CN102392036A - β-1,4-内切甘露聚糖酶(Tvi Man5A)基因的克隆及重组酶的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种源自绿色木霉(Trichoderma viride)WL 0422的新型β-甘露聚糖酶基因序列的克隆方法，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。生物信息学分析表明该β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶第5家族，命名为Tvi Man5A，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2，相应的基因命名为Tvi man5A。本发明还公开了β-甘露聚糖酶工程菌的构建以及重组β-甘露聚糖酶的高效表达和纯化的方法，制备的重组β-甘露聚糖酶的最适作用温度和pH分别为70℃和3.5，在pH3.0-7.0、60℃以下稳定，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及来源于绿色木霉(Trichoderma viride)WL 0422的一种新型β-甘露聚糖酶基因序列的克隆，新型β-甘露聚糖酶工程菌的构建，以及重组β-甘露聚糖酶的高效表达和纯化的方法，属于微生物基因工程技术领域。
背景技术
β-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannan mannohydrolase，EC 3.2.1.78)是一种能从均一甘露聚糖和异甘露聚糖主链的内部降解β-1，4-甘露糖苷键的水解酶，属于半纤维素酶类，其广泛地存在于微生物、植物和动物中。它可以广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、印染和石油工业等领域。在食品和医药领域，β-甘露聚糖酶作用于甘露聚糖后可以产生功能性低聚糖，这种低聚糖可以有效地降低人体血糖和胆固醇水平且有利于人和动物肠道内益生菌群的生长，进而调节人和动物的免疫系统、提高免疫力。在饲料工业中，它作为饲料添加剂能有效降解植物细胞壁中的甘露聚糖成分，消除抗营养因子，提高能量利用率、改善饲料转化率。在造纸工业中，β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用，处理纸浆，能明显改善纸质。将β-甘露聚糖酶运用纺织印染的漂白工艺中，能有效地去除产品上粘附的多余染料，更可以减少氯和碱的用量以及它们带来的环境污染问题，有利于生态环境的保护。另外，在酶法降解可再生生物质资源生产燃料酒精的工艺中添加一定量的β-甘露聚糖酶可以促进可发酵糖的产生，进一步促进燃料酒精的生产，缓解全球的能源危机。目前已报道的能产β-甘露聚糖酶的微生物主要来自于细菌、真菌和放线菌，例如细菌中的枯草芽孢杆菌，真菌中的曲霉、木霉、青霉、酵母，以及放线菌中的链霉菌等。根据序列同源性和空间结构分析，多数β-甘露聚糖酶都属于糖苷水解酶第5、26和113家族。目前，关于第5家族β-甘露聚糖酶的报道较多，它们的最适pH值为3.0～7.5，最适温度在45～92℃。
近年来，随着对自然界中半纤维素资源的开发、饲粮中甘露聚糖抗营养因子的消除以及甘露寡糖生理功能的发现，β-甘露聚糖酶的需求量越来越大，导致对β-甘露聚糖酶的研究和开发进入一个新高潮。但就国内外相关文献或专利报道来看，微生物β-甘露聚糖酶发酵酶活性普遍不高，导致了生产成本很高，从而阻碍了该酶在众多领域中的广泛应用。为了提高β-甘露聚糖酶的发酵产率和酶活性，早期的研究工作主要集中在产酶菌种的筛选、诱变、产酶诱导，酶的分离纯化及性质，酶水解底物方式及应用等方面。进入90年代，随着基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，研究工作逐步转向酶基因的克隆和表达以及酶活性位点的研究等方面。目前，虽已有一些有关β-甘露聚糖酶基因的克隆和表达的文献和专利报道，但 有关来源于绿色木霉(Trichoderma viride)β-甘露聚糖酶基因的克隆和表达等的研究未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型β-甘露聚糖酶基因序列的克隆，新型β-甘露聚糖酶工程菌的构建，以及重组β-甘露聚糖酶的高效表达和纯化的方法。生物信息学分析表明来源于T.viride WL 0422的一种新型β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶的第5家族，命名为Tvi Man5A，其相应的基因命名为Tvi man5A。Tvi Man5A具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值。
本发明的技术方案：一种源自T.viride WL 0422的新型β-甘露聚糖酶基因完整的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
T.viride WL 0422菌株由江南大学筛选和保藏，该菌株已于2006年在《江苏食品与发酵》杂志的No.1Pg.1公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。
所述的重组β-甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
所述的重组β-甘露聚糖酶的活性测定方法：
于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4.8、乙酸-乙酸钠缓冲液配制的质量浓度为0.5％的角豆胶溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应10min；立即各加入2.5mL 3′，5′-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从甘露糖标准曲线上查出相应的还原糖(以甘露糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个β-甘露聚糖酶活性单位(IU)。
所述的新型β-甘露聚糖酶基因序列的克隆和表达方法：
(1)β-甘露聚糖酶基因3′端mRNA序列的克隆：首先对Aspergillus usamii(GenBank HQ839639)、Aspergillus sulphureus(GenBank DQ328335)和Trichoderma reesei(GenBank L25310)β-甘露聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列；再对它们的核酸序列进行同源比对，设计两条正向简并引物Man5A-3F1和Man5A-3F2。
