纤维分解菌(Fibrobacter succinogenes)筛选出Fsβ-葡聚糖酶(Fsβ-glucanase)基因，其所表现的酶蛋白为一种β-1，3-1，4-葡聚糖酶(β-1，3-1，4-Glucanase)，通过研究此葡聚糖酶结构后，针对其活性区或具有关键性特性的氨基酸突变以增进酶活性及其热稳定性。以下将详述本发明改造葡聚糖酶的方法及其所得到的改良的葡聚糖酶。

首先，将沙斯诺金纤维分解菌的Fsβ-葡聚糖酶基因作为目标基因，如图1所示，野生型的Fsβ-葡聚糖酶基因的全长为747个碱基(核苷酸序列以序列号1标示)以及由此推导的248个氨基酸(氨基酸序列以序列号2标示)，利用限制酶XbaI以及NdeI作为酶切位点构建到pET32载体中，再将该重组质粒转化入感受态细胞(competentcell)中，进而得到野生型表达载体。构建步骤中，聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)所用的引物为5’-GGTATTGAGGGTCGCGCGGCGGCGGCGGCGATGTTGGTTAGCGCAAAGGATT-3’(正向引物)及5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACGGAGCAGGTTCGTCATC-3’(反向引物)。

为了提高所述的葡聚糖酶的比活性及对热的耐受性，本发明利用定点突变技术(site-directed mutagenesis)，以野生型葡聚糖酶基因做为模板进行聚合酶连锁反应步骤，其中所采用的突变引物列于图2，其中V18Y是将葡聚糖酶第18位置的缬氨酸突变成酪氨酸，而W203Y是将第203位置的色氨酸突变成酪氨酸。接着加入限制酶DpnI于37℃下作用，将原始模板去除，接着把突变质粒转化(Transformation)入大肠杆菌感受态细胞中同时以氨苄青霉素(Ampicillin)进行初步筛选，并通过DNA测序步骤确认成功突变基因。图3至图5表示本发明所构建的包含V18Y、W203Y及V18Y/W203Y酶蛋白的三个突变型基因及由此推导的氨基酸序列。V18Y是指将野生型的葡聚糖酶第18位置的缬氨酸突变成酪氨酸，W203Y是指将野生型的葡聚糖酶的第203位置的色氨酸突变成酪氨酸，而V18Y/W203Y则代表同时将野生型的葡聚糖酶的第18位置的氨基酸及第203位置的氨基酸都突变成酪氨酸，其中V18Y、W203Y及V18Y/W203Y的核苷酸序列分别以序列号3、5、7标示，而由此推导的V18Y、W203Y及V18Y/W203Y的氨基酸序列则以序列号4、6、8标示。

接着，将构建好的野生型及突变型葡聚糖酶的重组基因质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内，并通过含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养盘筛选菌株。接着把菌株接种到5ml LB内培养，再放大菌量至200ml LB中培养，最终放大到6L的LB培养基中。在OD值到达0.6至0.8时，加入1mM的IPTG诱导酶蛋白的大量表达。经过3小时的蛋白质诱导表达之后，将菌液以6000rpm转速离心10分钟将细胞收集起来。加入裂解缓冲液(lysis buffer)后利用超声波细胞破碎机(sonicator)破菌，再以16000rpm转速离心30分钟，并收集上清液用以准备下一步的纯化。为了得到高纯度的酶蛋白，通过快速蛋白质液相层析色谱(fast protein liquidchromatography；FPLC)依序利用镍离子层析柱以及DEAE阴离子交换柱分离纯化出蛋白纯度达95％以上的野生型及突变型葡聚糖酶蛋白，并以5mg/ml酶蛋白浓度在25mM Tris、150mM NaCl、pH 7.5条件下保存于-80℃。