Man5A-3F1：5′-GTATGGGGCTTCAACGACGTC-3′
Man5A-3F2：5′-AC(C/A/G)ATCAAC ACGGG(C/T/A)GCCGA-3′
提取T.viride WL 0422的总RNA，按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)说明书进行RT-PCR扩增。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-man5A3′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到T.viride WL 0422新型β-甘露聚糖酶基因3′端mRNA序列。
(2)β-甘露聚糖酶基因5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的β-甘露聚糖酶基因3′端mRNA序列，设计两条反向引物Man5A-5R1和Man5A-5R2。
Man5A-5R1：5′-GGATGACGAGCTTGAGGTTA-3′
Man5A-5R2：5′-ACTACATAGTCGAGCGTTTG-3′
按照TaKaRa 5′-Full RACE Kit说明书进行5′-RACE。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-man5A5′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到T.viride WL 0422新型β-甘露聚糖酶基因5′端mRNA序列。
(3)β-甘露聚糖酶基因(Tvi man5A)的生物信息学分析：将Tvi man5A的5′和3′端mRNA序列进行拼接，得到自转录起始位点至poly(A)的完整mRNA序列；在NCBI上对开放阅读框架(Open Reading Frame)进行分析，进而推导出Tvi Man5A的氨基酸序列；最后进行信号肽预测。
(4)构建含编码β-甘露聚糖酶成熟肽基因的表达质粒：基于上述得到的β-甘露聚糖酶基因完整mRNA序列以及预测的信号肽序列，设计一对引物Man5A-F、Man5A-R进行编码成熟肽cDNA的合成。
Man5A-F：5′GAATTCGCTTCGAGCTTTGTAACCAT-3′，含EcoR I酶切位点
Man5A-R：5′GCGGCCGCTCATGTATTCAGGCATTGCG-3′，含Not I酶切位点
按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)使用说明书进行RT-PCR。以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和Man5A-F为引物进行第一轮PCR；以Man5A-F和Man5A-R为引物进行第二轮PCR。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-man5A)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
将测序结果正确的pUCm-T-man5A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-man5A(图1)， 并对重组质粒进行序列测定。
(5)GS115/man5A的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sac I对pPIC9K-man5A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定重组β-甘露聚糖酶活性；发酵液经冷冻离心、超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析，得到电泳纯的重组β-甘露聚糖酶。
本发明的有益效果：本发明提供了一种新型β-甘露聚糖酶基因序列的克隆，新型β-甘露聚糖酶工程菌GS115/man5A的构建，以其重组β-甘露聚糖酶的高效表达和纯化的方法。生物信息学分析表明来源于T.viride WL 0422的一种新型β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶第5家族，命名为Tvi Man5A，其相应的基因命名为Tvi man5A。Tvi Man5A具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值，也为其它β-甘露聚糖酶的研究奠定了理论基础。
附图说明
图1：重组质粒pPIC9K-man5A的构建示意图
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1β-甘露聚糖酶基因3′端mRNA序列的克隆
以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和Man5A-3F1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃90s)，72℃10min；以M13Primer M4和Man5A-3F2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃90s)，72℃10min。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-man5A3′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Tvi man5A 3′端mRNA序列。
实施例2β-甘露聚糖酶基因5′端mRNA序列的克隆
以5′-Full RACE Kit的Outer Primer和Man5A-5R1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；以Inner Primer和Man5A-5R2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃ 30s，72℃60s)，72℃10min。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-man5A5′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Tvi man5A 5′端mRNA序列。
实施例3构建含编码β-甘露聚糖酶成熟肽基因的表达质粒
以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以Man5A-F和M13Primer M4为引物进行第一轮PCR，反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，53℃30s，72℃90s)，72℃10min；以Man5A-F和Man5A-R为引物进行第二轮PCR，反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，53℃30s，72℃90s)，72℃10min。将第二轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-man5A)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序结果正确的pUCm-T-man5A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-man5A，并对重组质粒进行序列测定。
实施例4GS115/man5A的构建、表达、产物纯化及活性测定
用Sac I对pPIC9K-man5A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A。该基因工程菌用1.0％甲醇诱导表达96h，采用DNS法测得发酵液中重组β-甘露聚糖酶活性达90IU/mL。发酵液经离心后的上清液为重组β-甘露聚糖酶粗酶液，该粗酶液经截留分子量为10,000Da的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组β-甘露聚糖酶的分子量为50kDa。该重组β-甘露聚糖酶的最适作用温度70℃，最适作用pH 3.5，该酶在pH 3.0-7.0、60℃以下稳定；金属离子Al3+、Ca2+对酶活性有明显的激活作用，而Ag+则具有很强的抑制作用。
Claims (3)
1.一种来源于T.viride WL 0422的新型β-甘露聚糖酶基因，其核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
2.T.viride WL 0422新型β-甘露聚糖酶基因序列的克隆方法：
(1)β-甘露聚糖酶基因3′端mRNA序列的克隆：首先对A.usamii、A.sulphureus和T.reeseiβ-甘露聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列；再对它们的核酸序列进行同源比对，设计两条正向简并引物Man5A-3F1和Man5A-3F2；
Man5A-3F1：5′-GTATGGGGCTTCAACGACGTC-3′
Man5A-3F2：5′-AC(C/A/G)ATCAAC ACGGG(C/T/A)GCCGA-3′
以T.viride WL 0422总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以Man5A-3F1和M13 Primer M4为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃90s)，72℃10min；以Man5A-3F2和M13 PrimerM4为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃90s)，72℃10min；目的条带经克隆、测序，得到Tvi man5A 3′端mRNA序列；
(2)β-甘露聚糖酶基因5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Tvi man5A 3′端mRNA序列，设计两条反向引物Man5A-5R1和Man5A-5R2；
Man5A-5R1：5′GGATGACGAGCTTGAGGTTA-3′
Man5A-5R2：5′-ACTACATAGTCGAGCGTTTG-3′
以合成的cDNA第一条链为模板，5′-Full RACE Kit的Outer Primer和Man5A-5R1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；以Inner Primer和Man5A-5R2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；目的条带经克隆、测序，得到Tvi man5A5′端mRNA序列；
3.T.viride新型β-甘露聚糖酶工程菌的构建和表达方法：
(1)构建含编码Tvi Man5A成熟肽基因的表达质粒：以合成的cDNA第一条链为模板，第一轮PCR以Man5A-F和M13 Primer M4为引物，反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，53℃30s，72℃90s)，72℃10min；第二轮PCR以Man5A-F和Man5A-R为引物，反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，53℃30s，72℃90s)，72℃10min；将第二轮PCR的目的条带进行克隆、测序；测序结果正确的pUCm-T-man5A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组表达质粒pPIC9K-man5A，并对表达质粒进行测序鉴定；
(2)GS115/man5A的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sac I对pPIC9K-man5A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A；该基因工程菌用1.0％甲醇诱导表达96h，采用DNS法测得发酵液中重组β-甘露聚糖酶活性达90IU/mL；发酵液经离心后的上清液为重组β-甘露聚糖酶粗酶液，该粗酶液经截留分子量为10,000Da的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组β-甘露聚糖酶的分子量为50kDa；该重组β-甘露聚糖酶的最适作用温度70℃，最适作用pH 3.5，在pH 3.0-7.0、60℃以下稳定；金属离子Al3+、Ca2+对酶活性有明显的激活作用，而Ag+则具有很强的抑制作用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120328 |