为了验证野生型与突变型葡聚糖酶的差异，本发明进一步测量它们的酶活性及耐热性。葡聚糖酶的活性测试方式主要是将1％大麦β-葡聚糖与适当浓度的酶蛋白(缓冲液为0.1M pH 5.0的醋酸钠)以1∶1比例混合一起，在50℃下反应10分钟。接着加入1.5倍体积的1％DNS于100℃沸水中作用5分钟，以停止反应且呈色。在OD540波长测定吸光值，再换算成酶活性单位(unit)，其中酶活性的标准曲线是由葡萄糖标准溶液0-0.25mg/ml之间制定，而1unit的定义为每分钟释放1μmole产物所需的酶蛋白量。此外，葡聚糖酶的热稳定性试验则是将野生型及突变型酶蛋白分别于50℃、53℃、55℃、57℃、59℃、62℃的温度下热处理2分钟并在冰上冷却5分钟后，测量其残存活性，其活性测试的标准步骤如上所述。

图6表示野生型及突变型酶蛋白之间的热稳定性试验结果比较，将纯化后的野生型及突变型酶蛋白在相同蛋白浓度的条件下，进行热稳定性试验。由图6可知，在2分钟的耐热测试中，突变型酶蛋白V18Y及V18Y/W203Y耐热性皆较野生型蛋白高。在55℃的热处理后，野生型酶蛋白(WT)与突变型W203Y的酶活性只有原始的40％残余活性，而V18Y及V18Y/W203Y还维持其原始活性的75％，且其对热的耐受度，亦即酶结构降解一半时的温度(Tm，meltingtemperature)由55℃升高为57℃，增加了约2℃。由此结果可证明，将V18突变成酪氨酸可提高Fsβ-葡聚糖酶的热稳定性。

图7为野生型及突变型酶蛋白之间的活性检测结果比较，使用大麦β-葡聚糖做为基质(substrate)来检测活性。由图7可知，野生型葡聚糖酶(WT)的比活性为5694U/mg，而将W203突变成酪氨酸的突变型酶蛋白W203Y及V18Y/W203Y比活性分别为9263U/mg及9967U/mg，与野生型酶蛋白相比明显地增加了1.6倍以上。

因此，综合上述结果，将Fsβ-葡聚糖酶第18个氨基酸由缬氨酸突变成酪氨酸时可以增加其热稳定性，而将第203个氨基酸由色氨酸突变成酪氨酸时可增进酶蛋白的活性。而在同时突变这两个氨基酸时(亦即同时将第18个氨基酸由缬氨酸突变成酪氨酸，以及将第203个氨基酸由色氨酸突变成酪氨酸)，其改造特性并不会互相影响，反而能够达成互补的作用，故与野生型葡聚糖酶相比，双点突变的酶蛋白(V18Y/W203Y)不但提高了其耐热性，且大大地增加了酶蛋白活性。

而除了将葡聚糖酶表达在大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统外，本发明还将野生型及突变型葡聚糖酶表达在工业上常用的毕赤酵母表达系统中。首先，将Fsβ-葡聚糖酶的野生型及突变型的重组基因利用限制酶EcoRI与NotI构建到pPICZαA载体中，再利用限制酶PmeI把DNA质粒进行线性化之后，通过电转化步骤将DNA转入至毕赤酵母细胞内。接着将菌液涂于含有100μg/ml zeocin抗生素的YPD培养盘上且于30℃下进行培养两天。再挑选菌落并接种到5ml YPD于30℃下培养，再次接种到50ml BMGY中于30℃下培养至过夜(over night)。接着，将培养基换成含有0.5％甲醇的20mlBMMY以诱导蛋白表达，同样培养于30℃下。每隔24小时取样并补充0.5％甲醇。将取样的菌液进行离心并收集上清液，进而测定葡聚糖酶的活性，其测定方法如上所述。

而为了进一步地测试葡聚糖酶发酵生产量，先将菌株接种到5ml YPD培养至过夜，接着放大到2L于30℃下培养之后，再次放大到含有19L发酵培养基(FBSM)的50L发酵槽内。针对毕赤酵母的发酵操作，基本上是参考Invitrogen公司的操作手册。发酵过程中，会全程监控温度在30℃并通过氨水控制pH值在5.0左右，而溶氧则通过进气量以及转速的调控维持在40％以上。在批次培养(batchculture)之后，添加50％甘油以使酵母生长到一定的菌量。再把甲醇以梯度递加的方式加入到发酵槽中，进而诱导酶蛋白的表达。每隔12小时取样一次并收集上清液，进而检测葡聚糖酶的表达量与活性。50L发酵槽的检测结果同样显示V18Y/W203Y突变型酶蛋白的活性明显地高于野生型，总活性净产量提升了约2倍。因此能够降低生产成本，在工业应用上会更具有竞争力。

为了验证及了解Fsβ-葡聚糖酶的V18Y/W203Y突变型酶蛋白的作用机理，本发明进一步利用X-ray蛋白结晶学技术解析出V18Y/W203Y突变型酶蛋白与纤维二糖结合的复合体的三维立体结构。首先通过蒸气扩散法，在室温下以座滴式(sitting drop method)进行养晶。利用不同的晶体筛选套组来筛选养晶条件，并经由调整修正找出最佳的长晶条件。接着，将Fsβ-葡聚糖酶的V18Y/W203Y突变型酶蛋白晶体浸泡于含有10mM纤维四糖的溶液中，并利用X-ray获得衍射图谱，最后利用分子置换法(molecular replacementmethod)，经由计算机运算后解析出Fsβ-葡聚糖酶的V18Y/W203Y突变型酶蛋白与纤维二糖(CLB)结合的复合体立体结构(如图8所示)。

图9表示V18Y/W203Y突变型酶蛋白与纤维二糖(CLB)结合的局部结构示意图。从图中可见，Y203上的OH基团和E11(Glutamicacid，谷氨酸)及R137(Arginine，精氨酸)形成了氢键，而E11及R137对于葡聚糖基质(substrate)的辨认有很重要的作用，由酶蛋白结构中可以看出，W203Y的突变可稳定E11及R137的位置及方向，使得这两个氨基酸更能与葡聚糖结合，也因此增强了酶蛋白的活性。

图10表示V18Y/W203Y突变型酶蛋白的局部结构示意图。从图中可见，Y18不仅提供了疏水性的作合力(Hydrophobicinteraction)，其上的OH基团也与T 14(Threonine，苏氨酸)及W186(Tryptophan，色氨酸)直接产生氢键的作用力，并通过两个水分子(Wa1及Wa2)与R197(Arginine，精胺酸)产生两个氢键，这都是突变之前所没有的，也因此使得V18Y突变型能大幅地增加葡聚糖酶的耐热性。

综上所述，为了增加葡聚糖酶的工业应用价值，本发明进一步研究Fsβ-葡聚糖酶的结构，针对其活性区或具有关键性特性的氨基酸进行突变，以增加酶活性及其热稳定性。根据本发明，将氨基酸序列上第18位置的缬氨酸突变为酪氨酸后可以增加酶蛋白的热稳定性；在2分钟的耐热试验中，其酶结构降解一半时的温度(Tm)增加了约2℃(从55℃增加到57℃)。此外，将氨基酸序列上第203位置的色氨酸突变成酪氨酸后能有效地提高所述的葡聚糖酶的活性，突变后的葡聚糖酶的酶蛋白比活性为野生型的比活性约1.6倍。而除了将此葡聚糖酶表达在大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统，本发明也将野生型及突变型葡聚糖酶表达在工业上常用的毕赤酵母表达系统。在此系统中，不论是在小量摇瓶或是大量生产的发酵技术上，突变后的葡聚糖酶蛋白活性皆明显高于野生型。因此，本发明通过结构分析所进行的突变可明显地增加葡聚糖酶活性及提高热稳定性，进而增进此葡聚糖酶的应用价值，尤其在食品工业及饲料工业的应用价值。故本发明所提出的葡聚糖酶极具产业价值。

本发明可为熟知本领域技术人员做各种修饰，但修饰后的技术特征也落入本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种葡聚糖酶，其氨基酸序列为将序列号2第18位置的缬氨酸突变为酪氨酸及第203位置的色氨酸突变为酪氨酸的氨基酸序列。

2.一种葡聚糖酶，其氨基酸序列为将序列号2第18位置的缬氨酸突变为酪氨酸的氨基酸序列。

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